本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中用于制備反式-4-羥基-l-脯氨酸的dna分子和方法。

背景技術(shù)：

反式-4-羥基-l-脯氨酸(trans-4-hydroxy-l-proline，hyp)是廣泛存在于動(dòng)物膠和骨膠原中的亞氨基酸，分子式如式1。

反式-4-羥基-l-脯氨酸可以作為膠原蛋白合成的增強(qiáng)劑而用于化妝品和醫(yī)藥產(chǎn)品。也可以作為許多組織(如皮膚、骨骼和消化道)的補(bǔ)充營養(yǎng)物而用于食品行業(yè)。此外，反式-4-羥基-l-脯氨酸帶有手性分子，是合成藥物時(shí)有用的手性元件。其有用的衍生品包括mk-1220(被認(rèn)為是一個(gè)高活性的丙型肝炎病毒蛋白酶抑制劑)；聚胺-4-l-thop(被用作非降解性丙烯酸骨結(jié)合劑)；n-乙酰thop(奧沙西羅)，可以抑制炎癥和減少腫脹，是有用的治療骨關(guān)節(jié)炎等影響結(jié)締組織疾病，奧沙西羅已經(jīng)被確立為一種無毒副作用的治療關(guān)節(jié)疾病的藥物。

目前，國內(nèi)生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的主要方法是生物提取法，利用動(dòng)物蛋白來源如明膠、豬皮為原料，經(jīng)酸、堿水解后提取反式-4-羥基-l-脯氨酸，該方法純化步驟長(zhǎng)，成本高，且廢棄物污染嚴(yán)重。隨著脯氨酸-4-羥化酶的開發(fā)和生物技術(shù)的發(fā)展，利用微生物生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸成為可能。

國外，shibasaki等人于2000年發(fā)表文章稱已構(gòu)建可以工業(yè)化生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的微生物，即在含有葡萄糖和l-脯氨酸的培養(yǎng)基中，用大腸桿菌表達(dá)反式-4-羥基-l-脯氨酸。但是利用天然序列含有過多稀有密碼子而導(dǎo)致目的蛋白量低，密碼子優(yōu)化合成基因表達(dá)量較高但是在宿主細(xì)胞中的可溶性表達(dá)低，產(chǎn)生較多的包涵體，不利于其工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何提高反式-4-羥基-l-脯氨酸的產(chǎn)量。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的dna分子，所述dna分子為將l-脯氨酸-4-羥化酶編碼基因(genbank:d78338.1)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化得到的dna分子，其名稱為p4hgp基因。

上述p4hgp基因的序列為序列表中序列1，序列1為將序列3的第69位的c突變?yōu)間，第72位的g突變?yōu)閏得到的序列。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了含有p4hgp基因的生物材料，所述生物材料為下述b1)至b9)中的任一種：

b1)含有p4hgp基因的表達(dá)盒；

b2)含有p4hgp基因的重組載體；

b3)含有b1)所述表達(dá)盒的重組載體；

b4)含有p4hgp基因的重組微生物；

b5)含有b1)所述表達(dá)盒的重組微生物；

b6)含有b2)所述重組載體的重組微生物；

b7)含有b3)所述重組載體的重組微生物；

b8)含有p4hgp基因的重組細(xì)胞系；

b9)含有b1)所述表達(dá)盒的重組細(xì)胞系。

上述生物材料中，b1)所述的含有p4hgp基因的表達(dá)盒，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)p4hgp基因的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)p4hgp基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止p4hgp基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。

可用現(xiàn)有的載體構(gòu)建含有所述p4hgp基因表達(dá)盒的重組載體。

上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體為向pyb1s載體的多克隆位點(diǎn)插入序列1所示的p4hgp基因得到的重組載體pyb1s-p4hgp；所述pyb1s載體為將載體pacycduet-1的含有復(fù)制子和鏈霉素抗性基因的dna片段與pbad/hisb載體的含有pbad啟動(dòng)子、酶切位點(diǎn)和終止子的dna片段進(jìn)行拼接得到的載體。

上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌。所述細(xì)菌可為大腸桿菌，如大腸桿菌bw25113。

上述生物材料中，所述重組微生物可為將含有p4hgp基因的重組載體導(dǎo)入大腸桿菌得到的表達(dá)l-脯氨酸-4-羥化酶的重組微生物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組微生物為將pyb1s-p4hgp導(dǎo)入大腸桿菌得到的重組菌。

上述生物材料中，所述重組細(xì)胞系不包括繁殖材料。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了反式-4-羥基-l-脯氨酸的制備方法，所述方法包括：將所述重組微生物置入含有制備反式-4-羥基-l-脯氨酸的初始物質(zhì)的體系中進(jìn)行反應(yīng)，得到反式-4-羥基-l-脯氨酸。

上述方法中，所述制備反式-4-羥基-l-脯氨酸的初始物質(zhì)可為l-脯氨酸。

上述方法中，所述重組微生物在所述體系中的濃度可為30od/ml，所述od為在od600(即在600nm下的吸光值)。

上述方法中，所述體系由水和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其濃度分別為100mmtris、100mml-脯氨酸、4mmfeso4和8mm維生素c，用hcl調(diào)ph至7.0。

上述方法中，所述反應(yīng)可在30℃下進(jìn)行。所述反應(yīng)可進(jìn)行12h。在進(jìn)行所述反應(yīng)時(shí)，將所述重組微生物置入所述體系中后可在非靜止的環(huán)境中進(jìn)行所述反應(yīng)，如250rpm的環(huán)境中。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了用于制備反式-4-羥基-l-脯氨酸的物質(zhì)，所述物質(zhì)由p4hgp基因或所述生物材料與用于制備反式-4-羥基-l-脯氨酸所需要的其他試劑組成。

上述物質(zhì)中，所述用于制備反式-4-羥基-l-脯氨酸所需要的其他試劑可為所述制備反式-4-羥基-l-脯氨酸的初始物質(zhì)，如l-脯氨酸。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了下述任一應(yīng)用：

m1、p4hgp基因在制備反式-4-羥基-l-脯氨酸中的應(yīng)用；

m2、p4hgp基因在制備用于生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

m3、所述生物材料在制備反式-4-羥基-l-脯氨酸中的應(yīng)用；

m4、所述生物材料在制備用于生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的產(chǎn)品中的應(yīng)用；

m5、所述物質(zhì)在制備反式-4-羥基-l-脯氨酸中的應(yīng)用。

實(shí)驗(yàn)證明，其名稱為，將l-脯氨酸-4-羥化酶基因(p4h基因)的密碼子進(jìn)行優(yōu)化后得到的基因可以提高反式-4-羥基-l-脯氨酸的產(chǎn)量：利用p4h基因得到極少量的反式-4-羥基-l-脯氨酸，利用將p4h基因按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化得到的p4hm與p4hgp基因得到的反式-4-羥基-l-脯氨酸的量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于利用p4h基因得到的反式-4-羥基-l-脯氨酸的量，利用p4hm基因得到的反式-4-羥基-l-脯氨酸平均為29mm，而利用p4hgp基因得到的反式-4-羥基-l-脯氨酸平均達(dá)34.7mm，與pyb1s-p4h/bw25113和pyb1s-p4hm/bw25113相比，pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸的分別產(chǎn)量提高了378.6％和19.7％。表明，可以利用序列1所示的p4hgp基因生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸。

附圖說明

圖1為重組載體pyb1s-p4hgh圖譜。

圖2為pyb1s-p4hgp/bw25113與pyb1s-p4hm/bw25113中目的蛋白的sds-page電泳分析結(jié)果。

圖3為利用pyb1s-p4hgp/bw25113與pyb1s-p4hm/bw25113生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸的產(chǎn)量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的大腸桿菌bw25113(tomoyababa,takeshiara,mikihasegawa,yukitakai,yoshikookumura,mikibaba,kirilladatsenko,masarutomita,barrylwanner,andhirotadamori1.constructionofescherichiacolik-12in-frame,single-geneknockoutmutants:thekeiocollection.molecularsystemsbiology(2006):1-11.)公眾可從申請(qǐng)人處獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

下述實(shí)施例中的5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基為無菌培養(yǎng)基，其配制方法如下：100mla+2mlb+2mlc+200μld+100μle；

a為zy溶液，zy溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：1％(質(zhì)量百分比濃度)胰蛋白胨和0.5％(質(zhì)量百分比濃度)酵母粉；

b為50×m溶液，50×m溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：1.25mna2hpo4，1.25mkh2po4，2.5mnh4cl和0.25mna2so4；

c為50×5052溶液，50×5052溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：25％(質(zhì)量百分比濃度)甘油，2.5％(質(zhì)量百分比濃度)葡萄糖，10％(質(zhì)量百分比濃度)l-阿拉伯糖；

d為1mmgso4水溶液；

e為1000×微量元素溶液，1000×微量元素溶液由超純水和溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為：50mmfecl3，20mmcacl2，10mmmncl2，10mmznso4，2mmcocl2，2mmnicl2，2mmna2mo4，2mmna2seo3，2mmh3bo3。

實(shí)施例1、利用p4hgp基因生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸

本發(fā)明提供了一種可用于生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸(trans-4-hydroxy-l-proline，hyp)的l-脯氨酸-4-羥化酶基因(p4h基因，genbank:d78338.1)的突變基因，將其命名為p4hgp基因，p4hgp基因與指孢囊菌(dactylosporangiumsp.)rh1的p4h基因均編碼l-脯氨酸-4-羥化酶(p4h)(序列表中序列2)(genebank:baa20094.1)，p4hgp基因的核苷酸序列如序列表中序列1所示，p4hgp基因?yàn)閷4h基因根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化得到的基因。

1、重組載體與重組菌的制備

制備名稱為pyb1s的載體：以p15asali_f:gtcgacgtgcgtcagcagaatatgtg和strsphi_r:acctaccaaggcaacgctat為引物，以載體pacycduet-1(novagen公司)為模板擴(kuò)增得到含有復(fù)制子和鏈霉素抗性基因的dna片段，將該dna片段命名為ori-aada；利用引物arac-trrnb_sphi_f:gcacatgcatgcaatgtgcctgtcaaatg和arac-trrnb_sali_r:atatacgcgtcgacgaaaggcccagtctttc，從pbad/hisb(invitrogen公司,貨號(hào)：v430-01)擴(kuò)增得到含有pbad啟動(dòng)子、酶切位點(diǎn)和終止子的dna片段，將該dna片段命名為arac-trrnb。分別用sphi和sali雙酶切ori-aada和arac-trrnb，將ori-aada雙酶切得到的大片段和arac-trrnb雙酶切得到的大片段連接，得到重組載體pyb1s。

將重組載體pyb1s的bglⅱ和ecori識(shí)別序列間的dna片段替換為序列表中序列1所示的dna分子(即p4hgp基因)，得到重組載體pyb1s-p4hgp(圖1)。重組載體pyb1s-p4hgp表達(dá)序列2所示的p4h。

將重組載體pyb1s的bglⅱ和ecori識(shí)別序列間的dna片段替換為序列表中序列3所示的dna分子(即p4hm基因，p4hm基因?yàn)閷4h基因根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性進(jìn)行優(yōu)化得到的基因，編碼序列2所示的p4h)，得到重組載體pyb1s-p4hm。重組載體pyb1s-p4hm表達(dá)序列2所示的p4h。

將重組載體pyb1s的bglⅱ和ecori識(shí)別序列間的dna片段替換為p4h基因(genbank:d78338.1)，得到重組載體pyb1s-p4h。重組載體pyb1s-p4h表達(dá)序列2所示的p4h。

將重組載體pyb1s-p4hgp導(dǎo)入大腸桿菌bw25113中，得到重組菌，將該重組菌命名為pyb1s-p4hgp/bw25113；將重組載體pyb1s-p4hm導(dǎo)入大腸桿菌bw25113中，得到重組菌，將該重組菌命名為pyb1s-p4hm/bw25113；將重組載體pyb1s-p4h導(dǎo)入大腸桿菌bw25113中，得到重組菌，將該重組菌命名為pyb1s-p4h/bw25113；將重組載體pyb1s導(dǎo)入大腸桿菌bw25113中，得到重組菌，將該重組菌命名為pyb1s/bw25113。

2、目的蛋白的檢測(cè)

將步驟1的pyb1s-p4hgp/bw25113接種于lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm培養(yǎng)10h。按照1％的接種量接種于5052自誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，于30℃，220rpm培養(yǎng)16h-20h。4℃，4200rpm離心10min，分別收集pyb1s-p4hgp/bw25113菌體。

按照上述方法，將pyb1s-p4hgp/bw25113分別替換為pyb1s-p4hm/bw25113、pyb1s-p4h/bw25113和pyb1s/bw25113，其他步驟均不變，分別得到pyb1s-p4hm/bw25113菌體、pyb1s-p4h/bw25113菌體與pyb1s/bw25113菌體。

對(duì)上述各菌體進(jìn)行超聲，破碎細(xì)胞，并將超聲產(chǎn)物在10000×g下進(jìn)行離心，將得到的上清液與沉淀分別進(jìn)行sds-page電泳分析，pyb1s/bw25113、pyb1s-p4h/bw25113、 pyb1s-p4hm/bw25113與pyb1s-p4hgp/bw25113結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，pyb1s/bw25113不表達(dá)p4h蛋白質(zhì)，pyb1s-p4h/bw25113表達(dá)較少量的p4h蛋白質(zhì)，pyb1s-p4hm/bw25113與pyb1s-p4hgp/bw25113中有較多的p4h蛋白質(zhì)的表達(dá)；在pyb1s-p4h/bw25113與pyb1s-p4hm/bw25113的上清液和沉淀中均含有p4h蛋白質(zhì)，pyb1s-p4hgp/bw25113的沉淀中的p4h蛋白質(zhì)明顯少于pyb1s-p4h/bw25113與pyb1s-p4hm/bw25113沉淀中的p4h蛋白質(zhì)。圖2中，圖a為上清液的結(jié)果，圖b為超聲沉淀的結(jié)果，泳道m(xù)均為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1均為pyb1s/bw25113，泳道2均為pyb1s-p4h/bw25113，泳道3均為pyb1s-p4hm/bw25113,泳道4均為pyb1s-p4hgp/bw25113；箭頭所示為p4h蛋白質(zhì)。

3、全細(xì)胞催化生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸

實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，將步驟2得到的pyb1s-p4hgp/bw25113菌體用質(zhì)量百分濃度為0.85％氯化鈉水溶液洗滌2次，4℃，4200rpm離心10min，得到洗滌后的菌體；將洗滌后的菌體按30od/ml的濃度(該od值為在600nm下的吸光值，以轉(zhuǎn)化液為空白對(duì)照)，重懸于轉(zhuǎn)化液中，在30℃、250rpm下轉(zhuǎn)化12h，以l-脯氨酸為底物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)反式-4-羥基-l-脯氨酸，得到pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物。其中，轉(zhuǎn)化液由溶劑和溶質(zhì)組成，溶劑為水，溶質(zhì)及其濃度分別為：100mmtris、100mml-脯氨酸、4mmfeso4和8mm維生素c，用hcl調(diào)ph至7.0。用氯胺t法測(cè)定pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸的含量。

按照上述方法，將pyb1s-p4hgp/bw25113菌體分別替換為pyb1s-p4hm/bw25113菌體、pyb1s-p4h/bw25113菌體和pyb1s/bw25113菌體，其他步驟均不變，分別得到pyb1s-p4hm/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物、pyb1s-p4h/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物和pyb1s/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物。

按照如下氯胺t法測(cè)定各反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸含量：

(1)將樣品按照一定比例稀釋后，取100μl于2ml離心管中，向離心管中加入200μl異丙醇和100μl氧化劑溶液(氧化劑溶液為將7％(質(zhì)量百分比濃度)氯胺t水溶液與醋酸-檸檬酸緩沖液(ph6.0)按照1:4的體積比混合得到的溶液，其中，醋酸-檸檬酸緩沖液(ph6.0)由水與溶質(zhì)組成，溶質(zhì)及其濃度分別為34.4g/l無水醋酸鈉、37.5g/l二水合檸檬酸鈉、5.5g/l一水合檸檬酸和385ml/l異丙醇)。

(2)搖勻，室溫放置4分鐘；向離心管中加入200μl新配制的艾氏試劑(艾氏試劑由對(duì)二甲氨基苯甲醛、高氯酸與異丙醇組成，艾氏試劑中各物質(zhì)的比例關(guān)系為：二甲氨基苯甲醛：高氯酸：異丙醇＝1mg：4ml：6ml)，搖勻，置于60℃水浴中20分鐘，自來水冷卻至室溫；于560nm處檢測(cè)吸光值。

按照如上步驟(1)和(2)的方法以反式-4-羥基-l-脯氨酸(阿拉丁公司，產(chǎn)品 編號(hào)h111005)為標(biāo)準(zhǔn)品制備hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線，hyp標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝5.6665x，r²＝0.9996。

結(jié)果(圖3)顯示，pyb1s/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中無反式-4-羥基-l-脯氨酸，pyb1s-p4h/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中含有少量的反式-4-羥基-l-脯氨酸，pyb1s-p4hm/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物與pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸的量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于pyb1s-p4h/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸的量，pyb1s-p4h/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸平均為7.25mmpyb1s-p4hm/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸平均為29mm，而pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸平均達(dá)34.7mm，與pyb1s-p4h/bw25113和pyb1s-p4hm/bw25113相比，pyb1s-p4hgp/bw25113反應(yīng)產(chǎn)物中反式-4-羥基-l-脯氨酸的分別產(chǎn)量提高了378.6％和19.7％。