本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種植物抗病蛋白BjMYB9及其編碼基因和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)作為最重要的植物真菌病原體，能夠侵染200多種植物，包括幾乎所有蔬菜和水果作物，每年導(dǎo)致全世界100億乃至1000億美元的損失，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失(Dean et al.,2012；Lu et al.,2013；Weiberg et al.,2013)。

為了防御病原體侵染，植物進(jìn)化出復(fù)雜的防御機(jī)制來應(yīng)對病原體的攻擊(Jones and Dangl,2006；Lu et al.,2013)。在防御過程中，一些植物基因被激活或誘導(dǎo)，其中許多轉(zhuǎn)錄因子(Transcription Factors,TFs)扮演重要的角色(Liu et al.,2013；Windram et al.,2012)。WRKY和AP2/ERF基因家族是主要的植物防御葡萄灰霉病菌侵染的轉(zhuǎn)錄因子(Hu et al.,2012；Lai et al.,2008；Lu et al.,2013)。此外NAC家族轉(zhuǎn)錄因子也能夠調(diào)節(jié)植物對葡萄灰霉病菌的抵抗作用(Wang et al.,2009)。最近研究表明：一些MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對葡萄灰霉病菌侵染過程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用(Mengiste et al.,2003；Peng et al.,2011；Raffaele and Rivas,2013)。

MYB蛋白組成植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物發(fā)育、次生代謝、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病和非生物脅迫方面發(fā)揮著重要的作用(Katiyar et al.,2012)。根據(jù)蛋白中MYB結(jié)構(gòu)域重復(fù)次數(shù)的多少，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族分為4個(gè)亞家族(R1-MYB、R2R3-MYB，3R-MYB和4R-MYB)(Dubos et al.,2010)。R2R3-MYB亞家族包含兩個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域，主要調(diào)節(jié)植物特定的生理功能如對病原微生物的免疫作用(Dubos et al.,2010；Stracke et al.,2001)。例如來自橡膠(Hevea brasiliensis)的R2R3-MYB基因HbMyb1在煙草中超表達(dá)能夠增強(qiáng)對葡萄灰霉病菌的抵抗作用(Peng et al.,2011)；小麥(Triticum aestivum L.)R2R3-MYB基因TaPIMP1在煙草中過表達(dá)能夠增強(qiáng)煙草對活體營養(yǎng)細(xì)菌病原體(Ralstonia solanacearum)的抵抗作用，也能夠增強(qiáng)小麥對半活體營養(yǎng)真菌病原體(Bipolaris sorokiniana)的抗性(Liu et al.,2011；Zhang et al.,2012)；水稻(Oryza sativa spp.japonica)R2R3-MYB基因OsJaMyb能夠?qū)Φ疚敛?Magnaportheoryzae)的侵染做出應(yīng)答(Lee et al.,2001)。此外AtMYB30作為擬南芥研究較為深入的R2R3-MYB基因，參與對病原微生物的免疫調(diào)節(jié)(Raffaele and Rivas, 2013)。其它一些來自擬南芥的R2R3-MYB基因如AtMYB108(Mengiste et al.,2003)，AtMYB72(Segarra et al.,2009)，AtMYB60和AtMYB96(Seo and Park,2010；Seo et al.,2009)也參與植物對病原體的抗性調(diào)節(jié)。

盡管R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在植物對病原體防御方面的突出作用，但這些蛋白質(zhì)與靶基因之間的互作細(xì)節(jié)仍然不甚清楚(Prouse and Campbell,2013)。在分子水平上研究R2R3-MYB蛋白功能的研究報(bào)告正在出現(xiàn)，一些R2R3-MYB蛋白能夠結(jié)合到AC元件(ACC(A/T)ACC(A/C/T)上，進(jìn)而激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄(Prouse and Campbell,2012)。例如松樹(Pinus taeda)MYB1和MYB4(Patzlaff et al.,2003a,2003b)以及桉樹(Eucalyptus grandis)MYB2能夠結(jié)合到木質(zhì)素生物合成基因啟動(dòng)子的AC元件上(Goicoechea et al.,2005)。

在分子水平上了解植物防御機(jī)制將有助于研究人員利用作物抗性機(jī)制來改良作物?；谖覀冎暗难芯浚築jCHI1啟動(dòng)子BjC-P是多脅迫誘導(dǎo)性啟動(dòng)子(Wu et al.,2009)；W-box-like-4元件(GTAGTGACTCAT)是該啟動(dòng)子響應(yīng)葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)侵染的核心元件(Gao et al.,2014)，為了進(jìn)一步分析BjC-P介導(dǎo)植物對真菌抗性的分子機(jī)制，我們通過酵母單雜交技術(shù)從芥菜(Botrytis cinerea)分離到一個(gè)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子BjMYB9。體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均表明BjMYB9能夠特異地結(jié)合到BjC-P的W-box-like-4元件上。此外過表達(dá)BjMYB9的轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對葡萄灰霉病菌的抗性。然而迄今還沒有人報(bào)道MYB蛋白能夠特異的結(jié)合到一個(gè)W-box元件進(jìn)而調(diào)節(jié)植物對病原真菌的防御作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種植物抗病蛋白質(zhì)及其編碼基因核苷酸序列。

本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)源自芥菜(Brassica juncea)，是一種R2R3-MYB核轉(zhuǎn)錄因子蛋白，命名為BjMYB9，能夠特異結(jié)合靶基因啟動(dòng)子中的W-box-like元件(GTAGTGACTCAT)，進(jìn)而介導(dǎo)植物對葡萄灰霉病原真菌侵染的防御作用。

SEQ ID NO:1所示的是BjMYB9的氨基酸序列，由220個(gè)氨基酸殘基組成，序列表中第13氨基酸至19位氨基酸，第79氨基酸至84位氨基酸是BjMYB9的2個(gè)MYB結(jié)構(gòu)域所在氨基酸殘基。

為了使BjMYB9便于純化或分子檢測，可由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接如下表所示的標(biāo)簽。

標(biāo)簽的序列如下：

編碼所述蛋白BjMYB9的核酸分子也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA；也可以是RNA，如mRNA等。

SEQ ID NO:2所示BjMYB9的cDNA分子，由663個(gè)核苷酸組成，開放閱讀框架為整個(gè)SEQ ID NO:2所示的序列，編碼SEQ ID NO:1所示的蛋白質(zhì)(BjMYB9)。

含有所述核酸分子的重組載體、重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

所述重組表達(dá)載體包括用于真核表達(dá)BjMYB9的雙元載體pCAMBIA1307-BjMYB9和用于原核表達(dá)His-BjMYB9融合蛋白的載體pET-28a-BjMYB9。重組菌為含有pCAMBIA1307-BjMYB9質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α以及農(nóng)桿菌EHA105和含有pET-28a-BjMYB9的大腸桿菌DH5α。在pCAMBIA1307載體的多克隆位點(diǎn)BamH I和Sal I之間插入所述BjMYB9基因，得到BjMYB9植物表達(dá)重組質(zhì)粒pCAMBIA1307-BjMYB9。在pET-28a載體多克隆位點(diǎn)EcoR I和Sal I之間插入所述BjMYB9基因得到BjMYB9的蛋白原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-BjMYB9。

所述BjMYB9蛋白或所述核酸分子在調(diào)控植物抗病性中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，所述調(diào)控植物抗病具體體現(xiàn)為提高植物對葡萄灰霉病菌的抗性。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種培育抗病性轉(zhuǎn)基因植物的方法。

所述BjMYB9基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入目的植物中，攜帶有所述BjMYB9基因的重組表達(dá)載體可通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化目的植物，獲得抗病性轉(zhuǎn)基因植株。所述目的植物既可以是雙子葉植物也可以是單子葉植物。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述植物具體為雙子葉植物哥倫比亞生態(tài)型擬南芥Col-0。

所述BjMYB9作為轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。BjMYB9能與W-box-like順式作用元件(GTAGTGACTCAT)結(jié)合，且具有激活功能。

本發(fā)明所提供的BjMYB9可以在葡萄灰霉病菌的誘導(dǎo)性下表達(dá)，可以特異結(jié)合W-box-like順式元件(GTAGTGACTCA，核心序列為TGAC)，是通過酵母單雜交技術(shù)篩選 到能夠和芥菜幾丁質(zhì)酶基因BjCHI1的啟動(dòng)子BjC-P中的真菌誘導(dǎo)核心元件W-box-like-4(GTAGTGACTCA)特異結(jié)合的R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)一步凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)和煙草瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)證明BjMYB9能夠和W-box-like-4特異結(jié)合并激活該啟動(dòng)子活性。BjMYB9基因在芥菜中RNA表達(dá)明顯受到真菌的誘導(dǎo)表達(dá)，該基因在模式植物擬南芥過表達(dá)后能夠明顯增強(qiáng)擬南芥對葡萄灰霉菌的抗性，可以提高植物對葡萄灰霉病菌的抗病能力，為揭示植物抗病機(jī)制及培育抗病品種提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和基因資源。本發(fā)明的BjMYB9將在提高植物病原真菌葡萄灰霉菌的抗性育種中發(fā)揮重要的作用。本發(fā)明首次證明R2R3-MYB蛋白質(zhì)可以與W-box-like元件互作，進(jìn)而介導(dǎo)植物對真菌侵染的防御作用，為W-box元件和互作蛋白之間的作用機(jī)制提供了新的詮釋，也將為培育能夠增強(qiáng)植物對活體營養(yǎng)性病原菌的抗性品種提供新的思路和基因資源。

附圖說明

圖1為酵母單雜交誘餌Bait和Bait-m序列示意圖以及Bait和Prey載體結(jié)構(gòu)示意圖。(A)野生型誘餌片段Bait和其突變體片段Bait-m序列示意圖。誘餌片段Bait和Bait-m序列示意圖：BjC-P啟動(dòng)子片段-700～-621(白框顯示)和-409～-371(灰框顯示)融合為誘餌序列，框上面的數(shù)字表明BjC-P啟動(dòng)子片段的核苷酸位置，W-box-like-4元件及其突變體序列被顯示，核心序列TGAC及其突變序列GCAA用粗體顯示；(B)誘餌和Prey載體結(jié)構(gòu)示意圖：Bait和Bait-m片段分別插入在pBait-AbAi載體上AbA^r報(bào)告基因的上游，芥菜cDNAs插入在pGADT7載體Sfi I位置，GAL4AD基因下游，報(bào)告基因LEU2基因上游，構(gòu)建成芥菜cDNA文庫。

圖2為BjMYB9的酵母單雜交篩選。酵母單雜交技術(shù)篩選和W-box-like-4元件互作的蛋白因子，其中：(A)通過SD/-Ura/AbA缺陷型培養(yǎng)基確定酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的Aureobasidin A(AbA)最適抑制自激活濃度。Aureobasidin A(AbA)是一種環(huán)酯肽抗生素，低濃度的AbA能夠抑制酵母Y1HGold的生長；但誘餌酵母中含有AbA抗性基因(AUR1-C)，當(dāng)獵物蛋白與誘餌片段互作時(shí)，GAL4AD就會(huì)激活A(yù)UR1-C基因的表達(dá)，誘餌酵母就能夠獲得AbA的抗性。為了確保獵物蛋白來自cDNA文庫，而非酵母內(nèi)源蛋白，在篩選cDNA文庫前要嚴(yán)格測試抑制誘餌酵母菌株Y1HGold[pBait1-AbAi]、Y1HGold[pBait1-m-AbAi]自激活最適AbA濃度，結(jié)果顯示報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的AbA最適抑制濃度為550ng/ml；(B)酵母單雜交技術(shù)Y1H篩選芥菜cDNA文庫：pGADT7-BjcDNAs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]，然后在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)上篩 選，利用不含AbA的培養(yǎng)基SD/-Leu作為對照，驗(yàn)證酵母轉(zhuǎn)化效率，箭頭表示篩選出的陽性克??；(C)BjMYB9與W-box-like-4元件互作，但與突變的W-box-like-4不互作。從篩選出的陽性克隆(如圖2B所示)分離出的質(zhì)粒pGADT7-BjMYB9重新分別轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]，然后分別在SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰培養(yǎng)基上篩選，結(jié)果pGADT7-BjMYB9質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株Y1H gold[pBait-AbAi]后能夠在SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰培養(yǎng)基上長出健康的克隆，但是pGADT7-BjMYB9轉(zhuǎn)化突變體酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-m-AbAi]不能長出健康的克隆?？召|(zhì)粒pGADT7作為篩選陽性互作克隆的陰性對照，不含抗生素的SD/-Leu平板篩選用來驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率。

圖3為BjMYB9受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)時(shí)熒光定量(Real-time)PCR圖譜。用200μg/ml的真菌激發(fā)子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)處理芥菜(Brassica juncea)幼苗葉面，保鮮袋保濕12h，然后分24、48和72h取葉片，速凍于液氮用于提取RNA及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析，檢測BjMYB9在這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA表達(dá)水平。0h的RNA表達(dá)水平作為對照，未真菌激發(fā)子處理。選用芥菜持家基因BjActin作為內(nèi)參(序列見表1)。數(shù)據(jù)顯示為平均值±SD，重復(fù)次數(shù)為3次(n＝3)。BjMYB9受到真菌激發(fā)子的誘導(dǎo)表達(dá)，在48hRNA表達(dá)水平達(dá)到最高，之后又開始下降。

圖4為T₃代BjMYB9轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥對葡萄灰霉病菌(Botrytis cinerea)抗病表型。(A)野生型擬南芥Col-0(WT)和3個(gè)BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(#1，#2，#6)在接種葡萄灰病(Botrytis cinerea)3周后的感/抗病表型。；(B)qRT-PCR檢測野生型擬南芥Col-0(WT)和3個(gè)BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系(#1，#2，#6)在接種后葡萄灰霉病的生物量；(C)qRT-PCR分析BjMYB9在轉(zhuǎn)基因擬芥接種葡萄灰霉病(Botrytis cinerea)前后的RNA表達(dá)。BjMYB9在野生型擬南芥Col-0(WT)中的表達(dá)作為參照。結(jié)果顯示BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥增強(qiáng)了對葡萄灰霉病菌的抗性。

圖5為His-BjMYB9融合蛋白與W-box-like-4元件的體外特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)檢測BjMYB9和W-box-like元件的體外互作：(A)探針W4、W4突變體W4d和W5的核苷酸序列，W4含有W-box-like-4元件，W4d含有突變的W-box-like-4，核心元件序列TGAC缺失，用(----)顯示，W5含有W-box-like-5元件，這些元件序列均用粗體和下劃線突出顯示。其中W5中的W-box-like-5元件與W-box-like-4元件僅1個(gè)堿基(C，用大寫及斜體顯示)的差別；(B)His-BjMYB9融合蛋白與W4和W4d之間的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)，每個(gè)結(jié)合反應(yīng)均用等量的His-BjMYB9融合蛋白和生物素標(biāo)記探針，競爭性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中未標(biāo)記生物素的冷探針分別為熱探針(標(biāo)記生物素)的50和200倍， 結(jié)合探針和自由探針的條帶如圖左邊箭頭所示；(C)His-BjMYB9融合蛋白與W4和W5之間的凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)，每個(gè)結(jié)合反應(yīng)均用等量探針，His-BjMYB9融合蛋白呈梯度濃度增加。

圖6為His-BjMYB9融合蛋白與W-box-like-4元件的體內(nèi)特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)。(A)BjC-P，GUS表達(dá)質(zhì)粒P16，P53和BjMYB9過表達(dá)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖。淺灰框代表BjC-P和其缺失片段，框上面的數(shù)字代表相對于BjCHI1轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)核苷酸的位置。含有紋理小框的的深灰框代表含有內(nèi)含子(內(nèi)含子用帶有紋理的框顯示)的GUS基因。P53中的小白框代表W-box-like-4元件中的TGAC堿基缺失；(B)GUS組織化學(xué)染色，圓的虛線框代表注射的區(qū)域，注射的質(zhì)粒如圖中所示；(C)P16和P53在煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)后的GUS活性熒光定量分析：煙草葉片共注射P16和pBjMYB9，pBI121-LUCint以及P53和pBjMYB9，pBI121-LUCint，GUS活性通過LUC活性均一化。柱形圖代表被pBjMYB9誘導(dǎo)后與誘導(dǎo)前的GUS活性比值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，圖為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)誤差。結(jié)果顯示BjMYB9通過結(jié)合W-box-like-4元件進(jìn)而激活BjC-P活性。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是對本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、BjMYB9的分子克隆

一.植物及生長條件

植物擬南芥Arabidopsis thaliana(L.)(生態(tài)型Col-0)，本名煙Nicotiana.benthamiana和芥菜Brassica juncea在22℃(光)/19℃(黑暗)及16h光照/8小時(shí)黑暗周期條件下生長。擬南芥用于穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化，本名煙Nicotiana.benthamiana用來瞬時(shí)表達(dá)，芥菜Brassica juncea用來構(gòu)建cDNA文庫和內(nèi)源性基因表達(dá)分析實(shí)驗(yàn)。

二.酵母單雜交實(shí)驗(yàn)篩選與W-box-like-4元件互作的轉(zhuǎn)錄因子

用200μg/ml的真菌激發(fā)子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)(Raventos et al.,1995)葉面噴灑處理芥菜幼苗，分別于處理后12、24、48和72h取葉片速凍于液氮中，將不同時(shí)間段所取葉片樣品混合并提取總RNA，用來構(gòu)建芥菜cDNA文庫。構(gòu)建cDNA文庫所用載體為pGADT7(Clontech Laboratories,Inc.,a Takara Bio Company)，誘餌載體為pAbAi(Clontech Laboratories,Inc.,a Takara Bio Company)。芥菜cDNA插入在pGADT7載體Sfi I位點(diǎn)，位于 GAL4AD基因下游，報(bào)告基因LEU2基因上游，構(gòu)建成芥菜cDNA文庫質(zhì)粒(參見圖1)。野生型誘餌片段Bait為BjC-P含有真菌誘導(dǎo)核心元件序列(GTAGTGACTCAT)的區(qū)段(-700～-621)和與其協(xié)同作用的區(qū)段(-409～-371)相連而成的片段，長度為125bp(參見圖1)。突變體誘餌片段為Bait-m，其Bait中真菌誘導(dǎo)核心元件序列(GTAGTGACTCAT)的保守堿基TGAC突變?yōu)镚CAA，其它序列與野生型Bait序列完全一致(參見圖1)。Bait核苷酸序列為5′-CTCTGCTAGAGATAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGTGACTCATGAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCATATATCGTGTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGTCCAGCTATCGTGTAGAAATATT-3′，Bait-m核苷酸序列為5′-CTCTGCTAGAGATAGTGTGGCCCAGCTAGTGAGTAGGCAATCATGAGGTAGAGAGAGGGTGGTCCATCATATATCGTGTTGCATGCGCTAGAGAGAGGGTGGTCCAGCTATCGTGTAGA AATATT-3′。Bait和Bait-m分別以質(zhì)粒P16和P54(Gao et al.,2014)為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增用引物見表1。引物對pAbAi-Seq1/pAbAi-Seq2(見表1)用來驗(yàn)證pBait-AbAi載體是否整合入酵母基因組中。引物對PGADT7-F/PGADT7-R(見表1)用來鑒定酵母單雜交(Y1H)篩選出的陽性克隆。

酵母菌株為Y1HGold，酵母單雜交方法嚴(yán)格按照Clontech公司的實(shí)驗(yàn)手冊操作(Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System User Manual)。結(jié)果如圖2所示：通過SD/-Ura/AbA缺陷型培養(yǎng)基確定酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]和Y1Hgold[pBait-m-AbAi]的Aureobasidin A(AbA)最適抑制自激活濃度為550ng/ml(參見圖2A)。pGADT7-BjcDNAs質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母報(bào)告菌株Y1Hgold[pBait-AbAi]，然后在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)篩選，利用不含AbA的培養(yǎng)基SD/-Leu作為對照，驗(yàn)證酵母轉(zhuǎn)化效率。如圖2B所示，在不含AbA的培養(yǎng)基SD/-Leu，克隆生長正常且克隆數(shù)較多，說明轉(zhuǎn)化效率正常。在含有550ng/ml AbA的SD/-Leu培養(yǎng)基上(SD/-Leu/+AbA⁵⁵⁰)生長有一定數(shù)量的克隆，如箭頭所示，表示篩選出的陽性克隆。圖2C顯示通過酵母單雜交技術(shù)獲得與W-box-like-4元件特異結(jié)合的R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子BjMYB9。該基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其開放閱讀框?yàn)樾蛄?整個(gè)序列。BjMYB9基因編碼序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白質(zhì)(命名為BjMYB9蛋白)，BjMYB9蛋白由220個(gè)氨基酸殘基組成，具有2個(gè)保守的R2R3-MYB結(jié)構(gòu)域。

表1運(yùn)用在BjMYB9研究中的引物

實(shí)施例2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析BjMYB9基因受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)后的RNA表達(dá)

一.材料處理

芥菜(Brassica juncea)幼苗葉片用200μg/ml真菌激發(fā)子(hexa-Nacetyl-chitohexaose)噴灑處理，在處理后24、48、72h及對照0h(未處理)取樣，于液氮中速凍研碎，采用TIANGEN公司的植物總RNA提取試劑盒提取芥菜總RNA，并用無RNAase污染的DNAase處理，去除RNA中基因組DNA的污染。并用TIANGEN公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA第一鏈用作實(shí)時(shí)定量PCR分析。

二.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

實(shí)時(shí)定量PCR運(yùn)用SYBR Green Premix(天根公司，北京，中國)和ABI 7500快速實(shí)時(shí)定 量PCR儀(Applied Biosystems,Foster city,CA,USA)進(jìn)行，具體步驟參見試劑盒的使用說明和實(shí)時(shí)定量PCR儀的操作說明。芥菜持家基因BjActin(引物序列見表1)作為內(nèi)參基因，通過其在不同樣品間的表達(dá)水平對不同樣品的PCR產(chǎn)物進(jìn)行水平校正。對所有樣品的實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物都進(jìn)行溶解曲線分析，以確保反應(yīng)產(chǎn)物為一種特異的產(chǎn)物。運(yùn)用2^-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen,2001)對BjMYB9在芥菜接種葡萄灰霉病菌前后的RNA表達(dá)進(jìn)行分析，檢測用引物對BjMYB9F3/BjMYB9R2和BjActin-F/BjActin-R序列見表1。BjMYB9受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)后在芥菜中的RNA表達(dá)結(jié)果見圖3。

圖3結(jié)果表明：芥菜受真菌激發(fā)子誘導(dǎo)后，內(nèi)源基因BjMYB9的表達(dá)明顯受到誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)48小時(shí)表達(dá)水平達(dá)到最高，之后表達(dá)水平開始下降。

實(shí)施例3、BjMYB9抗葡萄灰霉病表型檢測

一.BjMYB9對擬南芥Col-0的遺傳轉(zhuǎn)化

BjMYB9 cDNA運(yùn)用引物對BjMYB9-F2/BjMYB9-R(序列見表1)擴(kuò)增，測序正確并克隆進(jìn)pCAMBIA1307載體BamH I和Sal I位點(diǎn)，獲得35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒pCAMBIA1307-BjMYB9。運(yùn)用花頂端法并通過農(nóng)桿菌EHA 105介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥(Clough and Bent,1998)。陽性轉(zhuǎn)基因株系運(yùn)用引物BjMYB9-F2/BjMYB9-R并通過PCR檢測。3個(gè)獨(dú)立的T2代陽性轉(zhuǎn)基因株系在含有40μg/ml潮霉素的MS培養(yǎng)基再次篩選，后移栽到土里，約4周大時(shí)進(jìn)行葡萄灰霉病菌接種處理。

二.葡萄灰霉病菌(B.cinerea)的培養(yǎng)及對擬南芥的接種處理

葡萄灰霉病菌(B.cinerea)在土豆培養(yǎng)基(土豆200g/l,葡萄糖20g/l,瓊脂15g/l,1.5％右旋糖，pH 6.0)，22℃條件下培養(yǎng)10天。葡萄灰霉病菌的孢子用無菌ddH₂O懸浮，然后用2層無菌紗布過濾，并用無菌ddH₂O稀釋至5×10⁵個(gè)細(xì)胞/毫升，用于接種擬南芥。4周大的擬南芥進(jìn)行葡萄灰霉病噴霧接種，無菌ddH₂O噴霧接種作為對照。

接種結(jié)果見圖4A。由圖4A知：接種葡萄灰霉病菌后，野生型擬南芥的葉片大多干枯，而BjMYB9轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片大多仍然表現(xiàn)鮮綠，特別是2號(hào)株系葉片基本保持全綠。

三.BjMYB9，BcITS在BjMYB9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系接種葡萄灰霉病菌前后的RNA表達(dá)分析

qRT-PCR方法檢測BjMYB9，BcITS在BjMYB9轉(zhuǎn)基因擬南芥株系以及野生型擬南芥接種葡萄灰霉病菌前后RNA表達(dá)，檢測方法同實(shí)施例2中的qRT-PCR方法。擬南芥持家基因Atactin基因(引物序列見表1)作為內(nèi)參基因，檢測用引物對BjMYB9F3/BjMYB9R2和BcITS-F/BcITS-R序列見表1。檢測結(jié)果見圖4B和圖4C。

圖4B結(jié)果表明：野生型擬南芥Col-0和BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系接種葡萄 灰霉病菌后，BcITS在BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中的表達(dá)量較野生型明顯降低，說明葡萄灰霉病菌在BjMYB9過表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥株系中生長量明顯低于野生型，進(jìn)一步說明BjMYB9對葡萄灰霉病菌的抵抗作用。圖4C結(jié)果表明：BjMYB9在其轉(zhuǎn)基因擬南芥中的表達(dá)量較野生型明顯增強(qiáng)，當(dāng)接種葡萄灰霉病菌后表達(dá)量又進(jìn)一步增強(qiáng)。

實(shí)施例4、His-BjMYB9與W-box-like-4元件的體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)

一.His-BjMYB9在大腸桿菌中表達(dá)

BjMYB9通過引物對BjMYB9-F1/BjMYB9-R(見表1)擴(kuò)增，然后構(gòu)建入蛋白表達(dá)載體pET-28a(+)EcoR I和Sal I位點(diǎn)，獲得原核表達(dá)載體pET-28a-BjMYB9。將pET-28a-BjMYB9熱擊轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株E.coli Rosetta(DE3)進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)。在37度條件下含有pET-28a-BjMYB9質(zhì)粒的DE3菌的濃度搖至OD600為0.8時(shí)，轉(zhuǎn)為16度，用0.6mM isopropyl-D-thiogalactoside(IPTG)低溫誘導(dǎo)過夜。收獲細(xì)胞，然后用裂解緩沖液(含有50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉和10mM咪唑，pH 8.0)懸浮并超聲破碎細(xì)胞，高速離心后，裂解上清用Ni²⁺親和珠結(jié)合(Ni-NTA,QIAGEN)，方法按照產(chǎn)品說明書。純化的His-BjMYB9融合蛋白用于EMSA實(shí)驗(yàn)。

二.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)

凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)(EMSA)方法基本參見文章描述(Wang et al.,2014)，稍作調(diào)整。為了鑒定BjMYB9的結(jié)合位點(diǎn)，合成互補(bǔ)的含有W-box-like-4元件和其突變體的5′端標(biāo)記或非標(biāo)記生物素的BjC-P寡核苷酸單鏈，并退火獲得雙鏈寡核苷酸片段W4，W4d(W4的突變體)和W5。寡核苷酸序列單鏈如下：W4F(5′-gcccagctagtgagtagtgactcatgaggtagagagaggg-3′)，W4R(5′-ccctctctctacctcatgagtcactactcactagctgggc-3)，W4RBio(5′-ccctctctctacctcatgagtcactactcactagctgggc-3′,5′-biotin-labeled)，W4d-F(5′-gcccagctagtgagtagtcatgaggtagagagaggg-3′)，W4d-R(5′-ccctctctctacctcatgactactcactagctgggc-3′)，W4dRBio(5′-ccctctctctacctcatgactactcactagctgggc-3′，5′-biotin-labeled)，W5F(5′-agggtggtccctctagtgactcatgagctagagagagggt-3′)，W5R(5′-accctctctctagctcatgagtcactagagggaccaccct-3′)，W5RBio(5′-accctctctctagctcatgagtcactagagggaccaccct-3′，5′-biotin-labeled)。EMSA結(jié)合反應(yīng)體系為10mM Tris鹽酸(pH 7.5)，50mM氯化鈉，1mM乙二胺四乙酸鈉(pH 7.5)，2mM二硫蘇糖醇，30％甘油，1mM氯化鎂，0.01％牛血清白蛋白(BSA)，0.1mg/ml魚精DNA，40fmol生物素標(biāo)記DNA，0-8pmol非標(biāo)記DNA，15fmol His融合蛋白。先在室溫進(jìn)行30分鐘 的競爭性結(jié)合反應(yīng)，然后再進(jìn)行30分鐘的生物素標(biāo)記探針的結(jié)合反應(yīng)。之后用8％非變性凝膠電泳，轉(zhuǎn)尼龍膜，用交聯(lián)儀(CL-1000Ultraviolet Crosslinker)在120mJ/cm²條件下交聯(lián)1分鐘。免疫染色嚴(yán)格按照Light ShiftR Chemiluminescent EMSA Kit試劑盒說明書進(jìn)行(Pierce,Rockford,IL,USA)。

EMSA結(jié)果見圖5，圖5B結(jié)果顯示：BjMYB9能夠與W4特異結(jié)合，而與W4的突變體W4d沒有結(jié)合作用；圖5C結(jié)果顯示：BjMYB9能夠與W4結(jié)合，且隨著His-BjMYB9蛋白含量的逐漸增多，結(jié)合條帶濃度也增強(qiáng)，但與W5沒有任何結(jié)合作用。此結(jié)果表明BjMYB9能夠在體外與W-box-like-4元件特異結(jié)合。

實(shí)施例5、His-BjMYB9與W-box-like-4元件的體內(nèi)特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)

煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)：

煙草第6葉片完全展開時(shí)進(jìn)行注射。將獲得含陽性質(zhì)粒pBjMYB9的農(nóng)桿菌菌株EHA105、含真菌誘導(dǎo)核心元件的啟動(dòng)子質(zhì)粒p16菌株、含真菌誘導(dǎo)核心元件突變體質(zhì)粒p53菌株及含LUC基因的內(nèi)標(biāo)載體p57菌株(Gao et al.,2014)，培養(yǎng)在含卡那霉素(50μg/ml)和利福平(30μg/ml)的LB培養(yǎng)基上，28℃生長2天，用MMA緩沖液(10mM氯化鎂，1mM 2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)，pH 5.5，100μM乙酰丁香酮)懸浮，調(diào)節(jié)菌濃度OD600為1.5，28℃培養(yǎng)箱中孵育3小時(shí)。菌液pBjMYB9、內(nèi)標(biāo)載體p57菌液及p16菌液或p53菌液按1∶1∶1混合。用1mL去針頭的塑料注射器，將菌液注入生長約6周的本氏煙第5和6片葉中，48小時(shí)后取一片葉樣進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色，一旦染色即終止反應(yīng)，用梯度酒精脫色，結(jié)果見圖6B。

圖6A顯示芥菜幾丁質(zhì)酶BjCHI1的啟動(dòng)子BjC-P以及其缺失區(qū)段構(gòu)建的GUS表達(dá)質(zhì)粒P16，P53和BjMYB9表達(dá)質(zhì)粒pBjMYB9結(jié)構(gòu)示意圖。其中P16中含有W-box-like-4元件(在-668～-657)，而P53是將W-box-like-4元件中的核心序列TGAC缺失。

圖6B結(jié)果顯示：pBjMYB9質(zhì)粒與P16混合注射后，能夠激活P16質(zhì)粒中的GUS基因表達(dá)，但與P53質(zhì)粒共注射及P16，P53和pBjMYB9單獨(dú)注射均沒有GUS表達(dá)。而P53和P16相比，僅W-box-like-4元件突變，說明BjMYB9能夠體內(nèi)與W-box-like-4特異結(jié)合。

對稱的另一片葉樣用蛋白提取液(CCLR,Promega,Madison,WI,USA)提取總蛋白，離心吸取20μl蛋白提取液加480μl GUS反應(yīng)液(0.1mol/l pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，0.5mol/l乙二胺四乙酸鈉pH 8.0，0.1％Triton X-100，10mmol L–1β巰基乙醇，0.1％月桂?；“彼徕c，1mmol/l 4-甲基傘形酮-beta-D-葡萄糖醛酸酐)混合，迅速吸取反應(yīng)混合液100μl加到900μl反應(yīng)終止液(200mmol/l Na₂CO₃)中，將剩余的反應(yīng)液放37℃水浴鍋中反應(yīng)，30min 后取出，快速吸取100μl反應(yīng)液加到900μl反應(yīng)終止液中混勻，用HITACHI F-4600FLUO-RESCENCE SPECTROPHOTOMETER儀器測0min、30min GUS活性。根據(jù)Promega公司Luciferase Assay System的說明書，20μl蛋白提取液加100μl熒光素酶反應(yīng)(Luciferase Assay Reagent,Promega,Madison,WI,USA)混勻，用TriStar LB 941儀器測LUC活性(Gao et al.,2014)，結(jié)果見圖6C。

圖6C結(jié)果顯示：P16與BjMYB9共注射后GUS活性與P16單獨(dú)注射GUS活性的比值明顯高于P53，進(jìn)一步說明BjMYB9能夠與W-box-like-4體內(nèi)特異結(jié)合，進(jìn)而激活BjC-P的啟動(dòng)子活性。

<110> 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>植物抗病蛋白BjMYB9及其編碼基因和應(yīng)用

<160> 2

<210> 1

<211> 220

<212> 氨基酸

<400> 1

MetGlyValLysGlyLeuThrLeuTyrHisLeuLysSerHisLeuGlnLysPheArgLeuGlyArgGlnAlaCysLysGluSerThrGluAsnSerLysAspAlaSerCysValGlyGluSerGlnAspThrGlySerSerSerSerSerSerLeuArgMetAlaAlaGlnGluGlnAsnGluGlyTyrGlnValThrGluAlaLeuArgAlaGlnMETGluValGlnArgArgLeuHisGluGlnLeuGluTyrGlyGlnValGlnArgArgLeuGlnLeuArgIleGluAlaGlnGlyLysTyrLeuGlnSerIleLeuGluLysAlaCysGlnAlaPheAspAspGlnAlaAlaAlaPheValGlyLeuGluAlaAlaArgGluGluLeuSerGluLeuAlaIleLysValSerGlnGlyThrAlaValProPheLeuAspAlaThrLysMetMetMetMetProSerLeuSerGluLeuGluValAlaIleAspThrLysAsnAsnIleThrThrAsnCysSerValGluSerSerLeuThrSerAsnThrAsnGlySerSerValSerAlaAlaSerMetLysLysArgHisArgGlyAspAspValGlyLeuGlyTyrGluAlaGlyTrpIleValProSerSerThrIleGly

<210> 2

<211> 663

<212> DNA

<400> 2

ATGGGAGTGAAAGGCCTCACCCTCTACCACCTCAAATCACATCTCCAGAAATTCCGGCTAGGGAGGCAAGCTTGTAAAGAATCAACTGAGAACTCCAAGGATGCTTCTTGTGTTGGGGAGAGTCAGGACACAGGTTCATCTTCATCGTCATCACTGAGAATGGCAGCGCAGGAGCAGAACGAGGGTTACCAAGTCACTGAAGCTCTACGCGCTCAAATGGAAGTCCAAAGAAGACTACACGAGCAATTGGAGTATGGGCAGGTACAACGGAGACTCCAGCTGAGGATAGAGGCACAAGGAAAGTACTTACAATCGATCCTTGAGAAAGCTTGCCAGGCCTTTGACGACCAAGCTGCTGCTTTTGTTGGGCTCGAGGCAGCTAGGGAAGAGCTATCAGAGCTAGCCATCAAAGTGTCTCAAGGAACAGCAGTCCCGTTCTTAGATGCAACAAAGATGATGATGATGCCATCTTTGTCTGAGCTTGAAGTAGCGATAGACACCAAAAACAACATCACAACCAACTGTTCGGTTGAAAGCTCTCTGACTTCCAACACCAATGGGAGCTCGGTTTCTGCTGCATCGATGAAGAAGCGGCATCGTGGAGACGATGTAGGCCTAGGGTACGAGGCAGGGTGGATTGTGCCTAGTAGTACCATTGGATAA