本發(fā)明涉及生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種cas9/rna系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由于化石燃料的不可再生，以及燃燒化石燃料釋放的co2造成的溫室效應(yīng)的影響，發(fā)展可靠，環(huán)境友好，經(jīng)濟(jì)可行的替代能源已經(jīng)成為我國(guó)以及世界的一項(xiàng)重要的任務(wù)。生物燃油是一種對(duì)現(xiàn)用汽油的極具吸引力的替代品?，F(xiàn)在的可再生液體燃料主要用食物為原料進(jìn)行生產(chǎn)的。現(xiàn)在的生物燃料包括從油脂農(nóng)作物(例如：大豆、棕櫚樹、動(dòng)物脂肪、地溝油)中提取的生物柴油、生物乙醇和其它的提取自甘蔗和谷類的醇類、h2、長(zhǎng)鏈的烴和沼氣(scottetal.,2010)。生產(chǎn)以農(nóng)作物為來源的生物燃料需要大量的可耕種土地，這會(huì)和種植可食用農(nóng)作物競(jìng)爭(zhēng)土地，導(dǎo)致了一個(gè)“食物vs燃料”的矛盾。最近，高產(chǎn)油微藻被認(rèn)為是一種可以生產(chǎn)用于運(yùn)輸?shù)母哔|(zhì)量汽油的有前途的可再生原料(beeretal.,2009；chisti,2007)。

理想的微藻生物燃料藻株應(yīng)該可以快速生長(zhǎng)，高生物量，高油脂含量，容易收集，抗病性強(qiáng)。雖然已知的微藻種類多余500,000，但是直到現(xiàn)在，也僅有有限的幾種微藻被認(rèn)為是潛在的生物能源生產(chǎn)藻株，但是沒有被認(rèn)為是理想的。為獲得經(jīng)濟(jì)可行的工業(yè)生物能源微藻，對(duì)微藻的馴化和基因工程改造是必須的。

基因工程是了解和改造微藻油脂生物合成過程中關(guān)鍵的工具。隨機(jī)插入(rochaixandvandillewijn,1982)，同源重組(nelsonandlefebvre,1995)，rnai(schrodaetal.,1999)，鋅指核酸內(nèi)切酶(schrodaetal.,1999)，talen技術(shù)(daboussietal.,2014)等已經(jīng)被運(yùn)用到了微藻的基因工程改造。crispr/cas9系統(tǒng)是最近在細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的一種rna介導(dǎo)的控制病毒入侵和消除質(zhì)粒的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。從2013年起，cas9/grna系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于特定的基因組改造中。cas9/grna系統(tǒng)僅需要對(duì)rna進(jìn)行替換便可對(duì)新的基因位點(diǎn)進(jìn)行敲除，因此，與鋅指核酸酶和talens技術(shù)相比，cas9/grna系統(tǒng)更容易被編輯。此外，cas9/grna系統(tǒng)還可以通過對(duì)基因組雙鏈的打斷提高同源重組效率，但未見在宿主體內(nèi)可以持續(xù)表達(dá)cas9/grna，并對(duì)宿主進(jìn)行傳代連續(xù)敲除的報(bào)道。

同時(shí)，近幾年對(duì)于被歸類為眼點(diǎn)藻綱，不等鞭毛門(不等鞭毛們還包含褐藻和硅藻)的海洋微擬球藻(nannochloropsissp.)的研究逐步提升，不等鞭毛們還包含褐藻和硅藻。而這種藻株的油脂組成和油脂含量都已經(jīng)被研究過(danielewiczetal.,2011；schneiderandroessler,1994；sukenikandcarmeli,1990；tononetal.,2002)。此外，微擬球藻在不同條件下的生長(zhǎng)狀態(tài)在最近幾年被迅速研究(huandgao,2003；rodolfietal.,2009；srinivasandochs,2012；xuetal.,2004)。而且，nannochloropsisoceanica(pidkowichetal.,2007；wangetal.,2014)和nannochloropsisgaditana(radakovitsetal.,2012)的基因組已經(jīng)被幾個(gè)研究小組測(cè)序，而且在世界范圍內(nèi)，微擬球藻已經(jīng)變成了研究基于co2的油脂生產(chǎn)的新的模式藻株。

但是，采用cas9/grna系統(tǒng)對(duì)藻株進(jìn)行基因改造并未有相關(guān)報(bào)道，因此其具有潛在經(jīng)濟(jì)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種cas9/rna系統(tǒng)及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種cas9/rna系統(tǒng)，cas9/rna系統(tǒng)為篩選標(biāo)記、cas9蛋白基因和rna的編碼dna；其中，cas9蛋白基因?yàn)椋壕幋a與rna結(jié)合并對(duì)目的基因進(jìn)行敲除的蛋白質(zhì)基因；rna的編碼dna為能夠指導(dǎo)cas9蛋白進(jìn)行基因切割的rna的編碼dna。

一種cas9/rna系統(tǒng)，其特征在于：cas9/rna系統(tǒng)為篩選標(biāo)記、cas9蛋白基因和rna的編碼dna；其中，cas9蛋白基因?yàn)椋壕幋a與rna結(jié)合并對(duì)目的基因進(jìn)行敲除的蛋白質(zhì)基因；rna的編碼dna為能夠指導(dǎo)cas9蛋白進(jìn)行基因切割的rna的編碼dna，所述cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。

所述篩選標(biāo)記的抗性基因?yàn)槌泵顾乜剐曰鵫yg等敏感基因。

優(yōu)選，所述cas9蛋白基因?yàn)榻?jīng)過密碼子優(yōu)化并能完整編碼的cas9蛋白的基因；rna的編碼dna為一條或者兩條能與cas9蛋白結(jié)合構(gòu)成二級(jí)結(jié)構(gòu)，并指導(dǎo)cas9蛋白對(duì)目的位置或隨機(jī)目的位置剪切的rna的編碼dna。

進(jìn)一步優(yōu)選，所述cas9蛋白基因?yàn)獒勀撴溓蚓腸as9蛋白基因；樸氏菌屬，弗朗西斯氏菌屬的cpf1蛋白基因或已知的任何一種cas9蛋白等；

所述rna的編碼dna為grna的編碼dna。

更進(jìn)一步優(yōu)選，所述cas9蛋白基因?yàn)榻?jīng)過密碼子優(yōu)化并能完整編碼的釀膿鏈球菌的cas9蛋白基因；弗朗西斯氏菌屬的cpf1蛋白基因等。所述cas9的蛋白的核苷酸序列為seqno:1所示，同時(shí)其氨基酸序列如seqno:3所示。

所述rna的編碼dna為帶有可以形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的grna的編碼dna并在其5，端修飾帶有15-25個(gè)堿基序列。

更進(jìn)一步優(yōu)選，所述cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。

cas9/rna系統(tǒng)的應(yīng)用，所述cas9/rna系統(tǒng)在原核、真核或病毒的定點(diǎn)基因或隨機(jī)基因改造中的應(yīng)用。

所述cas9/rna系統(tǒng)在制備目的基因被敲除的原核、真核或病毒定點(diǎn)或隨機(jī)突變中的應(yīng)用。

所述cas9/rna系統(tǒng)在制備目的基因被敲除的原核、真核或病毒定點(diǎn)連續(xù)或隨機(jī)連續(xù)突變中的應(yīng)用。

一種基于cas9/rna系統(tǒng)的載體，載體為所述cas9/rna系統(tǒng)插入骨架載體的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，得到載體。

所述骨架載體為分別適用于原核、真核或病毒的載體。

一種基于cas9/rna系統(tǒng)的載體的應(yīng)用，所述載體在原核、真核或病毒的定點(diǎn)基因或隨機(jī)基因改造中的應(yīng)用。

所述載體在在制備目的基因被敲除的原核、真核或病毒定點(diǎn)連續(xù)或隨機(jī)連續(xù)突變中的應(yīng)用。

一種藻類基因改造的方法，將所述cas9/rna系統(tǒng)或載體導(dǎo)入藻株中，使系統(tǒng)中cas9蛋白在rna的指導(dǎo)下，對(duì)藻株中核酸序列的待敲除目的基因位點(diǎn)或隨機(jī)位點(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切后的核酸序列自我修復(fù)過程中實(shí)現(xiàn)目的位點(diǎn)突變或隨機(jī)位點(diǎn)突變，而后通過npcr/re-ngs聯(lián)合方式確定突變株；

或，酶切后的核酸序列自我修復(fù)，進(jìn)行目的位點(diǎn)或隨機(jī)位點(diǎn)突變，而后隨著藻株細(xì)胞傳代培養(yǎng)過程中，實(shí)現(xiàn)目的位點(diǎn)或隨機(jī)位點(diǎn)的連續(xù)不斷突變，而后通過npcr/re-ngs聯(lián)合方式確定突變株。

具體，將人工合成同時(shí)表達(dá)微擬球藻密碼子優(yōu)化后cas9蛋白，grna和微擬球藻抗性基因的載體，將載體以電擊方法導(dǎo)入微擬球藻，通過npcr/re-ngs聯(lián)合使用的方法鑒定有無突變產(chǎn)生，再進(jìn)一步篩選單克隆確定突變株；在確定突變株后藻株繼續(xù)生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)狀態(tài)下可實(shí)現(xiàn)該位點(diǎn)的連續(xù)不斷突變。

所述轉(zhuǎn)化方法為電擊轉(zhuǎn)化，還可以為任何已知的轉(zhuǎn)化方法。所述微擬球藻，還可以是已知的任何藻類、植物、哺乳動(dòng)物或農(nóng)作物。所述鑒定方法是npcr/re-ngs鑒定方法，還可以是已知的任何鑒定方法。所述擴(kuò)增目的基因的方法是npcr法，還可以是已知的任何的pcr方法。所述的敲除的目的基因可以為任何一段或幾段微擬球藻藻dna序列。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明運(yùn)用cas9/crispr定點(diǎn)進(jìn)行基因改造的方法。在微擬球藻中過表達(dá)的cas9蛋白和rna組成復(fù)合物，cas9蛋白在rna的指導(dǎo)下定點(diǎn)切割基因組雙鏈dna，進(jìn)而引發(fā)基因突變，可以極大的提高微擬球藻的藻種改良效率；而后再利用npcr/re-ngs鑒定方法可以有效的鑒定cas9/grna產(chǎn)生的低頻突變，從而最終鑒定突變株。

本發(fā)明建立的微擬球藻的cas9/grna系統(tǒng)對(duì)微擬球藻進(jìn)行代謝工程改造，進(jìn)而加強(qiáng)油脂合成。同時(shí)將本發(fā)明cas9/grna系統(tǒng)作用與其它作物上也可以大大加速農(nóng)作物育種的過程，作用于其它生物上可以大大加速生物的育種速度。

附圖說明

圖1a為本發(fā)明獲得的以潮霉素基因?yàn)楹Y選標(biāo)記的cas9/grna系統(tǒng)表達(dá)載體物理圖譜。

圖1b為本發(fā)明實(shí)施例提供的采用圖1acas9/grna系統(tǒng)表達(dá)載體對(duì)硝酸還原酶敲除位點(diǎn)圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的cas9蛋白和異源表達(dá)rna在微擬球藻中轉(zhuǎn)錄水平鑒定；其中，a為cas9蛋白在微擬球藻中轉(zhuǎn)錄水平鑒定；b為grna在微擬球藻中轉(zhuǎn)錄水平鑒定。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例提供的npcr/re-ngs方法篩選轉(zhuǎn)化株電泳檢測(cè)結(jié)果；其中，a為提取庫基因組dna酶切，npcr后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果；b為提取庫基因組dnanpcr后，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果。

圖4為本發(fā)明實(shí)施例提供的npcr/re-ngs方法高通量測(cè)序結(jié)果圖；其中，a為突變株提取基因組后進(jìn)行npcr，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，電泳檢測(cè)結(jié)果；b為突變株突變位點(diǎn)的5bp缺失突變；c為突變株突變位點(diǎn)的5bp缺失突變測(cè)序結(jié)果。

圖5為本發(fā)明實(shí)施例提供的突變株的表型鑒定圖，其中，a為野生型和突變株在硝酸鈉培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線；b為野生型和突變株在氯化銨培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)曲線；c為野生型和突變株在硝酸鈉和氯化銨培養(yǎng)基中培養(yǎng)10天后的濾膜過濾圖片。

表2a為本發(fā)明實(shí)施例提供的提取庫基因組dna酶切，npcr，對(duì)5號(hào)庫npcr產(chǎn)物送高通量測(cè)序后突變統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

表2b為本發(fā)明實(shí)施例提供的提取庫基因組dna進(jìn)行npcr，對(duì)5號(hào)庫npcr產(chǎn)物送高通量測(cè)序后突變統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施案例對(duì)本發(fā)明的方法及該方法所達(dá)到的效果做進(jìn)一步說明。

本發(fā)明獲得突變株的方法，是指利用電擊方法將含有本發(fā)明的cas9/grna系統(tǒng)導(dǎo)入藻株,通過cas9/grna系統(tǒng)的cas9蛋白在異源表達(dá)rna的指導(dǎo)下將目的基因定點(diǎn)敲除，實(shí)驗(yàn)中只要通過替換異源表達(dá)rna的用來識(shí)別靶序列的序列便可以實(shí)現(xiàn)對(duì)不同位點(diǎn)的敲除，而后通過npcr/re-ngs聯(lián)合方式確定突變株。所述目的基因硝酸還原酶基因?qū)嵤├簩?shí)現(xiàn)硝酸還原酶基因在微擬球藻中的定點(diǎn)敲除

cas9/rna系統(tǒng)為篩選標(biāo)記、cas9蛋白基因和grna的編碼dna；其中，cas9蛋白基因?yàn)椋航?jīng)過密碼子優(yōu)化并能完整編碼的釀膿鏈球菌的cas9蛋白基因；grna的編碼dna為可以形成一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并與cas9蛋白結(jié)合的rna序列其5`端帶有cagagcaagggcttcagctg的堿基序列(參見圖1b)；篩選標(biāo)記為潮霉素抗性基因。

利用所述cas9/grna系統(tǒng)在微擬球藻的硝酸還原酶基因改造中的應(yīng)用。

具體是，采用上述cas9/rna系統(tǒng)在制備目的基因被敲除的藻突變株的方法，將上述cas9/rna系統(tǒng)導(dǎo)入待敲除目的基因的藻株中，使系統(tǒng)中cas9蛋白在rna的指導(dǎo)下，對(duì)藻株中核酸序列的待敲除目的基因位點(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切后的核酸序列自我修復(fù)過程中實(shí)現(xiàn)目的位點(diǎn)突變，而后通過npcr/re-ngs聯(lián)合方式確定突變株。

具體是，

(1)將上述cas9蛋白，潮霉素，grna的編碼dna通過現(xiàn)有公知技術(shù)分別在不同的啟動(dòng)子下游分別表達(dá)，而后通過人工dna合成方法合成(參見圖1a)；其中，cas9的核苷酸序列如seqno:1所示。cas9/rna的核苷酸序列如seqno:2所示。cas9蛋白后連接有ha標(biāo)簽，核定位信號(hào)(nls)，由黃質(zhì)/葉綠體a結(jié)合蛋白(g2383)啟動(dòng)子(pvcp)啟動(dòng),α-微管蛋白(g5608)終止子終止(tatub)。sgrna基因由v型atpase(g335)啟動(dòng)子(patpase)啟動(dòng)，鐵氧還原蛋白(g2604)終止子(tfd)終止，潮霉素抗性基因由β-微管蛋白(g1388)啟動(dòng)子(pbtub)啟動(dòng)，黃質(zhì)/葉綠體a結(jié)合蛋白(g2383)終止子(tvcp)終止。pvcp：1-616；微擬球藻密碼子優(yōu)化后的cas9序列：623-4729；ha標(biāo)簽：4730-4756；sv40nls：4775-4795；sv40nls：4802-4822；核質(zhì)蛋白nls：4838-4885；tatub：4895-5513；pbtub：5562-5979；hygr：5980-6996；tvcp：7003-7483；patpase：7490-7654；硝酸還原酶grna：7655-7757；tfd：7758-8031；載體骨架：8032-12086。

(2)載體的cassette的構(gòu)建

將構(gòu)建好的載體利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有cas9蛋白，潮霉素，grna的線性化載體的pcr產(chǎn)物，pcr產(chǎn)物按照常規(guī)方式進(jìn)行cyclepure純化，制作用于轉(zhuǎn)化的cassette。

(3)電穿孔方法將cassette導(dǎo)入微擬球藻中并挑選單克隆

在轉(zhuǎn)化前1h，取濃度為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，6000g離心，棄上清，漂洗，取100ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，5000g離心5min，棄上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重懸藻體。將濃縮藻液分裝為200μl的小份，每份加入3μg線性化載體和1μl變性處理的鮭魚精dna(15μg/ml)，混勻后冰置10min。將混合物轉(zhuǎn)移入2mm電擊杯，以2200v(hv)，50μf進(jìn)行電擊，電擊后立即將藻體轉(zhuǎn)移入5ml新鮮f/2培養(yǎng)基。25℃搖床中100rpm，弱光復(fù)蘇48h。細(xì)胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作為唯一氮源的f/2固體平板，培養(yǎng)25天之后，挑100個(gè)單克隆放到一個(gè)三角瓶中作為一個(gè)庫，重復(fù)挑10個(gè)三角瓶，建立10個(gè)庫，共計(jì)1000個(gè)轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)14天。用植物組織提取試劑盒(omega)提取各個(gè)庫的dna，-20℃保存。對(duì)轉(zhuǎn)化后的微擬球藻根據(jù)trizol說明書提取rna，并利用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說明書反轉(zhuǎn)錄rna后，進(jìn)行pcr鑒定。如圖2所示，cas9(a)和grna(b)在轉(zhuǎn)化株中被成功表達(dá)。

(4)npcr/re-ngs方法篩選轉(zhuǎn)化株

設(shè)計(jì)擴(kuò)增硝酸還原酶敲除位點(diǎn)上下游序列npcr引物。cas9切割位置為酶切位點(diǎn)。對(duì)提取的基因組一部分進(jìn)行酶切，同時(shí)也以未酶切的基因組為模板分別進(jìn)行npcr擴(kuò)增，分別對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次酶切鑒定，對(duì)有未切開條帶的npcr產(chǎn)物高通量測(cè)序；具體

首先，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物(參見下表1)。其次，取部分提取的各個(gè)庫的基因組dna和野生型基因組dna，對(duì)靶序列位置進(jìn)行限制性內(nèi)切酶(pvuii)酶切。再次，分別以酶切后基因組dna和未酶切的基因組dna為模板進(jìn)行npcr擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物大小395bp)。最后，對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖3)。如圖3中a所示，對(duì)提取的基因組進(jìn)行酶切之后進(jìn)行npcr擴(kuò)增，npcr產(chǎn)物酶切，在5號(hào)瓶有明顯的未酶切條帶。b所示，對(duì)提取的基因組進(jìn)行npcr擴(kuò)增之后，用pvuii酶切，同樣在5號(hào)瓶所處有微弱的未酶切條帶。兩次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都說明5號(hào)瓶中有突變產(chǎn)生。取擴(kuò)增產(chǎn)物不能被完全切開的npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ngs測(cè)序，鑒定有何種突變產(chǎn)生。高通量測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)在酶切位點(diǎn)處有未切開的5bp和12bp缺失突變(表2)。5bp突變概率為1.22％，而12bp突變概率為0.04％，推測(cè)5bp突變株為挑單克隆時(shí)已經(jīng)發(fā)生突變的轉(zhuǎn)化株，而12bp突變株為在傳代過程中發(fā)生突變的轉(zhuǎn)化株，因此其突變概率遠(yuǎn)小于1％。對(duì)5號(hào)瓶轉(zhuǎn)化株涂平板進(jìn)行培養(yǎng)，之后挑取300個(gè)轉(zhuǎn)化株分別進(jìn)行液體培養(yǎng)。提取轉(zhuǎn)化株基因組dna，npcr擴(kuò)增，酶切鑒定，對(duì)無法酶切的npcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得硝酸還原酶基因5bp缺失的突變株(圖4)。圖4中a為對(duì)突變株進(jìn)行npcr擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行pvuii酶切，擴(kuò)增產(chǎn)物不能被pvuii酶切，證明有突變產(chǎn)生，對(duì)npcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示在酶切位點(diǎn)處有5bp缺失突變產(chǎn)生(圖4中b和c)。

表1敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物

表2a突變體庫dna被pvuii酶切后的npcr擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果

表2b突變體庫dnanpcr擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果

五、突變株表型鑒定

野生型和突變株分別在以nano3或nh4cl為唯一氮源的f/2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化株被培養(yǎng)在含50mlf/2培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，測(cè)量od75010天(圖5)。從圖中看，野生型可以在nano3和nh4cl培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。然而，突變株只能在nh4cl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，說明，突變株的硝酸還原酶基因突變，cas9/grna系統(tǒng)成功將微擬球藻中硝酸還原酶基因敲除。

實(shí)施例2

實(shí)現(xiàn)硫酯酶g9763在微擬球藻中的定點(diǎn)敲除

cas9/rna系統(tǒng)為篩選標(biāo)記、cas9蛋白基因和grna的編碼dna；其中，cas9蛋白基因?yàn)椋航?jīng)過密碼子優(yōu)化并能完整編碼的釀膿鏈球菌的cas9蛋白基因；grna的編碼dna為可以形成一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并與cas9蛋白結(jié)合的rna序列其的5`端帶有tcgaacggaaagtgtgtggg的堿基序列；篩選標(biāo)記為潮霉素抗性基因。

(2)載體的cassette的構(gòu)建

將構(gòu)建好的載體利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有cas9蛋白，潮霉素，grna的線性化載體的pcr產(chǎn)物，pcr產(chǎn)物按照常規(guī)方式進(jìn)行cyclepure純化，制作用于轉(zhuǎn)化的cassette。

(3)電穿孔方法將cassette導(dǎo)入微擬球藻中并挑選單克隆

在轉(zhuǎn)化前1h，取濃度為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，6000g離心，棄上清，漂洗，取100ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，5000g離心5min，棄上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重懸藻體。將濃縮藻液分裝為200μl的小份，每份加入3μg線性化載體和1μl變性處理的鮭魚精dna(15μg/ml)，混勻后冰置10min。將混合物轉(zhuǎn)移入2mm電擊杯，以2200v(hv)，50μf進(jìn)行電擊，電擊后立即將藻體轉(zhuǎn)移入5ml新鮮f/2培養(yǎng)基。25℃搖床中100rpm，弱光復(fù)蘇48h。細(xì)胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作為唯一氮源的f/2固體平板，培養(yǎng)25天之后，挑100個(gè)單克隆放到一個(gè)三角瓶中作為一個(gè)庫，重復(fù)挑10個(gè)三角瓶，建立10個(gè)庫，共計(jì)1000個(gè)轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)14天。用植物組織提取試劑盒(omega)提取各個(gè)庫的dna，-20℃保存。對(duì)轉(zhuǎn)化后的微擬球藻根據(jù)trizol說明書提取rna，并利用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說明書反轉(zhuǎn)錄rna后，進(jìn)行pcr鑒定。如圖2所示，cas9(a)和grna(b)在轉(zhuǎn)化株中被成功表達(dá)。

(4)npcr/re-ngs方法篩選轉(zhuǎn)化株

設(shè)計(jì)擴(kuò)增硝酸還原酶敲除位點(diǎn)上下游序列npcr引物。靶序列位置有酶切位點(diǎn)。對(duì)提取的基因組一部分進(jìn)行酶切，同時(shí)也以未酶切的基因組為模板分別進(jìn)行npcr擴(kuò)增，分別對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次酶切鑒定，對(duì)有未切開條帶的npcr產(chǎn)物高通量測(cè)序；具體

首先，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物(參見下表1)。其次，取部分提取的各個(gè)庫的基因組dna和野生型基因組dna，對(duì)靶序列位置進(jìn)行限制性內(nèi)切酶(pvuii)酶切。再次，分別以酶切后基因組dna和未酶切的基因組dna為模板進(jìn)行npcr擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物大小395bp)。最后，對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取擴(kuò)增產(chǎn)物不能被完全切開的npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ngs測(cè)序。鑒定是否有突變產(chǎn)生。涂平板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)。提取基因組dna，npcr擴(kuò)增，酶切鑒定，對(duì)無法酶切的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得轉(zhuǎn)化株(圖3)。由圖3結(jié)果顯示，5號(hào)瓶npcr產(chǎn)物有沒有酶切開的npcr產(chǎn)物，對(duì)5號(hào)瓶?jī)煞Nnpcr產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)在酶切位點(diǎn)處有未切開的5bp和12bp缺失突變。

表1敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物

五、突變株表型鑒定

野生型和突變株分別在以nano3或nh4cl為唯一氮源的f/2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化株被培養(yǎng)在含50mlf/2培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，測(cè)量od75010天(圖5)

實(shí)施例3

實(shí)現(xiàn)硫酯酶g9763在微擬球藻中的定點(diǎn)敲除

cas9/rna系統(tǒng)為篩選標(biāo)記、cas9蛋白基因和grna的編碼dna；其中，cas9蛋白基因?yàn)椋航?jīng)過密碼子優(yōu)化并能完整編碼的釀膿鏈球菌的cas9蛋白基因；grna的編碼dna為可以形成一定莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并與cas9蛋白結(jié)合的rna序列其的5`端帶有aattgggatttgaagacgg的堿基序列；篩選標(biāo)記為潮霉素抗性基因。

將構(gòu)建好的載體利用pcr引物f:5-aaggcgattaagttgggta-3和r:5-tggcacgacaggtttcc-3進(jìn)行擴(kuò)增，獲得帶有cas9蛋白，潮霉素，grna的線性化載體的pcr產(chǎn)物，pcr產(chǎn)物按照常規(guī)方式進(jìn)行cyclepure純化，制作用于轉(zhuǎn)化的cassette。

(3)電穿孔方法將cassette導(dǎo)入微擬球藻中并挑選單克隆

在轉(zhuǎn)化前1h，取濃度為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，6000g離心，棄上清，漂洗，取100ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的微擬球藻藻液，5000g離心5min，棄上清，375mm洗2次，最后用2ml山梨醇重懸藻體。將濃縮藻液分裝為200μl的小份，每份加入3μg線性化載體和1μl變性處理的鮭魚精dna(15μg/ml)，混勻后冰置10min。將混合物轉(zhuǎn)移入2mm電擊杯，以2200v(hv)，50μf進(jìn)行電擊，電擊后立即將藻體轉(zhuǎn)移入5ml新鮮f/2培養(yǎng)基。25℃搖床中100rpm，弱光復(fù)蘇48h。細(xì)胞被涂布到含潮霉素(300μg/ml)以nh4cl作為唯一氮源的f/2固體平板，培養(yǎng)25天之后，挑100個(gè)單克隆放到一個(gè)三角瓶中作為一個(gè)庫，重復(fù)挑10個(gè)三角瓶，建立10個(gè)庫，共計(jì)1000個(gè)轉(zhuǎn)化株，培養(yǎng)14天。用植物組織提取試劑盒(omega)提取各個(gè)庫的dna，-20℃保存。對(duì)轉(zhuǎn)化后的微擬球藻根據(jù)trizol說明書提取rna，并利用takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒根據(jù)說明書反轉(zhuǎn)錄rna后，進(jìn)行pcr鑒定。如圖2所示，cas9(a)和grna(b)在轉(zhuǎn)化株中被成功表達(dá)。

(4)npcr/re-ngs方法篩選轉(zhuǎn)化株

設(shè)計(jì)擴(kuò)增硝酸還原酶敲除位點(diǎn)上下游序列npcr引物。靶序列位置有酶切位點(diǎn)。對(duì)提取的基因組一部分進(jìn)行酶切，同時(shí)也以未酶切的基因組為模板分別進(jìn)行npcr擴(kuò)增，分別對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行再次酶切鑒定，對(duì)有未切開條帶的npcr產(chǎn)物高通量測(cè)序；具體

首先，設(shè)計(jì)可以擴(kuò)增敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物(參見下表1)。其次，取部分提取的各個(gè)庫的基因組dna和野生型基因組dna，對(duì)靶序列位置進(jìn)行限制性內(nèi)切酶(pvuii)酶切。再次，分別以酶切后基因組dna和未酶切的基因組dna為模板進(jìn)行npcr擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物大小395bp)。最后，對(duì)npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取擴(kuò)增產(chǎn)物不能被完全切開的npcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行ngs測(cè)序。鑒定是否有突變產(chǎn)生。涂平板進(jìn)行培養(yǎng)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，挑取單克隆進(jìn)行培養(yǎng)。提取基因組dna，npcr擴(kuò)增，酶切鑒定，對(duì)無法酶切的pcr產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得轉(zhuǎn)化株(圖3，圖4)。圖3結(jié)果顯示，5號(hào)瓶npcr產(chǎn)物有沒有酶切開的npcr產(chǎn)物，對(duì)5號(hào)瓶?jī)煞Nnpcr產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)在酶切位點(diǎn)處有未切開的5bp和12bp缺失突變。

表1敲除位點(diǎn)上下游dna序列的npcr引物

五、突變株表型鑒定

野生型和突變株分別在以nano3或nh4cl為唯一氮源的f/2培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化株被培養(yǎng)在含50mlf/2培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，測(cè)量od75010天(圖5)。

上述記載的seqno:1微擬球藻密碼子優(yōu)化后cas9蛋白核苷酸序列

1atggacaagaagtacagcatcggcctcgacatcggcaccaactctgtcggctgggccgtc

61atcaccgatgagtacaaggtcccctctaagaagttcaaggtcctcggcaacacggaccgc

121cactccatcaagaagaacctcattggcgcactcctcttcgactccggtgagacggcagag

181gccacgcgcctcaagcgtacggcacgccgccgctacacgcgccgcaagaaccgcatctgc

241tacctccaggagatcttctccaacgagatggccaaggtcgacgactccttcttccaccgc

301ctcgaggagtccttcttggtcgaggaggataagaagcacgagcgccaccccatcttcggt

361aacatcgtcgacgaggtcgcctaccacgagaagtaccccaccatctaccacctccgcaag

421aagctcgtggacagcaccgacaaggccgacctccgcctcatctacctcgccttggcccac

481atgatcaagttccgtggtcacttcctcatcgagggcgatttgaaccccgacaactccgac

541gtcgacaagctcttcatccagctcgtccagacctacaaccagctcttcgaggagaacccc

601atcaacgcgtccggcgtggacgccaaggccatcctctccgcccgcttgtccaagtcccgc

661cgtttggagaacttgatcgcccagctccccggcgagaagaagaacggcctcttcggcaac

721ttgatcgcgctctccctcggcctcacccccaacttcaagtccaacttcgacttggcggag

781gacgccaagctccagctctccaaggacacctacgacgacgacctcgataacctcctcgcc

841cagatcggggaccagtacgcggacctcttcctcgccgccaagaacctctccgacgctatc

901ctcctcagcgacatcctccgtgtgaacaccgagatcaccaaggcccctctcagcgcttct

961atgatcaagcgctacgacgagcaccaccaggacctcacgctcttgaaggccctcgtccgc

1021cagcagttgcctgagaagtacaaggagattttcttcgaccagtccaagaacggctacgcc

1081ggctacatcgatggcggtgcgagccaggaggagttctacaagttcatcaagcccatcctc

1141gagaagatggacggtacggaggagttgctcgtcaagctcaaccgcgaggacttgttgcgc

1201aagcagcgcaccttcgacaacggctccattccccaccagatccacctcggtgagttgcac

1261gccatcctccgtcgccaggaggacttctaccccttcctcaaggacaaccgcgagaagatt

1321gagaagatcctcactttccgcatcccctactacgtgggtcccctcgcgcgcggcaactcc

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1441gtcgtcgacaagggcgcctccgcgcagagcttcatcgagcgcatgaccaacttcgataag

1501aacctccccaacgagaaggtcctccccaagcactccctcctctacgagtacttcaccgtg

1561tacaacgagttgacgaaggtcaagtacgtgactgagggcatgcgcaagcccgctttcttg

1621tccggcgagcagaagaaggccatcgtggacctcctcttcaagaccaaccgcaaggtcacg

1681gtgaagcagttgaaggaggactacttcaagaagattgagtgcttcgactccgtggagatc

1741tctggtgtcgaggaccgcttcaacgcgtccctcgggacttaccacgacctcctcaagatc

1801atcaaggataaggactttctcgacaacgaggagaacgaggacatcctcgaggacatcgtc

1861ttgactctcactctcttcgaggaccgcgagatgatcgaggagcgcctcaagacctacgcg

1921cacctcttcgatgacaaggtcatgaagcagctcaagcgccgtcgctacactggctggggc

1981cgcctctcccgcaagctcatcaacggtatccgtgacaagcagagcgggaagaccatcctc

2041gattttctcaagtccgacggcttcgccaaccgcaacttcatgcagctcattcacgacgac

2101tccctcacgttcaaggaggacatccagaaggcccaggtgtctggccagggtgactccttg

2161cacgagcacatcgctaacctcgccggcagccccgccatcaagaaggggatcctccagacc

2221gttaaggtcgttgacgagttggtgaaggtcatggggcgccacaagcccgagaacatcgtg

2281atcgagatggctcgcgagaaccagaccacccagaagggccagaagaactcccgcgagcgt

2341atgaagcgcattgaggagggcatcaaggagttgggttctcagatcttgaaggagcaccct

2401gtggagaacacccagctccagaacgagaagttgtacctctactacttgcagaacgggcgc

2461gatatgtacgttgatcaggagttggacatcaaccgcctctctgattacgatgtcgaccac

2521atcgttccccagtcctttttgaaggacgattccatcgacaacaaggtcctcactcgctcc

2581gacaagaaccgcggcaagtccgacaacgttccttccgaggaggtggtcaagaagatgaag

2641aactactggcgtcagctcttgaacgcgaagctcatcacccagcgcaagtttgacaacctc

2701acgaaggctgagcgcgggggcctctctgagttggataaggcgggctttatcaagcgtcag

2761ctcgtcgagacccgccagatcaccaagcacgtcgcgcagatcctcgactcccgtatgaac

2821accaagtacgacgagaacgacaagttgatccgcgaggtgaaggttatcacgttgaagtct

2881aagctcgtctccgacttccgtaaggactttcagttctacaaggttcgcgagatcaacaac

2941taccaccacgcacacgacgcgtacttgaacgccgtcgtcggcaccgccctcatcaagaag

3001taccctaagctcgagtccgagttcgtgtacggtgactacaaggtctacgacgtccgtaag

3061atgatcgcaaagagcgagcaggagattggcaaggccaccgctaagtacttcttctactcc

3121aacatcatgaacttcttcaagaccgagattaccctcgctaacggcgagatccgcaagcgc

3181cctctcatcgagacgaacggcgagaccggcgagatcgtgtgggacaagggccgcgacttt

3241gcaaccgttcgcaaggttctctccatgccccaggtgaacattgttaagaagaccgaggtc

3301cagacgggtggcttctccaaggagtccatcttgcccaagcgcaactccgacaagctcatc

3361gcccgcaagaaggattgggaccccaagaagtacggtggcttcgactcccctaccgtggcg

3421tactccgtgctcgtcgtcgcgaaggtggagaagggcaagtccaagaagctcaagtccgtc

3481aaggagttgttgggcatcaccatcatggagcgctcctccttcgagaagaaccccattgac

3541ttcctcgaggcaaagggttacaaggaggtcaagaaggacctcatcattaagctccccaag

3601tactccctctttgagttggagaacggccgtaagcgcatgctcgcctccgccggcgagttg

3661cagaagggtaacgagttggccctcccctccaagtacgtgaactttctctacctcgcttcc

3721cactacgagaagctcaagggctcccccgaggataacgagcagaagcagctctttgtcgag

3781cagcacaagcactacctcgacgagattatcgagcagatctccgagttctccaagcgcgtc

3841atcctcgctgacgcgaacctcgacaaggtcctctccgcttacaacaagcaccgcgacaag

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4081gacttgtcccagttgggcggcgacgcctacccctacgatgtgcctgattacgcttccctc

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4261aagtaa

seqno:2cas9/grna轉(zhuǎn)化cassette的質(zhì)粒核酸全序列(硝酸還原酶基因?yàn)槔?。

1gccaaactctatctacacccttttgacttctgttgtggtcgtagtgtgtgcttgcatgcc

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901cgacgactccttcttccaccgcctcgaggagtccttcttggtcgaggaggataagaagca

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2281caagaccaaccgcaaggtcacggtgaagcagttgaaggaggactacttcaagaagattga

2341gtgcttcgactccgtggagatctctggtgtcgaggaccgcttcaacgcgtccctcgggac

2401ttaccacgacctcctcaagatcatcaaggataaggactttctcgacaacgaggagaacga

2461ggacatcctcgaggacatcgtcttgactctcactctcttcgaggaccgcgagatgatcga

2521ggagcgcctcaagacctacgcgcacctcttcgatgacaaggtcatgaagcagctcaagcg

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3601cggcaccgccctcatcaagaagtaccctaagctcgagtccgagttcgtgtacggtgacta

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seqno:3微擬球藻cas9蛋白序列。

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上述說明近視本發(fā)明技術(shù)方案概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù)手段，而可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，并且為了讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能夠更明顯易懂，以下特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，詳細(xì)說明如下。

sequencelisting

<110>中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過程研究所

<120>一種cas9/rna系統(tǒng)及其應(yīng)用

<130>

<160>1

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>4266

<212>dna

<213>釀膿鏈球菌

<220>

<221>cas9

<222>(1)..(4266)

<223>

<400>1

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aagtaa4266