本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一個抗番茄莖枯病基因mlcb2b及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，隨著番茄種植面積的擴大，番茄莖枯病的發(fā)生也越來越嚴重，它主要危害番茄的莖和果實，嚴重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。鏈格孢菌(alternariaalternataf.sp.lycopersici，aal)是番茄莖枯病的病原菌，它主要通過產(chǎn)生具有致病性的真菌毒素aal-toxin來實現(xiàn)對番茄組織細胞的毒害。針對如何提高番茄對鏈格孢菌的抗性，傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中所使用的化學(xué)調(diào)控方法顯然不符合當今綠色環(huán)保的生產(chǎn)理念，而通過挖掘抗性基因提高番茄自身的抗性，將是一種長期有效的方法。

《擬南芥和番茄對神經(jīng)鞘脂類似類真菌毒素的抗性機理研究》一文，以圖位克隆的方法在擬南芥抗fb1突變體中克隆fb1抗性基因，并對其功能進行分析，從分子水平揭示植物對fb1誘導(dǎo)的pcd的抗性機制；并將擬南芥的fb1抗性基因在對aal-toxin易感的番茄中遺傳轉(zhuǎn)化，分析轉(zhuǎn)基因番茄對aal-toxin的敏感性的變化及其機理，探究fb1抗性基因在不同植物種類對smat抗性的普適性，為番茄抗莖枯病的機理研究和通過基因工程使番茄易感品種獲得對抗莖枯病抗性提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種抗番茄莖枯病基因mlcb2b及其應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種提高番茄對鏈格孢菌引起的莖枯病抗性的蛋白mlcb2b，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno：3所示。

本發(fā)明還同時提供了編碼上述蛋白質(zhì)的基因mlcb2b，蓋基因的核苷酸序列如seqidno：1、seqidno：2所示。

本發(fā)明還同時提供了含有上述編碼基因的植物表達載體、大腸桿菌、農(nóng)桿菌和過表達該基因的轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明還同時提供了擴增上述基因的引物對，包括由f1和r1組成的引物對，以及由f2和r2組成的引物對；

f1：5’-atgattacgatcccatacct-3’；

f2：5’-atcctggatacgctccgatctgctt-3’；

r1：5’-aggatctggagattgttggtgcgcc-3’；

r2：5’-acgtcttgttgttatcgtca-3’。

本發(fā)明還同時提供了上述基因mlcb2b的用途：用于提高番茄對鏈格孢菌的抗性。

作為基因mlcb2b的用途的改進：用于構(gòu)建轉(zhuǎn)基因番茄，所述轉(zhuǎn)基因番茄對鏈格孢菌的抗性得以提高。

本發(fā)明提供了一個提高番茄對莖枯病抗性的基因，命名為mlcb2b，由擬南芥中編碼絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serinepalmitoyltransferase，spt)亞基的基因lcb2b經(jīng)過定點突變獲得，其開放閱讀框長285bp，序列如seqidno：2，編碼一個含有94個氨基酸的短肽，序列如seqidno：3所示。

本發(fā)明涉及對擬南芥中的基因lcb2b進行定點突變(堿基插入)的方法。

本發(fā)明提供了所述基因在通過創(chuàng)制mlcb2b轉(zhuǎn)基因植物來獲得抗莖枯病材料的應(yīng)用。其主要步驟如下：

(1)mlcb2b基因表達載體的構(gòu)建：

將mlcb2b開放閱讀框連入植物表達載體中，使其受到強啟動子的驅(qū)動。

(2)轉(zhuǎn)化mlcb2b基因的農(nóng)桿菌的獲得：

將mlcb2b基因表達載體通過熱激法導(dǎo)入農(nóng)桿菌中。

(3)mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株的獲得：

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法，獲得mlcb2b的轉(zhuǎn)基因植株。

(4)轉(zhuǎn)基因植株的鑒定：

通過dna鑒定，基因表達量測定，篩選mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株。

(5)轉(zhuǎn)基因植株純合系的獲得：

以抗生素抗性和基因的表達量為指標，分析各轉(zhuǎn)基因株系后代的分離情況，選取含有單拷貝插入的株系。之后通過單株留種，獲得后代性狀不發(fā)生分離的純合系。

(6)轉(zhuǎn)基因植株的抗性鑒定：

以純合的轉(zhuǎn)基因株系為材料，通過活體接種鏈格孢菌，分析發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株的發(fā)病癥狀明顯較對照輕；從而確定mlcb2b在提高番茄對鏈格孢菌抗性方面的功能。

本發(fā)明基因的過表達顯著提高了番茄對莖枯病致病菌鏈格孢菌(alternariaalternataf.sp.lycopersici)的抗性，轉(zhuǎn)基因番茄植株的萎蔫程度較輕，葉片的相對電導(dǎo)率和菌生物量也明顯較小。

附圖說明

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。

圖1是植物表達載體pgwb17-35s-mlcb2b的載體圖譜；

圖2是mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照在接種鏈格孢菌后的整體發(fā)病情況；

圖3是mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照在接種鏈格孢菌后的局部葉片圖；

圖4是mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照發(fā)病葉片的相對電導(dǎo)率和菌相對生物量；

圖4中，左圖為過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照發(fā)病葉片的相對電導(dǎo)率，右圖為過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照發(fā)病葉片的菌相對生物量；

圖5為fbr41-d過表達轉(zhuǎn)基因植株及其對照接種鏈格孢菌后的局部葉片圖和葉片相對電導(dǎo)率；

圖5中，左圖為過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照接種鏈格孢菌后的局部葉片圖，右圖為過表達轉(zhuǎn)基因植株及對照發(fā)病葉片的相對電導(dǎo)率。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

一、mlcb2b基因的克隆與保存

mlcb2b基因是由擬南芥中編碼絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶(serinepalmitoyltransferase，spt)亞基的基因lcb2b定點突變而來。主要步驟如下：用trizol法提取擬南芥野生型col-0的總rna，采用rt-pcr的方法獲取lcb2b的cdna。為使lcb2b基因在起始密碼子開始126位堿基后插入atcct，擴增基因時采用分段擴增的方法：首先，根據(jù)lcb2b開放閱讀框(orf)前126bp的序列設(shè)計前引物f1(5’-atgattacgatcccatacct-3’)(序列入seqidno：4)和后引物r1(5’-aggatctggagattgttggtgcgcc-3’，斜體插入堿基)(序列如seqidno：5)，擴增得到131bp的dna片段；接著，根據(jù)lcb2b基因orf127bp至280bp的序列設(shè)計前引物f2(5’-atcctggatacgctccgatctgctt-3’，斜體為插入堿基)(序列如seqidno：6)，和后引物r2(5’-acgtcttgttgttatcgtca-3’)(序列如seqidno：7)，擴增得到156bp的dna片段；最后，將純化的dna片段混合在一起作為模板，用f1和r2作為前后引物，進行pcr擴增，得到282bp的dna片段(備注：lcb2b基因由于5個堿基的插入，發(fā)生移碼突變，導(dǎo)致翻譯提前終止，因此我們根據(jù)lcb2b序列克隆了第一個終止子taa之前的序列)。將該片段連接到入門載體pqbv3上，熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，涂布在含有25μg/ml氯霉素的lb平板上過夜，之后挑取單菌落，用載體上的引物m13f和基因的后引物r2進行菌落pcr，選取陽性克隆搖菌并提取質(zhì)粒，送公司測序，最終成功克隆得到mlcb2b基因，命名為pqbv3-mlcb2b。

mlcb2b基因的核苷酸序列如seqidno：1、seqidno：2所示；該基因編碼的蛋白mlcb2b的氨基酸序列如seqidno：3所示。

二、植物表達載體的構(gòu)建

將連有pqbv3-mlcb2b和植物表達載體pgwb17混合在同一體系，該體系組成如下：

將該體系在25℃條件下反應(yīng)2h，加入0.5ulpreoteinaseksolution，在37℃下反應(yīng)10min，從而終止lr反應(yīng)。之后，將該體系熱激轉(zhuǎn)化到100ul大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞中，涂布在含有50mg/l卡那霉素的lb培養(yǎng)基上過夜，之后挑取單菌落，用mlcb2b基因的前引物f1(seqidno：4)和載體上的引物myc-r進行菌落pcr檢測，選取陽性克隆搖菌并提取質(zhì)粒，送公司測序，最終得到pgwb17-35s-mlcb2b。該載體含有強啟動子—煙草花葉病毒(camv)35s啟動子，可以組成型啟動mlcb2b在植物中的表達，表達出的mlcb2b蛋白帶有myc標簽。

三、轉(zhuǎn)化mlcb2b基因的農(nóng)桿菌的獲取

(1)農(nóng)桿菌lba4404感受態(tài)制備

將農(nóng)桿菌菌株lba4404涂布在含有500ug/ml硫酸鏈霉素(sm)和50ug/ml利福平(rif)的yeb固體培養(yǎng)基上，28℃黑暗條件活化2至3天。挑取活化后的單菌落于5ml含有500ug/mlsm和50ug/mlrif的yeb液體培養(yǎng)基中搖菌16h。按照1:100的比例將過夜培養(yǎng)的菌加入到100ml含有500ug/mlsm和50ug/mlrif的yeb液體培養(yǎng)基中大搖，直到od600到0.5-1.0。將菌液分裝，置于冰上15min，之后在4000rpm，4℃下離心10min，留沉淀，用1ml預(yù)冷的20mm的cacl2重懸，分裝，速凍，即得到農(nóng)桿菌感受態(tài)。

(2)表達載體的轉(zhuǎn)化

吸取1ugpgwb17-35s-mlcb2b載體質(zhì)粒于100ul農(nóng)桿菌菌株lba4404的感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，在冰上放置30min以上，之后放在液氮中3min，37℃水浴5min，加入1mlyeb溶液，置于28℃，200rpm和黑暗條件下活化2-4h。將活化的菌液離心，用100ul的yeb重懸，均勻涂布在含有500ug/mlsm、50ug/mlrif和50ug/mlkan的yeb培養(yǎng)基上，相同條件下培養(yǎng)2-3d。最后，挑取單菌落，進行菌落pcr鑒定，挑取陽性單菌落搖菌，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

四、番茄的遺傳轉(zhuǎn)化

選用對鏈格孢菌敏感的番茄品種la12(由美國加州大學(xué)番茄遺傳資源中心所贈送)作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，選取在1/2ms培養(yǎng)基中上長到子葉剛好展平時期的無菌苗作為外植體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，具體方法如下：

在無菌條件下，切取子葉，利用含有目的基因的農(nóng)桿菌對子葉進行侵染，之后放在含有1.0mg/liaa、1.75mg/lzt和75mg/lkan的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織的形成。經(jīng)過2-3周的誘導(dǎo)后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有1.0mg/liaa、1.75mg/lzt和50mg/lkan的生芽培養(yǎng)基上誘導(dǎo)芽的生成。待愈傷組織分化出生長點后，將其轉(zhuǎn)移到含有50mg/lkan的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)根的形成。約2-3周時間，將成功分化出根的抗性苗轉(zhuǎn)移到基質(zhì)中培養(yǎng)煉苗，之后對轉(zhuǎn)基因苗進行基因表達量分析，初步確定mlcb2b過表達的轉(zhuǎn)基因植株。

五、mlcb2b過表達轉(zhuǎn)基因植株純系的獲得

對獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行單株留種，將種子滅菌消毒后播到含有50mg/lkan的1/2ms培養(yǎng)基上，選擇抗性與非抗性接近3:1，即單拷貝插入的株系。選取每個株系的陽性苗，繼續(xù)單株留種，挑選后代不再分離的單株的種子，作為后續(xù)功能驗證的實驗材料，最終獲得了純合的轉(zhuǎn)基因株系mlcb2b-ox-3-2和mlcb2b-ox-11-1。

六、mlcb2b轉(zhuǎn)基因植株抗病性鑒定

(1)鏈格孢菌的培養(yǎng)及孢子懸浮液的準備

將分離純化的鏈格孢菌置于pda培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)約14d，直到培養(yǎng)基上布滿黑色的真菌孢子。在培養(yǎng)真菌的培養(yǎng)皿中加入少量蒸餾水，浸泡10min，然后用滅菌的刀片刮下真菌孢子及菌絲。用雙層紗布過濾除去菌絲，收集黑色的孢子懸浮液。將懸浮液轉(zhuǎn)入50ml離心管中，4000rpm，常溫下離心10min，棄上清以去除其中的毒素，用蒸餾水重懸，此操作重復(fù)2遍，最后得到均勻不含毒素的孢子懸浮液。用血球計數(shù)板計算懸浮液的孢子濃度，用蒸餾水將濃度稀釋到10⁶個/ml，加入0.1％的的tween-20，得到適宜濃度的侵染液。

(2)鏈格孢菌接種

用噴霧器將制備好的孢子懸浮液噴濕到長有6片真葉(約1個月)的轉(zhuǎn)基因番茄植株及其對照的葉片上，在25℃，高濕條件下培養(yǎng)2d，之后恢復(fù)正常栽培條件，對照用0.1％的tween處理。接種后第3天進行發(fā)病癥狀的觀察，并對葉片的相對電導(dǎo)率和菌生物量進行測定。和對照相比，純合的轉(zhuǎn)基因株系mlcb2b-ox-3-2和mlcb2b-ox-11-1整體植株的萎蔫程度較輕(見圖2)，葉片的對比圖如圖3所示；葉片的相對電導(dǎo)率和菌生物量都明顯較對照小(見圖4)，說明過表達mlcb2b基因，植株對鏈格孢菌表現(xiàn)出高抗性。由此mlcb2b在抗鏈格孢菌引起的莖枯病方面起到正調(diào)控作用。

(3)對比實驗：

將《擬南芥和番茄對神經(jīng)鞘脂類似類真菌毒素的抗性機理研究》中的fbr41-d基因替代mlcb2b基因，即構(gòu)建pgwb17-35s-fbr41-d過表達載體，進行上述步驟三至步驟六。發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在接種鏈格孢菌以后，發(fā)病程度只比對照低一些，葉片的對比圖如圖5左圖所示，葉片的相對電導(dǎo)率如圖5右圖所示。相比較而言，本發(fā)明過表達的轉(zhuǎn)基因材料發(fā)病程度明顯降低。因此，本發(fā)明過表達的轉(zhuǎn)基因材料的抗性更高。

最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認為是本發(fā)明的保護范圍。

<110>浙江大學(xué)

<120>抗番茄莖枯病基因mlcb2b及其應(yīng)用

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<213>擬南芥（arabidopsisthaliana）

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