本發(fā)明涉及生物
技術領域：
中一種奎寧酮還原酶RrQR的制備方法及其應用。
背景技術：
：R-3-奎寧醇是很多抗膽堿藥物的重要中間體，例如索利那辛、瑞伐托酯等都是含有R-3-奎寧醇結構的最新抗膽堿藥物，對于治療尿失禁和慢性阻塞性肺病(COPD)有很好的療效。R-3-奎寧醇的合成有化學法和生物法兩種?；瘜W法合成R-3-奎寧醇，在產(chǎn)物里，會殘留金屬催化劑，與化學方法相比，生物法具有反應條件溫和、轉化率高、立體選擇性強多種優(yōu)點，因此開發(fā)生物法來合成R-3-奎寧醇是工業(yè)化生產(chǎn)的方向。采用奎寧酮還原酶來生產(chǎn)(R)-3-奎寧醇是研究的熱點。催化3-奎寧酮生成(R)-3-奎寧醇示意圖見圖1。宋水山等從土壤中篩選到粘紅酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)在100mL反應體系中可將奎寧酮還原為(R)-3-奎寧醇,轉化率90％,ee值為88％；朱敦明從土壤中篩選到兩株微生物：諾卡氏(Nocardiasp.)和紅串紅球菌(Rhodococcuserythropolis)分別將奎寧酮生成R-奎寧醇和(S)-奎寧醇；日本SakayuShimizu課題組利用從深紅酵母(Rhodotorularubra)中克隆得到的還原酶催化3-奎寧酮不對稱還原得到(R)-3奎寧醇，產(chǎn)物濃度達到618mM,且對映體過量值(ee)＞99.9％,但此酶的Km值高達145mM，這一高Km值表明該酶對底物的親和力較弱，底物濃度較低時反應速率較慢，底物濃度為120mM時，反應速率僅為最大速率的46％，導致反應時間的延長(Appl.Micbrobiol.Biotechnol.2009,83,617-626)；日本NobuyaItoh等人篩選到一株淡黃微桿菌(Microbacteriumluteolum)JCM9174，該菌能夠還原3-奎寧酮生成(R)-奎寧醇，并從中克隆出兩個NADH依賴性還原酶QNR和BacC經(jīng)純化后，測得其比活力分別為8.4U/mg和0.5U/mg(Appl.Environ.Microbiol.2013,79,1378-84)。徐建和等從放射性土壤桿菌中篩選奎寧酮還原酶，可以利用奎寧酮鹽酸鹽將其還原生成(R)-3-奎寧醇。將1M的奎寧酮在1.5小時后，將其完全轉化成R)-3-奎寧醇，對映體過量值(ee)大于99％(專利申請?zhí)枺?01310422722.1)；徐建和等篩選出的奎寧酮還原酶比活力198U/mg，但是其熱穩(wěn)定性不夠好(ORGANICLETTERS2013Vol.15,No.194917–4919)，因此，尋找比活力高、熱穩(wěn)定性好，高立體選擇性的奎寧酮還原酶是滿足還原酶法生產(chǎn)R-3-奎寧醇是迫切需要的技術。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術問題是獲得高活性和熱穩(wěn)定性以及高的立體選擇性的奎寧酮還原酶。本發(fā)明所要解決的另一個技術問題是將奎寧酮還原酶與葡萄糖脫氫酶共表 達，構建全細胞催化劑，用于R-3-奎寧醇的生物合成。為解決上述技術問題，本發(fā)明首先提供了如下D1-D4中任一種的應用：D1)RrQR在作為奎寧酮還原酶中的應用；D2)所述RrQR相關的生物材料在制備奎寧酮還原酶中的應用；D3)RrQR在合成R-3-奎寧醇中的應用；D4)所述RrQR相關的生物材料在合成R-3-奎寧醇中的應用；所述RrQR是如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)；b)在SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有奎寧酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。其中，SEQIDNo.2由260個氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1.標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到。所述RrQR相關的生物材料，為下述A1)至A8)中的任一種：A1)編碼所述RrQR的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；上述應用中，A1)所述核酸分子為如下a1)或a2)或a3)所示的RrQR基因：a1)其編碼序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼所述RrQR的cDNA分子或基因組DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼所述RrQR的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQIDNo.1由783個核苷酸組成，編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。上述應用中，A2)所述的表達盒和/或A3)所述重組載體可含有如下c1)或c2)或c3)所示的基因：c1)其編碼序列是SEQIDNo.5的cDNA分子或DNA分子；c2)與c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼葡萄糖脫氫酶(GDH)的cDNA分子或基因組DNA分子；c3)在嚴格條件下與c1)或c2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼葡萄糖脫氫酶的cDNA分子或基因組DNA分子。本領域普通技術人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼RrQR的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的RrQR的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼RrQR且具有RrQR功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述生物材料中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼RrQR的核酸分子的表達盒(RrQR基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達RrQR的DNA。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述的微生物可為細菌、酵母、藻或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為埃希氏菌屬細菌。所述埃希氏菌屬細菌可為大腸桿菌(Escherichiacoli)。所述大腸桿菌(Escherichiacoli)可為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了一種R-3-奎寧醇的制備方法。本發(fā)明所提供的一種R-3-奎寧醇的制備方法，包括用葡萄糖脫氫酶和所述RrQR將3-奎寧酮轉化為R-3-奎寧醇。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，用葡萄糖脫氫酶和所述RrQR將3-奎寧酮轉化為R-3-奎寧醇可為用表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞(簡稱全細胞催化劑)將3-奎寧酮轉化為R-3-奎寧醇。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，所述葡萄糖脫氫酶的氨基酸序列可為SEQIDNo.6所示。所述表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞含有SEQIDNo.5所示的所述葡萄糖脫氫酶的編碼基因(GDH基因)。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，所述表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞具體可為表達所述葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組微生物細胞。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，所述的微生物可為細菌、酵母、藻或真菌。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌，可為埃希氏菌屬細菌。所述埃希氏菌屬細菌可為大腸桿菌(Escherichiacoli)。所述大腸桿菌(Escherichiacoli)可為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，所述表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞按照包括如下步驟的方法構建：將含有所述RrQR基因和所述GDH基因的共表達載體導入大腸桿菌BL21(DE3)得到所述表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞。上述R-3-奎寧醇的制備方法中，用葡萄糖脫氫酶和所述RrQR將3-奎寧酮轉化為R-3-奎寧醇可為向溶劑為pH7.0200mM磷酸緩沖液中加入表達葡萄糖脫氫酶和所述RrQR的重組細胞、3-奎寧酮鹽酸鹽、葡萄糖和NAD+得到反應體系，30℃保溫反應。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了所述RrQR的制備方法。本發(fā)明所提供的所述RrQR的制備方法，可包括將所述RrQR的編碼基因在生物細胞中進行表達得到具有奎寧酮還原酶活性的蛋白質(zhì)。上述所述RrQR的制備方法中，所述RrQR的編碼基因可為如下⑴或⑵或⑶所示的 核酸分子：⑴核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；⑵與⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；⑶在嚴格條件下與⑴限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，SEQIDNo.1由783個核苷酸組成，SEQIDNo.1的核苷酸編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述所述蛋白質(zhì)RrQR的制備方法中，所述生物細胞可為微生物細胞。所述細菌可為革蘭氏陽性細菌或革蘭氏陰性細菌。所述革蘭氏陰性細菌可為埃希氏菌屬細菌。所述埃希氏菌屬細菌可為大腸桿菌(Escherichiacoli)。所述大腸桿菌(Escherichiacoli)可為大腸桿菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)。本發(fā)明還提供了一種RrQR基因。本發(fā)明所提供的RrQR基因，為如下⑴或⑵或⑶所示的基因：⑴核苷酸序列是序列表中SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；⑵與⑴限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；⑶在嚴格條件下與⑴限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，SEQIDNo.1由783個核苷酸組成，SEQIDNo.1的核苷酸編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。為解決上述技術問題，本發(fā)明還提供了與所述RrQR基因相關的生物材料。本發(fā)明所提供的與RrQR基因相關的生物材料，為下述B1)至B8)中的任一種：B1)編碼所述RrQR基因的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表達盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體；B4)含有B2)所述表達盒的重組載體；B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物；B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物；B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；B8)含有B4)所述重組載體的重組微生物；其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述所述與RrQR基因相關的生物材料中，B2)所述的表達盒和/或B3)所述重組載體可含有如下d1)或d2)或d3)所示的基因：d1)其編碼序列是SEQIDNo.5的cDNA分子或DNA分子；d2)與d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼葡萄糖脫氫酶的cDNA分子或基因組DNA分子；d3)在嚴格條件下與d1)或d2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼葡萄糖脫氫酶的cDNA分子或基因組DNA分子。實驗證明，本申請?zhí)峁┑目鼘幫€原酶RrQR的比活力為227.49U/mg，而在同等條件下奎寧酮還原酶ArQR的比活力為200U/mg。對奎寧酮還原酶RrQR熱穩(wěn)定性的進行分析表明，奎寧酮還原酶RrQR具有很高的熱穩(wěn)定性，30℃孵育8小時，奎寧酮還原酶RrQR的相對活力依然保持在70.58％，而奎寧酮還原酶ArQR的相對活力只有25.37％。同時利用本申請?zhí)峁┑目鼘幫€原酶RrQR可將3-奎寧酮不對稱還原生成光學活性的R-3-奎寧醇，在4.5小時內(nèi)，可以將2M的底物完全轉化，是目前報道的最高水平。結果表明，利用本申請?zhí)峁┑目鼘幫€原酶RrQR不對稱還原3-奎寧酮所得R-3-奎寧醇的轉化率大于99％,產(chǎn)物的ee值大于99.0％。附圖說明圖1為奎寧酮還原酶催化3-奎寧酮生成R-3-奎寧醇示意圖。圖2為重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR的圖譜。圖3RrQR蛋白的表達和純化圖譜。M為蛋白質(zhì)分子量Marker；泳道1為重組菌BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解上清液；泳道2為RrQR純化蛋白。圖4ArQR蛋白的表達和純化圖譜。M為蛋白質(zhì)分子量Marker；泳道1為重組菌BL21(DE3)/pBAD/ArQR菌體裂解上清液；泳道2為ArQR純化蛋白。圖5為重組奎寧酮還原酶RrQR和ArQR的熱穩(wěn)定性的分析比較結果。具體實施方式下面結合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的大腸桿菌BL21(DE3)為Invitrogen公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為 C6010-03。下述實施例中的pBAD-hisB為Invitrogen公司產(chǎn)品。產(chǎn)品目錄號為VT1275。實施例1、重組奎寧酮還原酶RrQR催化3-奎寧酮的不對稱還原生產(chǎn)R-3-奎寧醇本實施例以徐建和公開的重組奎寧酮還原酶ArQR作為對照，具體實驗方法如下：一、重組奎寧酮還原酶表達載體的構建1、RrQR基因表達質(zhì)粒的構建人工合成SEQIDNo.1所示的DNA分子(RrQR基因)，編碼SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)RrQR。將質(zhì)粒pBAD-hisB的XhoⅠ識別序列和PstⅠ識別序列間的DNA替換為核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子，保持pBAD-hisB的其它序列不變得到RrQR基因表達載體，其名稱為pBAD/RrQR。pBAD/RrQR表達SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)RrQR。重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR的構建示意圖見圖2。2、ArQR基因表達質(zhì)粒的構建人工合成SEQIDNo.3所示的DNA分子(ArQR基因)，編碼SEQIDNo.4所示的蛋白質(zhì)ArQR。將質(zhì)粒pBAD-hisB的XhoⅠ識別序列和PstⅠ識別序列間的DNA替換為核苷酸序列是SEQIDNo.3的DNA分子，保持pBAD-hisB的其它序列不變得到ArQR基因表達載體，其名稱為pBAD/ArQR。pBAD/ArQR表達SEQIDNo.4所示的蛋白質(zhì)ArQR。二、重組奎寧酮還原酶的表達和純化1、重組奎寧酮還原酶RrQR的表達和純化1.1、將重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR用氯化鈣法導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到含有pBAD/RrQR的重組菌大腸桿菌，將該重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pBAD/RrQR。將BL21(DE3)/pBAD/RrQR接種于LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過夜得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR培養(yǎng)菌液1，然后將BL21(DE3)/pBAD/RrQR培養(yǎng)菌液1以1:100(體積比)接種到LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL氨芐青霉素)中，振蕩培養(yǎng)至OD600值0.6-0.8得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR培養(yǎng)菌液2。向BL21(DE3)/pBAD/RrQR培養(yǎng)菌液2中加入阿拉伯糖，使阿拉伯糖在體系中的濃度為0.2％(質(zhì)量百分比)，30℃，誘導14h，收集菌體PBS重懸后超聲破碎，得到BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體破碎液。將該菌體破碎液12000rpm離心10min，得到的BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解沉淀進行SDS-PAGE。1.2、按照上述方法，將重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR替換為質(zhì)粒pBAD-hisB，其它步驟均相同，將得到BL21(DE3)/pBAD菌體裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD菌體裂解沉淀進行SDS-PAGE。1.3、將步驟1.1中的BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解上清液和HisTrapFFcrude預裝柱(GE公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為11-0004-58)結合，然后分別用含有20mM咪唑的PBS洗脫液和含有500mM咪唑PBS洗脫液洗脫，將500mM咪唑PBS洗脫液洗脫的蛋白為獲得純化蛋白RrQR。將純化蛋白RrQR進行SDS-PAGE。結果表明，蛋白質(zhì)RrQR存在于BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解上清液(圖3)和BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解沉淀中，BL21(DE3)/pBAD/RrQR菌體裂解上清液中的蛋白質(zhì)RrQR可被鎳柱純化，分子量大小為29kDa。BL21(DE3)/pBAD菌體裂解上清液和BL21(DE3)/pBAD菌體裂解沉淀中均無蛋白質(zhì)RrQR的表達。利用改良型Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號SK3041),測得重組奎寧酮還原酶的蛋白質(zhì)RrQR濃度為5.1mg/mL。2、重組奎寧酮還原酶ArQR的表達和純化按照上述步驟1，將重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR替換為重組表達質(zhì)粒pBAD/ArQR，進一步用氯化鈣法導入大腸桿菌BL21(DE3)、阿拉伯糖誘導、純化得到重組奎寧酮還原酶ArQR酶液，測得重組奎寧酮還原酶ArQR酶液中的蛋白質(zhì)ArQR濃度為11mg/mL。結果見圖4。三、奎寧酮還原酶比活力的測定1、奎寧酮還原酶活力的測定方法如下：制備1ml反應體系1，該反應體系1的pH7.0，溶劑為0.1mmol/L磷酸緩沖液，溶質(zhì)為3-奎寧酮、NAD+和步驟二制備的重組奎寧酮還原酶酶液。1ml反應體系1中，3-奎寧酮的濃度為2μmol/L，NADH的濃度為0.1μmol/L，步驟二制備的重組奎寧酮還原酶稀釋100倍，上樣10μL。測定步驟如下：首先向pH7.0的0.1mmol/L磷酸緩沖液中加入3-奎寧酮和NADH，30℃保溫2分鐘后加入步驟二制備的重組奎寧酮還原酶酶液，迅速混勻，檢測340nm處吸光值的變化。利用分光光度計，通過檢測340nm處吸光值的變化來測定奎寧酮還原酶的活力。酶活力的計算公式為：酶活力(U)＝EW×V×103/(6220×l)。式中，EW為1分鐘內(nèi)340nm處吸光度的變化；V為反應液的體積，單位ml；6220為NADH的摩爾消光系數(shù)，單位L/(mol·cm)；l為光程距離，單位為cm。每單位奎寧酮還原酶活力的定義為在上述條件下，每分鐘催化生成1μMNADH所需的酶量。2、重組奎寧酮還原酶RrQR和ArQR的比活力酶的比活力的計算公式為：酶的比活力(U/mg)＝酶活力/蛋白濃度根據(jù)上述步驟1中奎寧酮還原酶活力的測定方法，測得純化蛋白RrQR的比活力為227.49U/mg，純化蛋白ArQR的比活力為200U/mg。四、重組奎寧酮還原酶RrQR熱穩(wěn)定性的分析1、重組奎寧酮還原酶RrQR的熱穩(wěn)定性1.1、將步驟二制備的重組奎寧酮還原酶RrQR酶液在30℃分別孵育1小時、2小時、4小時、6小時和8小時，分別得到熱處理1小時的酶液、熱處理2小時的酶液、熱處理4小時的酶液、熱處理6小時的酶液和熱處理8小時的酶液。1.2、按照步驟三中奎寧酮還原酶活力的測定方法，將步驟三中的步驟二制備的重組奎寧酮還原酶酶液分別替換為熱處理1小時的酶液，得到熱處理1小時的奎寧酮還原酶RrQR活力。按照下述公式計算得到熱處理1小時奎寧酮還原酶RrQR的相對活力?？鼘幫€原酶RrQR的相對活力＝(熱處理1小時的奎寧酮還原酶RrQR活力/酶液的奎寧酮還原酶RrQR活力)*100％按照上述方法，分別將熱處理1小時的酶液替換為熱處理2小時的酶液、熱處理4小時的酶液、熱處理6小時的酶液和熱處理8小時的酶液，分別得到熱處理2小時奎寧酮還原酶RrQR的相對活力、熱處理4小時奎寧酮還原酶RrQR的相對活力、熱處理6小時奎寧酮還原酶RrQR的相對活力和熱處理8小時奎寧酮還原酶RrQR的相對活力。2、重組奎寧酮還原酶ArQR的熱穩(wěn)定性按照上述步驟將步驟二制備的重組奎寧酮還原酶RrQR酶液替換為步驟二制備的重組奎寧酮還原酶ArQR酶液，其余步驟均相同，得到熱處理1小時奎寧酮還原酶ArQR的相對活力、熱處理2小時奎寧酮還原酶ArQR的相對活力、熱處理4小時奎寧酮還原酶ArQR的相對活力、熱處理6小時奎寧酮還原酶ArQR的相對活力和熱處理8小時奎寧酮還原酶ArQR的相對活力。實驗結果見圖5，重組奎寧酮還原酶RrQR和重組奎寧酮還原酶ArQR孵育8小時，重組奎寧酮還原酶RrQR的相對活力依然保持在70.58％，而重組奎寧酮還原酶ArQR的相對活力只有25.37％。結果表明，重組奎寧酮還原酶RrQR具有較高的熱穩(wěn)定性。五、全細胞催化劑的獲得1、共表達載體質(zhì)粒的構建巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)DSMNo.319購自德國微生物菌種保藏中心。用細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)DSMNo.319的基因組DNA，以該基因組DNA為模板，以GGCGTTCGTATGGATTAACTGCAAAAGGAGATATAATGATGTATACAGATTTAAAAGATAAAG和TGGCTGCCGCGCGGCACCAGCTGCAGTTAGCCTCTTCCTGCTTGGAAAG為引物進行PCR擴增得到PCR 產(chǎn)物。所述PCR產(chǎn)物中包含SEQIDNo.5所示的DNA分子。將載體pBAD/RrQR的用PstⅠ單酶切，然后利用Gibson組裝克隆試劑盒(NEB公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為E2611L)組裝上述PCR產(chǎn)物，保持載體pBAD/RrQR的其它序列不變得到含有GDH基因和RrQR基因的的共表達載體，其名稱為pBAD/RrQR/GDH。pBAD/RrQR/GDH表達SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)RrQR和SEQIDNo.6所示的蛋白質(zhì)GDH。2、全細胞催化劑的獲得將重組表達質(zhì)粒pBAD/RrQR/GDH用氯化鈣法導入大腸桿菌BL21(DE3)，得到含有pBAD/RrQR/GDH的重組菌大腸桿菌，將該重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pBAD/RrQR/GDH。將BL21(DE3)/pBAD/RrQR/GDH接種到LB液體培養(yǎng)基(含50μg/mL氨芐青霉素)中，振蕩培養(yǎng)至OD600值0.6-0.8，加入阿拉伯糖，使阿拉伯糖在體系中的濃度為0.2％(質(zhì)量百分比)，30℃，誘導培養(yǎng)14h后收集菌體，收集到的菌體即為全細胞催化劑。六、全細胞催化劑還原3-奎寧酮催化合成(R)-3-奎寧醇制備65ml反應體系，該反應體系中溶劑為pH7.0200mM磷酸緩沖液，溶質(zhì)為3-奎寧酮鹽酸鹽、葡萄糖、NAD+和步驟五制備全細胞催化劑。65ml反應體系中，3-奎寧酮鹽酸鹽的濃度為2M，葡萄糖的濃度為2M，NAD+的濃度為0.1mmol/L，全細胞催化劑的濃度為10g(濕重)/L。在30℃，110rpm，振蕩反應4.5個小時。反應過程中，用2MNaOH調(diào)節(jié)反應體系中pH值，使pH值保持在7.0。反應結束后用2MNaOH調(diào)至pH13.0，加入0.4ml三氯甲烷進行萃取，萃取兩次，萃取液合并后加入無水硫酸鈉干燥過夜，然后分析測定底物轉化率和還原產(chǎn)物的ee值。產(chǎn)物ee值的具體分析條件如下：使用氣相色譜儀進行分析，色譜柱為手性毛細管柱CP-chirasil-DEXCB(25m*0.25mm*0.25μm)(Agilent公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CP7502)，以氮氣為載氣，進樣口溫度220℃，檢測器溫度220℃。實驗結果見表1。結果表明，測得用RrQR以上述條件下不對稱還原3-奎寧酮所得R-3-奎寧醇的轉化率大于99％,產(chǎn)物的ee值大于99.0％。檢測標準品，S-3-奎寧醇的保留時間為32.78，R-3-奎寧醇的保留時間為33.45.我們所得產(chǎn)物全部為R型。表1.RrQR催化3-奎寧酮不對稱還原的結果當前第1頁1 2 3