本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序建庫用pcr引物及建庫方法。
背景技術(shù)：
：dna測序已經(jīng)成為生物學(xué)研究中不可缺少的一項重要技術(shù)，從根本上改變了人們研究生命藍(lán)圖的方式。隨著測序平臺硬件及相應(yīng)軟件的優(yōu)化，阻礙研究進(jìn)展的亦非測序技術(shù)本身而是與其相關(guān)的文庫構(gòu)建以及數(shù)據(jù)的分析和解釋。454lifesciences公司(roche)首先推出了革命性的基于焦酸測序法的超高通量基因組測序系統(tǒng)，開創(chuàng)了第二代測序技術(shù)的先河。二代測序又叫高通量測序技術(shù)，基本原理是邊合成邊測序。在sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dntp，當(dāng)dna聚合酶合成互補鏈時，每添加一種dntp就會釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號并經(jīng)過特定的計算機軟件處理，從而獲得待測dna的序列信息。二代測序是一項新的低成本，高通量，高準(zhǔn)確度的快速測序技術(shù)，在臨床和科學(xué)研究方面都有著廣泛的應(yīng)用。二代測序的檢測流程簡單分為建庫和測序兩部分組成。對于建庫部分，現(xiàn)有的方法分為pcr擴增和probe探針兩種。無論對于現(xiàn)有的pcr擴增，還是probe探針，目前主要由國外的生產(chǎn)廠家所霸占，如果要做相關(guān)的實驗，必須提供要做的基因給相應(yīng)的公司，例如：lifetechnology，illumina等國外公司，然后這些國外公司設(shè)計合成好相應(yīng)的試劑之后，再賣給國內(nèi)廠家，極大制約了國內(nèi)相關(guān)技術(shù)的開發(fā)和研究的開展。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序建庫用pcr引物及建庫方法；具體為嗜鉻細(xì)胞瘤7個致病基因(sdhb,sdhc,sdhd,max,vhl,tmem127,ret)的基因檢測自行設(shè)計用于二代測序中的建庫方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：第一方面，本發(fā)明涉及一種用于嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序建庫的pcr引物，其特征在于，所述引物選自seqidno:1～seqidno:70所示的核苷酸。優(yōu)選的，所述嗜鉻細(xì)胞致病基因為sdhb、sdhc、sdhd、max、vhl、tmem127、ret。優(yōu)選的，與sdhb基因相對應(yīng)的pcr引物由8組引物對組成，分別是序列號為seqidno:1的e1-f和序列號為seqidno:1的e1-r，序列號為seqidno:3的e2-f和序列號為seqidno:4的e2-r，序列號為seqidno:5的e3-f和序列號為seqidno:6的e3-r，序列號為seqidno:7的e4-f和序列號為seqidno:8的e4-r，序列號為seqidno:9的e5-f和序列號為seqidno:10的e5-r，序列號為seqidno:11的e6-f和序列號為seqidno:12的e6-r，序列號為seqidno:13的e7-f和序列號為seqidno:14的e7-r，以及序列號為seqidno:15的e8-f和序列號為seqidno:16的e8-r。優(yōu)選的，與sdhc基因相對應(yīng)的pcr引物由6組引物對組成，分別是序列號為seqidno:17的e1-f和序列號為seqidno:18的e1-r，序列號為seqidno:19的e2-f和序列號為seqidno:20的e2-r，序列號為seqidno:21的e3-f和序列號為seqidno:22的e3-r，序列號為seqidno:23的e4-f和序列號為seqidno:24的e4-r，序列號為seqidno:25的e5-f和序列號為seqidno:26的e5-r，以及序列號為seqidno:27的e6-f和序列號為seqidno:28的e6-r。優(yōu)選的，與sdhd基因相對應(yīng)的pcr引物由4組引物對組成，分別是序列號為seqidno:29的e1-f和序列號為seqidno:30的e1-r，序列號為seqidno:31的e2-f和序列號為seqidno:32的e2-r，序列號為seqidno:33的e3-f和序列號為seqidno:34的e3-r，以及序列號為seqidno:35的e4-f和序列號為seqidno:36的e4-r。優(yōu)選的，與vhl基因相對應(yīng)的pcr引物由4組引物對組成，分別是序列號為seqidno:37的e1-1f和序列號為seqidno:38的e1-1r，序列號為seqidno:39的e1-2f和序列號為seqidno:40的e1-2r，序列號為seqidno:41的e2-f和序列號為seqidno:42的e2-r，以及序列號為seqidno:43的e3-f和序列號為seqidno:44的e3-r。優(yōu)選的，與max基因相對應(yīng)的pcr引物由5組引物對組成，分別是序列號為seqidno:45的e1-f和序列號為seqidno:46的e1-r，序列號為seqidno:47的e2-f和序列號為seqidno:48的e2-r，序列號為seqidno:49的e3-f和序列號為seqidno:50的e3-r，序列號為seqidno:51的e4-f和序列號為seqidno:52的e4-r，序列號為seqidno:53的e5-f和序列號為seqidno:54的e5-r。優(yōu)選的，與tmem127基因相對應(yīng)的pcr引物由4組引物對組成，分別是序列號為seqidno:55的e1-f和序列號為seqidno:56的e1-r，序列號為seqidno:57的e2-f和序列號為seqidno:58的e2-r，序列號為seqidno:59的e3-1f和序列號為seqidno:60的e3-1r，序列號為seqidno:61的e3-2f和序列號為seqidno:62的e3-2r。優(yōu)選的，與ret基因相對應(yīng)的pcr引物由4組引物對組成，分別是序列號為seqidno:63的e10-f和序列號為seqidno:64的e10-r，序列號為seqidno:65的e11-634-f和序列號為seqidno:66的e11-634-r，序列號為seqidno:67的e15-f和序列號為seqidno:68的e15-r，序列號為seqidno:69的e16-f和序列號為seqidno:70的e16-r。需要說明的是，其他6個基因都是全部檢測，ret基因只是檢測了10,15,16號外顯子，還有11號外顯子上的634位點。第二方面，本發(fā)明涉及一種嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序建庫的試劑盒，包括有：針對不同樣品的不同引物組，每組引物組中包含至少一對pcr引物對；所述pcr引物對選自前述與sdhb、sdhc、sdhd、max、vhl、tmem127、ret基因相對應(yīng)的pcr引物。第三方面，本發(fā)明還涉及一種嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序的建庫方法，所述方法包括如下步驟：s1、利用提取的人基因組dna作為模板，采用前述的試劑盒中的引物作為引物的特異擴增部分進(jìn)行第一輪pcr擴增；(真正引物還有后面的tag部分)s2、將第一輪pcr產(chǎn)物，稀釋100～1000倍，作為第二輪pcr擴增的模板；s3、第二輪pcr擴增利用第一輪pcr擴增的通用引物再進(jìn)行一輪pcr擴增，同時加上測序機器需要的index、特異引物識別區(qū)用于測序機器識別的堿基序列；s4、第二輪pcr測序產(chǎn)物經(jīng)過核酸純化后，即可上機檢測。優(yōu)選的，步驟s1中，所述pcr擴增的反應(yīng)體系為：10×擴增緩沖液5μl，4種dntp混合物終濃度為各0.2mm，各引物0.1～0.5μm，模板dna10～100ng，聚合酶0.5～2u，最后加雙蒸水至50μl。優(yōu)選的，步驟s1中，所述pcr擴增的條件為：95℃預(yù)變性5～10min，95℃變性15～30s、56～64℃退火15～60s、72℃延伸15～60s，其中變性、退火至延伸共20～35個循環(huán)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：1、自行設(shè)計，成本極低(對比購買國外試劑盒)；2、美國公司lifetechnologiescorporation提供的關(guān)于ampliseq方法的說明書中明確：平均插入8kb片段大小，77個擴增子，達(dá)到的覆蓋率為98.7％，與之相比，本發(fā)明對應(yīng)的是：10kb，35個擴增子，覆蓋率是100％?？梢姡景l(fā)明的結(jié)果達(dá)到預(yù)期的效果，100％的擴增了目標(biāo)區(qū)域，并且均一性也非常好。具體實施方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例本實施例涉及一種嗜鉻細(xì)胞致病基因二代測序的建庫方法，包括如下步驟：1.利用提取的人基因組dna作為模板進(jìn)行pcr擴增2.pcr擴增的條件和引物如下：反應(yīng)體系(以50ul為例)：pcr反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5～10min，95℃變性15～30s、56～64℃退火15～60s、72℃延伸15～60s，其中變性、退火至延伸共20～35個循環(huán)。上述10×擴增緩沖液的配方可選用：100mmtris-hcl,ph8.3at25℃、500mmkcl、25mmmgcl2、10mmedta、1mmtween20。引物序列見表1：表13.回收擴增的pcr片段，進(jìn)行測序建庫。上述步驟1、2完成了第一輪pcr擴增(本發(fā)明的特異引物+5’端通用引物擴增)；該步驟3具體包括以下步驟：3.1將上述第一輪pcr產(chǎn)物，經(jīng)過稀釋，100-1000倍，作為第二輪擴增的模板；3.2第二輪擴增利用第一輪擴增的通用引物再進(jìn)行一輪pcr擴增，同時加上測序機器需要的index，特異引物識別區(qū)等用于測序機器識別的堿基序列；3.3第二輪測序產(chǎn)物經(jīng)過一般的核酸純化后，就可以上機檢測了。實驗結(jié)果如表2所示，表2分組長度數(shù)量分組長度數(shù)量分組長度數(shù)量132315900132841549125297203512249110041429110223262751518133267732152492120027317132534281173171628116978283131354252931256817280229032930413824629412179182931500730330969272291720719331122693130517777828493862031814395323071679992791765421212182703326626364102785432222781163734341106521127711751233351088935235189931219227226242874169本發(fā)明經(jīng)過系統(tǒng)的研究和不斷的實驗摸索，已經(jīng)完成該7個基因的建庫方法體系工作，并且經(jīng)過上海生工生物工程有限公司對建庫方法進(jìn)行檢測后的數(shù)據(jù)顯示，結(jié)果達(dá)到預(yù)期的效果，100％的擴增了目標(biāo)區(qū)域，并且均一性也非常好。當(dāng)前第1頁12