一種醛酮還原酶在催化生成(r)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種醛酮還原酶的應(yīng)用，尤其涉及一種醛酮還原酶(aldo - keto reductase)在以4_氯乙酰乙酸乙醋為底物不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)生產(chǎn)(對(duì)-4-氯-3羥基丁酸乙酯中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002](對(duì)-4-氯_3 輕基丁酸乙醋(Ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate, {R) -CHBE)是合成許多藥物化合物的重要手性中間體，可用于多種活性藥物的合成，如(-)_大內(nèi)酰亞胺 A ((-)-macro I act in A) [1]、L_ 肉堿(L-carnitine) [2]、阿伐他汀媽[3]、R-Y-氨基-β -輕基丁酸(GABOB) M的關(guān)鍵手性中間體。
[0003]以4-氯乙酰乙酸乙醋(4-chloroacetoacetate Ethyl C0BE)作為還原反應(yīng)的潛手性底物，易于合成且價(jià)格低廉，以其為底物進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)獲取(對(duì)-CHBE是非常經(jīng)濟(jì)有效的制備途徑。
[0004]迄今為止關(guān)于COBE不對(duì)稱(chēng)還原制備手性CHBE已有很多的研宄報(bào)道。制備方法主要有化學(xué)法和生物法。
[0005]化學(xué)法以手性催化劑，如2，2’ - 二聯(lián)苯磷基-1，I’ -聯(lián)萘釕配合物作為不對(duì)稱(chēng)還原催化劑，通過(guò)高溫高壓，達(dá)到還原的目的，對(duì)映體過(guò)量(e.e.)值可達(dá)到97%。這一方法應(yīng)用較多，但是缺點(diǎn)也是顯而易見(jiàn)的:使用高壓的氫，對(duì)反應(yīng)器要求較高，而且所用的催化劑價(jià)格昂貴且不易獲得，因此成本較高制約了其發(fā)展。
[0006]微生物法分為酶催化和全細(xì)胞催化法，全細(xì)胞法又分為采用野生酵母和基因工程菌催化COBE生成(對(duì)-CHBE兩種。生物催化因其反應(yīng)條件溫和，立體選擇性強(qiáng)，反應(yīng)速度快，在合成此類(lèi)手性化合物中有很大的優(yōu)勢(shì)。許多微生物都能還原C0BE，但絕大多數(shù)微生物的還原產(chǎn)物是S構(gòu)型的，只有少數(shù)微生物能獲得R型還原產(chǎn)物，如赭色擲孢酵母(Sporobolomyces salmonicolor)、麥芽糖假絲酵母{Candida maltose!)、卡斯太拉德巴利酵母{Debaryomyces castellii)及擲抱圓酵母{Torulaspora nagoyaensis)等，但其催化產(chǎn)物的手性選擇性即對(duì)映體過(guò)量(e.e)值只有8%?63%[5’6]。除此之外，篩選到高立體選擇性的優(yōu)良微生物菌株非常困難，所以近來(lái)的研宄著重集中在使用基因工程手段，運(yùn)用重組大腸桿菌不對(duì)稱(chēng)合成具有高光學(xué)純度的(對(duì)-CHBE。例如shimizu等人m用同時(shí)表達(dá)乙醛還原酶和葡萄糖脫氫酶的重組大腸桿菌細(xì)胞作為催化劑，使(R)-CHBE的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到62.5%，對(duì)映體過(guò)量e.e.值達(dá)到95%。Hiroaki Yamamoto等[8]則將來(lái)自于CandidaparaAsiJosis的醇脫氫酶基因在大腸桿菌E.coli W3110中表達(dá)，重組菌在水相體系中催化COBE不對(duì)稱(chēng)還原(輔底物為2-丙醇)，得到產(chǎn)物(對(duì)-CHBE，對(duì)映體過(guò)量(e.e.)值為99%ο公開(kāi)號(hào)為CN 103160547 A的中國(guó)專(zhuān)利利用白色念珠菌來(lái)源的醇脫氫酶CADH轉(zhuǎn)化50g/L的C0BE，得率為93%。公開(kāi)號(hào)為CN 102618513的中國(guó)專(zhuān)利利用羰基還原酶CgKRl轉(zhuǎn)化2mol/L(329.2g/L)的COBE,收率為91%，產(chǎn)物光學(xué)純度e.e.%為97%。
[0007]綜上所述，現(xiàn)有催化COBE為{R) -CHBE的技術(shù)普遍存在底物得率低、產(chǎn)物光學(xué)活性低、成本高等問(wèn)題。
[0008]本專(zhuān)利中涉及到的還原酶是醛酮還原酶，包含295個(gè)氨基酸，其在Genbank中的收錄號(hào)為 ΧΡ_719854.I (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/protein/XP_719854.1)，其氨基酸序列如SEQ ID Ν0:2所示。編碼該蛋白的基因含有888個(gè)堿基對(duì)，其在Genbank中的收錄號(hào)為 XM_714761，(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/XM_714761)其基因序列如 SEQID NO:1所示。至今未發(fā)現(xiàn)該醛酮還原酶用于COBE不對(duì)稱(chēng)還原制備(對(duì)-CHBE的報(bào)道。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種醛酮還原酶在COBE不對(duì)稱(chēng)還原制備(A) -CHBE中的應(yīng)用。
[0011]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下:
一種氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醛酮還原酶在4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)不對(duì)稱(chēng)還原制備(R)-4-氯-3羥基丁酸乙酯(U)-CHBE)中的應(yīng)用。
[0012]即以氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醛酮還原酶為催化劑，以4-氯乙酰乙酸乙酯為底物，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(還原型輔酶II，NADPH)為輔因子，不對(duì)稱(chēng)還原制備U)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。
[0013]編碼所述醛酮還原酶的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0014]一種重組表達(dá)載體，包含上述技術(shù)方案所述核酸的重組表達(dá)載體。
[0015]一種重組大腸桿菌，包含上述技術(shù)方案所述重組表達(dá)載體。
一種重組醛酮還原酶的制備方法，包括如下步驟:培養(yǎng)上述技術(shù)方案所述重組大腸桿菌，從培養(yǎng)物中獲得重組醛酮還原酶。
[0016]具體反應(yīng)是將表達(dá)基因序列如SEQ ID NO:1所示的重組菌，100g/L~350g/L的4-氯乙酰乙酸乙醋，200g/L~600g/L的葡萄糖，20KU/L~60KU/L的葡萄糖脫氫酶(glucosedehydrogenase，⑶H)，在 ρΗ6.5-7.5、恒溫?fù)u床 25~30°C、180~220rpm 條件下，反應(yīng) 12~30h，得到U)-4-氯-3羥基丁酸乙酯。該反應(yīng)無(wú)需額外添加氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(氧化型輔酶II，NADP)，只需要利用重組菌粗酶液中含有的輔酶NADP即可，NADP和⑶H生成NADPH供不對(duì)稱(chēng)還原使用，且使反應(yīng)得以循環(huán)進(jìn)行，極大地減少了生產(chǎn)成本。
[0017]本發(fā)明的應(yīng)用運(yùn)用現(xiàn)代生物信息學(xué)工具，結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)，采用基因工程的手段從白色念珠菌Candida W克隆醛酮還原酶的基因，在大腸桿菌中表達(dá)后發(fā)現(xiàn)其在水相中能夠高效的催化COBE為(對(duì)-CHBE，且e.e.值>99%。同時(shí)，通過(guò)在水相和水/有機(jī)相中反應(yīng)、分批添加底物COBE等方式，解除了底物和產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞和酶的抑制作用，顯著的提高了轉(zhuǎn)化效果。通過(guò)對(duì)醛酮還原酶的基因進(jìn)行重組表達(dá)，獲得了具有新型催化功能的酶蛋白，開(kāi)發(fā)了該條基因的新功能一一催化非天然底物COBE為高立體選擇性的(對(duì)-CHBE。
[0018]有益效果:本發(fā)明首次將氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醛酮還原酶應(yīng)用于COBE不對(duì)稱(chēng)還原制備U)-CHBE中，取得很好的效果，其酶活高達(dá)8.lU/mg。氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的醛酮還原酶對(duì)底物COBE的得率高(大于99%)、產(chǎn)物CHBE的光學(xué)活性高(e.e.值為>99%)，且產(chǎn)量高，大大降低了生產(chǎn)成本。
[0019]【附圖說(shuō)明】:
圖1為醛酮還原酶基因的構(gòu)建圖。
[0020]圖2為實(shí)施例5中反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定體系中COBE和CHBE的譜圖。
[0021]圖3為實(shí)施例5中反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定體系中(5)- CHBE和(對(duì)-CHBE的譜圖。
[0022]【具體實(shí)施方式】:
根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0023]實(shí)施例1:重組大腸桿菌E.coli Rosetta (pET_22b_CAK)的構(gòu)建
1、醛酮還原酶基因的獲取
白色念?朱菌 Candida albicansi^^ Centraalbureauvoor Schimmelcultures (CBS)Fungal B1diversiry Centre)，培養(yǎng)基YPD (g.L4):酵母提取物10，蛋白胨20，葡萄糖20，補(bǔ)蒸餾水至1L。
[0024]將白色念珠菌Candida接種于5mL YPD液體培養(yǎng)基中30 V培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，使用基因組DNA提取試劑盒(北京天為生物工程有限公司酵母基因組提取試劑盒，⑶2415 Yeast gDNA Kit)提取基因組。
[0025]從基因組中擴(kuò)增目的片段所用的引物加設(shè)酶切位點(diǎn)，引物序列如下:
上游引物{含 Ndet)為:5’_ GGAATTCCATATGCCAGCTCAATTGCA-3’
下游引物(含 AfcoT)