本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種偽狂犬病毒變異株的弱毒株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

偽狂犬病是由偽狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病。PRV能感染多種宿主，但豬是該病毒主要的天然宿主、貯存者和傳播者。不同年齡段的豬都可感染，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬高死亡率，及種豬不育。PRV屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，其基因組為線狀雙鏈DNA,長(zhǎng)約150kb,由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)(UL)、短獨(dú)特區(qū)(US)及US兩側(cè)的重復(fù)序列所組成，編碼70多種蛋白。病毒粒子由核衣殼、外殼及囊膜三層組成。核衣殼是由6種衣殼蛋白包裹病毒基因組形成的二十面體結(jié)構(gòu)；外殼介于核衣殼與囊膜層間，由14種蛋白組成；囊膜由15種蛋白鑲嵌于雙層脂膜組成，其中糖蛋白11種。病毒表面蛋白決定了病毒的細(xì)胞嗜性，也是主要的保護(hù)性抗原。一些重要的病毒基因，如tk和gI/gE，對(duì)病毒毒力存在顯著影響，其缺失能使病毒致病力減弱。

偽狂犬病最早發(fā)生于美國(guó)，我國(guó)于上世紀(jì)40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了PRV，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒流行，至今偽狂犬病毒仍在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重威脅著我國(guó)豬群的健康，并造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。豬感染PRV后，有的呈隱性感染，但長(zhǎng)期攜帶病毒；出現(xiàn)臨床癥狀的耐過豬也能成為病毒的攜帶者，成為傳染源，這增加了PRV防治的難度。為了控制PRV，我國(guó)豬場(chǎng)自上世紀(jì)90年代開始廣泛使用基因缺失的PRV弱毒活疫苗(如PRV Bartha株活疫苗)，豬偽狂犬發(fā)病率明顯下降，部分種豬場(chǎng)實(shí)際已經(jīng)根除了此病毒。但自2011年以來，許多使用PRV活疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等偽狂犬的臨床癥狀。童武、彭金美等人也分別從發(fā)病豬中分離到了PRV野毒株，并通過基因序列分析與抗體中和試驗(yàn)證實(shí)了分離的野毒株較疫苗株和經(jīng)典毒發(fā)生了較大的變異。這表明，我國(guó)豬場(chǎng)中出現(xiàn)了PRV變異株，而目前使用的商品化疫苗對(duì)變異株的保護(hù)效果差，導(dǎo)致了我國(guó)豬場(chǎng)偽狂犬發(fā)病率的抬頭。為了有效控制PRV變異株的流行，需要開發(fā)更為高效的PRV疫苗。而以PRV變異株為基礎(chǔ)，研制新的PRV疫苗，將能提高針對(duì)PRV變異株的免疫保護(hù)效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決目前國(guó)內(nèi)出現(xiàn)PRV變異株，而現(xiàn)有商品化PRV疫苗對(duì)變異株保護(hù)效果差， 亟需開發(fā)新的PRV疫苗的技術(shù)問題，提供一種偽狂犬病毒變異株的弱毒株，該弱毒株對(duì)PRV變異株和PRV經(jīng)典強(qiáng)毒株都具有很好的免疫保護(hù)效果，接種2周齡內(nèi)PRV陰性仔豬，沒有出現(xiàn)任何臨床不良癥狀，安全性高，適于作為防控偽狂犬病的疫苗候選株。

此外，還需要提供一種上述偽狂犬病毒變異株的弱毒株的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種偽狂犬病毒變異株的弱毒株，該弱毒株是偽狂犬病毒變異株P(guān)RV JS-2012株的基因缺失弱毒株，其缺失的基因序列包括：PRV JS-2012變異株基因組中g(shù)E基因CDS區(qū)的全部或部分DNA序列。該P(yáng)RV JS-2012變異株gE基因CDS區(qū)的全部DNA序列如SEQ ID NO.20所示。

優(yōu)選的，所述缺失的基因序列還包括：PRV JS-2012變異株基因組中US2基因CDS區(qū)的全部或部分DNA序列。該P(yáng)RV JS-2012變異株US2基因CDS區(qū)的全部DNA序列如SEQ ID NO.21所示。

更優(yōu)選的，所述缺失的基因序列包括：PRV JS-2012變異株基因組中g(shù)E基因CDS區(qū)的部分DNA序列和US2基因CDS區(qū)的部分DNA序列。最優(yōu)選的，所述缺失的基因序列包括：PRV JS-2012變異株基因組中g(shù)E基因CDS區(qū)的第437位堿基至US2基因CDS區(qū)的第396位堿基之間的DNA序列，共計(jì)連續(xù)缺失2307bp，該連續(xù)缺失的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種疫苗組合物，所述組合物包含與佐劑或藥用載體混合的偽狂犬病毒變異株的弱毒株。

所述疫苗組合物適于以滴鼻或注射的方式接種。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種上述偽狂犬病毒變異株的弱毒株在制備預(yù)防或治療偽狂犬病的疫苗中的應(yīng)用。

在本發(fā)明的另一方面，還提供了一種區(qū)分上述偽狂犬病毒變異株的弱毒株與變異株或野毒株感染的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包含：針對(duì)所述弱毒株缺失基因序列設(shè)計(jì)的引物對(duì)。利用設(shè)計(jì)合成的引物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)，能區(qū)分鑒別出本發(fā)明的偽狂犬病毒變異株基因缺失弱毒株與變異株或野毒株。

本發(fā)明偽狂犬病毒變異株的弱毒株，是以PRV變異株為基礎(chǔ)，通過將偽狂犬變異株JS-2012用Vero細(xì)胞在40℃高溫下連續(xù)傳代獲得。該弱毒株具有良好的安全性，接種2周齡內(nèi)PRV陰性仔豬，沒有出現(xiàn)任何臨床不良癥狀，能產(chǎn)生gB抗體，但不產(chǎn)生gE抗體。該弱毒株免疫2周齡PRV陰性仔豬后，仔豬能有效抵抗變異和經(jīng)典偽狂犬強(qiáng)毒的攻擊，因此該弱毒株能作為有效防控豬偽狂犬病的疫苗候選株。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F50毒與親本毒PRV JS-2012在Vero細(xì)胞上的細(xì)胞病變圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120毒在Vero細(xì)胞上的早、中、晚期細(xì)胞病變圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120毒及親本毒PRV JS-2012在Vero細(xì)胞上的蝕斑形態(tài)圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因組的gB,gC,gD基因的PCR鑒定結(jié)果圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因組的gI基因的PCR鑒定結(jié)果圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因組的gE基因的PCR鑒定結(jié)果圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例1的PRV JS-2012-F120病毒基因組的US2基因的PCR鑒定結(jié)果圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比對(duì)結(jié)果前半段圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比對(duì)結(jié)果后半段圖；

圖10是本發(fā)明實(shí)施例2的PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失示意圖；

圖11是本發(fā)明實(shí)施例2的PRV JS-2012-F120病毒及親本毒的PCR鑒定結(jié)果圖；

圖12是本發(fā)明實(shí)施例3高溫傳代不同代次病毒接種陰性仔豬后體溫動(dòng)態(tài)變化圖；

圖13是本發(fā)明實(shí)施例3高溫傳代不同代次病毒接種陰性仔豬后不同時(shí)間點(diǎn)的存活率圖；

圖14是本發(fā)明實(shí)施例3高溫傳代不同代次病毒接種陰性仔豬后不同時(shí)間點(diǎn)的gB抗體動(dòng)態(tài)變化圖；

圖15是本發(fā)明實(shí)施例3高溫傳代不同代次病毒接種陰性仔豬后不同時(shí)間點(diǎn)的gE抗體動(dòng)態(tài)變化圖；

圖16是本發(fā)明實(shí)施例4的PRV JS-2012-F120免疫仔豬后攻毒的不同時(shí)間點(diǎn)體溫變化圖；

圖17是本發(fā)明實(shí)施例4的PRV JS-2012-F120免疫仔豬后攻毒的不同時(shí)間點(diǎn)存活率圖。

具體實(shí)施方式

下列實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按常規(guī)條件，如《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(F.M.奧斯伯,R.E.金斯頓,J.G.塞德曼等主編，馬學(xué)軍,舒躍龍的譯.北京：科學(xué)出版社，2004)中所述的方法進(jìn)行。

由于目前的豬偽狂犬病毒疫苗不能對(duì)現(xiàn)今流行的偽狂犬病毒變異毒株提供較好的免疫保護(hù)效果，因此有必要研制PRV新型疫苗。本實(shí)驗(yàn)室2012年分離到一株偽狂犬病毒變異強(qiáng)毒株P(guān)RV JS-2012。將該變異強(qiáng)毒株用Vero細(xì)胞，在40℃高溫條件下，連續(xù)傳代得到的一株弱毒株P(guān)RV JS-2012-F120。該弱毒株不僅毒力致弱且gE基因有缺失，該基因缺失為連續(xù)缺失，缺失位置在gE基因CDS區(qū)的第436位堿基之后至US2基因CDS區(qū)的397位堿基之前，共計(jì)缺 失2307個(gè)堿基。該弱毒株具有較好的安全性，接種2周齡內(nèi)PRV陰性仔豬，沒有出現(xiàn)任何不良的臨床癥狀，且將該弱毒株免疫2周齡PRV陰性仔豬后，能有效抵抗變異和經(jīng)典偽狂犬強(qiáng)毒的攻擊。因此本發(fā)明弱毒株能作為防控豬偽狂犬病的疫苗候選株。

在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，使用的實(shí)驗(yàn)材料如下：

病毒和細(xì)胞:Vero細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫,保藏號(hào)為：GN010)，偽狂犬病毒JS-2012株(本實(shí)驗(yàn)室保存；發(fā)表文章見：童武，張青占，鄭浩，劉飛，姜一峰，單同領(lǐng)，周艷君，童光志.免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定.中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2013，21(3):1-7)。

其他試劑:胎牛血清，胰酶，DMEN,Life technologies公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；2×GC BufferⅡ，dNTP Mix(2.5mmol/L each)，LA-Taq，DL-15000,DL-2000DNA Marker購自TakaRa；細(xì)胞培養(yǎng)耗材購自上海百賽生物科技有限公司。

在本發(fā)明的實(shí)施例中，Vero細(xì)胞的培養(yǎng)方法如下：

Vero細(xì)胞在含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基的T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中貼壁長(zhǎng)滿單層后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基，并以PBS洗一次，以0.25％的胰酶將細(xì)胞消化下，加入新的含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基，以1:6的比例分種于細(xì)胞瓶或細(xì)胞培養(yǎng)板中。

實(shí)施例1PRV JS-2012高溫傳代弱毒株的構(gòu)建

以偽狂犬變異株P(guān)RV JS-2012株為基礎(chǔ)，將該P(yáng)RV JS-2012株在Vero細(xì)胞上通過40℃連續(xù)高溫傳代，獲得了傳代毒株P(guān)RV JS-2012-F120。PRV JS-2012-F120株在Vero細(xì)胞上增殖，其病毒滴度可達(dá)10^8.5TCID₅₀/0.1mL，且該毒在Vero細(xì)胞上所造成的細(xì)胞病變形態(tài)及蝕斑形態(tài)明顯不同于其親本毒PRV JS-2012。經(jīng)PCR驗(yàn)證，PRV JS-2012-F120毒株的gE及US2基因均有缺失。

1方法

1.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PRV JS-2012株的全基因組序列，用Oligo 6.0軟件設(shè)計(jì)了多條引物(見表1)，gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID，gEU/gED，US2U/US2D用于擴(kuò)增偽狂犬病毒gB,gC,gD,gI,gE,US2基因的部分或全長(zhǎng)序列。

表1引物序列

1.2PRV JS-2012病毒的高溫傳代

37℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下，Vero細(xì)胞在25cm²的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至單層后，接種含10⁶個(gè)TCID₅₀的PRV JS-2012病毒液5ml。將接毒后的Vero細(xì)胞放至40℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，約24h后，待80％-90％的細(xì)胞病變后，將病毒放至-20℃凍融一次，再將病毒液轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中10000g離心2min，取上清裝置干凈的1.5ml的EP管中，將該病毒記為PRV JS-2012-F1。

將PRV JS-2012-F1以含2％FBS的DMEM作1:50稀釋，取5ml稀釋病毒接種T25細(xì)胞瓶中的單層Vero細(xì)胞，放至40℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，待80％-90％的細(xì)胞病變后，放至-20℃凍融一次，再將病毒液轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中10000g離心2min，取上清分裝于1.5ml的EP管中，將該病毒記為PRV JS-2012-F2。再參照上述方法進(jìn)行連續(xù)傳代，直至傳至120代，將第120代的病毒記為PRV JS-2012-F120。傳代過程中每傳至30n-3(n為1,2,3,4)代時(shí)通過連續(xù)3代蝕斑克隆純化(過程如下)傳代病毒。

將傳代病毒以DMEM稀釋，接種至60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的Vero細(xì)胞單層上，在37℃、5％的CO₂的培養(yǎng)條件下孵育1h后，棄吸附病毒液，并以PBS洗一次，加入含1％瓊脂和2％FBS的覆蓋層，室溫放至瓊脂凝固后，將細(xì)胞放至37℃、5％的CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，2至3天后，挑取單一的蝕斑置于0.5mL DMEM中。經(jīng)1次凍融后，以DMEM稀釋蝕斑液，接種60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的Vero細(xì)胞單層進(jìn)行第二輪蝕斑純化。將第三輪蝕斑液以含2％FBS的DMEM稀釋至5mL,接種T25細(xì)胞瓶中的單層Vero細(xì)胞，放至40℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下繼續(xù)傳代。

1.3PRV JS-2012-F120病毒的PCR鑒定、毒價(jià)測(cè)定及蝕斑形態(tài)觀察

用DNA提取試劑盒提取PRV JS-2012-F120的DNA，用gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID，gEU/gED，US2U/US2D六對(duì)引物分別進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系均為20μL：2×GC BufferⅡ10ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；上游引物0.5ul(10pmol/ul)；下游引物0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH₂O 4.5ul；病毒的DNA 2ul。反應(yīng)條件均為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，69℃退火30s，72℃延伸2.5min，循環(huán)35次；最后于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物以1％的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀中觀察。

將PRV JS-2012-F120病毒接種Vero細(xì)胞，待80％細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收獲病毒。參照文獻(xiàn)(殷震等，動(dòng)物病毒學(xué)，科學(xué)出版社，1997),用96孔組織培養(yǎng)板方法測(cè)定該病毒的滴度。將該病毒用含2％FBS的DMEM作10倍系列稀釋后，將稀釋的病毒接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上的Vero單層細(xì)胞。每稀釋度接種8孔，設(shè)8孔對(duì)照(以含2％FBS的DMEM接種),置37℃5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察至接種后第4天，記錄出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算TCID₅₀。

將PRV JS-2012-F120病毒以適當(dāng)?shù)亩玖拷臃N至單層的Vero細(xì)胞上，在37℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下孵育1h，將混合好的瓊脂(2％的瓊脂與2＊MEM培養(yǎng)基1:1混合，再加入總體積2％的胎牛血清)加到Vero細(xì)胞，室溫放至瓊脂凝固后，將細(xì)胞放至37℃，5％的CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，2至3天后，以5％結(jié)晶紫進(jìn)行染色，觀察蝕斑形態(tài)。

2結(jié)果

2.1PRV JS-2012病毒的高溫傳代

隨著病毒的高溫傳代，到傳至第50代時(shí)，PRV JS-2012-F50病毒在Vero細(xì)胞上所形成的細(xì)胞病變與親本病毒PRV JS-2012的細(xì)胞病變完全不同。親本病毒感染能導(dǎo)致細(xì)胞形成合胞體，感染細(xì)胞出現(xiàn)聚集，并成團(tuán)脫落；而PRV JS-2012-F50感染則呈現(xiàn)單個(gè)細(xì)胞變圓、脫落，不出現(xiàn)感染細(xì)胞聚集(結(jié)果見圖1，其中A為親本毒PRV JS-2012在Vero細(xì)胞上的細(xì)胞病變圖，B為PRV JS-2012-F50毒在Vero細(xì)胞上的細(xì)胞病變圖)。50代之后直至第120代時(shí)，各代次的傳代病毒在Vero細(xì)胞上所形成的細(xì)胞病變與PRV JS-2012-F50病毒的細(xì)胞病變完全一致，圖2為PRV JS-2012-F120病毒在Vero細(xì)胞上的早期，中期及晚期病變圖，圖2中，A為早期，B為中期，C為晚期。

蝕斑形態(tài)顯示：如圖3所示，PRV JS-2012-F120病毒與親本病毒PRV JS-2012的蝕斑形態(tài)完全不同，親本病毒的蝕斑呈圓形(圖3A)，而PRV JS-2012-F120病毒的蝕斑呈梭形(圖B)。

2.2PRV JS-2012-F120病毒的PCR鑒定及毒價(jià)測(cè)定

PRV JS-2012-F120在Vero細(xì)胞上增殖，經(jīng)TCID₅₀測(cè)定，其病毒滴度可達(dá)10^8.5TCID₅₀/0.1mL。PCR鑒定結(jié)果顯示，gBU/gBD，gCU/gCD,gDU/gDD，gIU/gID引物的結(jié)果均呈陽性，說明這些基因均未發(fā)生缺失，見圖4，圖5。圖4A、B、C分別為gB、gC、gD的全基因擴(kuò)增結(jié)果，其中數(shù)字編號(hào)1-3均為PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，4均為陽性對(duì)照，5均為 陰性對(duì)照。圖5為gI的全基因擴(kuò)增結(jié)果，其中1-10均為PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，11為陽性對(duì)照，12為陰性對(duì)照。

gEU/gED，US2U/US2D引物的結(jié)果呈陰性，說明這兩基因出現(xiàn)缺失，見圖6，圖7。圖6為gE的全基因擴(kuò)增結(jié)果，其中1-20均為PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，21為陽性對(duì)照，22為陰性對(duì)照。圖7為US2的全基因擴(kuò)增結(jié)果，其中1-6均為PRV JS-2012-F120毒的不同克隆，7為陽性對(duì)照，8為陰性對(duì)照。

實(shí)施例2 PRV JS-2012-F120病毒基因組的缺失序列分析

實(shí)施例1中經(jīng)過PCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)PRV JS-2012-F120病毒的gE，US2基因存在缺失，本實(shí)施例針對(duì)這兩基因設(shè)計(jì)了1對(duì)引物(gE330up/US2down)分別擴(kuò)增親本毒PRV JS-2012和傳代毒PRV JS-2012-F120的gE至us2基因(見SEQ ID NO.14,SEQ ID NO.15)，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，傳代毒較親本毒而言，gE基因CDS區(qū)的437位堿基至US2基因CDS區(qū)的396位堿基間的DNA序列連續(xù)缺失，共計(jì)缺失2307個(gè)堿基。參照該缺失設(shè)計(jì)了1對(duì)引物(DF120up/DF120down)用于區(qū)分PRV JS-2012-F120毒與親本毒PRV JS-2012。

1材料和方法

1.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PRV JS-2012株的全基因組序列，用Oligo 6.0軟件針對(duì)gE和us2基因設(shè)計(jì)了1對(duì)引物gE330up/US2down，gE330up:5’‐GCGCCGTGCTGGCCGGGATCTGGAC‐3’(SEQ ID NO.16)；US2down:5’‐GCCCCGCTCTGTTCTTCCTCCACCC‐3’(SEQ ID NO.17)，用于來擴(kuò)增PRV JS-2012及PRV JS-2012-F120傳代毒的gE至US2的序列。

1.2PRV JS-2012-F120基因組的提取

將PRV JS-2012-F120株接種融合單層的BHK-21細(xì)胞，待70％-80％的細(xì)胞都產(chǎn)生病變，棄掉四分之三培養(yǎng)液，用細(xì)胞刮將細(xì)胞刮下，并將細(xì)胞液移入50ml離心管，1500rmp離心5min,棄上清，以TNE溶液將沉淀細(xì)胞重懸。以酚-氯仿法從感染細(xì)胞中提取總DNA,并溶于TE中，于-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3PCR擴(kuò)增及測(cè)序

將1.2中提取的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL：2×GC BufferⅡ10ul；dNTP Mix(2.5mmol/L each)2ul；gE330up 0.5ul(10pmol/ul)；US2down 0.5ul(10pmol/ul)；LA-Taq 0.5ul；ddH₂O 4.5ul；病毒的DNA 2ul。反應(yīng)條件均為:94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，69℃退火30s，72℃延伸2.5min，循環(huán)35次；最后于72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物以1％的瓊脂糖電泳，凝膠成像儀中觀察。

回收PRV JS-2012-F120擴(kuò)增的目的片段，以pMD-18T進(jìn)行克隆，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞后，篩選陽性菌落進(jìn)行基因序列測(cè)定。

1.4傳代缺失株鑒定PCR方法

根據(jù)PRV JS-2012-F120缺失區(qū)域及兩側(cè)序列，設(shè)計(jì)合成了1對(duì)引物：DF120up/DF120down，DF120up：5'-GGCCGGGATCTGGACGTT-3'(SEQ ID NO.18)；DF120down：5'-CGGGTCACG ATCTGGGCAT-3'(SEQ ID NO.19)。以PRV JS-2012-F120和PRV JS-2012基因組為模板，參照1.3中的試驗(yàn)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

2.結(jié)果

2.1PRV JS-2012-F120的缺失序列分析

用膠回收試劑盒回收引物gE330up/US2down擴(kuò)增的PRV JS-2012-F120病毒條帶，經(jīng)連接，轉(zhuǎn)化后挑陽性菌落進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明：PRV JS-2012-F120病毒的gE基因CDS區(qū)的第437位堿基至US2基因CDS區(qū)的第396位堿基均缺失，共計(jì)缺失2307bp，見圖8、9、10。圖8是PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比對(duì)結(jié)果前半段圖，圖9是PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失序列的比對(duì)結(jié)果后半段圖。圖10A、B均為PRV JS-2012-F120gE/US2基因缺失示意圖，其中圖10B的紅色區(qū)域?yàn)?307bp連續(xù)缺失的位置。

2.2鑒定PCR結(jié)果

引物DF120up/DF120down的PCR結(jié)果顯示，PRV JS-2012病毒擴(kuò)增出了2728bp的目的片段，與預(yù)期結(jié)果相符；而PRV JS-2012-F120病毒的目的片段為421bp左右，兩片段剛好相差2307bp，與預(yù)期結(jié)果相符，見圖11。這表明，引物DF120up/DF120down檢測(cè)PRV JS-2012-F120，僅擴(kuò)增出特異性的421bp的條帶，這可區(qū)分PRV JS-2012-F120與其它PRV株。在圖11中，1為PRV JS-2012-F120毒的目的片段，2為PRV JS-2012毒的目的片段，3為陰性對(duì)照,左邊的M為2000DNA maker，右邊的M為15000DNA maker。

實(shí)施例3 PRV JS-2012不同代次的高溫傳代病毒對(duì)14日齡仔豬的致病性實(shí)驗(yàn)

選取實(shí)施例1中PRV JS-2012-F5，PRV JS-2012-F50，PRV JS-2012-F91，PRV JS-2012-F120，通過滴鼻接種14日齡的PRV陰性仔豬，驗(yàn)證病毒的致弱效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PRV JS-2012-F5毒能100％致死試驗(yàn)豬；PRV JS-2012-F50毒能使豬100％發(fā)病，但致死率為40％；PRV JS-2012-F91毒能使豬80％發(fā)病，但不能使豬致死；PRV JS-2012-F120對(duì)14日齡仔豬非常安全。通過分析攻毒后血清中的抗體，結(jié)果表明：所有未死的試驗(yàn)豬從第7天之后均能檢測(cè)到gB基因的抗體，而直至第21天實(shí)驗(yàn)結(jié)束gE抗體均呈陰性，說明PRV JS-2012-F50，PRV JS-2012-F91，PRV JS-2012-F120病毒gE基因均有缺失。

1材料和方法

1.1試驗(yàn)豬

本實(shí)驗(yàn)選取14日齡的陰性仔豬(豬偽狂犬病，病原與抗體均為陰性；豬藍(lán)耳病，豬瘟，豬圓環(huán)病毒2型的抗體也均為陰性)20頭

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與攻毒

將1.1中的20頭陰性仔豬隨機(jī)分成4組，每組5頭。第1組5頭試驗(yàn)豬分別滴鼻接種PRVJS-2012-F5病毒10⁶個(gè)TCID₅₀2ml；第2組5頭試驗(yàn)豬分別滴鼻接種PRV JS-2012-F50病毒10⁶個(gè)TCID₅₀2ml；第3組5頭試驗(yàn)豬分別滴鼻接種PRV JS-2012-F91病毒10⁶個(gè)TCID₅₀2ml；第4組5頭試驗(yàn)豬分別滴鼻接種PRV JS-2012-F120病毒10⁶個(gè)TCID₅₀2ml。攻毒后每天通過直腸檢測(cè)各組試驗(yàn)豬的體溫，并采血分離血清，觀察臨床癥狀及死亡情況，并做好記錄。

1.3PRV特異性抗體檢測(cè)

按照說明書，用IDEXX的偽狂犬病毒gB、gE抗體檢測(cè)試劑盒分別對(duì)1.2收集的血清檢測(cè)PRV gB和gE抗體。

2結(jié)果

PRV JS-2012-F5組在攻毒后第2天體溫均發(fā)燒至41℃以上，攻毒后第4天出現(xiàn)死亡，第5天全部死亡。PRV JS-2012-F50組在攻毒后第2天體溫均發(fā)燒至40.5℃以上，攻毒后第6天和第8天各死亡1頭豬。PRV JS-2012-F91組在攻毒后第2天有4頭豬體溫發(fā)燒至40.5℃以上，其中3頭豬持續(xù)2至3天后體溫恢復(fù)正常，1頭豬發(fā)燒持續(xù)7天，另有1頭豬整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未見任何臨床反應(yīng)。PRV JS-2012-F120組試驗(yàn)豬在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中均未見任何臨床癥狀。結(jié)果見圖12，圖13。這表明，隨著病毒傳代次數(shù)增高，病毒毒力不斷下降，120代的病毒PRV JS-2012-F120已對(duì)兩周齡仔豬不具有致病性，是一株弱毒株。

抗體檢測(cè)結(jié)果顯示，PRV JS-2012-F5接種仔豬，在其存活的5d內(nèi)，gB抗體和gE抗體均為陰性；而PRV JS-2012-F50、PRV JS-2012-F91、PRV JS-2012-F120三組接種存活仔豬，接種后第7d gB呈陽性，而至接種后第21天，gE抗體仍呈陰性(見圖14、圖15)。PRV野毒感染豬，感染后第7天產(chǎn)生gB抗體，2周后則能檢測(cè)到gE抗體。本次實(shí)驗(yàn)中，接種后存活超過1周的豬，均產(chǎn)生gB抗體，且所有存活的實(shí)驗(yàn)豬，到3周時(shí)仍不產(chǎn)生gE抗體，表明PRV JS-2012-F50，PRV JS-2012-F91，PRV JS-2012-F120均存在gE基因缺失。PRV JS-2012-F120的gE基因序列檢測(cè)也證實(shí)，其gE基因存在缺失，這與血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果相一致。

實(shí)施例4 PRV JS-2012-F120病毒對(duì)14日齡仔豬的免疫保護(hù)性試驗(yàn)

將PRV JS-2012-F120接種14日齡仔豬，28天后用變異強(qiáng)毒株P(guān)RV JS-2012和經(jīng)典強(qiáng)毒株P(guān)RV SC進(jìn)行攻擊，能獲得100％的保護(hù)。因此PRV JS-2012-F120毒能作為疫苗候選株，來防控豬偽狂犬病。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)仔豬

本實(shí)驗(yàn)選取14日齡的陰性仔豬(豬偽狂犬病，病原與抗體均為陰性；豬藍(lán)耳病，豬瘟，豬圓環(huán)病毒2型的抗體也均為陰性)20頭

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組與攻毒

將1.1中的20頭仔豬，將其隨機(jī)分成4組，每組5頭：第1組與第2組，共10頭豬均滴鼻接種PRV JS-2012-F120病毒10⁵個(gè)TCID₅₀2ml；第3組與第4組，共10頭豬均滴鼻接種不含血清的DMEM 2ml。接種28天后，第1組與第3組，共10頭豬均滴鼻接種PRV JS-2012強(qiáng)毒10⁵個(gè)TCID₅₀2ml；第2組與第4組，共10頭豬均滴鼻接種PRV SC強(qiáng)毒10⁵個(gè)TCID₅₀2ml。攻毒后每天通過直腸檢測(cè)各組試驗(yàn)豬的體溫，觀察臨床癥狀及死亡情況，并做好記錄。

2結(jié)果

第1組和第2組在攻強(qiáng)毒后整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中試驗(yàn)豬均未見任何臨床癥狀。第3組在攻PRV JS-2012強(qiáng)毒后的第2天體溫均發(fā)燒至41℃以上，攻毒后第4天出現(xiàn)死亡，第7天全部死亡。第4組在攻PRV SC強(qiáng)毒后的第3天體溫均發(fā)燒至41℃以上，攻毒后第6天死亡2頭，第7天和第9天各死亡1頭。結(jié)果見圖16，圖17。這表明，以10⁵TCID₅₀PRV JS-2012-F120接種仔豬，能有效抵抗變異強(qiáng)毒和經(jīng)典強(qiáng)毒的攻擊，對(duì)仔豬提供完全保護(hù)。

鑒于PRV JS-2012-F120對(duì)仔豬無致病性，能提供良好的免疫保護(hù)效果，且接種仔豬后不產(chǎn)生gE抗體，可作為疫苗候選株，來開發(fā)新型PRV疫苗。

以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。