本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物學技術及生物化學與分子生物學技術領域，具體涉及一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP，還涉及其在提高植物抗病性中應用。

背景技術：

蛋白激發(fā)子能誘導植物的抗性，增強植物對多種病原菌的防御能力，且不產(chǎn)生毒副作用和不引起病原菌的抗性特點，在植物病害生物防治中的作用越來越受到關注。目前蛋白激發(fā)子在誘導植物抗性上已展現(xiàn)出較好的應用前景，然而已報道的蛋白激發(fā)子多來源于細菌hapin蛋白，源于真菌的蛋白激發(fā)子發(fā)現(xiàn)較少。

真菌具有很豐富的抗病毒活性物質的資源，蛋白多肽類是其中重要的一類。研究證明，蛋白激發(fā)子編碼基因是重要的新基因資源，結合蛋白激發(fā)子新基因的挖掘與轉基因植物功能研究將有利于生物防治新途徑的開拓和培育出優(yōu)良的作物新品種(唐宏琨等2010)。目前關于真菌蛋白激發(fā)子的報道有，研究人員從叢梗孢菌(Monilinia fructicola)菌絲體、發(fā)酵液或細胞壁中分離得到不同的蛋白激發(fā)子(崔彥玲2003)；疫霉屬(Phytophthora sp.)分泌的Elicitin，能使煙草發(fā)生過敏性反應并誘導產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性(Kamoun et al 2001)，能強烈的激活植物的過敏反應(Chen 1991；Du 1997)；從交鏈孢菌、木霉菌和鐮刀菌等真菌中分離純化得到的新型激活蛋白(郭廣君等2003)，激活蛋白能通過激發(fā)植物體的代謝調(diào)控，增強植物免疫力，進一步提高植物葉綠素的含量和促進根莖葉的生長，提高作物產(chǎn)量(唐宏琨等2010；孫伯欣等2005)；從尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)分離的Nep1-like proteins(NLPs)蛋白(Gijzen 2006)，研究表明NLPs蛋白在較低的濃度下即可提高植物防御酶的活性。在多種雙子葉植物中，NLPs能夠激活植物的抗性相關反應，如形成植保素、產(chǎn)生乙烯信號分子、上調(diào)表達抗性相關基因及細胞死亡等(Fellbrich 2002)。

蛋白激發(fā)子能夠激發(fā)植物發(fā)生防御反應，對植物誘導產(chǎn)生抗性的主要結果包括：引起植物的過敏反應和誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)性抗性。過敏反應為植物抵御病原菌的反應之一，通過信號分子傳遞，程序性死亡相關基因在病原菌侵染部位的細胞表達，導致該細胞及周圍細胞死亡，使得病原菌困于壞死細胞中進而減少其危害(Lindgren et al 1997)；同時，未被侵染的植物部位也擁有了相關的抗性，這可能是由相關基因的表達引起，或是由于抗性物質的轉移和運輸導致。這些過程都需要信號分子參與及信號通道的介導(Zhao et al 2005)。

我國農(nóng)作物的病毒病發(fā)生嚴重，造成了巨大的經(jīng)濟損失，所以解決作物病毒病的問題至關重要。由于環(huán)境安全問題的日益突出，化學農(nóng)藥的使用受到更多的限制，因而植保工作者 將研究重點逐漸轉移到天然抗病毒物質上。通過對大量源自微生物的天然產(chǎn)物的篩選,尋找發(fā)現(xiàn)新的抗病毒物質。這有利于植物病毒抑制物篩選譜的擴大，新的抗植物病毒抑制物的獲得，為研制出新型多功能蛋白質藥物奠定較好的基礎。

在已報道研究基礎上，我們從長勢良好的煙草根際土壤中分離出真菌并篩選，得到抗病毒效果最好的菌株，選出發(fā)酵液中含有蛋白激發(fā)子的青霉XF6菌株，利用不同的蛋白純化技術從青霉XF6菌株的發(fā)酵液中分離能引起非寄主植物煙草過敏性反應的蛋白激發(fā)子，研究該蛋白誘導煙草獲得系統(tǒng)抗性的機制，包括煙草早期信號事件的發(fā)生，防御相關酶活性的變化，防衛(wèi)物質的產(chǎn)生和積累以及與防御相關抗性基因的表達等，其作用機制成為新蛋白激發(fā)子控制植物病害和提高植物抗性的理論依據(jù)。有望在減少化學農(nóng)藥使用量、降低農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留及農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種青霉蛋白激發(fā)子，該蛋白激發(fā)子分離純化自煙草根際土壤青霉XF6菌株，經(jīng)SDS-PAGE檢測，申請人將其命名為EPTP，其序列為SEQ ID NO.2所示，其對應的核苷酸序列為SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的另一個目的在于提供了一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP在提高植物抗病性中的應用。將其噴灑在植物葉面，它可以誘導植物產(chǎn)生抗性，對病毒病等有較好防效，特別適用于煙草抗煙草花葉病毒。

為了達到上述目的，本發(fā)明采取以下技術措施：

一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP，其序列為SEQ ID NO.2所示。

一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP，可通過SEQ ID NO.2所示氨基酸序列合成得到，或利用SEQ ID NO.1所示序列，利用生物技術原核蛋白表達得到。

一種蛋白激發(fā)子EPTP在提高植物抗病性中的應用，其應用過程是：

將EPTP溶液(2.0-5.0mg/ml)噴灑在植物葉面，可以誘導植物產(chǎn)生抗性，對植物病毒病有較好防效。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明制備的EPTP激發(fā)子能誘導煙草抗病相關基因的表達及防衛(wèi)物質的產(chǎn)生和積累，抑制TMV的增殖，減輕癥狀，葉綠素含量顯著高于對照植株。為日后開發(fā)應用新的蛋白激發(fā)子及抗病毒制劑提供了一定的理論支撐。

2.EPTP對TMV有較好的防治效果。田間小區(qū)實驗，3次的統(tǒng)計調(diào)查結果為：蛋白激發(fā)子的防效依次為64.69％、61.26％、61.28％。鹽酸嗎啉胍處理組的防效依次為38.39％、5.96％、 18.03％。表明EPTP對TMV的防治效果優(yōu)于鹽酸嗎啉胍，能有效地抑制TMV在煙草體內(nèi)的增殖，降低發(fā)病率，推遲發(fā)病時間。

3.EPTP是一種新型蛋白激發(fā)子，氨基酸序列不同與已報道的激發(fā)子。該蛋白可直接噴施于植物葉片表面、施用方便。此外，由蛋白激發(fā)子開發(fā)的生防農(nóng)藥的發(fā)酵原料來源豐富、生產(chǎn)成本低、無毒安全、無公害。蛋白激發(fā)子施用在田間后易分解、無殘留、對環(huán)境無污染，對人畜等非靶標生物相對安全，具有廣闊的應用與市場前景。

附圖說明

圖1為蛋白激發(fā)子EPTP熱穩(wěn)定性檢測。

圖2為蛋白激發(fā)子EPTP引起煙草過敏反應的最低濃度。

圖3為EPTP處理的煙草苯丙氨酸解氨酶活性變化圖譜。*顯著差異，P<0.05

圖4為EPTP處理的煙草多酚氧化酶活性變化。*顯著差異，P<0.05

圖5為EPTP處理的煙草過氧化物酶活性變化。

圖6為EPTP處理煙草細胞不同時間的NO含量變化。**顯著極差異，P<0.01

圖7為EPTP DAB染色檢測煙草葉片中H₂O₂的積累。A對照處理葉片；B蛋白激發(fā)子處理葉片

圖8為EPTP處理后煙草細胞的胞外pH變化。**顯著極差異，P<0.01

圖9為苯胺藍檢測EPTP誘導的煙草葉片胼胝質的積累。a和c是對照；b和d用0.01g/L蛋白EPTP處理葉片。

圖10為熒光檢測EPTP蛋白誘導煙草葉片酚類物質的積累。處理后108h，A和a,對照細胞；B和b,激發(fā)子處理細胞

圖11為清水處理的煙草葉葉肉細胞。A未接種TMV；B,C,D接種TMV后12d,21d,28d。

圖12為21d后的煙草葉葉肉細胞。A，a清水處理；B，b涂抹預防處理；C，c噴霧治療處理；D，d噴霧預防處理。Ch代表葉綠體；P代表TMV病毒粒子；S代表淀粉粒；Os，嗜鋨顆粒；CW代表細胞壁。

圖13為預防噴霧組的TMV的相對含量。

圖14為第21d的TMV的相對含量。

圖15為激活蛋白EPTP誘導心葉煙抗TMV。A,枯斑抑制率；B,枯斑直徑；C,每平方厘米葉片面積的枯斑數(shù)。

圖16為激活蛋白EPTP處理對煙草體內(nèi)的活性氧清除系統(tǒng)關鍵酶基因表達情況的影響。

圖17為激活蛋白EPTP處理對茉莉酸-乙烯途徑相關基因表達情況的影響。

圖18為激活蛋白EPTP處理對水楊酸途徑相關基因表達情況的影響。

圖19為激活蛋白EPTP處理對與抗性相關酶基因表達情況的影響。

圖20為轉化子菌落PCR驗證。M，DNA Maker；1，2，3，4，5為轉化子。

圖21為重組pMD18-T質粒為載體PCR驗證。M，DNA Maker；1為轉化子1。

圖22為轉化子菌落PCR驗證。M，5000DNA Maker；H，純水對照；CK，空載對照；1，2，3，4，5，6，7，8，9，10為不同的轉化子。

圖23為EPTP的誘導表達。M,蛋白Maker；1，對照誘導前；2，對照誘導后；3，重組菌誘導后。

圖24為純化融合蛋白的SDS-PAGE。M,蛋白Maker；1，重組菌誘導前；2，重組菌誘導后；3，純化的硫氧化蛋白；4，純化的融合蛋白。

圖25為純化蛋白的過敏性反應檢測。

具體實施方式

本發(fā)明實施例所述技術方案，如未特別說明，均為常規(guī)技術，所用試劑如未特別說明，均來源于商業(yè)化渠道。

實施例1：

檢測蛋白激發(fā)子EPTP的理化性質：

(1)熱穩(wěn)定性鑒定

取EPTP(按照SEQ ID NO.2所示序列人工合成，10μg/ml)蛋白分別在40℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃孵育5min，迅速置于冰上，待溶液降至室溫后，進行過敏性反應實驗。檢測EPTP的熱穩(wěn)定性。

實驗對象為長勢健康的云煙87，取生長健康且完整的葉片，采用半葉法的注射方法，葉子左邊為清水對照，右邊為EPTP。采用不帶針頭的微量注射器在每個點注射20μL EPTP或水。6d后將葉片剪下并照相，觀察葉片上是否出現(xiàn)過敏斑，以及過敏斑的形態(tài)。若出現(xiàn)過敏斑，則表明該激活蛋白可引起煙草的過敏性反應。

結果顯示：如圖1，當溫度達到70℃時，EPTP蛋白基本失活?？梢姡珽PTP蛋白在高溫下容易失活。

(2)蛋白激發(fā)子EPTP引起煙草過敏反應的最低濃度

取不同濃度0.5、1、2、5μg/ml的蛋白EPTP，同樣按照上述生物活性鑒定方法檢測能夠引起煙草過敏反應的最低蛋白濃度。

結果如下：如圖2所示，能引起煙草過敏反應的蛋白EPTP的最低濃度是2μg/ml，低 于這一濃度將基本上不能引起煙草的過敏反應，高于這一濃度時，隨著濃度的增加，過敏反應就越加強烈，可引起典型的過敏反應的濃度為5μg/ml。

實施例2：

EPTP誘導的煙草系統(tǒng)抗性反應：

取2月齡的煙草植株，一般生長5-7片真葉為宜，用1ml不帶針頭的注射器，將400μl(10μg/ml)蛋白EPTP溶液從葉片背面注入，以PB緩沖液為對照，每個處理1株，重復3次。處理后24、48、72、96、120、144、168、192h分別取處理葉的上一位葉，測定防御相關酶活性的變化。

(1)苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性測定

PAL活性測定參照Hano文獻方法，略有改變(Hano 2008)。取0.25g處理的葉片組織加入3ml緩沖液(5mmol/Lβ-巰基乙醇，1mmol/L EDTA，1％PVP，pH 8.4)，加入石英砂于研缽中冰浴研磨，4℃，8000rpm/min離心20min，收集上清液檢測PAL酶活性。取上清液4μl，加入3.9ml測定液(L-苯丙氨酸20mmol/L，0.05mmol/L硼酸緩沖液，pH 8.4)中，混勻后40℃下反應1h，在290nm測定OD值。以每克蛋白質每分鐘OD值變化0.01定義為1個活力單位。

PAL活性(0.01△OD·g^-1·min^-1)＝(100×ΔOD₂₉₀×V_T)/(FW×t×V₁)

式中t:反應時間(min)；V_T:樣液總體積(ml)；V₁:測定時樣品用量(ml)；FW:樣品鮮重(g)。

結果顯示：如圖3，在蛋白EPTP誘導后，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性變化較大。EPTP處理后48h PAL活性顯著增加，是對照的1.7倍，到72h時有所下降，而96h又開始上升，隨后隨著時間的延長酶活性下降。

(2)多酚氧化酶(PPO)活性測定

參照Ali文獻方法，略有改變(Ali 2006)。取0.25g處理的葉片組織加入3ml的酶提取液(50mmol/L磷酸緩沖液，pH 7.0)勻漿，4℃，12000rpm/min離心20min，上清保存于-20℃，用于酶活性檢測。取0.1ml酶液，加入1.5ml 0.05mol/L磷酸緩沖液，30℃下反應2min，再加入1.5ml 20mmol/L鄰苯二酚，在420nm下測定，以每克蛋白質每分鐘420nm波長的OD值變化0.01定義為1個活力為單位。

PPO活性(△OD·g^-1·min^-1)＝(ΔOD₄₂₀×V_T)/(FW×t×V₁)

式中t:反應時間(min)；V_T:樣液總體積(ml)；V₁:測定時樣品用量(ml)；FW:樣品鮮重(g)。

結果顯示：如圖4，在EPTP處理煙草第4d時，多酚氧化酶含量對照組和處理組PPO的活性均達到最高，出現(xiàn)一個較高的峰值，此時處理組PPO的活性顯著高于對照組，隨后均下降。處理組的POD活性在實驗的大部分時間段高于對照組。

(3)過氧化物酶(POD)活性測定

POD的活性測定采用鄰甲氧基苯酚法，略有改變(Zhang 2004)。POD酶液提取方法同PPO，用50mmol/L磷酸緩沖液將粗酶液稀釋10倍，取1ml酶液，加入1ml 50mmol/L磷酸緩沖液，再加入1ml 1％愈創(chuàng)木酚搖勻后，置30℃下水浴5min，然后加入1ml 3％H₂O₂，于470nm下測定，以每毫克蛋白質每分鐘470波長的OD值變化0.01為1個活力單位。

POD活性(△OD·g^-1·min^-1)＝(ΔOD470×VT)/(FW×t×V1)

式中t：反應時間(min)；VT：樣液總體積(ml)；V1：測定時樣品用量(ml)；FW：樣品鮮重(g)。

結果顯示：如圖5，激活蛋白EPTP可以激活過氧化物酶。在EPTP誘導后，從2d開始POD的活性明顯高于對照組，為對照組1.7倍，處理組POD活性在4d時達到最大，為對照組的1.4倍，且對照組POD活性一直保持穩(wěn)定。

(4)EPTP誘導NO的產(chǎn)生

取30ml煙草懸浮細胞，加入10μg/ml蛋白EPTP處理，然后根據(jù)一氧化氮檢測試劑盒進行操作，采用分光光度計在540nm下測量。以蛋白緩沖液為對照。

結果顯示：如圖6，蛋白EPTP處理的煙草細胞，NO的產(chǎn)生量在30min-60min顯著高于對照組，在蛋白EPTP處理60min左右，處理細胞NO的產(chǎn)生量達到最高值，隨后隨時間延續(xù)又降回并趨于平穩(wěn)，而對照細胞NO的產(chǎn)量在整個處理時間內(nèi)卻變化不大。

(5)EPTP激活過氧化氫的沉積

參照Hans的3,3’-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)組織染色法，略有改變(Hano 2008)。用10μg/ml的蛋白EPTP注射煙草葉片，處理24h后，將處理的葉片，用蒸餾水洗凈后置于平皿中，取適量DAB顯色試劑盒中的A液(1mg/ml,pH 3.8),用C液調(diào)pH值至5.8加入管中，室溫避光保存6小時。隨后去除染液，加入95％乙醇沸水浴數(shù)分鐘，去除葉綠素，吸除各管液體，加入無水乙醇并沸水浴直至葉片綠色完全脫去為止。將葉片浸泡在70％甘油中，顯微鏡觀察。以蛋白緩沖液為對照，每個處理重復三次。

結果顯示：如圖7，蛋白EPTP處理煙草葉片后，可觀察到DAB與葉片中產(chǎn)生和積累的H₂O₂發(fā)生反應，形成的褐紅色斑點。從圖中可以看出，激活蛋白EPTP處理的葉片中過氧化氫主要積累在葉脈組織和處理部位，表明激活蛋白EPTP可誘導煙草葉片活性氧的產(chǎn)生。

(6)EPTP誘導細胞外質的堿化

取約0.1g/ml的煙草懸浮細胞，轉接到新的煙草懸浮細胞培養(yǎng)基中，25℃，150rpm/min培養(yǎng)3天后，加入蛋白EPTP處理，使其終濃度為10μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)。此后每隔45min用pH測定儀測定細胞培養(yǎng)基的pH值的變化。以蛋白緩沖液為對照，每個處理重復三次，并進行方差分析。

結果顯示：如圖8，蛋白EPTP誘導煙草懸浮細胞后，使細胞外基質的pH明顯改變。在誘導后90min胞外pH接近6.6，堿性化程度最高，在隨后的45min胞外pH有所下降，隨后基本不變；而對照在整個檢測過程中pH雖然也有所上升，但最高為6.3左右，遠遠小于實驗組的pH。表明，激活蛋白EPTP可誘導煙草細胞外質的堿化。

(7)EPTP誘導胼胝質的產(chǎn)生

10μg/ml的蛋白EPTP注射處理煙草葉片，24h后，將葉片放入緩沖液(1％戊二醛，5mmol/L檸檬酸，90mmol/L磷酸氫二鈉，pH 7.4)過夜。取出葉片，放入無水乙醇中沸水浴10min，取出葉片再放入50％乙醇中，接著轉入漂洗緩沖液(67mmol/L磷酸氫二鉀,pH 12)。在染色液(0.1％苯胺藍,67mmol/L磷酸氫二鉀,pH 12)中染色1h，取出葉片用漂洗緩沖液沖洗1-2次，放入70％甘油，用熒光顯微鏡進行觀察。

結果顯示：如圖9，用苯胺藍進行胼胝質染色后，蛋白EPTP處理的煙草葉片在紫外熒光顯微鏡下，可以檢測到藍色的熒光物，蛋白緩沖液處理的葉片則幾乎沒有熒光物質的積累。EPTP處理后，胼胝質作為植物物理防御物質產(chǎn)生，有利于加強細胞壁的成分，形成植物防御的物理機制。

(8)EPTP誘導酚類的產(chǎn)生和積累

取300μl煙草懸浮細胞，加入蛋白EPTP使其終濃度為10μg/ml，于25℃，150rpm/min孵育108h后，用PBS淋洗細胞1-2次，將細胞放在載玻片上用蓋玻片封住后，在紫外熒光顯微鏡(激發(fā)波長為395nm)下觀察酚類物質的積累。

結果顯示：如圖10，酚類物質在熒光下可以觀察到自發(fā)熒光。激活蛋白處理煙草懸浮細胞108h后，用熒光顯微鏡觀察，可觀察到實驗組酚類物質的產(chǎn)生和積累明顯高于對照組，激活蛋白EPTP誘導煙草細胞產(chǎn)生大量的酚類物質，而對照組產(chǎn)生極少量的酚類物質。

實施例3：

檢測激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒的防效

(1)室內(nèi)防治煙草花葉病毒病試驗

TMV病毒汁液的制備：稱取1g新鮮的已具有明顯病毒癥狀的煙草葉片，放入研缽中， 加入0.05M的PBS(pH 7.0)40mL和2g石英砂，研磨成勻漿后，2層紗布過濾，得到的病毒濾液(30個病毒粒子/ml)即可用來摩擦接種煙草(每株煙草病毒接種量以均勻覆蓋該株煙草頂端兩片新葉為宜)，用于以下實驗或實施例。

選擇7-8葉期長勢一致、健壯的煙草，采用盆栽試驗，測定激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒病的防效。試驗分保護和治療兩種作用方式：

保護組：施藥1次，5天后接種TMV，然后每隔7天施藥1次，共施藥3次(此處的3次不包括接種前的1次施藥)；

治療組：先接種TMV，然后每隔7天施藥1次，共施藥3次；

發(fā)病對照組：只接種TMV，不施藥；

超敏蛋白對照組：施藥方法與保護組相同。

以上各組分別用超敏蛋白(Harpin)噴霧(60mg/kg,每株噴施50ml)，EPTP(10μg/ml)噴霧(每株噴施50ml)，EPTP(10μg/ml)+10％(V/V)脂肽(從解淀粉芽胞桿菌發(fā)酵液中提取純化，Gaofu,2010)噴霧(每株噴施50ml)，EPTP(10μg/ml)+10％脂肽涂抹(每平方厘米葉片涂抹1ml)

接種后21天和28天檢查發(fā)病情況，計算病情指數(shù)及防治效果。每處理30株煙苗。統(tǒng)計每株煙草的病級數(shù)并計算病情指數(shù)和防治效果。病害分級標準參照文獻(陳麗和安德榮，2004)的方法。

病情指數(shù)＝[∑(病級數(shù)×病株數(shù)))/(最高病級×總株數(shù))]×100

防治效果％＝(對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù))/對照病情指數(shù)×100％

結果顯示：從表1可以看出，其中以激活蛋白EPTP涂抹處理的保護作用最大，21d和28d的防治效果分別達到66.7％和39.29％，顯著高于對照藥劑超敏蛋白。另外，不同施藥方式影響EPTP的防效，其中21d時激活蛋白EPTP噴霧治療組的效果最差，其次為噴霧預防組，而EPTP+脂肽涂抹的效果最好。但28d天時噴霧保護組的效果最好。分析，保護效果優(yōu)于治療效果；涂抹效果優(yōu)于噴霧效果。添加脂肽，有利于提高前期防效，但在后期增效不明顯。

為激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒病的保護作用。

表2為田間試驗測定激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒的防治效果

表3為激活蛋白EPTP對感病煙草體內(nèi)葉綠素含量的影響。

表1為激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒病的保護作用

(2)田間防治煙草花葉病毒病試驗

田間共施藥5次，苗期施藥一次，移栽后15天、30天、45天、60天各施藥一次，EPTP(10μg/ml)溶液噴霧整株煙草的葉片(每株噴施50ml)。每小區(qū)栽50株云煙87，重復4次。從移栽當天調(diào)查一次病情，每隔15天調(diào)查一次。以噴施清水為空白對照，噴施鹽酸嗎啉胍為藥劑對照。(煙草花葉病為自然發(fā)病，不接種病毒)。

結果顯示：從表2可以看出，對照組發(fā)病最為嚴重，激活蛋白EPTP處理組發(fā)病最輕。與鹽酸嗎啉胍藥劑組相比，激活蛋白EPTP處理組的病情較輕。EPTP的防效較為穩(wěn)定，三次防效依次為64.69％、61.26％、61.28％，說明該激活蛋白能長久持效地防治病毒病。EPTP的防效高于鹽酸嗎啉胍化學藥劑，說明可以采用青霉激活蛋白EPTP抗病毒菌劑代替化學藥劑用于生產(chǎn)。

表2為田間試驗測定激活蛋白EPTP對煙草花葉病毒的防治效果

⑶檢測煙草葉片葉綠素含量的變化

按照步驟(1)中的保護組的實驗方式：

接病毒后十二天開始采樣、然后每七天采樣一次，共采四組，分別為：①清水對照；②超敏蛋白(Harpin)(噴霧)；③EPTP(10μg/ml)(噴霧)；④EPTP(10μg/ml)(涂抹)，各組的噴霧量及次數(shù)與步驟(1)中的相同，病毒的接種量與步驟(1)中的相同。

葉綠素含量的測定:準確稱取0.2g幼嫩葉片，加入少量CaCO₃和石英砂，5ml 95％丙酮-乙醇溶液，冰浴研磨成勻漿，再加入5ml 95％丙酮-乙醇溶液，繼續(xù)研磨，靜置3min至 碎片無色。濾紙過濾，將濾液過濾至25ml容量瓶中，用溶劑沖洗研缽和濾紙，直至無色，定容至25ml，搖勻。用溶劑校零，分別于663nm和645nm測定吸光度。按下列公式計算出葉綠素濃度：

葉綠素a濃度(mg/L):C_a＝12.7A₆₆₃-2.69A₆₄₅

葉綠素b濃度(mg/L):C_a＝22.9A₆₄₅-4.68A₆₆₃

葉綠素總濃度(mg/L):C_a+b＝C_a+C_b

計算提取葉中葉綠素濃度，換算為每克鮮葉葉綠素含量(mg/L)，即：

葉綠素濃度(mg/L)*提取液總體積(ml)/[樣品鮮重(g)*1000]

結果顯示：從表3可以看出，云煙87施用激活蛋白EPTP后，處理位和上位葉片中葉綠素含量高于清水對照組，且噴霧涂抹組與對照葉片間的差異更為明顯。

表3為激活蛋白EPTP對感病煙草體內(nèi)葉綠素含量的影響

激活蛋白EPTP各處理組，在接種TMV 12d后，上位葉葉綠素含量測定結果見表3，從表中可以看出，3個處理煙草葉片中葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素與對照相比均有所提高，第22天，噴施EPTP的煙草葉片中總葉綠素增長率最大，為15％。結果表明，激活蛋白EPTP和超敏蛋白對由TMV引起的煙草葉片中葉綠素含量下降具有一定的保護作用。說明蛋白激發(fā)子EPTP能激活植物體內(nèi)分子免疫系統(tǒng)，提高其自身免疫力，通過信號分子轉導 調(diào)控植物體相關代謝過程，提高葉綠素含量，增強植物體光合作用。

⑷煙草花葉病毒的侵染和組織超微病理變化的研究

將上述樣品制備成直徑小于1mm的小塊，制樣，通過透射電鏡觀察細胞結構。

結果顯示：透射電鏡下觀察煙草葉片的超微結構。如圖11，結果發(fā)現(xiàn)，未接種病毒時其細胞形態(tài)正常，葉綠體排列整齊且含有適當?shù)矸哿?；而接種TMV 12d后，細胞形態(tài)較正常，葉綠體出現(xiàn)輕微腫大細胞中的膜狀結構增多，類溶酶體及顆粒狀物質明顯增多，在細胞質膜的周圍分布著大量的核糖體。接種21d的煙草葉肉細胞中葉綠體形態(tài)變化非常明顯，葉綠體膨大變形且數(shù)量減少，淀粉粒消失，接種21d的煙草細胞葉綠體層排列紊亂、松散，嚴重扭曲；葉綠體內(nèi)無淀粉粒且膨大變形，最后導致大多數(shù)葉綠體甚至解體，細胞膜部分解體，嗜餓小體增多。

煙草接種TMV后21d，對照組葉片細胞質零亂，膜發(fā)生了破裂并開始崩解，葉綠體膨大變形，大部分細胞器消失解體，細胞質中出現(xiàn)大量病毒粒子；而涂抹EPTP預防處理組的葉片，其葉肉細胞仍保持完整，葉綠體中還含有淀粉粒，形態(tài)基本正常，細胞內(nèi)存在少量的病毒粒子，并產(chǎn)生膜體，細胞壁發(fā)生次生加厚，嗜餓顆粒增加。EPTP噴霧處理治療組中，其葉肉細胞也只含有少量的病毒粒子，細胞仍保持完整，葉綠體中含有大量淀粉粒，產(chǎn)生較多的嗜餓顆粒，細胞壁加厚。EPTP噴霧預防治療組中，葉綠體形態(tài)正常并含有淀粉粒，產(chǎn)生較多的嗜餓顆粒，細胞壁增厚(圖12)。

(5)煙草花葉病毒的熒光定量PCR

總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用蛋白EPTP處理煙草葉片的上位葉片，取所需的樣品液氮研磨成粉，每管分裝0.1g樣品。每管加入1ml Trizol，迅速混勻，室溫下靜置5-10min，12000rpm/min離心5min，棄沉淀；加200μl氯仿，震蕩混勻，4℃，12000rpm/min離心15min，吸取上層，加入0.5ml異丙醇，混勻，-20℃靜置20min；離心，75％乙醇漂洗，離心去除乙醇，5-10min晾干。

用1.2％瓊脂糖凝膠和紫外吸收法檢測RNA的質量。第一鏈cDNA的合成，主要操作步驟如下。

第一條鏈cDNA反應體系：

輕輕混勻，42℃孵育60min，70℃加熱5min使酶失活。將合成的cDNA作模板用于PCR擴增。

RT-qPCR反應體系：

擴增條件：95℃預變性4min；95℃變性30s、62℃退火30s、72℃延伸30s、延伸時采集熒光，40個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

結果顯示：如圖13、14，噴施及涂抹激活蛋白EPTP對煙草體內(nèi)煙草花葉病毒(TMV)的增殖具有抑制作用，激活蛋白處理煙草后，可以誘導系統(tǒng)獲得性抗性，有效減少TMV的危害；第一次采樣和第三次采樣時其系統(tǒng)獲得性抗性綜合最強，TMV相對于對照的含量顯著減少。噴施EPTP后的煙草中TMV含量遠比對照低，說明激活蛋白EPTP誘導煙草獲得對病毒病的系統(tǒng)抗性，從而間接地抑制了病毒的繁殖。不同的施藥方式也影響煙草對TMV的抗性，預防涂抹組TMV相對含量最小，預防噴霧組次之，治療噴霧組最大。

⑹蛋白EPTP誘導提高心葉煙對TMV抗性

TMV病毒汁液的制備同實例3，長勢健康、6-7葉期的心葉煙，組3株苗，3個重復。選取植株上部的2片葉片，注射EPTP 20μl。1d后蘸取病毒汁液及石英砂(1mL病毒濾液/葉片，0.1g石英砂/葉片)，沿著葉脈小心且均勻地涂抹在其余葉片上。以蒸餾水作對照。于接種病毒后72h觀察枯斑的形態(tài)與數(shù)量。

按照下列公式計算枯斑抑制率：

枯斑面積抑制率＝[(對照組枯斑面積占葉片總面積百分比－實驗組枯斑面積占葉片總面積百分比)/對照組枯斑面積占葉片總面積百分比]×100％

枯斑數(shù)量抑制率＝[(對照組枯斑數(shù)量－實驗組枯斑數(shù)量)/對照組枯斑數(shù)量]×100％

結果顯示(接種后72h觀察結果)：如圖15，蛋白EPTP處理后的煙草，枯斑面積顯 著小于對照，枯斑面積抑制率為82％?？莅呙娣e小主要表現(xiàn)為枯斑直徑減小和枯斑數(shù)減少兩方面。圖中顯示，枯斑直徑和枯斑數(shù)處理組都顯著小于對照。

(7)蛋白EPTP誘導煙草抗性相關基因

a.總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成

用800μl(10μg/ml)蛋白EPTP溶液注射煙草葉片的上位兩片葉片，取注射蛋白EPTP鄰近的下位葉片,液氮研磨成粉，每管分裝0.1g樣品。按上述方法提取RNA，消化DNA，并進行mRNA的反轉錄。

b.特異引物的設計

基因表達分析采用半定量RT-PCR的方法，以在煙草中高度保守的基因Actin作內(nèi)參照。

引物見表4。

表4為抗性相關基因特異性引物

c.通過RT-PCR擴增抗性基因

取上述反轉錄的第一鏈cDNA產(chǎn)物，用滅菌的ddH₂O稀釋50-100倍，用作目的基因的擴增。

擴增條件：94℃預變性4min；94℃變性30s、49-57℃退火30s、72℃延伸30-45s、35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠中檢測。

結果顯示：激發(fā)子EPTP能誘導植物體ROS的積累，進一步激發(fā)植物的抗病反應。EPTP處理煙草4小時后，RBHOB基因的表達水平開始顯著上升，到72小時達到最高，說明EPTP誘導了植物的抗病反應。但如果ROS過量積累，則會使植物的細胞膜脂過氧化和膜透性喪失，從而導致植物體內(nèi)代謝紊亂，反而對植物造成傷害。這時候若能激活植物的活性氧清除系統(tǒng)，就可以使植物對活性氧的承受能力提高，并緩解ROS的迅速過量的積累而造成的損傷，因此，活性氧清除系統(tǒng)關鍵酶基因的上調(diào)表達分析也是植物抗性提高的一種表現(xiàn)。APX是一種活性氧清除系統(tǒng)關鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)此基因的表達程度顯著提高，其中，在誘導處理 12h后APX表達量最大(圖16)。這一結果說明EPTP蛋白可以激活植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)，從而增加了煙草對TMV侵染的抵抗能力。細胞程序性死亡是誘導植物系統(tǒng)抗性的一個標志，hin1是細胞程序性死亡的相關基因，在誘導處理4h、24h和72h后，其表達水平都顯著上調(diào)；WIPK基因編碼創(chuàng)傷蛋白激酶，在激發(fā)子誘導后4h開始出現(xiàn)較高的表達量，到12h表達水平最高。

防衛(wèi)基因的表達調(diào)控在植物抗病信號轉導網(wǎng)絡中起重要作用。目前誘導抗病性的信號傳導可分為兩種：茉莉酸/乙烯依賴途徑和水楊酸依賴途徑，茉莉酸和乙烯主要誘導堿性PR蛋白表達，如pR3。茉莉酸/乙烯信號途徑依賴于COI1，產(chǎn)生防御基因PDF。PR-3是與此途徑相關的蛋白，在誘導處理4h后PR-3基因表達水平開始增加，9h后增加顯著，72h小時后又開始有所下降；NtCOI1基因雖然在誘導處理后表達水平不強，但在誘導處理24h后也有所增加；PDF基因在EPTP誘導后在4h和1d后轉錄量都有所提高，其表達一直持續(xù)到觀察時間結束；LOX是茉莉酸合成依賴的基因，ERF是乙烯途徑的相關基因，而它們在被誘導后表達水平都是顯著增加，且基因表達量一直增加，到第2d才開始逐漸下降。說明此抗病反應依賴于茉莉酸、乙烯(圖17)。

各種病原菌和化學因子都通過水楊酸依賴途徑誘導植物產(chǎn)生抗病性。當激發(fā)子誘導使植物體內(nèi)的SA含量升高，水楊酸信號的下游信號NPR1便從細胞質往細胞核中運輸，并最終調(diào)控與抗性相關基因PR1-a/b的表達。PR蛋白對植物誘導抗病性非常重要，PR1、PR2和PR5都是水楊酸途徑相關基因。其中PR-1b的表達量在EPTP誘導處理12h后表達量才開始急劇升高，后期表達水平也較高；而PR-1a不如上述基因，只有在2h表達水平才稍微有所增加；而PR-5在24h表達水平顯著增加；水楊酸途徑標記基因NPR1，在EPTP誘導2h后出現(xiàn)，持續(xù)到第4天；水楊酸誘導蛋白激酶(Salicylate-Induced Protein Kinase,SIPK)，它在被誘導6h后轉錄量開始增加，并保持這個量一直到誘導后4d；通過這些抗性相關基因的表達結果，說明EPTP能使煙草產(chǎn)生依賴于SA等信號途徑的系統(tǒng)性抗性(圖18)。

PAL對調(diào)控代謝流進入苯丙烷途徑起著關鍵性作用，它除了參與木質素及異黃酮類物質的生成；還是產(chǎn)生SA的一種重要的次級信號分子，可以啟動HR和系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)的表達，因此PAL通過快速轉錄激活對植物系統(tǒng)抗性也至關重要。PAL等酶活性的提高可以使植物免受病原真菌的侵染，其活性也是植物抗性的重要指標(張學昆等2002)。苯丙氨酸解氨酶基因在EPTP誘導2h后表達，轉錄量隨時間逐漸上升，且表達量一直保持較強水平。從PAL活性在不同時間的變化趨勢可以看出，蛋白EPTP在12h時已明顯增強了煙草對TMV的抗性。

Ntf4是一種有絲分裂原激活蛋白質的激酶，Npk1是一種鈣調(diào)蛋白激酶，它們在誘導植物產(chǎn)生抗性工程中起著信號傳遞的作用，同時調(diào)節(jié)相關基因的表達。PR-10是核酸酶，作用于病原RNA。CRT能阻止病毒在胞間聯(lián)絲的移動，與病毒在細胞間傳輸。這些基因在被誘導后表達水平均有不同程度的上升(圖19)。

植物體內(nèi)防衛(wèi)基因表達對植物產(chǎn)生抗性起著中心作用。這些防衛(wèi)基因的誘導表達主要是借助一些信號分子來實現(xiàn)信號傳導的。蛋白EPTP處理煙草后，可以誘導植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，有效減少煙草花葉病毒(TMV)的危害；蛋白EPTP誘導煙草1d時其系統(tǒng)抗性綜合最強。依賴于SA的信號途徑標記基因NPR1和基因PR-1a/b同時被誘導表達，證實了蛋白EPTP可能激發(fā)煙草產(chǎn)生了SA信號途徑介導的系統(tǒng)抗性。而PDF、LOX、ERF和NtCOI1基因的表達量升高，說明EPTP引起的系統(tǒng)抗性也依賴于Ja-Et途徑。

說明SA和Ja-Et兩種信號分子協(xié)同參與了蛋白EPTP誘導煙草對TMV的抗性過程。

實施例4：

青霉蛋白激發(fā)子EPTP的原核表達

直接合成537bp的基因片段，基因全長為537bp，其序列為SEQ ID NO.1所示，該序列編碼178個氨基酸，分子量大小為19247Da，其序列為SEQ ID NO.2所示。

(5)目的基因轉入大腸桿菌DH5α。

酶連：

PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，按照T克隆載體pMD18-T(TaKaRa)的說明書連接目的片段，體系如下：

目的DNA片段 4μl

pMD18-T vector 1μl

Solution I 5μl

4℃過夜連接。

轉化：

取100μl DH5α感受態(tài)細胞，加入酶連pMD18-T質粒10μl，在冰浴中靜置30min，然后42℃熱激90s，再放入冰浴中靜置5-10min，加入900μl LB液體培養(yǎng)基，37℃，180rpm/min，活化1h，取200μl涂布于含有Amp(100μg/ml)LB固體培養(yǎng)基中，37℃，培養(yǎng)12h。

挑取單克隆菌株，加入1.8ml含Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，200rpm/min，培養(yǎng)12h，進行菌體PCR驗證并送于奧科公司測序驗證陽性克隆。

結果顯示：如圖20、21為菌落PCR，以重組pMD18-T質粒為載體PCR，并且轉化子 測序結果與目的基因EPTP匹配度達100％，表明EPTP成功轉入。

(6)目的基因轉入大腸桿菌BL21，載體為pET-32a。

引物設計：

EPTP-F 5’-CGCGGATCCATGAAGTTCGTATCAGCC-3’

EPTP-R 5’-CCCAAGCTTTCAGTGTCCACCAATACTGAACC-3’

目的基因擴增，體系如下：

酶切目的片段與pET-32a質粒，采用TaKaRa公司的Bam H I和Hind III，并用DNA純化試劑盒回收，體系如下：

T4連接酶連接酶切目的基因與質粒，體系如下：

轉化：轉化方法參照DH5α的方法。

結果顯示：如圖22為菌落PCR，并且轉化子1測序結果與目的基因EPTP匹配度達100％，表明EPTP成功轉入。

(7)誘導表達轉入重組質粒的大腸桿菌BL21：

a.取3μl保存的甘油菌BL21(pET-32a)(對照組)與上述轉化成功的含有目的基因的BL21(實驗組)分別接種于3ml LB(含100μg/ml Amp)中，37℃過夜活化。

b.按1％的接種量轉接與200ml LB(含100μg/ml Amp)中，37℃，180rpm/min培養(yǎng)3h。

c.培養(yǎng)3h后加入終濃度為1mM的IPTG誘導，37℃，180rpm/min培養(yǎng)5h后，8000rpm/min離心5min，收集菌體。

d.用PBS緩沖液重懸菌體，8000rpm/min，離心5min，收集菌體。

e.超聲波破碎細胞：用20ml PBS緩沖液重懸菌體，加入終濃度為1mM的PMSF，在超聲波破碎儀上冰浴破碎1h(200W,5s,5s間隔)。

SDS-PAGE檢測：

取對照誘導前(加IPTG前)，誘導后5h，實驗誘導后5h的菌液1.5ml，離心收集菌體后，加入50μl PBS緩沖液重懸，再加入10μl上樣緩沖液，煮沸5-10min后，離心取上清，上樣，12％SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白的表達。

結果顯示：如圖23，與對照誘導前相比，對照誘導后在18.4KDa上明顯多出一條蛋白條帶，為轉入的pET-32a質粒表達的硫氧化蛋白；重組菌誘導后在35KDa上明顯多出一條蛋白條帶，為轉入的重組pET-32a質粒表達的硫氧化蛋白與EPTP蛋白的融合蛋白。

(8)Ni-NTA分離純化融合蛋白

a.按上述方法誘導轉入重組質粒的BL21菌株，超聲破碎細胞，8000rpm/min離心30min。將上清沉淀進行SDS-PAGE檢測，結果顯示，融合蛋白存在于沉淀中。用20ml的8M的尿素變性12h，使其溶解，8000rpm/min離心10min收集上清。

b.填料裝柱后，蒸餾水(3-5倍柱床體積)洗凈乙醇，用5-10倍柱床體積Ni柱平衡緩沖液(100ml，0.2M的Tris-HCl；100ml甘油；29.22g NaCl定容到1L)洗滌，然后用含8M尿素的Ni柱平衡緩沖液平衡柱子，電腦紫外檢測儀，280nm紫外光下調(diào)零。

c.上樣：20ml上清全部上樣。

d.上樣完成后，用含8M尿素的Ni柱平衡緩沖液洗脫，至透過峰下降至最低，期間收集透過峰。

e.用1％DOC洗脫膜蛋白(10-15ml)，收集樣品。

f.用含20mM咪唑的8M尿素Ni柱平衡緩沖液洗脫雜蛋白，至峰線平穩(wěn)。

g.用含200mM咪唑的8M尿素Ni柱平衡緩沖液洗脫融合蛋白，收集樣品。

h.Ni-NTA柱回收。

融合蛋白的復性

用含6M、4M、2M、0M尿素的PBS緩沖液依次透析，每次12h。

Ni-NTA分離純化硫氧化蛋白

純化方法與Ni-NTA分離純化融合蛋白方法類似，由于硫氧化蛋白在細胞破碎后的上清液中，故不必再用8M的尿素變性，所用緩沖液均用Ni柱平衡緩沖液溶解即可。

SDS-PAGE檢測純化蛋白。復性后用融合蛋白與硫氧化蛋白進行過敏性檢測實驗。

結果顯示：如圖24，純化得到較純的蛋白。如圖25，過敏性檢測顯示融合蛋白仍具有活性，硫氧化蛋白不能誘導煙草產(chǎn)生過敏性反應。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農(nóng)業(yè)大學

<120> 一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP及其在提高植物抗病性中的應用

<130> 一種青霉蛋白激發(fā)子EPTP及其在提高植物抗病性中的應用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgaagttcg tatcagccgc tgccctgctt ctcgccgctc cgctcgtcgc ggcggcgtcc 60

atccccagca tcttcgaccc gacgcaggct cccatgagtg cggccaacag cgtgcgaaac 120

aacccggtcg agggtgacaa tcctttggaa ttctgtgaac ctcctacgtc tcatcttctc 180

accatcgact ccgtcgactt gtctcccaac ccccccaaag ctggccagac cctcactatc 240

accgcctcgg gcgtcttcca cgaacgcatt acctccggcg ccacggtaaa cattgttgtc 300

aaatatggtc tcatcacctt gatcaggcag actatggatc tctgcgaaca gattgagaac 360

gtcgacttga aatgccctct cgagaaggga agaatgacca tgaccaagca ggtggacctg 420

ccaagccaaa ttcctcccgg cacctattcc gtccttgctg atgtctacac cgaggaccac 480

aagaaggtca cctgcctcat ggctaatggc atccggttca gtattggtgg acactga 537

<210> 2

<211> 178

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Lys Phe Val Ser Ala Ala Ala Leu Leu Leu Ala Ala Pro Leu Val

1 5 10 15

Ala Ala Ala Ser Ile Pro Ser Ile Phe Asp Pro Thr Gln Ala Pro Met

20 25 30

Ser Ala Ala Asn Ser Val Arg Asn Asn Pro Val Glu Gly Asp Asn Pro

35 40 45

Leu Glu Phe Cys Glu Pro Pro Thr Ser His Leu Leu Thr Ile Asp Ser

50 55 60

Val Asp Leu Ser Pro Asn Pro Pro Lys Ala Gly Gln Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Thr Ala Ser Gly Val Phe His Glu Arg Ile Thr Ser Gly Ala Thr Val

85 90 95

Asn Ile Val Val Lys Tyr Gly Leu Ile Thr Leu Ile Arg Gln Thr Met

100 105 110

Asp Leu Cys Glu Gln Ile Glu Asn Val Asp Leu Lys Cys Pro Leu Glu

115 120 125

Lys Gly Arg Met Thr Met Thr Lys Gln Val Asp Leu Pro Ser Gln Ile

130 135 140

Pro Pro Gly Thr Tyr Ser Val Leu Ala Asp Val Tyr Thr Glu Asp His

145 150 155 160

Lys Lys Val Thr Cys Leu Met Ala Asn Gly Ile Arg Phe Ser Ile Gly

165 170 175

Gly His