本發(fā)明涉及基因測(cè)序領(lǐng)域，具體涉及一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法。
背景技術(shù)：
：在二代測(cè)序中，常需要對(duì)特定基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序。目標(biāo)區(qū)域測(cè)序，比較常用的方法利用rna探針捕獲富集感興趣的目標(biāo)基因或基因組區(qū)域的dna片段，以提高測(cè)序的深度、準(zhǔn)確性和靈敏度。由于dna捕獲探針被設(shè)計(jì)成能夠與靶標(biāo)區(qū)域相雜交互補(bǔ)的性質(zhì)，使得目標(biāo)片段的富集依賴于核苷酸的物理及化學(xué)性質(zhì)，比如二級(jí)結(jié)構(gòu)、退火溫度、核苷酸濃度以及gc含量及鹽濃度等。基于雜交富集的原理，通常通過提高孵育的時(shí)間來(lái)提高特異性，通常的孵育時(shí)間在10-72小時(shí)，甚至更長(zhǎng)。而長(zhǎng)時(shí)間的孵育明顯影響測(cè)序的進(jìn)程。另外，較高的孵育溫度以及長(zhǎng)時(shí)間的孵育將會(huì)影響混合液中的鹽離子濃度，尤其是當(dāng)雜交反應(yīng)的體積較小的時(shí)候。雖然現(xiàn)在很多測(cè)序公司已經(jīng)能夠提供商品化的雜交富集方法及相應(yīng)的試劑盒，但是其雜交方法多針對(duì)于本公司所生產(chǎn)的探針，其捕獲探針通常不公開，且試劑溶液價(jià)格昂貴。每種試劑盒的操作條件均不相同，存在較大的差異，且文庫(kù)的輸入量有嚴(yán)格要求。因而很有必要提供一種重復(fù)性高，操作時(shí)間短，高特異性，同時(shí)能夠適用多種方法構(gòu)建的基因組文庫(kù)及捕獲探針的雜交溶液及方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中雜交富集溶液昂貴、使用有局限，提供一種用于基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種基因組目標(biāo)區(qū)域測(cè)序的雜交捕獲方法，包括如下步驟：(一)探針設(shè)計(jì)合成根據(jù)基因組目標(biāo)區(qū)域，以已知基因組序列為參考，以瓦片陣列的方式設(shè)計(jì)生成探針群，探針長(zhǎng)度為100～120bp，并過濾掉高度重復(fù)探針，在探針兩段加入通用引物，并合成作為探針模板，以此模板體外轉(zhuǎn)錄制備參入生物素標(biāo)記核苷酸的探針；(二)文庫(kù)構(gòu)建按照插入片段大小為200～300bp構(gòu)建dna文庫(kù)，文庫(kù)濃度不低于15ng/μl；(三)雜交捕獲1)分別配置文庫(kù)混合液、雜交混合液和捕獲混合液；2)pcr儀設(shè)定如下程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；3)放入文庫(kù)混合液，開始程序第一步：95℃5min；4)到程序第二步65℃3min時(shí)，立即將雜交混合液放入；5)到程序第三步65℃2min時(shí)，立即將捕獲混合液放入；6)到程序第四步后，在pcr儀上，將文庫(kù)混合液、雜交混合液與捕獲混合液混合；7)65度雜交36個(gè)小時(shí)；8)用磁珠捕獲步驟7)的雜交產(chǎn)物；其中，文庫(kù)混合液含humancot-1、通用寡核苷酸、步驟(二)構(gòu)建的文庫(kù)和文庫(kù)對(duì)應(yīng)的blocker序列；其中，雜交混合液由sspe、edta、denharts溶液及sds混合制成；其中，捕獲混合液為含步驟(一)所述探針和rnase抑制劑的溶液。其中，步驟(二)構(gòu)建文庫(kù)進(jìn)行的pcr循環(huán)數(shù)不超過9次，構(gòu)建文庫(kù)時(shí)包括采用ampure磁珠對(duì)打斷產(chǎn)物純化的步驟。優(yōu)選地，所述文庫(kù)混合液的配置方法如下：在1.5mlep管中加入：humancot-15μl、500μmuniversaloligo2μl、1-8種dna文庫(kù)每個(gè)文庫(kù)200ng，各dna文庫(kù)對(duì)應(yīng)的blocker200μm各1μl，蓋上后，用注射器針頭在蓋上扎3-5個(gè)孔，65℃離心真空干燥至看不見明顯液滴，12000rpm離心2min，打開蓋，底部加入8μl水，蓋上蓋，用封口膜將蓋子上的孔封住，渦旋，12000，2min，并轉(zhuǎn)移到pcr管。優(yōu)選地，所述雜交混合液的配置方法如下：4*sspe20μl、ph8.0、0.1medta0.8μl、50×denharts8μl、0.1％sds8μl。優(yōu)選地，所述捕獲混合液的配置方法如下：步驟(一)所述探針5μl、rnase抑制劑1μl。優(yōu)選地，所述步驟(三)第6)步為到程序第四步后，在pcr以上，移7μl文庫(kù)混合液與13μl雜交混合液至捕獲混合液，上下吹吸10次。其中，所述的blocker可選自seqidno.1-96所示的序列。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟(三)第8)步所述捕獲步驟如下：1)洗滌緩沖液1提前半小時(shí)放置到室溫，洗滌緩沖液265℃預(yù)熱1h；2)30μlmyonec1磁珠至新的1.5mlep管，磁力架上3min，移去上清；3)加入200μl結(jié)合緩沖液，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，磁力架上3min，去上清；4)重復(fù)3)兩邊，總共洗3次；5)加入200μl結(jié)合緩沖液，移液器上下吹吸10次；6)將雜交產(chǎn)物加入到重懸好的myonec1磁珠中，顛倒混勻3-5下，室溫30min；7)磁力架上3min，去上清；8)加入500μl洗滌緩沖液1，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，室溫15min，磁力架上3min，去上清；9)加入500μl洗滌緩沖液2，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，65度10min，磁力架上3min，去上清；10)為確保液體去凈：可用小離心機(jī)甩一下，放磁力架上，用10μl移液器將殘留液體洗凈；11)加入25μl的水將磁珠重懸，下一步取15μl留10μl備份；其中，所述洗滌緩沖液1的配置方法為：20×ssc2.8ml、10％sds1ml、加水補(bǔ)至50ml；所述洗滌緩沖液2的配置方法為：20×ssc3ml、10％sds0.1ml、加水補(bǔ)至100ml。發(fā)明公開的改進(jìn)的雜交方法，操作簡(jiǎn)單，孵育時(shí)間適中，能夠用于多種不同來(lái)源的dna文庫(kù)，有效降低捕獲成本，提高捕獲效率，縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，適合基因組目標(biāo)區(qū)域的測(cè)序。附圖說明圖1雜交捕獲示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖，詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施操作，但本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案不受限于下述實(shí)施方式，在不改變其要點(diǎn)的情況下，可做各種改變進(jìn)行實(shí)施。其中實(shí)施例中使用的試劑，如果沒有特別說明，在滿足實(shí)驗(yàn)要求的情況下，均購(gòu)自試劑公司。實(shí)施例中涉及的試劑及材料：實(shí)施例1試劑配制與存儲(chǔ)以下試劑配制所用水均為無(wú)核酸水，所用容器也需進(jìn)行去核酸酶處理后才能使用。1)note#14*sspe(ivitrogen，15591043)，分裝于1.5ml管中，保存于4度。2)note#20.1medta，ph8.0(ivitrogen，15575020)，分裝于1.5ml管中，保存于4度。3)note#350*denharts(invitrogen,750018)，分裝于1.5ml管中，保存于-20度。4)note#40.1％sds(invitrogen,15553027),稀釋到1×，分裝于1.5ml管中，保存于4度。5)結(jié)合緩沖液(bindingbuffer)：組成：nacl，tris-hcl，edta，ph7.5配制：6)洗滌緩沖液1(washbuffer1)：組成：ssc,sds配制：7)洗滌緩沖液2(washbuffer2)：組成：ssc,sds配制：oligo準(zhǔn)備用page純化方式合成以下oligo，用水將oligo干粉溶解到存儲(chǔ)濃度，然后存于-20℃。*：與barcode序列反向互補(bǔ)，見下表1表1：blocker序列實(shí)施例2panel的設(shè)計(jì)與定制1.目標(biāo)區(qū)域列表的生成a)根據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì),選擇想要測(cè)序的區(qū)域，以hg19為參考基因組，建立目標(biāo)區(qū)域列表，含染色體編號(hào)及起始點(diǎn)位置；b)目標(biāo)區(qū)域調(diào)整：目標(biāo)區(qū)域小于220bp的，向兩端延伸到220bp。2.評(píng)估目標(biāo)區(qū)域(targetregion)的gc含量對(duì)于gc含量高于70％或低于30％的區(qū)域，多設(shè)計(jì)1×到2×tiling的探針設(shè)計(jì)。3.探針的生成a)以瓦片陣列(tilingarray)方式生成長(zhǎng)度為110bp的探針群，即按照一定的重疊程度有規(guī)律地截取基因組的序列作為探針序列(如2×tiling設(shè)計(jì)，間隔長(zhǎng)度為55bp；3×tiling設(shè)計(jì)，間隔長(zhǎng)度為37bp)；b)對(duì)于gc含量高于70％或低于30％的區(qū)域，多設(shè)計(jì)1×到2×tiling的探針設(shè)計(jì)；c)探針到目標(biāo)區(qū)域末端時(shí)直接跨出區(qū)域設(shè)計(jì)。4.過濾高度重復(fù)區(qū)的探針參考過濾條件：所有探針blast到基因組(沒加接頭)，過濾掉高重復(fù)(30％match，80％indentity)的探針，repeat>15濾掉。5.通用引物序列加入探針的兩端加上下一步用于pcr的通用引物序列，探針結(jié)構(gòu)如下：gaagcgaggatcaact(n110)cattgcgtgaaccga。6.芯片定制將探針列表交由探針合成公司合成(可選擇公司如customarray、mycroarray等)，返回的即為洗脫下來(lái)的探針溶液。注意事項(xiàng):1)根據(jù)panel的大小與檢測(cè)目的的不同，選擇不同的tiling的探針設(shè)計(jì)，以2×至4×為佳。2)gc含量高于70％或低于30％的區(qū)域，即使多設(shè)計(jì)1×，實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果也可能欠佳。3)內(nèi)含子區(qū)域或者其他非編碼區(qū)，可能重復(fù)序列較高，或gc含量較低，這些區(qū)域捕獲測(cè)序效果可能欠佳。實(shí)施例3探針的制備本實(shí)施例介紹探針的制備、存儲(chǔ)。本章實(shí)驗(yàn)所需耗材需為無(wú)核酸耗材，全程戴手套、口罩，在超凈臺(tái)操作。1.探針模板制備1)先取5μl探針原液，用10mmtris-hclbuffer稀釋到3ng/μl,，4.2μl/管分裝，取一管繼續(xù)下面的步驟，其余凍存于-80度；2)按以下體系及程序，平行做2管；反應(yīng)體系：kapahifilibraryamplificationkit25μlrev(25μm)1μlsp6promoter(25μm)1μloligopool(稀釋后)1μl水22μl反應(yīng)程序：3)qubit定量：取1μlpcr產(chǎn)物進(jìn)行qubit定量，確定2管皆有pcr產(chǎn)物，繼續(xù)下面步驟；注：濃度大概在10-20ng/μl，但不同panel會(huì)有差異，可在此步驟做幾次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)平均數(shù)及偏差，作為一個(gè)質(zhì)控點(diǎn).4)2管合并到一起，用qiaquickpcrcleankit純化，用50μl水(堿性)溶；5)qubit定量，總量約在500ng上下；注：不同panel會(huì)有差異，純化后濃度約在10ng/μl6)分裝:9μl/管,分成5管，可凍存于-80度，每次使用一管，避免反復(fù)凍融。2.體外轉(zhuǎn)錄1)將試劑盒ambionsp6megascriptkit取出；2)按以下體系準(zhǔn)備反應(yīng)體系，平行做兩管；探針模板4.4μlatp2μlctp2μlgtp2μlutp1.6μlbiotin-16-utp2μl10*reactionbuffer2μlenzymemix2μl水2μltotal20μl3)37度，6小時(shí)。注：不能過夜，時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)反而導(dǎo)致得率降低。3.純化1)試劑盒：megaclearkit(以下elutionsolution、washsolution、bindingsolution是megaclearkit試劑盒中的帶的溶液)；2)2管合并，加60μlelutionsolution將體系補(bǔ)齊到100微升，輕輕混勻；3)加入350μlbindingsolution溶液，輕輕混勻；4)再加入250μl無(wú)水乙醇，輕輕混勻；5)將溶液加入離心柱中，靜置1分鐘；6)將140μlelutionsolution溶液加入到一個(gè)1.5ml的ep管中，再將其放入到56度水浴鍋中預(yù)熱；7)將離心管用12000*g離心1分鐘，棄廢液；8)向離心柱中加入500μlwashsolution，12000*g離心1分鐘，棄廢液；9)再向離心柱中加入500μlwashsolution，12000*g離心1分鐘，棄廢液；10)12000*g離心2分鐘(空甩)；11)將離心柱放入一個(gè)新的離心管中，室溫靜置2分鐘；12)將70μl預(yù)熱過的elutionsolution加入到離心柱的中央，靜置2分鐘，12000*g離心2分鐘；13)再將剩余的70微升預(yù)熱過的elutionsolution加入到離心柱的中央，靜置2分鐘，12000*g離心2分鐘。4.定量與分裝qubit定量(使用rna定量試劑)，濃度在60ng/μl上下；分裝500kpanel：用elutionsolution(或者無(wú)rnase水配的10mmtris-hcl，ph8.0)稀釋到30ng/μl，60μl/管分裝；4mpanel：用elutionsolution(或者無(wú)rnase水配的10mmtris-hcl，ph8.0)稀釋到60ng/μl，60μl/管分裝；3)分裝探針凍存于-80度。實(shí)施例4文庫(kù)的構(gòu)建本方案需要300ng常規(guī)dna文庫(kù)，使用的文庫(kù)構(gòu)建試劑盒為nextflextmrapiddna-seqkit(bioo，5144-02)。1.重要參數(shù)起始量：500ng；插入片段：建議插入片段為200-300bp，可使用bioruptor或者cavaris打斷，打斷體系為50μl；pcr循環(huán)數(shù)：文庫(kù)構(gòu)建pcr的循環(huán)數(shù)不超過9；文庫(kù)濃度：最終文庫(kù)濃度不得小于15ng/μl。2.實(shí)驗(yàn)步驟文庫(kù)構(gòu)建步驟按試劑盒說明書進(jìn)行，需要調(diào)整的步驟如下：1)為控制成本，體系可減半進(jìn)行；2)為確保文庫(kù)構(gòu)建的順利進(jìn)行，去除可能存在的抑制劑對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，先用1.8×ampure磁珠對(duì)打斷產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化步驟參考試劑盒說明書；3)接頭連接后，無(wú)需片段選擇，用0.8×ampure磁珠純化兩次；4)最終文庫(kù)溶于25μlrsb中。注：其余試劑盒構(gòu)建的文庫(kù)也可，但需保證pcr的循環(huán)數(shù)不超過9，且需注意barcode的對(duì)應(yīng)關(guān)系。3.文庫(kù)質(zhì)量檢測(cè)1)濃度檢測(cè)：qubit定量檢測(cè)，濃度須大于15ng/μl；2)插入片段：安捷倫2100檢測(cè)插入片段，插入片段須在200-300bp左右；多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，確定打斷區(qū)域沒有問題后，可省略此步驟。實(shí)施例5目標(biāo)區(qū)域的雜交、捕獲1.雜交1)配制librarymastermix以5個(gè)dna文庫(kù)為例說明文庫(kù)混合物的配置，universaloligo為實(shí)施例1中的通用引物uni-oligo，dna文庫(kù)按照200ng計(jì)算加入即加入體積xμl根據(jù)文庫(kù)的濃度核算。i.在1.5mlep管中加入：dna文庫(kù)(5個(gè)文庫(kù)混樣，每個(gè)文庫(kù)200ng)xμlii.蓋上后，用注射器針頭(5ml注射器)在棺蓋上扎3-5個(gè)孔；iii.65度離心真空干燥至看不見明顯液滴；iv.12000rpm，2min；v.小心開蓋，底部加入8μl水，蓋上蓋，用封口膜將蓋子上的孔封?。籿i.渦旋，12000,2min，并轉(zhuǎn)移到pcr管，標(biāo)記librarymastermix。注意事項(xiàng)：所使用的文庫(kù)構(gòu)建時(shí)pcr循環(huán)數(shù)不可大于9，否則可能會(huì)引起重復(fù)率高；所使用的文庫(kù)最好是同一性質(zhì)的，使用同一個(gè)sop獲得，這樣可保證數(shù)據(jù)量的均衡。2)取一新的的pcr管，加入以下體系，并標(biāo)記noteridizationmastermix：note#120μl、note#20.8μl、note#38μl、note#48μl；共計(jì)36.8μl。3)取一新的的pcr管，加入以下體系，并標(biāo)記capturebaitsmastermix：探針5μl、rnase抑制劑1μl；共計(jì)6μl。4)pcr儀設(shè)定程序：95℃，5min；65℃，3min；65℃，2min；65℃，∞；5)將librarymastermix放進(jìn)pcr儀中，開始程序第一步：95度5min；6)到程序第二步65度3min時(shí)，立即將noteridizationmastermix放入；7)到程序第三步65度2min時(shí)，立即將capturebaitsmastermix放入；8)到程序第四步后，在pcr以上，移7μloflibrarymastermix與13μlnoteridizationmastermix至capturebaitsmastermix，上下吹吸10次；9)65度雜交36個(gè)小時(shí)。2.捕獲1)washbuffer1提前半小時(shí)放置到室溫，washbuffer265度預(yù)熱1h；2)30μlmyonec1磁珠至新的1.5mlep管，磁力架上3min，移去上清；3)加入200μlbindingbuffer，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，磁力架上3min，去上清；4)重復(fù)3)兩邊，總共洗3次；5)加入200μlbindingbuffer，移液器上下吹吸10次；6)將雜交體系(2-9)加入到重懸好的myonec1磁珠中，顛倒混勻3-5下，rotator(翻轉(zhuǎn)器)室溫30min；7)磁力架上3min，去上清；8)加入500μlwashbuffer1，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，室溫15min，磁力架上3min，去上清；9)加入500μlwashbuffer2，移液器上下吹吸10次，將磁珠重懸，65度10min，磁力架上3min，去上清；10)為確保液體去凈：可用小離心機(jī)甩一下，放磁力架上，用10μl移液器將殘留液體洗凈；11)加入25μl的水將磁珠重懸，下一步取15μl留10μl備份。3.post-pcr反應(yīng)體系：反應(yīng)程序：98℃45s；98℃20s，65℃30s，72℃40s，共16個(gè)循環(huán)；72℃4min。取上清，用2×ampurebeads(beckmancoulter，產(chǎn)品agencourtampurexp，貨號(hào)a63881.)純化，25μlelutionbuffer(agencourtampurexp自帶)洗脫，預(yù)計(jì)20-30ng/μl。實(shí)施例6不同的混樣個(gè)數(shù)進(jìn)行測(cè)序的結(jié)果影響按照實(shí)施例1-5，以人的血液提取的dna制作dna文庫(kù)，針對(duì)了20個(gè)基因來(lái)設(shè)計(jì)(actc1,tpm1,actn2,lmna,nexn,tnnt2,des,ttn,dsc2,dsg2,ttr,mybpc3,csrp3,myh6,myh7,tgfb3,myl2,abcc9,pkp2,myl3)，8個(gè)血樣，分別對(duì)應(yīng)文庫(kù)編號(hào)為1-8。構(gòu)建文庫(kù)的試劑盒為nextflextmrapiddna-seqkit(bioo，5144-02)。相應(yīng)地，barcodes選擇了1-8，blocker選擇了1-8，探針長(zhǎng)度110bp。按照實(shí)施例5進(jìn)行雜交富集，其中，混樣的個(gè)數(shù)分別選擇為4個(gè)、6個(gè)以及8個(gè)，分別對(duì)應(yīng)文庫(kù)1-4、1-6和1-8。并進(jìn)一步對(duì)得到的溶液進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序的結(jié)果如下表表2所示。表2混樣個(gè)數(shù)對(duì)測(cè)序結(jié)果的影響從表2的結(jié)果來(lái)看，采用本申請(qǐng)述及的雜交富集溶液及相應(yīng)的雜交方法，在多個(gè)樣本進(jìn)行混樣的情況下，測(cè)序結(jié)果表明同樣能夠得到較高的目標(biāo)區(qū)域覆蓋度。本發(fā)明將多個(gè)樣混合，進(jìn)行一次雜交捕獲，目標(biāo)區(qū)域覆蓋率同樣達(dá)到極高的覆蓋度，不僅能解決探針等材料的使用成本，而且降低了操作次數(shù)，節(jié)約了時(shí)間。實(shí)施例7與進(jìn)口安捷倫試劑盒捕獲數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)對(duì)特定的目標(biāo)區(qū)域分別采用本申請(qǐng)述及的雜交富集溶液及相應(yīng)的雜交方法進(jìn)行雜交及測(cè)序，同時(shí)采用美國(guó)安捷倫試劑盒(sureselectxtreagentkit貨號(hào)g9611a)進(jìn)行雜交捕獲測(cè)序，以比較本發(fā)明的溶液及方法的性能。試驗(yàn)對(duì)象及方法同實(shí)施例6，test2-5分別對(duì)應(yīng)的是dna文庫(kù)2-5。安捷倫試劑盒按照其說明操作，試驗(yàn)對(duì)象同為相同的血樣dna，編號(hào)2-4。測(cè)試結(jié)果如下表表3所示。表3：與美國(guó)安捷倫試劑盒數(shù)據(jù)對(duì)比從表3的結(jié)果來(lái)看，采用本申請(qǐng)的溶液及雜交方法，對(duì)目標(biāo)區(qū)域序列的覆蓋達(dá)到了100％，明顯優(yōu)于美國(guó)安捷倫試劑盒測(cè)定的結(jié)果。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)12