本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種可用于肝癌篩查的多基因檢測方法，為肝癌的早期篩查提供了一種新的方法。
背景技術(shù)：
肝癌（livercancer）即肝臟惡性腫瘤，是死亡率僅次于胃癌、食道癌的第三大常見惡性腫瘤。肝癌起病常隱匿，多在肝病隨訪中或體檢普查中應(yīng)用afp及b型超檢查偶然發(fā)現(xiàn)肝癌，此時(shí)病人既無癥狀，體格檢查亦缺乏腫瘤本身的體征，此期稱之為亞臨床期。肝癌從第一個(gè)癌細(xì)胞形成發(fā)展到有自覺癥狀，大約需要2年時(shí)間，在此期間，病人可無任何癥狀或體征，少數(shù)病人會出現(xiàn)一些早期癥狀。包括：食欲減退，上腹悶脹、乏力等，有些病人可能輕度肝腫大。肝癌一旦出現(xiàn)癥狀而來就診者其病程大多已進(jìn)入中晚期，肝癌的典型癥狀和體征一般出現(xiàn)于中晚期。中晚期癥狀主要有肝痛、乏力、消瘦、黃疸、腹水等。臨床上一般采取西醫(yī)的手術(shù)、放化療與中藥結(jié)合療法，但晚期患者因癌細(xì)胞擴(kuò)散而治愈率較低，因此做到肝癌的早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)、早期治療具有非常重要的意義。
實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timert-pcr）是一種在dna擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（pcr）循環(huán)后產(chǎn)物總量，通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定dna序列進(jìn)行定量分析的方法。在pcr擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對pcr進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。由于在pcr擴(kuò)增的指數(shù)時(shí)期，模板的ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。
本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，建立了一種基于多基因檢測的肝癌篩查方法，為肝癌的早期篩查提供了一種新的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-timert-pcr）技術(shù)，通過檢測p53和beta-catenin基因的突變情況，篩選被測人員患肝癌的可能性。我們研究發(fā)現(xiàn)約有60%的肝癌患者中p53基因的249號密碼子發(fā)生突變，從agg突變到agt，即由精氨酸突變到絲氨酸。通過對p53-249ser的檢測可以進(jìn)行肝癌的篩選。我們設(shè)計(jì)的針對p53-249ser檢測的特異性的引物如下：
p53mu-def:5’aggagaatggcgtgaacctg3’
p53mu-der:5’gccacaggttaagaggtccc3’
tm=60℃,pcr產(chǎn)物長度：488bp，擴(kuò)增模板類型：dna
同時(shí)，我們研究發(fā)現(xiàn)beta-catenin基因，在肝癌患者中也常發(fā)生突變，該基因在33、37、41和45號密碼子分別由絲氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、絲氨酸均突變成纈氨酸。我們也針對性的設(shè)計(jì)了特異性的引物如下：
beta-cateninmu-def:5’gatggagttggacatggcca3’
beta-cateninmu-der:5’cagggaacatagcagctcgt3’
tm=60℃,pcr產(chǎn)物長度：4881bp，擴(kuò)增模板類型：dna
本發(fā)明通過檢測被測者血清中p53和beta-catenin基因的部分密碼子的突變情況，進(jìn)行肝癌的篩查。
具體實(shí)施步驟如下：
步驟一：對待測者進(jìn)行抽血，獲得200ul以上的血清樣本。
步驟二：對血清樣本進(jìn)行p53基因第249號密碼子，beta-catenin基因第33、37、41和45號密碼子的rt-pcr檢測。
步驟三：對每個(gè)密碼子的突變情況進(jìn)行檢測和分析。
步驟四：p53基因的第249號密碼子突變?yōu)榻z氨酸的，被測者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，需要進(jìn)行進(jìn)一步檢查確認(rèn)是否患肝癌。
步驟五：beta-catenin基因第33、37、41和45號密碼子，其中三個(gè)以上突變?yōu)槔i氨酸的，被測者患肝癌的風(fēng)險(xiǎn)較高，需要進(jìn)行進(jìn)一步檢查確認(rèn)是否患肝癌。
以上是對本發(fā)明的描述而非限定，基于本發(fā)明思想的其它實(shí)施方式，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。