本發(fā)明屬于海洋生物活性物質(zhì)制備技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種離心技術(shù)結(jié)合疏水層析介質(zhì)制備藻紅蛋白的方法。

背景技術(shù)：

藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)是存在于藍(lán)藻、紅藻、隱藻（甲藻）中的一類捕光色素蛋白。它是由脫輔基蛋白和色基組成，其脫輔基蛋白是一類寡聚蛋白，基本單位為α和β亞基，有些藻紅蛋白中還有少量的γ亞基。開(kāi)環(huán)的四吡咯藻紅素作為色基部分，由于色基的存在，藻紅蛋白在可見(jiàn)光區(qū)480～570nm處有較強(qiáng)的光吸收，并且具有強(qiáng)烈的熒光。藻紅蛋白用途非常廣泛，它既可以作為天然色素應(yīng)用于食品、化妝品等行業(yè)，還可制成熒光試劑，用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域。藻紅蛋白也是一種重要的生理活性物質(zhì)，具有抗腫瘤，抗病毒，增強(qiáng)免疫力等，它還是一種具有開(kāi)發(fā)潛力的光敏劑，可制成光敏劑應(yīng)用于腫瘤光動(dòng)力學(xué)治療。藻紅蛋白的純度通常用(A₅₄₅/A₂₈₀)來(lái)表示，等級(jí)劃分為0.7<食品級(jí)<3.0<反應(yīng)級(jí)<4.0<分析級(jí)，藻紅蛋白的純度越高，價(jià)格越高。目前人們主要采用硫酸按分級(jí)沉淀、羥基磷灰石柱層析、凝膠過(guò)濾層析等相結(jié)合的方法制備藻紅蛋白，現(xiàn)有的制備工藝流程存在操作復(fù)雜，生產(chǎn)成本高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，且難以實(shí)現(xiàn)工業(yè)化的大規(guī)模的生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明就是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種操作簡(jiǎn)便、成本低廉且易于大規(guī)模制備高純度藻紅蛋白的方法。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的制備方案為：

（1) 離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻，將藻泥與磷酸鹽緩沖液按1:5～1:10比例充分混勻，得細(xì)胞懸液；

（2) 將步驟(1)所得細(xì)胞懸液反復(fù)凍融5～7次，得到破壁液；將破壁液冷凍離心, 收集上清液；

（3) 室溫下將步驟(2)所得上清液超濾后，收集濾液，得到藻紅蛋白粗提液；

(4) 將步驟(3)所得的藻藍(lán)蛋白粗提液加入用磷酸鹽緩沖液預(yù)處理的疏水層析介質(zhì)，充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入2倍體積的蒸餾水，充分混勻后冷凍離心，取上清，冷凍干燥得到純化的藻紅蛋白。

以上步驟所用的磷酸鹽緩沖液pH為6.8～7.0，濃度為0.01～0.02mol/L；

步驟(3)中所述的將上清液用分子截留量為50～60kD的膜包超濾，超濾4～6次；

步驟(4)中所述的疏水層析介質(zhì)為Phenyl Sepharose Fast Flow。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用的離心技術(shù)結(jié)合疏水層析介質(zhì)制備藻紅蛋白的方法，與傳統(tǒng)技術(shù)相比省去了柱層析的步驟，操作方法簡(jiǎn)便易行，成本低廉，純度高，回收率高，并且經(jīng)過(guò)了實(shí)驗(yàn)室放大設(shè)備的驗(yàn)證。本發(fā)明采用了反復(fù)凍融、超濾以及加入疏水層析介質(zhì)離心的方法，得到的藻紅蛋白純度A₅₄₅/A₂₈₀>4.0，為藻紅蛋白應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)分析和免疫化學(xué)等領(lǐng)域奠定了基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化后藻紅蛋白的全波長(zhǎng)掃描圖。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例提供的純化后藻紅蛋白的SDS-PAGE電泳圖（泳道1，標(biāo)準(zhǔn)蛋白；泳道2, 純化的藻紅蛋白）。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻5g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液(pH 6.9，0.01mol/L)按1:6比例混合，得細(xì)胞懸液；

(2)將細(xì)胞懸液反復(fù)凍融7次得到破壁液；將破壁液冷凍離心，收集上清液；

(3)室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為60kD膜包超濾，超濾6次，收集濾液，得到藻紅蛋白粗提液；

(4)向所得藻紅蛋白粗提液加入用pH 6.9、0.01mol/L磷酸鹽緩沖液預(yù)處理的層析介質(zhì)Phenyl Sepharose Fast Flow(2g)，充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入2倍體積蒸餾水，充分混勻，冷凍離心，取上清(見(jiàn)圖1、圖2)，冷凍干燥得到純化的藻紅蛋白。

從圖1可以看出，制備的藻紅蛋白純度（A₅₄₅/A₂₈₀）>4.0；純化后的藻紅蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜見(jiàn)圖2，在分子量為30kD處的條帶為γ亞基，在分子量為19kD處的條帶為α和β亞基，由于這兩種亞基的分子量接近，所以在圖譜中出現(xiàn)了重疊現(xiàn)象，該結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道一致。

實(shí)施例2

（1)離心收集新鮮培養(yǎng)的紫球藻20g，將藻泥與磷酸鹽緩沖液(pH 6.8，0.02mol/L)按1:5比例混合，得細(xì)胞懸液；

（2) 將細(xì)胞懸液反復(fù)凍融7次得到破壁液；將破壁液冷凍離心，收集上清液；

（3) 室溫下將上清液經(jīng)分子截留量為50kD膜包超濾，超濾5次，收集濾液，得到藻紅蛋白粗提液；

(4) 向所得藻紅蛋白粗提液加入用pH 6.8、0.02mol/L磷酸鹽緩沖液預(yù)處理的層析介質(zhì)Phenyl Sepharose Fast Flow（8g），充分混勻，冷凍離心，取沉淀；接著向沉淀中加入加入2倍體積蒸餾水，充分混勻，冷凍離心，取上清，冷凍干燥得到純化的藻紅蛋白；制備的藻紅蛋白純度（A₅₄₅/A₂₈₀）>4.0，回收率為39.5%。