本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種植物種子粒重相關(guān)蛋白GmGA20ox2及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：大豆蘊(yùn)含豐富營養(yǎng)價(jià)值，是提供糧油和飼料的重要經(jīng)濟(jì)作物。在工業(yè)生產(chǎn)中大豆油也有很多用途，例如生物燃料、表面活性劑、軟化劑等。中國曾是世界最大的大豆生產(chǎn)國，然而近年來，我國大豆生產(chǎn)只占需求的三分之一，致使中國成為全球最大的大豆進(jìn)口國，進(jìn)口總額為全球大豆總出口量的一半。近50年來，我國大豆生產(chǎn)僅增長了62％，而其他糧食作物已增長了5倍以上，大豆生產(chǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于我國國內(nèi)其他糧食作物發(fā)展的步伐，不能滿足國民需要。因此提高大豆單產(chǎn)已成為目前亟待解決的問題。種子的重量(粒重)在作物生產(chǎn)中的一個(gè)重要指標(biāo)，是影響作物產(chǎn)量的重要農(nóng)藝性狀之一。植物可以通過增加種子粒重來達(dá)到增產(chǎn)的目的。一般認(rèn)為，種子粒重是數(shù)量性狀，由多個(gè)基因決定。千粒重是以克表示的一千粒種子的重量，百粒重是以克表示的一百粒種子的重量，它們是體現(xiàn)種子大小與飽滿程度的一項(xiàng)指標(biāo)，是檢驗(yàn)種子質(zhì)量和作物考種的內(nèi)容，也是田間預(yù)測產(chǎn)量時(shí)的重要依據(jù)。測定小粒種子千粒重的常規(guī)方法為：隨機(jī)數(shù)出三個(gè)一千粒種子，分別稱重，求其平均值。測定大粒種子百粒重的常規(guī)方法為：取三個(gè)一百粒分別稱重，取其平均值，稱百粒重。大豆產(chǎn)量由株型、結(jié)莢率、莢粒數(shù)、種子百粒重等因素組成,其中粒重是遺傳力最高的因素。粒重對產(chǎn)量的影響不限于豆科植物，也存在于其它單、雙子葉植物，因此成為作物品種選育過程中要考慮的重要選擇性狀。已有的研究表明，種子粒重受栽培環(huán)境和遺傳的影響，在正常的栽培條件下，遺傳(也即相關(guān)基因)起重要作用，因此與粒重相關(guān)的分子機(jī)制的研究成為熱點(diǎn)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物種子粒重相關(guān)蛋白GmGA20ox2及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，來源于大豆，命名為GmGA20ox2蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物種子粒重相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述GmGA20ox2蛋白的基因(命名為GmGA20ox2基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述GmGA20ox2基因具體可為如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：(1)編碼區(qū)如序列表的序列2所示的DNA分子；(2)在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物種子粒重相關(guān)蛋白的DNA分子；(3)與1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼植物種子粒重相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為為：50℃，在7％SDS、0.5MNa3PO4和1mMEDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述嚴(yán)格條件也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。含有所述GmGA20ox2基因的表達(dá)盒、重組載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述基因的重組表達(dá)載體。所述表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用所述基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨(dú)使用或與其它的啟動子結(jié)合使用；此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄 起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于進(jìn)行鑒定及篩選，可對所述重組表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。所述重組載體具體可為重組表達(dá)載體。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述GmGA20ox2基因?qū)氡磉_(dá)載體pGWB411得到的重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述GmGA20ox2基因?qū)肽康闹参镏?，得到種子粒重和/或種子百粒重和/或種子千粒重高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述GmGA20ox2基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述方法中，所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述GmGA20ox2基因具體可通過所述重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為十字花科植物，具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明還保護(hù)所述GmGA20ox2蛋白在調(diào)節(jié)植物種子重量中的應(yīng)用。所述調(diào)節(jié)種子重量具體可為提高種子粒重和/或種子百粒重和/或種子千粒重。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為十字花科植物，具體可為擬南芥，更具體可為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明對于提高作物產(chǎn)量，培育高產(chǎn)品種具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。附圖說明圖1為大豆Williams82的7個(gè)階段的種子照片。圖2為實(shí)施例1中，GmGA20ox2基因的相對表達(dá)量。圖3為質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)元件示意圖。圖4為實(shí)施例2中，GmGA20ox2基因的相對表達(dá)量。圖5為千粒重的結(jié)果。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。大豆材料：大豆Williams82記載在如下文獻(xiàn)中：ScottAJackson等，Genomesequenceofthepalaeopolyploidsoybean,Nature,2010,Vol.463,178-183；公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得；該大豆材料為美國栽培品種，由PurdueUniversity,DepartmentofAgronomy,ScottJackson教授贈送?？寺≥d體8/GW/TOPO(結(jié)構(gòu)示意圖見圖3A，具有重組位點(diǎn)attL1和attL2)：invitrogen公司。表達(dá)載體pGWB411(具有重組位點(diǎn)attR1和attR2)記載在如下文獻(xiàn)中：DepartmentofMolecularandFunctionalGenomics,ShimaneUniversity,Aatsue,Shimane690-8504,Japan,E.mail:tnakagaw@life.shimane-u.ac.jpIsuyoshiNakagawa,etal.,GatwayVectorsforPlantTransformation,PlantBiotechnology,2009,26,275-284。由TsuyoshiNakagawa博士提供，公眾得到TsuyoshiNakagawa博士同意后可從中科院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。農(nóng)桿菌GV3101，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，記載在如下文獻(xiàn)中：LeeCW等，AgrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinArabidopsisthaliana,PlantCell,2009,21(9),2948-62。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)：ArabidopsisBiologicalResourceCenter(ABRC)。實(shí)施例1、GmGA20ox2蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)以大豆種子重量為標(biāo)準(zhǔn)，將大豆發(fā)育過程分成7個(gè)階段。具體標(biāo)準(zhǔn)為發(fā)育中種子占飽滿但尚沒脫水種子的重量百分比。階段1至階段7對應(yīng)的重量百分比依次為4％、8％、12％、16％、24％、48％、96％。大豆Williams82的7個(gè)階段的種子照片見圖1。對階段3和階段5的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序比對,獲得了在階段6高表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,其中包括一個(gè)開放閱讀框，其對應(yīng)的DNA序列如序列表的序列2所示，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)命名為GmGA20ox2蛋白，將編碼GmGA20ox2蛋白的DNA分子命名為GmGA20ox2基因。對GmGA20ox2基因在大豆種子發(fā)育過程中的表達(dá)特征進(jìn)行驗(yàn)證。分別提取大豆Williams82的苗、葉、莢以及階段1至階段6的種子的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行RealTime-PCR分析。用于檢測GmGA20ox2基因引物的為：TAGGAACTGGACCTCATTGTGACC和AGGAGCGACAGAGTACCATCTTC。將大豆Tublin基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，用于檢測Tublin基因的引物為：Primer-TF：AACCTCCTCCTCATCGTACT和Primer-TR：GACAGCATCAGCCATGTTCA-3’。GmGA20ox2基因的相對表達(dá)量見圖2。在苗、葉和莢中均難以檢測到GmGA20ox2基因的表達(dá)。在種子發(fā)育過程中，階段1、階段2、階段3、階段4的表達(dá)水平雖有起伏，但總體上變化不太大，至階段5明顯上升，而至階段6開始下降。種子處于階段1、階段2、階段3、階段4、階段5和階段6時(shí)，GmGA20ox2基因相對表達(dá)量依次為100、150、120、140、360和235。實(shí)施例2、GmGA20ox2蛋白的功能鑒定一、重組質(zhì)粒的構(gòu)建1、提取大豆Williams82的幼苗的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用GmGA20ox2-up和GmGA20ox2-dp組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。GmGA20ox2-up：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGCTAGTTCCTCATCCTTC-3’(序列3)；GmGA20ox2-dp：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGTTTATAGATTTTGTTGGCCATGG-3’(序列4)。3、將步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與克隆載體8/GW/TOPO連接，得到重組質(zhì)粒。4、步驟3得到的重組質(zhì)粒與表達(dá)載體pGWB411發(fā)生LR重組，得到重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：LR重組產(chǎn)生attB1和attB2位點(diǎn)，兩個(gè)位點(diǎn)之間為GmGA20ox2基因。重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2的元件示意圖見圖3B。二、轉(zhuǎn)基因植物的制備1、將重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、將步驟1得到的重組農(nóng)桿菌通過抽真空法轉(zhuǎn)化哥倫比生態(tài)型擬南芥(Clough-SJ,Bent-AF.Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.Plant-Journal.1998,16:6,735-743)，然后培養(yǎng)植株并收獲種子。3、將步驟2得到的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基平板上，存活的植株長至4-6葉時(shí)移到蛭石上生長，即為T1代植株，培養(yǎng)T1代植株，并單株收獲種子。4、將T1代植株的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基平板上，存活的植株長至4-6葉時(shí)移到蛭石上生長，即為T2代植株，培養(yǎng)T2代植株，并單株收獲種子。5、將T2代植株的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基平板上，存活的植株長至4-6葉時(shí)移到蛭石上生長，即為T3代植株，培養(yǎng)T3代植株，并單株收獲種子。6、將T3代植株的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基平板上，所有植株均可存活，植株長至4-6葉時(shí)移到蛭石上生長，即為T4代植株(純合的轉(zhuǎn)GmGA20ox2基因植株)，培養(yǎng)T4代植株，并單株收獲種子。7、將T4代植株的種子播種于含50mg/L卡那霉素的MS篩選培養(yǎng)基平板上，所有植株均可存活，植株長至4-6葉時(shí)移到蛭石上生長，即為T5代植株(純合的轉(zhuǎn)GmGA20ox2基因植株)。三、轉(zhuǎn)基因植物的分子鑒定步驟二獲得了17個(gè)遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)GmGA20ox2基因純合株系，隨機(jī)取其中三個(gè)株系(OE-9、OE-12和OE-16)進(jìn)行如下鑒定：每個(gè)株系取15株T5代植株幼苗，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行RealTime-PCR(引物對：TAGGAACTGGACCTCATTGTGACC和AGGAGCGACAGAGTACCATCTTC)。以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥作為對照植株。以AtActin2基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，用于鑒定內(nèi)標(biāo)的引物對為：ATGCCCAGAAGTCTTGTTCC和TGCTCATACGGTCAGCGATA。結(jié)果見圖4。OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系中GmGA20ox2基因的相對表達(dá)量約為1.0、1.3和2.1，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中未能檢測出GmGA20ox2基因的表達(dá)。四、轉(zhuǎn)空載體植株的獲得用表達(dá)載體pGWB411代替重組質(zhì)粒pGWB411-GmGA20ox2進(jìn)行步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體擬南芥。五、千粒重測定將轉(zhuǎn)空載體擬南芥、OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系分別進(jìn)行如下鑒定：每個(gè)株系取24株T5代植株，在相同條件下培養(yǎng)并收獲籽粒，稱取千粒重。在相同條件下培養(yǎng)24株哥倫比亞生態(tài)型擬南芥并收獲籽粒，稱取千粒重。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，千粒重結(jié)果取平均值。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、轉(zhuǎn)空載體擬南芥、OE-9株系、OE-12株系和OE-16株系的植株表型(如蓮座、株高等)均未見明顯差異。千粒重結(jié)果見圖5。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥、OE-6株系、OE-12株系和OE-16株系的籽粒千粒重分別為15.3±4.0、25.2±3.8、26.3±2.5和34.2±2.4。轉(zhuǎn)空載體擬南芥的籽粒千粒重與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥沒有顯著差異。結(jié)果表明，GmGA20ox2蛋白與種子重量相關(guān)，GmGA20ox2基因的過量表達(dá)提高了種子千粒重，并且其在提高轉(zhuǎn)基因植株種子重量的同時(shí)，不影響植株的正常生長。因此，GmGA20ox2基因可作為提高植物種子產(chǎn)量的目的基因。當(dāng)前第1頁1 2 3