本發(fā)明涉及生物學(xué)和其應(yīng)用領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種科學(xué)上首次研究和制備得到的自身具有磁性的蛋白，即磁感應(yīng)受體蛋白，以及所述磁感應(yīng)受體蛋白的純合蛋白復(fù)合物，以及所述磁感應(yīng)受體蛋白和光感應(yīng)蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物。本發(fā)明還提供了所述蛋白或復(fù)合物的用途。

背景技術(shù)：

鐵是生命體必需的微量元素，和鐵結(jié)合、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)也得到了較多的關(guān)注和研究。鐵結(jié)合蛋白是含鐵的金屬結(jié)合蛋白，其中有一個(gè)亞類稱之為鐵硫蛋白，其結(jié)合的鐵是以鐵硫中心(Iron-sulfur cluster)的形式存在。鐵硫蛋白是非常重要的電子傳遞的載體，主要牽涉到呼吸鏈和植物的光合作用等生化反應(yīng)過(guò)程。對(duì)鐵結(jié)合蛋白和鐵硫蛋白的研究非常廣泛和深入，主要集中在和生化代謝相關(guān)的各個(gè)方面。生物中最重要的兩個(gè)鐵結(jié)合蛋白是乳鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，其中轉(zhuǎn)鐵蛋白構(gòu)成的復(fù)合籠狀結(jié)構(gòu)，能裝載大約3000-5000個(gè)鐵原子，是生物中重要的儲(chǔ)存鐵的機(jī)制。一些研究也表明，可以利用裝載鐵原子的轉(zhuǎn)鐵蛋白作為納米顆粒用于生物醫(yī)學(xué)和其它領(lǐng)域的應(yīng)用。然而，迄今為止，所有已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鐵結(jié)合蛋白都不具備自身的磁性，即都不是“磁性蛋白”。例如，上述載鐵能力極高的轉(zhuǎn)鐵蛋白在磁場(chǎng)下能夠被磁場(chǎng)吸引，具備順磁的特性，但也不具備自身的磁性。該蛋白具有類似于鐵球在磁場(chǎng)下的反應(yīng)，但因?yàn)椴痪邆渥陨淼拇判?，所以不能作為如同用作指南針的磁鐵那樣的磁性材料使用。

另外，動(dòng)物的磁感應(yīng)能力一直是生物學(xué)領(lǐng)域中最引人注目的未解之謎。很多年以來(lái)，人們已經(jīng)知道許多動(dòng)物在進(jìn)行長(zhǎng)距離遷徙時(shí)是通過(guò)感應(yīng)地磁場(chǎng)來(lái)判斷方向和導(dǎo)航的，例如黑脈金斑蝶、家鴿、蜜蜂、龍蝦、海龜、鯊魚、蝙蝠、牛羚羊以及眾所周知的候鳥等等。除此之外，還有一些物種利用地磁場(chǎng)來(lái)引導(dǎo)自身的朝向和筑巢的走向，例如名為 Tritonias diomedea的海洋軟體動(dòng)物、指南白蟻、裸鼴鼠等。然而，人們對(duì)動(dòng)物體感應(yīng)磁場(chǎng)的分子機(jī)理了解甚少。

動(dòng)物能夠通過(guò)某種分子機(jī)制(例如，通過(guò)某種特定的基因或者蛋白質(zhì)，或者通過(guò)某條細(xì)胞信號(hào)通路)來(lái)感應(yīng)地磁場(chǎng)的這一說(shuō)法，從無(wú)人相信到被學(xué)界認(rèn)可，經(jīng)歷了很長(zhǎng)的一段時(shí)間。迄今為止，與動(dòng)物體感應(yīng)磁場(chǎng)有關(guān)的最關(guān)鍵的一個(gè)研究是隱花色素蛋白(Cryptochrome，簡(jiǎn)稱為Cry)的發(fā)現(xiàn)和研究。2008年,在Gegear,R.J.,Casselman,A.,Waddell,S.&Reppert,S.M.等的Cryptochrome mediates light-dependent magnetosensitivity in Drosophila.Nature 454,1014-1018(2008)中描述了將模式動(dòng)物果蠅的Cry基因敲除后，果蠅就失去了對(duì)磁場(chǎng)的感知能力。這一實(shí)驗(yàn)充分說(shuō)明了動(dòng)物對(duì)磁場(chǎng)的感知和利用磁場(chǎng)導(dǎo)航存在某種分子機(jī)制，并且這一過(guò)程由特定的基因和蛋白質(zhì)參與。這表明，動(dòng)物具有磁感應(yīng)能力不是偽科學(xué)，而是由特定基因決定的，并證明Cry蛋白是動(dòng)物磁感應(yīng)信號(hào)通路中非常關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)。但是，該發(fā)現(xiàn)并不能確認(rèn)Cry蛋白是直接感應(yīng)磁場(chǎng)的受體蛋白。事實(shí)上，其后有很多該領(lǐng)域的相關(guān)文獻(xiàn)也進(jìn)一步說(shuō)明了這一點(diǎn)，如Gould,J.L.的Magnetoreception.Curr Biol 20,R431-435(2010)，其指出當(dāng)前的幾種假說(shuō)都有缺陷，尤其是Cry作為磁感應(yīng)蛋白的假說(shuō)并不能解釋蛋白質(zhì)如何識(shí)別磁場(chǎng)的磁極，而Cry蛋白質(zhì)在磁場(chǎng)下的反應(yīng)并沒(méi)有任何直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)支持。值得注意的是，Cry蛋白并不是一種含鐵的蛋白質(zhì)，因此Cry蛋白不能提供其具有感磁特性的讓人信服的機(jī)理。

本領(lǐng)域尚未發(fā)現(xiàn)本身具有磁性和/或光磁性的蛋白或蛋白復(fù)合物。本領(lǐng)域亦未得到過(guò)本身具有磁性和/或光磁性的蛋白或蛋白復(fù)合物以及將其應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活中。

發(fā)明概述

本發(fā)明涉及一種在現(xiàn)代生物學(xué)研究中新研究和制備得到的自身具有磁性和/或能夠形成具有磁性之復(fù)合物的蛋白，即磁感應(yīng)受體蛋白，以及所述磁感應(yīng)受體蛋白的純合蛋白復(fù)合物，以及所述磁感應(yīng)受體蛋白和光感應(yīng)蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物。本發(fā)明還提供了所述磁感應(yīng)受體蛋白或復(fù)合物的用途。

本發(fā)明提供了一種分離的磁感應(yīng)受體蛋白。磁感應(yīng)受體蛋白(或稱 “Magnetoreceptor”，或稱“MagR”)是本申請(qǐng)發(fā)明人在現(xiàn)代生物學(xué)研究中首個(gè)研究、鑒定并命名的一種其核酸編碼序列在生物體基因組中廣泛存在并高度保守，可形成具有生物磁性的蛋白單體或純合復(fù)合物或雜合復(fù)合物的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的磁感應(yīng)受體蛋白的核酸序列在大量不同物種的基因組中都存在，其編碼的蛋白序列高度保守，并具有多個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，例如特征性的結(jié)合鐵和/或硫的結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的磁感應(yīng)受體蛋白可為磁感應(yīng)受體蛋白家族中的其中一種。本發(fā)明的磁感應(yīng)受體蛋白可來(lái)自脊椎動(dòng)物或來(lái)自無(wú)脊椎動(dòng)物。示例性的MagR的核酸或蛋白序列為本申請(qǐng)發(fā)明人從家鴿(pigeon，拉丁名Columba livia)和黑脈金斑蝶(或稱美洲帝王蝶，monarch butterfly，拉丁名Danaus plexippus)得到，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。這些序列在本發(fā)明之前是未被公開的。

本發(fā)明提供的磁感應(yīng)受體蛋白還包括其它生物物種的磁感應(yīng)受體蛋白，例如來(lái)自果蠅(Fruit fly，拉丁名Drosophila melanogaster)，蜜蜂(Honey bee，拉丁名Apis mellifera)，文昌魚(Lancelet，拉丁名Branchiostoma floridae)，斑馬魚(Zebrafish，拉丁名Danio rerio)，蟒蛇(Burmese python，拉丁名Python bivittatus)，草雀(Zebra finch，拉丁名Taeniopygia guttata)，雞(Chicken，拉丁名Gallus gallus)，鯨魚(Minke whale，拉丁名Balaenoptera acutorostrata)，蝙蝠(Little brown bat，拉丁名Myotis lucifugus)，裸鼴鼠(Naked mole rat，拉丁名Heterocephalus glaber)，小鼠(Mouse，拉丁名Mus musculus)，人(Human，拉丁名Homo sapiens)。上述來(lái)自果蠅、蜜蜂、文昌魚、斑馬魚、蟒蛇、草雀、雞、鯨魚、蝙蝠、裸鼴鼠、小鼠和人的磁感應(yīng)受體蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14所示。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了一種分離的磁感應(yīng)受體蛋白，其具有：

(1)如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或

(2)在與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。其中所述序列同一性可通過(guò)Clustal V比對(duì)方法計(jì)算得到。

優(yōu)選地，其中不相同的殘基位置的差異為保守性氨基酸取代?！氨Ｊ匦园被崛〈敝钙渲邪被釟埢涣硪环N具有化學(xué)性質(zhì)(例如：電荷或親水性)類似之側(cè)鏈R基的氨基酸殘基取代。通常，保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。具有相似化學(xué)性質(zhì)之側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)實(shí)例包括：1)脂肪族側(cè)鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸與異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈：絲氨酸與蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈：天冬酰胺與谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈：苯丙氨酸、酪氨酸、與色氨酸；5)堿性側(cè)鏈：賴氨酸、精氨酸與組氨酸；6)酸性側(cè)鏈：天冬氨酸與谷氨酸；及7)含硫側(cè)鏈：半胱氨酸與甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸取代組合為：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸、及天冬酰胺-谷氨酰胺。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了一種分離的磁感應(yīng)受體蛋白，其具有：在與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14進(jìn)行比較時(shí)具有一個(gè)或多個(gè)(通常為2-8個(gè)，例如為2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)或5個(gè))氨基酸的取代、缺失、添加的氨基酸序列。例如，其中取代、缺失、添加的氨基酸為保守性氨基酸。本發(fā)明提供的具有所述取代、缺失、添加的磁感應(yīng)受體蛋白具有磁感應(yīng)受體蛋白活性。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了一種分離的磁感應(yīng)受體蛋白，其氨基酸序列不為如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸 序列。

在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，上述分離的磁感應(yīng)受體蛋白具有磁性和/或能夠形成具有磁性的蛋白復(fù)合物。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，上述分離的磁感應(yīng)受體蛋白具有結(jié)合鐵和/或硫的結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，上述分離的磁感應(yīng)受體蛋白能形成具有磁性的純合蛋白復(fù)合物，和/或能與隱花色素蛋白(Cryptochrome，簡(jiǎn)稱為Cry)形成雜合蛋白復(fù)合物。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，上述純合蛋白復(fù)合物或雜合蛋白復(fù)合物具有特定的蛋白立體結(jié)構(gòu)，例如長(zhǎng)條形；在所述純合蛋白復(fù)合物或雜合蛋白復(fù)合物中，具有多個(gè)鐵原子，其在棒狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的中央也形成有序排列，由此使得所述蛋白復(fù)合物具有磁性。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，本發(fā)明還提供了前述磁感應(yīng)受體蛋白的活性片段或衍生物。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種前述磁感應(yīng)受體蛋白，其中所述磁感應(yīng)受體蛋白含有鐵原子。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述磁感應(yīng)受體蛋白還含有硫原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種重組DNA構(gòu)建體，其包含編碼如前所述的磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物的核苷酸序列。在所述構(gòu)建體中，所述編碼如前所述的磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物的核苷酸序列可操作地連接至少一個(gè)調(diào)控元件，例如可在真核細(xì)胞或原核細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。

本發(fā)明提供了一種分離的蛋白復(fù)合物，其包含多個(gè)(兩個(gè)或兩個(gè)以上)前述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物，即純合蛋白復(fù)合物。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物中所述磁感應(yīng)受體蛋白來(lái)自脊椎動(dòng)物，例如家鴿、蟒蛇、草雀、雞、鯨魚、斑馬魚、蝙蝠、裸鼴鼠、小鼠和人，或來(lái)自無(wú)脊椎動(dòng)物，例如果蠅、文昌魚、蜜蜂和黑脈金斑蝶。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物中的磁感應(yīng)受體蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或

(2)在與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列。其中所述序列同一性可通過(guò)Clustal V比對(duì)方法計(jì)算得到。

優(yōu)選地，其中不相同的殘基位置的差異為保守性氨基酸取代。

在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物中的磁感應(yīng)受體蛋白具有：在與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14進(jìn)行比較時(shí)具有一個(gè)或多個(gè)(通常為2-8個(gè)，例如為2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)或5個(gè))氨基酸的取代、缺失、添加的氨基酸序列。例如，其中取代、缺失、添加的氨基酸為保守性氨基酸。本發(fā)明提供的具有所述取代、缺失、添加的磁感應(yīng)受體蛋白具有磁感應(yīng)受體蛋白活性。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物中含有鐵原子。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物中還含有硫原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物含有2個(gè)或4個(gè)所述磁感應(yīng)受體蛋白。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物含有8個(gè)或以上所述磁感應(yīng)受體蛋白，優(yōu)選為20個(gè)或以上所述磁感應(yīng)受體蛋白，更優(yōu)選為20-24個(gè)所述磁感應(yīng)受體蛋白。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)為“長(zhǎng)條形”。蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)。長(zhǎng)條形的蛋白立體結(jié)構(gòu)也可稱為“棒狀結(jié)構(gòu)”或“棍狀結(jié)構(gòu)”。蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)可以通過(guò)電子顯微鏡觀察和測(cè)量。在本發(fā)明的蛋白復(fù)合物中，所述多個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物發(fā)生聚合，形成棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物中的多個(gè)磁感應(yīng)受體蛋 白或其活性片段或衍生物發(fā)生線性聚合形成兩條蛋白長(zhǎng)鏈(通常為兩條等長(zhǎng)的蛋白長(zhǎng)鏈，即兩條蛋白單鏈中含有相同個(gè)數(shù)的蛋白單體)。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述兩條蛋白長(zhǎng)鏈以螺旋形式結(jié)合，形成棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。在本發(fā)明的所述蛋白復(fù)合物中還包含多個(gè)鐵原子。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述多個(gè)鐵原子位于所述棒狀結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物的中央。例如，每個(gè)形成所述蛋白復(fù)合物的單個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白都結(jié)合鐵原子，又例如，每個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白單體結(jié)合鐵原子的位置都相同或相近，由此，在由磁感應(yīng)受體蛋白單體線性聚合形成的棒狀結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物中，所述多個(gè)鐵原子在棒狀結(jié)構(gòu)的中央也形成有序排列。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物中每個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白含有1個(gè)2Fe2S的鐵硫中心，即每個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白可含有2個(gè)鐵原子和2個(gè)硫原子。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述蛋白復(fù)合物含有約20個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白，由此，所述蛋白復(fù)合物含有約40個(gè)鐵原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在前述蛋白復(fù)合物中還具有光感應(yīng)元件。光感應(yīng)元件是可感受/傳遞光信號(hào)的部分，如可結(jié)合到蛋白上的分子、復(fù)合物或蛋白等，例如可以是可感受/傳遞光信號(hào)的蛋白。在生物界已發(fā)現(xiàn)多種可感受/傳遞光信號(hào)的蛋白。其中一種是隱花色素蛋白(Cryptochrome，簡(jiǎn)稱為Cry)或其活性片段或衍生物。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，在所述蛋白復(fù)合物中，每2個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白與1個(gè)隱花色素蛋白結(jié)合。

隱花色素蛋白(Cryptochrome，簡(jiǎn)稱為Cry)是一類能夠感受藍(lán)光(400～500nm)和近紫外光(320～400nm)的黃素蛋白(Flavoprotein)，分子量為70～80KD，生色團(tuán)可為黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和蝶呤(pterin)。Cry蛋白及其編碼基因普遍存在于植物、動(dòng)物以及整個(gè)高等真核生物中。Cry蛋白在動(dòng)物中可能與動(dòng)物時(shí)鐘節(jié)律和生物鐘的控制有關(guān)。Cry蛋白家族包括Cry、Cry1、Cry2、Cry3和Cry4等。在哺乳動(dòng)物、昆蟲體內(nèi)都有其同源基因編碼隱花色素蛋白。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在本發(fā)明的蛋白復(fù)合物中，所述隱花色素蛋白可選自Cry、Cry1、Cry2、Cry3或Cry4。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，在本發(fā)明的蛋白復(fù)合物中，所述隱花色素蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或

(2)在與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16進(jìn)行比較時(shí)具有至少 50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有隱花色素蛋白的活性。其中所述序列同一性可通過(guò)Clustal V比對(duì)方法計(jì)算得到。

優(yōu)選地，其中不相同的殘基位置的差異為保守性氨基酸取代。

在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述分離的蛋白復(fù)合物中的隱花色素蛋白具有：在與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16進(jìn)行比較時(shí)具有一個(gè)或多個(gè)(通常為2-8個(gè)，例如為2個(gè)，3個(gè)，4個(gè)或5個(gè))氨基酸的取代、缺失、添加的氨基酸序列。例如，其中取代、缺失、添加的氨基酸為保守性氨基酸。本發(fā)明提供的具有所述取代、缺失、添加的磁感應(yīng)受體蛋白具有磁感應(yīng)受體蛋白活性。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述本發(fā)明的蛋白復(fù)合物具有磁性?！暗鞍踪|(zhì)具有磁性”或者“磁性蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)復(fù)合物作為磁性材料的主體存在，自身具備磁性。所述磁性蛋白質(zhì)可具有類似磁鐵的磁極(南北極)，可以被外源的磁場(chǎng)牽引運(yùn)動(dòng)，也具備吸引鐵、鈷、鎳等鐵磁性物質(zhì)的性質(zhì)。值得指出的是，本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)具有自身的磁性，其磁性不依賴于外界磁場(chǎng)而存在。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物為晶體。

本發(fā)明還提供了生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法，其包含下述步驟：

在允許形成蛋白復(fù)合物的條件下，使所述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物相互直接聚合形成同源聚合物；分離該同源聚合物。

在上述生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁感應(yīng)受體蛋白具有鐵原子。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述磁感應(yīng)受體蛋白中還含有硫原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法中，其中所述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物在細(xì)胞中表達(dá)和形成復(fù)合物。所述細(xì)胞可以是培養(yǎng)的原核或者真核動(dòng)物細(xì)胞，例如大腸桿菌或者哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在培養(yǎng)所述細(xì)胞過(guò)程中，所述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物含有鐵和/或硫原子，因 此培養(yǎng)液中需加入可生物利用的鐵元素和/或硫元素(單體或化合物)。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法在存在磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。例如，其中分離同源聚合物的步驟在存在磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述磁場(chǎng)為外加磁場(chǎng)。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，分離蛋白質(zhì)同源聚合物通過(guò)親和層析法進(jìn)行，例如通過(guò)親和層析柱；在采用親和層析法分離所述蛋白質(zhì)時(shí)，提供磁場(chǎng)條件。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁場(chǎng)的磁場(chǎng)強(qiáng)度大于約5倍地球磁場(chǎng)，例如是地球磁場(chǎng)的約10-100倍。在生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁場(chǎng)的磁場(chǎng)強(qiáng)度大于約100倍地球磁場(chǎng)也可以獲得良好的效果。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了前述的本發(fā)明磁感應(yīng)受體蛋白或蛋白復(fù)合物的應(yīng)用。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了前述的本發(fā)明磁感應(yīng)受體蛋白或蛋白復(fù)合物的與磁性相關(guān)的應(yīng)用，例如，其作為磁性材料的應(yīng)用。本發(fā)明的磁感應(yīng)受體蛋白或蛋白復(fù)合物具有對(duì)磁場(chǎng)的高度敏感，更特殊的是，其存在內(nèi)在的磁性，可作為各種與磁性相關(guān)的應(yīng)用中的磁性材料。與磁性相關(guān)的應(yīng)用的領(lǐng)域非常廣泛，包括但不限于生物醫(yī)藥和醫(yī)療器械如磁性生物材料、生物分子提純、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的定向移動(dòng)、通過(guò)磁場(chǎng)控制某些細(xì)胞生命活動(dòng)等，磁記錄介質(zhì)，超導(dǎo)應(yīng)用如納米環(huán)形電流超導(dǎo)體、磁流變流體等，電器設(shè)備如電磁轉(zhuǎn)換設(shè)備，通訊和導(dǎo)航設(shè)備如分子陀螺儀中的應(yīng)用等。

本發(fā)明還提供了一種分離的雜合蛋白復(fù)合物，其包含1)磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物，以及2)光感應(yīng)蛋白(例如隱花色素蛋白)或其活性片段或衍生物。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述雜合蛋白復(fù)合物中所述磁感應(yīng)受體蛋白來(lái)自脊椎動(dòng)物，例如家鴿、蟒蛇、草雀、雞、鯨魚、斑馬魚、蝙蝠、裸鼴鼠、小鼠和人，或來(lái)自無(wú)脊椎動(dòng)物，例如果蠅、文昌魚、蜜蜂和黑脈金斑蝶。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述雜合蛋白復(fù)合物中的磁感應(yīng)受體蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO： 8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列，或

(2)在與SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列。其中所述序列同一性可通過(guò)Clustal V比對(duì)方法計(jì)算得到。

優(yōu)選地，其中不相同的殘基位置的差異為保守性氨基酸取代。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在本發(fā)明的所述雜合蛋白復(fù)合物中，所述隱花色素蛋白可選自Cry1、Cry2、Cry3和Cry4。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，在本發(fā)明的雜合蛋白復(fù)合物中，所述隱花色素蛋白具有：

(1)如SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列，或

(2)在與SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16進(jìn)行比較時(shí)具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性的氨基酸序列，并且具有隱花色素蛋白的活性。其中所述序列同一性可通過(guò)Clustal V比對(duì)方法計(jì)算得到。

優(yōu)選地，其中不相同的殘基位置的差異為保守性氨基酸取代。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述雜合蛋白復(fù)合物中含有鐵原子。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述分離的雜合蛋白復(fù)合物中還含有硫原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在所述雜合蛋白復(fù)合物中，每2個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白與1個(gè)隱花色素蛋白結(jié)合。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述雜合蛋白復(fù)合物含有20個(gè)或以上所述磁感應(yīng)受體蛋白，更優(yōu)選為20-24個(gè)所述磁感應(yīng)受體蛋白。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述復(fù)合物含有10個(gè)或以上所述隱花色素蛋白，更優(yōu)選為10-12個(gè)所述隱花色素蛋白。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，所述雜合蛋白復(fù)合物具有光磁性。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，前述的本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物為晶體。

本發(fā)明還提供了生產(chǎn)前述的本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的方法，其包含下述步驟：

在允許形成蛋白復(fù)合物的條件下，使1)磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物與2)光感應(yīng)蛋白(例如隱花色素蛋白)或其活性片段或衍生物接觸和聚合，形成雜合聚合物，其中1)和2)的蛋白中的至少一種是分離形式或被重組表達(dá)；和

分離該雜合聚合物。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在生產(chǎn)前述的本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的方法中，其中磁感應(yīng)受體蛋白和光感應(yīng)蛋白在細(xì)胞中表達(dá)和形成復(fù)合物。所述細(xì)胞可以是培養(yǎng)的原核細(xì)胞或者真核動(dòng)物細(xì)胞，例如大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在培養(yǎng)所述原核或真核動(dòng)物細(xì)胞過(guò)程中，所述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物含有鐵和/或硫原子，因此培養(yǎng)液中需加入可生物利用的鐵元素和/或硫元素(單體或化合物)。

在上述生產(chǎn)本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁感應(yīng)受體蛋白具有鐵原子。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述磁感應(yīng)受體蛋白中還含有硫原子。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，生產(chǎn)前述的本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的方法在存在磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。例如，其中分離該雜合復(fù)合物的步驟在存在磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，所述磁場(chǎng)為外加磁場(chǎng)。在本發(fā)明的其中又一個(gè)方面，分離雜合蛋白復(fù)合物通過(guò)親和層析法進(jìn)行，例如通過(guò)親和層析柱；在采用親和層析法分離所述蛋白質(zhì)時(shí)，提供磁場(chǎng)條件。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，在生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁場(chǎng)的磁場(chǎng)強(qiáng)度大于約5倍地球磁場(chǎng)，例如是地球磁場(chǎng)的約10-100倍。在生產(chǎn)前述的本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法中，所述磁場(chǎng)的磁場(chǎng)強(qiáng)度大于約100倍地球磁場(chǎng)也可以獲得良好的效果。

在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了鑒別前述本發(fā)明磁感應(yīng)受體蛋白可形成之光磁感應(yīng)復(fù)合物的方法，其包含下述步驟：

a.在允許形成蛋白復(fù)合物的條件下，使1)前述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物與待測(cè)蛋白或衍生物接觸；

b.測(cè)定所述磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物與待測(cè)蛋白或衍生物是否可形成復(fù)合物；

c.測(cè)定所形成的復(fù)合物內(nèi)1)的蛋白與待測(cè)蛋白之間的相互作用。

在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了前述本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的應(yīng)用。在本發(fā)明的其中一個(gè)方面，提供了前述本發(fā)明雜合蛋白復(fù)合物的與磁性相關(guān)的應(yīng)用，例如，其作為磁性材料的應(yīng)用。本發(fā)明的雜合蛋白復(fù)合物具有對(duì)磁場(chǎng)的高度敏感，更特殊的是，其存在內(nèi)在的磁性，可作為各種與磁性相關(guān)的應(yīng)用中的磁性材料。與磁性相關(guān)的應(yīng)用的領(lǐng)域非常廣泛，包括但不限于生物醫(yī)藥和醫(yī)療器械如磁性生物材料、生物分子提純、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的定向移動(dòng)、通過(guò)磁場(chǎng)控制某些細(xì)胞生命活動(dòng)等，磁記錄介質(zhì)，超導(dǎo)應(yīng)用如納米環(huán)形電流超導(dǎo)體、磁流變流體等，電器設(shè)備如電磁轉(zhuǎn)換設(shè)備，通訊和導(dǎo)航設(shè)備如分子陀螺儀中的應(yīng)用等。

本文所引用的全部出版物都并入本文作為參考。除非另有定義，在本文中使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一般理解的相同的含義。

術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白”和“肽”在本文中互換地用于指氨基酸鏈，其中氨基酸殘基通過(guò)肽鍵或修飾的肽鍵相連。氨基酸鏈可以是大于2個(gè)氨基酸的任意長(zhǎng)度。除非另有說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“多肽”、“蛋白”和“肽”也包括它們的各種修飾形式。這些修飾形式可以是天然存在的修飾形式或化學(xué)修飾形式。修飾形式的實(shí)例包括但不限于：糖基化形式、磷酸化形式、核糖基化形式、乙?；问?、泛素化形式等。修飾也包括分子內(nèi)交聯(lián)和與各種部分(例如脂質(zhì)、黃素、生物素、聚乙二醇或其衍生物等)的共價(jià)附著。另外，修飾也可以包括環(huán)化、分支和交聯(lián)。此外，在多肽中也可以包含由基因密碼子編碼的20個(gè)常見(jiàn)氨基酸以外的氨基酸。

“磁感應(yīng)受體蛋白”(或稱“Magnetoreceptor”，或稱“MagR”)是本申請(qǐng)發(fā)明人在現(xiàn)代生物學(xué)研究中首個(gè)研究、得到、鑒定并命名的一種其核酸編碼序列在生物體基因組中廣泛存在并高度保守，可形成具有生物磁性單體或復(fù)合物的蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的磁感應(yīng)受體蛋白的核酸序列在大量不同物種的基因組中都存在，其編碼的蛋白序列高度保守，并具有多個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，如結(jié)合鐵和/或硫的結(jié)構(gòu)域。磁感應(yīng)受體蛋白能形成具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)、具有自身磁性的純合蛋白復(fù)合物，和/或能與隱花色素蛋白(Cryptochrome，簡(jiǎn)稱為Cry)形成雜合蛋白復(fù)合物。 “蛋白家族”是指生物物種中存在的一系列具有同源性結(jié)構(gòu)域或序列、進(jìn)化上相關(guān)的、功能相同或相似的蛋白質(zhì)。磁感應(yīng)受體蛋白的蛋白家族中包括家鴿磁感應(yīng)受體蛋白和黑脈金斑蝶磁感應(yīng)受體蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。磁感應(yīng)受體蛋白的蛋白家族的其它成員包括果蠅(Drosophila melanogaster)、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)、蜜蜂(Apis mellifera)、文昌魚(Branchiostoma floridae)、斑馬魚(Danio rerio)、蟒蛇(Python bivittatus)、家鴿(Columba livia)、草雀(Taeniopygia guttata)、雞(Gallus gallus)、鯨魚(Balaenoptera acutorostrata)、蝙蝠(Myotis lucifugus)、裸鼴鼠(Heterocephalus glaber)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的磁感應(yīng)受體蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示。磁感應(yīng)受體蛋白的純合蛋白復(fù)合物或磁感應(yīng)受體蛋白與隱花色素蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物具有特定的蛋白立體結(jié)構(gòu)，例如長(zhǎng)條形；在所述純合蛋白復(fù)合物或雜合蛋白復(fù)合物中，具有多個(gè)鐵原子，其在棒狀結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的中央也形成有序排列，由此使得所述蛋白復(fù)合物具有磁性。例如，多個(gè)所述磁感應(yīng)受體蛋白發(fā)生線性聚合，并進(jìn)而聚集形成棒狀結(jié)構(gòu)。其中，多個(gè)所述磁感應(yīng)受體蛋白線性聚合形成兩條蛋白長(zhǎng)鏈；所述兩條蛋白長(zhǎng)鏈以螺旋形式結(jié)合，形成棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。磁感應(yīng)受體蛋白的純合蛋白復(fù)合物或磁感應(yīng)受體蛋白與隱花色素蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物中還包含多個(gè)鐵原子；所述多個(gè)鐵原子位于所述棒狀結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物的中央。例如，每個(gè)形成所述蛋白復(fù)合物的單個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白都結(jié)合鐵原子，又例如，每個(gè)磁感應(yīng)受體蛋白單體結(jié)合鐵原子的位置都相同或相近，由此，在由磁感應(yīng)受體蛋白單體線性聚合形成的棒狀結(jié)構(gòu)蛋白復(fù)合物中，所述多個(gè)鐵原子在棒狀結(jié)構(gòu)的中央也形成有序排列。

物質(zhì)的“磁性”是指能夠產(chǎn)生磁場(chǎng)、具有吸引鐵磁性物質(zhì)(如鐵、鎳、鈷等金屬)的特性。

“蛋白質(zhì)具有磁性”或者“磁性蛋白質(zhì)”是指蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)復(fù)合物自身具備磁性，體現(xiàn)出類似磁鐵的磁極(南北極)，可以被外源的磁場(chǎng)牽引運(yùn)動(dòng)，也具備吸引鐵、鈷、鎳等鐵磁性物質(zhì)的性質(zhì)，可作為磁 性材料。

“光磁性”是指物質(zhì)受到光照后，磁學(xué)性質(zhì)(如磁化率、磁晶各向異性、磁滯回線等)發(fā)生變化的現(xiàn)象，包括基于對(duì)光信號(hào)和磁場(chǎng)信號(hào)中的一種感應(yīng)引發(fā)另一種基于光或磁場(chǎng)的作用。

本文使用的“磁感應(yīng)受體蛋白的活性片段”是指磁感應(yīng)受體蛋白的部分或片段，其包含磁感應(yīng)受體蛋白中維持它以類似于全長(zhǎng)磁感應(yīng)受體蛋白的方式并具有磁感應(yīng)受體蛋白全部活性或部分活性的部分，或?yàn)榫哂性摰鞍椎亩喾N活性中的某種或某幾種活性的片段，例如其結(jié)構(gòu)域片段。

本文使用的“磁感應(yīng)受體蛋白的衍生物”是指，具有與磁感應(yīng)受體蛋白的天然形式類似的一級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)，但與所述天然形式相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基(例如一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、插入和/或缺失)的蛋白(多肽)，或是具有/額外具有其它可以與之結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)或蛋白(多肽)基團(tuán)；這些衍生物具有或保持磁感應(yīng)受體蛋白的全部或部分活性。所述可結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)包括例如多肽的翻譯后的衍生化或修飾，例如PEG化和/或巰基基團(tuán)。所述可結(jié)合的蛋白(多肽)基團(tuán)包括例如His標(biāo)簽或IgG蛋白等。

術(shù)語(yǔ)“分離的”用于描述這樣的物質(zhì)(例如核酸和/或蛋白質(zhì))，該物質(zhì)不同于自然界中其天然存在或在原始細(xì)胞或生物環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的形式的物質(zhì)。該物質(zhì)基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該物質(zhì)或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)，該物質(zhì)已從所述組分中移出。

“分離的蛋白”是這樣的蛋白：它基本上與蛋白的天然來(lái)源中存在的至少一種組分或其它蛋白分離，或當(dāng)化學(xué)合成所述蛋白時(shí)，它基本上不含有至少一種化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。當(dāng)存在小于約30％、20％、10％或5％(按干重計(jì))的其它蛋白或其它化學(xué)藥品(在本文中也稱作“污染蛋白”或“污染化學(xué)藥品”)時(shí)，在蛋白的制劑中蛋白“基本上分離于”或“基本上不含有”其它蛋白或其它化學(xué)藥品。

分離的蛋白可以具有幾種不同的物理形式。分離的蛋白可以作為全長(zhǎng)新生的或未加工的多肽，或者作為部分加工的多肽，或者作為加工的多肽，或者它們的組合存在。

分離的多肽可以是非天然存在的多肽。例如，“分離的多肽”可以是“雜種多肽(hybrid peptide)”。“分離的多肽”也可以是通過(guò)氨基酸的添加、缺失或取代從天然存在的多肽衍生的多肽。分離的多肽也可以是“純 化的多肽”，后者在本文中用于指基本上均質(zhì)的制劑中基本上不含有其它細(xì)胞組分、其它多肽、病毒材料或培養(yǎng)基的特定多肽，或當(dāng)化學(xué)合成所述多肽時(shí)，基本上不含有化學(xué)前體或與化學(xué)合成有關(guān)的副產(chǎn)物?！凹兓亩嚯摹笨梢酝ㄟ^(guò)標(biāo)準(zhǔn)的純化技術(shù)或通過(guò)化學(xué)合成從天然或重組宿主細(xì)胞得到，如技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“相互作用”是指，2個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)域、片段或完整蛋白彼此表現(xiàn)出足夠的物理親和力，以便使所述2個(gè)“相互作用”蛋白結(jié)構(gòu)域、片段或蛋白彼此物理上接近。相互作用可以來(lái)自一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵的形成，其導(dǎo)致2個(gè)相互作用實(shí)體的連續(xù)且穩(wěn)定的接近。相互作用也可以僅僅基于物理親和力，這在共同定位(co-localize)2個(gè)蛋白方面同樣有效。物理親和力和化學(xué)鍵的實(shí)例包括但不限于，由電荷差異造成的力、疏水性、氫鍵、范德華力、離子力、共價(jià)鍵以及它們的組合。相互作用域、片段或蛋白之間的接近狀態(tài)可以是瞬時(shí)的或永久的，可逆的或不可逆的。在任何情況下，其與2個(gè)實(shí)體的天然隨機(jī)運(yùn)動(dòng)造成的接觸形成對(duì)照且可以區(qū)分開。通常，通過(guò)相互作用域、片段或蛋白之間的結(jié)合，表現(xiàn)出“相互作用”。相互作用的實(shí)例包括抗原和抗體、配體和受體、酶和底物等之間的特異性相互作用。

如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“蛋白復(fù)合物”或“多肽復(fù)合物”是指一種復(fù)合單位，它是通過(guò)蛋白之間的相互作用形成的2個(gè)或更多個(gè)蛋白的組合。通常，通過(guò)特異性非共價(jià)結(jié)合親和力將2個(gè)或更多個(gè)蛋白結(jié)合到一起，形成“蛋白復(fù)合物”?！凹兒系鞍讖?fù)合物”是指由同一種蛋白質(zhì)組分通過(guò)聚合(或稱之為“同源聚合”)形成的多聚物?！半s合蛋白復(fù)合物”是指由兩種或者多種不同的蛋白質(zhì)組分通過(guò)聚合(或稱之為“異源聚合”)形成的多聚物。

術(shù)語(yǔ)“分離的蛋白復(fù)合物”是指在不同于其在自然界中天然存在或在原始細(xì)胞或生物環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的形式的蛋白復(fù)合物。該蛋白復(fù)合物基本上不含在天然存在的環(huán)境中通常伴隨該蛋白復(fù)合物或與其反應(yīng)的組分，或者說(shuō)，該蛋白復(fù)合物已從所述組分中移出?！胺蛛x的蛋白復(fù)合物”也可以是未在自然界發(fā)現(xiàn)的蛋白復(fù)合物。

“分離的”核酸分子是這樣的，它基本上與核酸的天然來(lái)源中存在的至少一種其它核酸分子分離，或當(dāng)化學(xué)合成所述核酸分子時(shí)，它基本上不含有至少一種化學(xué)前體或其它化學(xué)藥品。“分離的”核酸分子也可以 是，例如，基本上不含有在該核酸的來(lái)源生物基因組DNA中在5'和3'末端天然側(cè)接該核酸分子的至少一個(gè)核苷酸序列的核酸分子。在核酸分子的制劑中，當(dāng)存在小于約30％、20％、10％或5％(按干重計(jì))的其它核酸分子或其它化學(xué)藥品(在本文中也稱作“污染核酸分子”或“污染化學(xué)藥品”)時(shí)，核酸分子“基本上分離于”或“基本上不含有”其它核酸分子或其它化學(xué)藥品。

“序列”是指聚合物中單體出現(xiàn)的線性次序，例如，多肽中氨基酸的次序或多核苷酸中核苷酸的次序。“核苷酸序列”指單鏈或雙鏈形式的聚合物中脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸殘基的排列。核酸序列可以由包含下述堿基的天然核苷酸組成：胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶；分別縮寫為T、A、C、G和U，和/或所述天然核苷酸的合成類似物。

核苷酸序列或氨基酸序列比對(duì)和序列的同一性百分比可用設(shè)計(jì)用于鑒別同源序列的多種比較方法來(lái)確定，這些方法包括但不限于生物信息計(jì)算包(Inc.，Madison，WI)的程序。除非另外說(shuō)明，否則本文提供的序列多重比對(duì)用Clustal V比對(duì)方法(Higgins和Sharp，1989，CABIOS.5：151-153)采用默認(rèn)參數(shù)(空位罰分＝10，空位長(zhǎng)度罰分＝10)執(zhí)行。用Clustal V方法進(jìn)行成對(duì)比對(duì)和蛋白質(zhì)序列的同一性百分比計(jì)算的默認(rèn)參數(shù)為KTUPLE＝1、空位罰分＝3、窗口(WINDOW)＝5和DIAGONALS SAVED＝5。而對(duì)于核酸，這些參數(shù)為KTUPLE＝2，空位罰分＝5，窗口＝4和DIAGONALS SAVED＝4。用Clustal V程序比對(duì)序列后，可通過(guò)查看同一程序中的“序列距離”表來(lái)獲得“同一性百分比”和“趨異”值。

“重組DNA構(gòu)建體”指在自然界中通常不會(huì)一起存在的核酸片段的組合。因此，重組DNA構(gòu)建體可包含源于不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或源于相同來(lái)源但以不同于通常天然存在的方式排列的調(diào)控序列(如啟動(dòng)子等)和編碼序列。

分子生物學(xué)和蛋白-蛋白相互作用領(lǐng)域的技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)，可以在磁感應(yīng)受體蛋白或其活性片段或衍生物中導(dǎo)入氨基酸序列變異。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以導(dǎo)入位點(diǎn)特異性的突變，例如將“CTT”密碼子變成“ATT”密碼子，從而造成天然多肽中的亮氨酸殘基被替換為合成同源物中的異亮氨酸殘基。

在另一個(gè)一般方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明蛋白復(fù)合物的方法。本發(fā)明的蛋白復(fù)合物可以通過(guò)多種方法來(lái)制備。具體而言，蛋白復(fù)合物可以直接分離自含有該蛋白復(fù)合物的動(dòng)物組織樣品，例如人組織樣品。蛋白復(fù)合物也可以分離自重組表達(dá)蛋白復(fù)合物成員的宿主細(xì)胞?；蛘?，可以通過(guò)組合蛋白復(fù)合物的個(gè)別成員來(lái)體外構(gòu)建蛋白復(fù)合物。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)明白，為了表達(dá)蛋白或蛋白復(fù)合物的目的，在本發(fā)明中可以使用任何重組表達(dá)方法。例如，可以將編碼MagR和Cry的核酸導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中。通常，將核酸(優(yōu)選地以DNA形式)整合入表達(dá)載體中，從而在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后指導(dǎo)生產(chǎn)相互作用蛋白成員。許多類型的載體可以用于本發(fā)明。獲知本公開內(nèi)容的技術(shù)人員應(yīng)了解構(gòu)建用于本發(fā)明目的的表達(dá)載體的方法。

通常，表達(dá)載體包括具有啟動(dòng)子的表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子可操作地連接到編碼相互作用蛋白成員的DNA上。所述啟動(dòng)子可以是天然啟動(dòng)子，即在天然存在的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的負(fù)責(zé)在該細(xì)胞中表達(dá)相互作用蛋白成員的啟動(dòng)子?；蛘?，所述表達(dá)盒可以是嵌合表達(dá)盒，即，具有不是在天然存在的細(xì)胞中負(fù)責(zé)表達(dá)相互作用蛋白成員的天然啟動(dòng)子的異源啟動(dòng)子。表達(dá)載體還可以包括用于在宿主細(xì)胞中復(fù)制載體的DNA復(fù)制起點(diǎn)。優(yōu)選地，表達(dá)載體包括用于在例如大腸桿菌中擴(kuò)增載體的復(fù)制起點(diǎn)，和用于僅選擇和維持?jǐn)y帶表達(dá)載體的那些宿主細(xì)胞的選擇標(biāo)記。另外，表達(dá)盒優(yōu)選地也含有誘導(dǎo)型元件，其功能是控制從編碼相互作用蛋白成員的DNA的轉(zhuǎn)錄。其它調(diào)節(jié)序列例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列和翻譯調(diào)節(jié)序列(例如,SD序列)也可以可操作地包含在表達(dá)盒中。終止序列(例如來(lái)自牛生長(zhǎng)激素、SV40和lacZ)也可以可操作地與表達(dá)盒中編碼蛋白成員的DNA連接。當(dāng)需要在單個(gè)宿主細(xì)胞中表達(dá)2個(gè)或更多個(gè)相互作用蛋白成員時(shí)，編碼相互作用蛋白成員的DNA片段可以整合入單個(gè)載體或不同載體中。

通過(guò)本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)，例如，通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電穿孔、病毒感染、脂轉(zhuǎn)染、基因槍等，可以將表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中?；蛘呖赏ㄟ^(guò)常規(guī)技術(shù)例如穩(wěn)定細(xì)胞系的選擇或位點(diǎn)特異性的重組，可以將表達(dá)載體整合入宿主細(xì)胞的染色體中。

可以將載體構(gòu)建體設(shè)計(jì)成適合在各種宿主細(xì)胞中表達(dá)，宿主細(xì)胞包括但不限于細(xì)菌、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物和人細(xì)胞。

其中，可以將哺乳動(dòng)物細(xì)胞用作用于表達(dá)融合蛋白和檢測(cè)蛋白-蛋 白相互作用的宿主細(xì)胞。為此，實(shí)際上可以使用任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括正常組織細(xì)胞、穩(wěn)定的細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。方便地，使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞、Jurkat T細(xì)胞、NIH 3T3細(xì)胞、HEK-293細(xì)胞、CV-1細(xì)胞、COS-1細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、VERO細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、WI38細(xì)胞等。哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是本領(lǐng)域眾所周知的，且許多可商業(yè)得到。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄嵌合基因的合適啟動(dòng)子的實(shí)例包括源自下述病毒的病毒轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子：腺病毒、猿猴病毒40(SV40)(例如，SV40的早期和晚期啟動(dòng)子)、勞斯肉瘤病毒(RSV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)(例如，CMV立即早期啟動(dòng)子)、人免疫缺陷病毒(HIV)(例如，長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LTR))、痘苗病毒(例如，7.5K啟動(dòng)子)和單純皰疹病毒(HSV)(例如，胸苷激酶啟動(dòng)子)。也可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。合適的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子包括，例如，四環(huán)素響應(yīng)元件(TRE)(參見(jiàn)Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：5547-5551(1992))、金屬硫蛋白IIA啟動(dòng)子、蛻皮激素-響應(yīng)啟動(dòng)子和熱激啟動(dòng)子。用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制和維持表達(dá)載體的合適復(fù)制起點(diǎn)包括，例如，在有Epstein Barr核抗原存在下的Epstein Barr復(fù)制起點(diǎn)(參見(jiàn)Sugden等人,Mole.Cell.Biol.,5：410-413(1985))和在有SV40T抗原(它存在于COS-1和COS-7細(xì)胞中)存在下的SV40復(fù)制起點(diǎn)(參見(jiàn)Margolskee等人,Mole.Cell.Biol.,8：2837(1988))。合適的選擇標(biāo)記包括，但不限于，賦予對(duì)新霉素、潮霉素、zeocin等的抗性的基因。許多可商業(yè)得到的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體可以用于本發(fā)明，包括，例如，pCEP4、pcDNAI、pIND、pSecTag2、pVAX1、pcDNA3.1和pBI-EGFP和pDisplay。使用任何已知的技術(shù)，例如磷酸鈣沉淀、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔等，可以將載體導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。可以將誘餌載體和獵物載體共轉(zhuǎn)化進(jìn)相同細(xì)胞，或者，導(dǎo)入2個(gè)不同的細(xì)胞，隨后通過(guò)細(xì)胞融合或其它合適的技術(shù)將它們?nèi)诤系揭黄稹?/p>

允許通過(guò)病毒感染將重組基因?qū)爰?xì)胞中的病毒表達(dá)載體，也可以用于表達(dá)融合蛋白。本領(lǐng)域普遍已知的病毒表達(dá)載體包括基于腺病毒、牛乳頭瘤病毒、鼠干細(xì)胞病毒和反轉(zhuǎn)錄病毒等的病毒載體。

使用上述的重組方法，也可以容易地表達(dá)天然相互作用蛋白成員的同源物和片段。例如，為了表達(dá)蛋白片段，可以選擇整合入表達(dá)載體中的DNA片段，從而使它僅僅編碼該蛋白片段。同樣，使用編碼雜種蛋白的重組DNA，可以表達(dá)特定的雜種蛋白。類似地，同源物蛋白可以從 編碼該同源物蛋白的DNA序列表達(dá)。通過(guò)使用重組DNA技術(shù)操作編碼天然蛋白的序列，可以得到編碼同源物蛋白的DNA序列。為此，可以使用本領(lǐng)域普遍已知的技術(shù)，進(jìn)行隨機(jī)的或定點(diǎn)誘變。

另外，通過(guò)使某些用于修飾蛋白的部分經(jīng)由化學(xué)方式連接到天然蛋白的氨基酸側(cè)鏈上，由此制備本發(fā)明的蛋白的衍生物。

如果需要，可以測(cè)試這樣產(chǎn)生的同源物和衍生物，以確定它們是否能與它們預(yù)期的配體相互作用，以形成蛋白復(fù)合物。測(cè)試可以通過(guò)例如酵母雙雜交系統(tǒng)或本領(lǐng)域已知的檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的其它方法來(lái)進(jìn)行。

通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的常規(guī)生化和免疫化學(xué)方法，可以純化表達(dá)的蛋白。轉(zhuǎn)染的真核細(xì)胞或生物組織樣品可以勻漿，并在將不同細(xì)胞組分進(jìn)行分離的適宜條件下分級(jí)分離。通常，將細(xì)胞裂解物在蔗糖梯度(或基于大小和密度分離細(xì)胞組分的其它材料)上運(yùn)行。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法，例如免疫印跡或免疫沉淀方法，用適宜的抗體分析目標(biāo)蛋白的存在。

然后將純化的蛋白用于親和層析處理：將來(lái)自培養(yǎng)的細(xì)胞或勻漿的組織樣品的提取物在適宜的緩沖液中裝載到柱上，目的蛋白或蛋白復(fù)合物可與柱上的成分結(jié)合；洗脫非結(jié)合蛋白；然后使用各種方法，例如pH梯度或鹽濃度梯度，洗脫結(jié)合蛋白或蛋白復(fù)合物；最后可以通過(guò)二維凝膠電泳，分離洗脫的蛋白，也可以通過(guò)微量測(cè)序進(jìn)行鑒別。所有這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。

純化的目標(biāo)蛋白或復(fù)合物，也可以用于在兔子、小鼠、大鼠、雞、山羊、綿羊、豬、豚鼠、牛和馬中制備抗體。用于抗體生成和表征的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。

附圖說(shuō)明

圖1家鴿MagR蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖；

圖2家鴿和黑脈金斑蝶的MagR-Cry蛋白復(fù)合物的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖；

圖3家鴿MagR蛋白樣品全波長(zhǎng)掃描結(jié)果圖；

圖4家鴿MagR形成的純合蛋白復(fù)合物或雜合蛋白復(fù)合物的電鏡觀察結(jié)果圖。A：家鴿MagR形成的純合蛋白復(fù)合物的橫截面結(jié)構(gòu)；B： 家鴿MagR形成的純合蛋白復(fù)合物的縱截面結(jié)構(gòu)；C：家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的橫截面結(jié)構(gòu)；D：家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的縱截面結(jié)構(gòu)；

圖5家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)圖。A：家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的橫截面的電鏡形態(tài)和結(jié)構(gòu)示意；B：家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的縱截面的電鏡形態(tài)和結(jié)構(gòu)示意；

圖6家鴿MagR和Cry形成的雜合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)圖。A：雜合蛋白復(fù)合物的橫截面；B：雜合蛋白復(fù)合物的縱截面；

圖7家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物晶體受磁場(chǎng)影響的電鏡觀察結(jié)果圖。A：電子顯微鏡照片；B：統(tǒng)計(jì)結(jié)果；

圖8用鐵粉從細(xì)胞裂解液中分離和純化家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)示意和電泳檢測(cè)結(jié)果圖；

圖9家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中同步旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖10黑脈金斑蝶MagR蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖；

圖11黑脈金斑蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中同步旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖12家鴿MagR突變體蛋白樣品全波長(zhǎng)掃描結(jié)果圖；

圖13各物種MagR蛋白的序列比對(duì)圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：家鴿MagR蛋白的表達(dá)和純化

1.人工合成編碼以下氨基酸序列的插入片段(表達(dá)框)：

MWSHPQFEKGGGTSMASSASSVVRATVRAVSKRKIQATRAALTLTPSAVQKIKELLKDKPEHVGVKVGVRTRGCNGLSYTLEYTKSKGDSDEEVVQDGVRVFIEKKAQLTLLGTEMDYVEDKLSSEFVFNNPNIKGTCGCGESFNI

其中，第2-9個(gè)氨基酸WSHPQFEK為Strep II親和標(biāo)簽序列；第10-14個(gè)氨基酸GGGTS為鏈接區(qū)序列；帶下劃線的序列為家鴿(Columba livia)的MagR的蛋白質(zhì)序列，即如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

2.將上述合成的編碼家鴿MagR蛋白的氨基酸序列且N端具有Strep II親和標(biāo)簽的插入片段通過(guò)SalI/XhoI位點(diǎn)克隆到pET-21a(+)質(zhì)粒(Novagen)。

3.將上述包含具有編碼家鴿MagR蛋白的氨基酸序列且N端具有Strep II親和標(biāo)簽的插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(商購(gòu))。挑取單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，低溫誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，20-24小時(shí)后收菌。

4.將上述得到的表達(dá)了MagR蛋白的轉(zhuǎn)化菌用緩沖液重懸后，用超聲破碎儀裂解，完成后進(jìn)行高速離心，取上清液進(jìn)行親和純化。通過(guò)Strep-Tactin親和柱親和純化后，進(jìn)行陰離子交換柱或者分子篩凝膠層析進(jìn)一步純化，得到純度較高的家鴿MagR蛋白。純化全過(guò)程在4℃進(jìn)行。純化后得到的MagR蛋白在濃度較高時(shí)呈現(xiàn)明顯的棕黃色或棕褐色，這提示蛋白質(zhì)中結(jié)合了二價(jià)或三價(jià)的鐵。

5.對(duì)收集的MagR蛋白樣品進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，其中各泳道的樣品為：(1):蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；(2)：純化的含有Strep II親和標(biāo)簽的家鴿MagR蛋白，分子量約為15KDa。

實(shí)施例2：家鴿MagR蛋白形成二聚體和多聚體的純合復(fù)合物

將實(shí)施例1中表達(dá)和純化的家鴿MagR蛋白，在通過(guò)Strep-Tactin親和柱親和純化后進(jìn)一步用Superdex 20010/300GL純化柱(GE Healthcare)進(jìn)行分子篩凝膠層析，即凝膠過(guò)濾(Gel-filtration)或凝膠排阻層析(Size-exclusion chromatography)。

樣品的分子篩凝膠層析呈現(xiàn)出單體峰、二聚體峰和多聚體峰，分別收集三個(gè)峰的樣品，獲得純化蛋白。這顯示，純化的MagR蛋白在分子篩凝膠層析中以三種形式存在。與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較可知，三個(gè)峰(洗脫體積大約為：17.5ml、16.2ml、9.5ml)的大致分子量為15KDa、30KDa和大于200KDa，這與MagR蛋白的單體、二聚體和多聚體的分子量相吻合。由于Superdex S200的分辨率最高為約200KDa，所以，尚無(wú)法判斷多聚體的分子量和多聚體所含單體個(gè)數(shù)。

實(shí)施例3：家鴿MagR蛋白和家鴿Cry4蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物的表達(dá)和純化

1.人工合成編碼以下氨基酸序列的插入片段(表達(dá)框)：

MHHHHHHHHHHGGGGSTSMPHRTIHLFRKGLRLHDNPTLLAALESSETIYPVYVLDRRFLASAMHIGALRWHFLLQSLEDLHKNLSRLGARLLVIQGEYESVLRDHVQKWNITQVTLDAEMEPFYKEMEANIRRLGAELGFEVLSRVGHSLYDTKRILDLNGGSPPLTYKRFLHILSQLGDPEVPVRNLTAEDFQRCMSPEPGLAERYRVPVPADLEIPPQSLSPWTGGETEGLRRLEQHLTDQGWVANFTKPRTIPNSLLPSTTGLSPYFSMGCLSVRTFFQRLSNIYAQAKHHSLPPVSLQGQLLWREFFYTVASATQNFTQMAGNPICLQIHWYEDAERLHKWKTAQTGFPWIDAIMTQLRQEGWIHHLARHAVACFLTRGDLWISWEEGMKVFEELLLDADYSINAGNWMWLSASAFFHHYTRIFCPVRFGKRTDPEGQYIRKYLPVLKNFPTKYIYEPWTASEEEQRQAGCIIGRDYPFPMVNHKEASDRNLQLMRRVREEQRGTAQLTR

其中，第2-11個(gè)氨基酸為10個(gè)組氨酸的His親和標(biāo)簽序列；第12-18個(gè)氨基酸GGGGSTS為鏈接區(qū)序列；帶下劃線的序列為家鴿的Cry4的氨基酸序列，即如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

2.將上述合成的編碼家鴿Cry4蛋白的氨基酸序列并且N端具有His親和標(biāo)簽的插入片段通過(guò)SalI/XhoI位點(diǎn)克隆到pET-21a(+)質(zhì)粒(Novagen)。

3.將前述具有家鴿Cry4蛋白的編碼基因并融合了組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的質(zhì)粒與實(shí)施例1步驟2得到的具有家鴿MagR蛋白的編碼基因并融合了StrepII標(biāo)簽的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取含有兩種質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，低溫誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，20-24小時(shí)后收菌。

4.將上述得到的共表達(dá)了家鴿MagR蛋白和Cry4蛋白的轉(zhuǎn)化菌用緩沖液重懸后，用超聲破碎儀裂解，完成后進(jìn)行高速離心，取上清液進(jìn)行親和純化。通過(guò)Ni-NTA親和柱親和純化后，再通過(guò)Strep-Tactin親和柱純化，得到家鴿MagR蛋白和Cry4蛋白形成的MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物。進(jìn)一步通過(guò)陰離子交換柱和分子篩凝膠層析純化，得到純度較高的雜合蛋白復(fù)合物。純化全過(guò)程在4℃和存在外加磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。外加磁場(chǎng)通過(guò)下述方法施加：當(dāng)樣品過(guò)親和柱時(shí)，將兩個(gè)相同的條形磁鐵分別綁在親和柱的兩側(cè)，該兩個(gè)相同的條形磁鐵的南極和北極分別相對(duì)，提供一個(gè)均勻穩(wěn)定的磁場(chǎng)。結(jié)果顯示，在純化時(shí)施加外加磁場(chǎng)(例如，外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度是地球磁場(chǎng)的10-100倍)，純化蛋白的產(chǎn)率有顯著增加；在洗脫純化蛋白時(shí)，撤去磁場(chǎng)，蛋白質(zhì)洗脫效率更高。

5.對(duì)收集的家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物樣品進(jìn)行變性聚丙烯酰 胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，其中從左向右第5泳道加載的樣品為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，第6泳道加載的樣品為家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物。結(jié)果：由于使用變性電泳分析，泳道6中顯示出兩種蛋白質(zhì)樣品，即含有Strep II親和標(biāo)簽的家鴿MagR蛋白(分子量約為15KDa)以及含有His標(biāo)簽的家鴿Cry4蛋白(分子量約為70KDa)。

實(shí)施例4：家鴿MagR蛋白以及MagR純合蛋白復(fù)合物含有鐵的證明實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例2得到的家鴿MagR蛋白的單體峰樣品用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

如圖3所示，結(jié)果顯示在Fe元素的特征吸收位置(320nm和410nm)有吸收峰。第一個(gè)吸收峰為UV280的蛋白質(zhì)吸收峰。

將實(shí)施例2中得到的家鴿MagR蛋白形成的二聚物或多聚物樣品，用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果與圖3相似。

實(shí)施例5：家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物和家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的電子顯微鏡圖像和結(jié)構(gòu)

將實(shí)施例2中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后獲得的家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品以及實(shí)施例3中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后的家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品采用乙酸鈾或甲酸鈾負(fù)染，制備蛋白質(zhì)的負(fù)染電鏡樣品，將樣品放置于透射電鏡下觀察并拍照，按照標(biāo)準(zhǔn)的電鏡結(jié)構(gòu)分析方法解析其結(jié)構(gòu)，并測(cè)量大小(包括蛋白長(zhǎng)度和寬度)。所述電鏡結(jié)構(gòu)分析方法可參照Ohi,M.,et al.(2004)，"Negative Staining and Image Classification-Powerful Tools in Modern Electron Microscopy."Biol Proced Online 6:23-34。

結(jié)果如圖4所示。其中A和B是家鴿MagR形成的純合蛋白復(fù)合物的電鏡結(jié)構(gòu)，其中A為橫截面結(jié)構(gòu)，B為縱截面結(jié)構(gòu)。C和D為家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的電子顯微鏡結(jié)構(gòu)，其中C為橫截面結(jié)構(gòu)，D為縱截面結(jié)構(gòu)。MagR和/或Cry蛋白在復(fù)合物中的組織形式和相對(duì)位置的示意圖如右側(cè)所示，并標(biāo)出了在電鏡下測(cè)量的大小尺寸(單位為納米)。

如圖4的A和B顯示，家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物呈現(xiàn)為長(zhǎng)條形的棒狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為約20-24納米長(zhǎng)，寬度為約7-11納米?！皩挾取笔侵鸽婄R下該棒狀結(jié)構(gòu)的橫截面為圓形或類似圓形的形狀時(shí)測(cè)量到的半徑。根據(jù)同源晶體結(jié)構(gòu)和分子模型計(jì)算，結(jié)果表明該復(fù)合物具有約20個(gè)MagR蛋白。如圖4的C和D顯示，家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物呈現(xiàn)為長(zhǎng)條形的棒狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為約20-24納米長(zhǎng)，寬度為約13-18納米。根據(jù)同源晶體結(jié)構(gòu)和分子模型計(jì)算，結(jié)果表明該多聚體具有約20個(gè)MagR蛋白和10個(gè)Cry4蛋白。

圖5為家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)圖。圖5中，A顯示復(fù)合物的橫截面的電鏡形態(tài)和結(jié)構(gòu)示意，B顯示復(fù)合物的縱截面的電鏡形態(tài)和結(jié)構(gòu)示意。每一個(gè)MagR純合蛋白復(fù)合物包括約20個(gè)MagR蛋白，有序排列形成線性雙螺旋聚合體，其中每10個(gè)MagR蛋白單體以線性聚合的形式首尾相接，形成兩條蛋白長(zhǎng)鏈，兩條蛋白長(zhǎng)鏈以螺旋形式結(jié)合，由此形成長(zhǎng)條形棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。圖5中的虛線框顯示出一個(gè)MagR四聚體的結(jié)構(gòu)：如圖所示的MagR純合蛋白復(fù)合物棒狀結(jié)構(gòu)由5個(gè)該四聚體構(gòu)成。另外，每一個(gè)MagR蛋白包括一個(gè)2Fe2S的鐵硫中心，也即每一個(gè)MagR蛋白包括一個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合了2個(gè)鐵原子。整個(gè)棒狀的純合蛋白復(fù)合物包含約20個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合了約40個(gè)鐵原子。所述多個(gè)鐵原子位于棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物的中央。磁感應(yīng)受體蛋白單體結(jié)合鐵原子的位置相同或相近，處于棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物的立體結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，由此，在磁感應(yīng)受體蛋白單體線性聚合棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物中，所述多個(gè)鐵原子也在蛋白復(fù)合物中形成有規(guī)律的排列。

圖6為家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)圖。圖6中，A顯示雜合蛋白復(fù)合物的橫截面的電鏡形態(tài)(左上)、組織形式(左下)和結(jié)構(gòu)示意(右)，B顯示雜合蛋白復(fù)合物的縱截面的電鏡形態(tài)(左上)、組織形式(左下)和結(jié)構(gòu)示意(右)。在MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物中，在由約20個(gè)MagR組成的純合蛋白復(fù)合物所形成的棒狀線性雙螺旋聚合體的外圍，有約10個(gè)感光的Cry4蛋白纏繞排列，從而形成雜合復(fù)合物。同樣地，整個(gè)棒狀的雜合蛋白復(fù)合物包含約20個(gè)鐵結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)合了約40個(gè)鐵原子。所述多個(gè)鐵原子位于棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物的中央，也形成有規(guī)律的排列。

實(shí)施例6：家鴿MagR蛋白復(fù)合物結(jié)晶

將實(shí)施例2中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后獲得的家鴿MagR純合蛋白復(fù)合體的蛋白樣品以及實(shí)施例3中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后的家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品濃縮，然后進(jìn)行結(jié)晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶方法按照如教科書McPherson,A.(2009).Introduction to macromolecular crystallography.Hoboken,N.J.,Wiley-Blackwell記載的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程采用懸滴法進(jìn)行。在硅化過(guò)的顯微鏡蓋玻片上將蛋白質(zhì)溶液與等體積的沉淀劑溶液混合形成液滴；蓋玻片被倒置在盤子的空穴上方，空穴中放置了所需的沉淀劑溶液，在蓋玻片放置前，在空穴的邊緣涂抹油或脂以密封空穴。大約2-7天后可以觀察到MagR蛋白復(fù)合物形成的晶體。

圖9顯示了本發(fā)明的家鴿MagR蛋白形成的純合復(fù)合物的晶體照片。

結(jié)果：共觀察到兩種類型的晶體：

第一種是黑色不透明的長(zhǎng)方體形狀的晶體(參見(jiàn)圖9中上排給出的晶體照片；所使用的結(jié)晶條件為：0.1M HEPES,pH 7.5,3.0M氯化鈉)，其長(zhǎng)度約為0.5mm，顯示鐵元素在晶體中已被氧化成均一的三價(jià)。第二種晶體為淺黃色或黃色的透明晶體(參見(jiàn)圖9中下排給出的晶體照片；所使用的結(jié)晶條件為：0.1M BIS-TRIS,pH6.5，3.0M氯化鈉)，形狀不規(guī)則或呈小片狀，顯示鐵元素可能以二價(jià)存在。在以下實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)中證明，兩種晶體都表現(xiàn)出非常強(qiáng)的磁性。

本發(fā)明的家鴿MagR蛋白與Cry4蛋白形成的雜合復(fù)合物的晶體的形態(tài)與圖9的照片顯示的晶體相似。

實(shí)施例7：家鴿MagR蛋白復(fù)合物的磁性測(cè)試

家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物以及家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的磁性測(cè)試通過(guò)以下幾個(gè)實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行：

(1)電子顯微鏡下的磁性測(cè)試：

在實(shí)施例5中描述的電鏡分析制樣中，將實(shí)施例2中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后獲得的家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品以及實(shí)施例3中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后的家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品制備負(fù)染電鏡樣品，此時(shí)在電鏡銅網(wǎng)樣品上標(biāo)記制樣時(shí)的地球磁場(chǎng) 方向或者人工外加的磁場(chǎng)方向，在電鏡得到的蛋白顆粒的圖像中，統(tǒng)計(jì)所有的棍狀的蛋白復(fù)合物顆粒的方向(蛋白為長(zhǎng)條形棒狀，其方向是指該蛋白長(zhǎng)度方向，即長(zhǎng)軸的軸向)，按照?qǐng)D示的三個(gè)方向統(tǒng)計(jì)(平行于地球或者外加磁場(chǎng)方向的，垂直于地球或者外加磁場(chǎng)方向的，以及在兩者之間不能歸于上述兩個(gè)方向的)，計(jì)算各個(gè)方向的棍狀蛋白復(fù)合物所占的比例。

結(jié)果如圖7所示。圖7為利用電子顯微鏡對(duì)MagR純合蛋白復(fù)合物在磁場(chǎng)下的排列方向進(jìn)行研究，顯示MagR蛋白復(fù)合物具有自身磁性，達(dá)到了類似“蛋白質(zhì)指南針”的效果。圖7的A為電子顯微鏡照片，其中用深色方框標(biāo)示平行于磁場(chǎng)方向(即與磁場(chǎng)方向相同或相差小于等于30度)的蛋白質(zhì)復(fù)合物顆粒，淺色方框標(biāo)示垂直于磁場(chǎng)方向(即與磁場(chǎng)垂直的方向相同或相差小于等于30度)的蛋白質(zhì)復(fù)合物顆粒，圓圈顯示介于兩者之間的其它方向。圖7的B顯示對(duì)于大樣本的顆粒數(shù)目按排列方向進(jìn)行統(tǒng)計(jì)的結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)包括大約1500個(gè)蛋白復(fù)合物顆粒進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差作圖。圖7的B中橫坐標(biāo)為磁場(chǎng)的強(qiáng)度，以mT為單位，地球磁場(chǎng)為0.04mT(以北京的地理位置為準(zhǔn))，試驗(yàn)中所采用的外加的磁場(chǎng)通過(guò)永磁鐵獲得，磁場(chǎng)強(qiáng)度經(jīng)過(guò)磁力計(jì)測(cè)量為1mT。縱坐標(biāo)為沿著三個(gè)不同的方向(平行于地球磁場(chǎng)或者外加磁場(chǎng)的方向，垂直于地球磁場(chǎng)或者外加磁場(chǎng)的方向，介于兩者之間的其它方向)排列的MagR蛋白復(fù)合物在所有蛋白復(fù)合物中所占的比例。結(jié)果顯示，家鴿磁感應(yīng)受體蛋白MagR形成的純合蛋白復(fù)合物有將近或超過(guò)一半的蛋白質(zhì)顆粒順應(yīng)(平行于)地球磁場(chǎng)或者外加人工磁場(chǎng)的方向。增加磁場(chǎng)強(qiáng)度，平行于磁場(chǎng)方向的蛋白質(zhì)顆粒所占比例將隨之上升，其它兩個(gè)方向的比例將相應(yīng)地下降。這充分說(shuō)明即使在微觀條件下的納米尺度的蛋白質(zhì)顆粒也呈現(xiàn)了非常明顯的磁性，具備與指南針類似的物理性質(zhì)。蛋白質(zhì)顆粒在磁場(chǎng)中的方向不是象宏觀世界的指南針一樣100％地順應(yīng)磁場(chǎng)方向分布，是因?yàn)樵谖⒂^的納米尺度下，分子熱運(yùn)動(dòng)和溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)嚴(yán)重影響了蛋白質(zhì)顆粒的取向，使得微觀粒子(如本實(shí)驗(yàn)中的納米尺度下的蛋白質(zhì)顆粒)的取向只遵循統(tǒng)計(jì)物理學(xué)的規(guī)律。

本發(fā)明的家鴿MagR蛋白與Cry4蛋白形成的雜合復(fù)合物的晶體受磁場(chǎng)影響的實(shí)驗(yàn)和電鏡觀察結(jié)果與圖7的照片顯示的相似。

(2)利用蛋白質(zhì)的磁性對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和純化：

家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物和家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物可用鐵粉從細(xì)胞裂解液中快速分離和純化出來(lái)，表明它們均具有磁性。

以家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物為例，具體方法如圖8所示：將實(shí)施例3中共表達(dá)MagR與Cry4蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞收集起來(lái)，用緩沖液重懸，超聲破碎后取上清液，向其加入市售的納米鐵粉顆粒(海貍生物科技有限公司，#70301)，室溫孵育10min后，用標(biāo)準(zhǔn)TBS緩沖液清洗鐵粉顆粒，然后用蛋白電泳上樣緩沖液對(duì)鐵粉進(jìn)行洗脫，對(duì)洗脫液進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分析蛋白成分。

結(jié)果顯示，經(jīng)上述方法得到的納米鐵粉洗脫液中含有對(duì)應(yīng)的蛋白。如圖8所示，在實(shí)施例3中共表達(dá)MagR與Cry4蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞的樣品中經(jīng)上述方法得到的納米鐵粉洗脫液中同時(shí)含有分子量約為15KDa的條帶(MagR)和約為70KDa的條帶(Cry4)。

另外，在實(shí)施例1中表達(dá)家鴿MagR的大腸桿菌細(xì)胞的樣品中經(jīng)上述方法得到的納米鐵粉洗脫液中則含有分子量約為15KDa的條帶(MagR)。

(3)蛋白質(zhì)晶體的磁性檢測(cè)：

將實(shí)施例6中獲得的MagR純合蛋白復(fù)合物的晶體或MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的晶體置于光學(xué)顯微鏡下觀察，在顯微鏡的載物臺(tái)上安裝旋轉(zhuǎn)的磁場(chǎng)，保持均勻的磁場(chǎng)強(qiáng)度(10高斯)。將晶體生長(zhǎng)的液滴(其中含有蛋白質(zhì)晶體)置于旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)的中心。圖9為家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中同步旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。如圖9所示，在磁場(chǎng)(圓圈中指針?lè)较驗(yàn)榇艌?chǎng)方向)旋轉(zhuǎn)的時(shí)候，可以觀察到蛋白質(zhì)晶體幾乎完全同步地沿著磁場(chǎng)旋轉(zhuǎn)，如同由磁鐵構(gòu)成的指南針一樣。當(dāng)用磁鐵去接近蛋白質(zhì)晶體時(shí)，蛋白質(zhì)晶體會(huì)立即靠近，當(dāng)顛倒磁鐵的磁極時(shí)，蛋白質(zhì)晶體會(huì)即刻遠(yuǎn)離并顛倒方向，然后重新靠近，顯示蛋白質(zhì)形成的晶體如同磁鐵一樣，具有自身的磁性和磁極。

本發(fā)明的家鴿MagR蛋白與Cry4蛋白形成的雜合復(fù)合物的晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中同步旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與圖9的照片顯示的相似。

另外，當(dāng)用鐵磁性物質(zhì)(如鐵棒)接近前述晶體生長(zhǎng)的液滴(其中含有蛋白質(zhì)晶體)時(shí)，蛋白質(zhì)晶體會(huì)向該鐵磁性物質(zhì)迅速靠近，甚至飛出液滴去接近該鐵性物質(zhì)，顯示蛋白質(zhì)晶體具備非常強(qiáng)的磁性。

實(shí)施例8：黑脈金斑蝶MagR蛋白的表達(dá)和純化

1.人工合成編碼以下氨基酸序列的插入片段(表達(dá)框)：

MWSHPQFEKGGSTSMSTKTIASATVRAVKKRLLPSRAALVLTSSAVNKVKEIMAKEEGKGYIGLKVGVRQRGCNGLSYTLDYATSKGKLDEEVKQDGVTIIIDKKAQLTLLGTEMDFVEDKLSAEFVFNNPNIKGTCGCGESFSI

其中，第2-9個(gè)氨基酸WSHPQFEK為Strep II親和標(biāo)簽序列；第10-14個(gè)氨基酸GGGTS為鏈接區(qū)序列；帶下劃線的序列為黑脈金斑蝶(或稱美洲帝王蝶，拉丁名Danaus plexippus，以下也可簡(jiǎn)稱為“蝴蝶”)的MagR的蛋白質(zhì)序列，即如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

2.將上述合成的編碼蝴蝶MagR蛋白的氨基酸序列并且N端具有Strep II親和標(biāo)簽的插入片段通過(guò)SalI/XhoI位點(diǎn)克隆到pET-21a(+)質(zhì)粒(Novagen)。

3.將上述包含具有編碼蝴蝶MagR蛋白的氨基酸序列且N端具有Strep II親和標(biāo)簽的插入片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)(商購(gòu))。挑取單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，低溫誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，20-24小時(shí)后收菌。

4.將上述得到的表達(dá)了MagR蛋白的轉(zhuǎn)化菌用緩沖液重懸后，用超聲破碎儀裂解，完成后進(jìn)行高速離心，取上清液進(jìn)行親和純化。通過(guò)Strep-Tactin親和柱親和純化后，進(jìn)行陰離子交換柱或者分子篩凝膠層析進(jìn)一步純化，得到純度較高的蝴蝶MagR蛋白。純化全過(guò)程在4℃進(jìn)行。純化后得到的MagR蛋白在濃度較高時(shí)可呈現(xiàn)明顯的棕黃色或棕褐色，這提示蛋白質(zhì)中結(jié)合了二價(jià)或三價(jià)的鐵。

5.對(duì)收集的MagR蛋白樣品進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，其中各泳道的樣品為：(1):蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；(2)：純化的含有Strep II親和標(biāo)簽的蝴蝶MagR蛋白，分子量約為15KDa。

實(shí)施例9：黑脈金斑蝶MagR蛋白形成純合復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例8中表達(dá)和純化的蝴蝶MagR蛋白，在通過(guò)Strep-Tactin親和柱親和純化后進(jìn)一步用Superdex 200 10/300GL純化柱(GE Healthcare)進(jìn)行分子篩凝膠層析。

樣品的分子篩凝膠層析呈現(xiàn)出單體峰、二聚體峰和多聚峰，分別收 集三個(gè)峰的樣品，獲得純化蛋白。這顯示，純化的MagR蛋白在分子篩凝膠層析中以三種形式存在。與蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較可知，三個(gè)峰的大致分子量為15KDa、30KDa和大于200KDa，這與MagR蛋白的單體、二聚體和多聚體的分子量相吻合。由于Superdex S200的分辨率最高為約200KDa，所以，尚無(wú)法判斷多聚體的分子量范圍和多聚體所含單體個(gè)數(shù)。

實(shí)施例10：黑脈金斑蝶MagR蛋白和Cry1蛋白形成的雜合蛋白復(fù)合物的表達(dá)和純化

1.人工合成編碼以下氨基酸序列的插入片段(表達(dá)框)：

MHHHHHHHHHHGGGGSTSMLGGNVIWFRHGLRLHDNPSLHSALEDASSPFFPIFIFDGETAGTKMVGYNRMRYLLEALNDLDQQFRKYGGKLLMIKGRPDLIFRRLWEEFGIRTLCFEQDCEPIWRPRDASVRALCRDIGVSCREHVAHTLWNPDTVIKANGGIPPLTYQMFLHTVEIIGNPPRPVDDVDLNGVNFGSLPESFYREFVVFDKAPKPEDLGVFLENEDIRMIRWVGGETAALKQMQERLAVEYETFCRGSYLPTHGNPDLLGPPISLSPALRFGCLSVRRFYWSLQDLFQQVHQGRLASTQFITGQLIWREYFYTMSVNNPNYAQMSGNPICLDIPWKEPENDELQRWKEGRTGFPFVDAAMRQLRTEGWLHHVVRNTVASFLTRGTLWLSWEHGLQHFLKYLLDADWSVCAGNWMWVSSSAFEALLDSGECACPVRLGRRLEPTGHYVRRYVPELARMPGEYIYEPWRAPLEVQEAAGCVIGRDYPAPVVDHTAAAARNRANMQELRRLLEKAPPHCCPSSEDEVRQFMWLGDDSQPELTTT

其中，第2-11個(gè)氨基酸為10個(gè)組氨酸的His親和標(biāo)簽序列；第12-18個(gè)氨基酸GGGGSTS為鏈接區(qū)序列；帶下劃線的序列為蝴蝶的Cry1的氨基酸序列，即如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

2.將上述合成的編碼蝴蝶Cry1的氨基酸序列并且N端具有His親和標(biāo)簽的插入片段通過(guò)SalI/XhoI位點(diǎn)克隆到pET-21a(+)質(zhì)粒(Novagen)。

3.將前述具有蝴蝶Cry1蛋白的編碼基因并融合了組氨酸標(biāo)簽(His-tag)的質(zhì)粒與實(shí)施例8步驟2得到的具有蝴蝶MagR蛋白的編碼基因并融合了StrepII標(biāo)簽的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，挑取含有兩種質(zhì)粒的大腸桿菌單克隆接種至LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，低溫誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)，20-24小時(shí)后收菌。

4.將上述得到的共表達(dá)了蝴蝶MagR蛋白和Cry1蛋白的轉(zhuǎn)化菌用緩沖液重懸后，用超聲破碎儀裂解，完成后進(jìn)行高速離心，取上清液進(jìn)行親 和純化。通過(guò)Ni-NTA親和柱親和純化后，再通過(guò)Strep-Tactin親和柱純化，得到蝴蝶MagR蛋白和Cry1蛋白形成的MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物。進(jìn)一步通過(guò)陰離子交換柱和分子篩凝膠層析純化，得到純度較高的雜合蛋白復(fù)合物。純化全過(guò)程在4℃和存在外加磁場(chǎng)的條件下進(jìn)行。外加磁場(chǎng)通過(guò)下述方法施加：當(dāng)樣品過(guò)親和柱時(shí)，將兩個(gè)相同的條形磁鐵分別綁在親和柱的兩側(cè)，該兩個(gè)相同的條形磁鐵的南極和北極分別相對(duì)，提供一個(gè)均勻穩(wěn)定的磁場(chǎng)。結(jié)果顯示，在純化時(shí)施加外加磁場(chǎng)(例如，外加磁場(chǎng)的強(qiáng)度是地球磁場(chǎng)的10-100倍)，純化蛋白的產(chǎn)率有顯著增加；在洗脫純化蛋白時(shí)，撤去外加磁場(chǎng)，蛋白質(zhì)洗脫效率更高。

5.對(duì)收集的蝴蝶MagR-Cry1蛋白復(fù)合物樣品進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，其中從左向右第3泳道加載的樣品為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，第4泳道加載的樣品為蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物。結(jié)果：由于使用變性電泳分析，泳道4中顯示出兩種蛋白質(zhì)樣品，即含有Strep II親和標(biāo)簽的蝴蝶MagR蛋白(分子量約為15KDa)以及含有His標(biāo)簽的蝴蝶Cry1蛋白(分子量約為70KDa)。

實(shí)施例11:黑脈金斑蝶MagR蛋白以及MagR純合蛋白復(fù)合物含有鐵的證明實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例9得到的蝴蝶MagR蛋白的單體峰樣品用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果與圖3相似。

將實(shí)施例9中得到的蝴蝶MagR蛋白形成的二聚物或多聚物樣品，用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果與圖3相似。

實(shí)施例12：黑脈金斑蝶MagR純合蛋白復(fù)合物和黑脈金斑蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的電子顯微鏡圖像和結(jié)構(gòu)

將實(shí)施例9中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后獲得的蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品以及實(shí)施例10中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后的蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品采用乙酸鈾或者甲酸鈾負(fù)染，制備蛋白質(zhì)的負(fù)染電鏡樣品，將樣品放置于透射電鏡下觀察并拍照，按照標(biāo)準(zhǔn)的電鏡結(jié)構(gòu)分析方法解析其結(jié)構(gòu)，并測(cè)量大小(包括蛋白長(zhǎng)度和寬度)。

電鏡結(jié)果顯示，蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物和蝴蝶MagR-Cry1雜合 蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)形式與實(shí)施例5圖4中觀測(cè)到的家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物和MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)形式相同。

電鏡觀測(cè)到的結(jié)果顯示，蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物呈現(xiàn)為長(zhǎng)條形的棒狀結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)度為約20-24納米長(zhǎng)，寬度為約7-11納米。根據(jù)同源晶體結(jié)構(gòu)和分子模型計(jì)算，結(jié)果表明該復(fù)合物具有約20個(gè)MagR蛋白。電鏡觀測(cè)到的結(jié)果顯示，蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物呈現(xiàn)為棒狀，長(zhǎng)度為約20-24納米長(zhǎng)，寬度為約13-18納米寬。根據(jù)同源晶體結(jié)構(gòu)和分子模型計(jì)算，結(jié)果表明該復(fù)合物具有約20個(gè)MagR蛋白和10個(gè)Cry1蛋白。

電鏡結(jié)果還顯示，每一個(gè)MagR純合蛋白復(fù)合物包括約20個(gè)MagR蛋白質(zhì)，有序排列形成線性雙螺旋聚合體，其中每10個(gè)MagR蛋白單體以線性聚合的形式首尾相接，形成兩條蛋白長(zhǎng)鏈，兩條蛋白長(zhǎng)鏈以螺旋形式結(jié)合，由此形成長(zhǎng)條形棒狀結(jié)構(gòu)的蛋白復(fù)合物。

電鏡結(jié)果還顯示，在蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物中，在由約20個(gè)MagR組成的蛋白復(fù)合物所形成的棒狀線性雙螺旋聚合體的外圍，有約10個(gè)感光的Cry1蛋白質(zhì)纏繞排列，從而形成雜合復(fù)合物。

實(shí)施例13：黑脈金斑蝶MagR蛋白復(fù)合物結(jié)晶

將實(shí)施例9中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后獲得的蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品以及實(shí)施例10中經(jīng)分子篩凝膠層析純化后的蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的蛋白樣品濃縮，然后進(jìn)行結(jié)晶。蛋白質(zhì)結(jié)晶方法按照如教科書McPherson,A.(2009).Introduction to macromolecular crystallography.Hoboken,N.J.,Wiley-Blackwell記載的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程采用懸滴法進(jìn)行。

蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物的晶體和蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的晶體的形態(tài)與對(duì)應(yīng)的家鴿MagR純合蛋白復(fù)合物的晶體或家鴿MagR-Cry4雜合蛋白復(fù)合物的晶體類似，分別制備和觀察到兩種類型的晶體：第一種是黑色不透明的長(zhǎng)方體形狀的晶體，提示鐵元素在晶體中已被氧化成均一的三價(jià)；第二種晶體為淺黃色或黃色的透明晶體，形狀不規(guī)則或呈小片狀，提示鐵元素可能以二價(jià)存在。圖11示出了蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的晶體照片，可見(jiàn)該晶體具有黑色不透明的長(zhǎng)方體形狀，長(zhǎng)度約為0.5mm。

實(shí)施例14：黑脈金斑蝶MagR蛋白復(fù)合物的磁性測(cè)試

采用與實(shí)施例7中同樣的方法對(duì)蝴蝶MagR蛋白形成的純合蛋白復(fù)合物以及蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的磁性進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示，蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物和蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的磁性測(cè)試結(jié)果與家鴿的測(cè)試結(jié)果(如實(shí)施例7中觀察到的)類似。這表明，蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物和蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白蛋白復(fù)合物具有磁性。

圖11為蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中同步旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。實(shí)驗(yàn)方法如實(shí)施例7的(3)所描述。如圖11所示，可以觀察到蝴蝶MagR-Cry1雜合蛋白復(fù)合物的晶體為黑色，并且在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中發(fā)生同步旋轉(zhuǎn)。同樣，蝴蝶MagR純合蛋白復(fù)合物的晶體在旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)中也出現(xiàn)同步旋轉(zhuǎn)的現(xiàn)象。

實(shí)施例15：家鴿MagR蛋白以及MagR純合蛋白復(fù)合物具有結(jié)合鐵的保守結(jié)構(gòu)域的證明實(shí)驗(yàn)

根據(jù)實(shí)施例1、2和4描述的方法和步驟，測(cè)試將家鴿MagR的如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的三個(gè)半胱氨酸C60、C124、C126突變?yōu)榻z氨酸(S)后得到的蛋白結(jié)合鐵的能力。

即將實(shí)施例1步驟1中人工合成的插入片段改變?yōu)椋篗WSHPQFEKGGGTSMASSASSVVRATVRAVSKRKIQATRAALTLTPSAVQKIKELLKDKPEHVGVKVGVRTRGSNGLSYTLEYTKSKGDSDEEVVQDGVRVFIEKKAQLTLLGTEMDYVEDKLSSEFVFNNPNIKGTSGSGESFNI。

根據(jù)實(shí)施例1和2描述的方法和步驟表達(dá)和純化具有上述C60S、C124S、C126S突變的家鴿MagR蛋白以及MagR純合蛋白復(fù)合物。突變的家鴿MagR蛋白經(jīng)過(guò)分子篩凝膠層析，也呈現(xiàn)出單體峰、二聚體峰和多聚體峰。分別收集三個(gè)峰的樣品。將得到的蛋白樣品分別根據(jù)實(shí)施例4描述的方法用分光光度計(jì)(Nanodrop 2000)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

如圖12所示，結(jié)果顯示上述突變蛋白形成的家鴿MagR單體蛋白的吸收曲線(實(shí)線所示)在Fe元素的特征吸收位置(320nm和410nm)沒(méi)有吸收峰。作為對(duì)照的野生型的家鴿MagR蛋白以及MagR純合蛋白復(fù)合物的吸收曲線(虛線所示)則顯示在320nm和410nm有明顯的吸收峰。類似的，根據(jù)前述方法經(jīng)過(guò)分子篩凝膠層析和純化后得到的突變 蛋白形成的家鴿MagR的二聚物或多聚物的吸收曲線在Fe元素的特征吸收位置(320nm和410nm)也沒(méi)有吸收峰。

結(jié)果表明，家鴿MagR蛋白具有結(jié)合鐵的結(jié)構(gòu)域，其包括C60、C124、C126三個(gè)位點(diǎn)中的一個(gè)或多個(gè)。

實(shí)施例16：各物種MagR蛋白的序列比對(duì)

測(cè)序或根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得果蠅(Drosophila melanogaster)、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)、蜜蜂(Apis mellifera)、文昌魚(Branchiostoma floridae)、斑馬魚(Danio rerio)、蟒蛇(Python bivittatus)、家鴿(Columba livia)、草雀(Taeniopygia guttata)、雞(Gallus gallus)、鯨魚(Balaenoptera acutorostrata)、蝙蝠(Myotis lucifugus)、裸鼴鼠(Heterocephalus glaber)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的磁感應(yīng)受體蛋白的氨基酸序列，其分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所示。

用Clustal V比對(duì)方法對(duì)獲得的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

圖13是上述各物種MagR蛋白的序列比對(duì)的結(jié)果。其中從上至下的來(lái)源物種名稱以及基因在NCBI的序列號(hào)(如果有的話)分別為：(1)果蠅(Drosophila melanogaster),基因序列號(hào)為NP_573062.1；(2)黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)；(3)蜜蜂(Apis mellifera),基因序列號(hào)為XP_624993.1；(4)文昌魚(Branchiostoma floridae),基因序列號(hào)為XP_002589524.1；(5)斑馬魚(Danio rerio),基因序列號(hào)為NP_001020349.1；(6)蟒蛇(Python bivittatus),基因序列號(hào)為XP_007429307.1；(7)家鴿(Columba livia)；(8)草雀(Taeniopygia guttata),基因序列號(hào)為XP_002194930.1；(9)雞(Gallus gallus),基因序列號(hào)為XP_003643055.1；(10)鯨魚(Balaenoptera acutorostrata)；(11)蝙蝠(Myotis lucifugus),基因序列號(hào)為XP_006102189.1；(12)裸鼴鼠(Heterocephalus glaber),基因序列號(hào)為XP_004879403.1；(13)小鼠(Musmusculus),基因序列號(hào)為NP_081197.1；(14)人(Homo sapiens),基因序列號(hào)為NP_112202.2。其中(2)黑脈金斑蝶、(7)家鴿和(10)鯨魚的序列為本申請(qǐng)發(fā)明人測(cè)序獲得。

結(jié)果顯示，本申請(qǐng)發(fā)明人首次研究、制得、鑒定并命名的磁感應(yīng)受體 蛋白的核酸編碼序列在生物體基因組中廣泛存在。本發(fā)明提供的磁感應(yīng)受體蛋白的核酸序列在大量不同物種的基因組中都存在，其編碼的蛋白序列高度保守，并具有多個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域，如結(jié)合鐵和/或硫的結(jié)構(gòu)域，在圖13中箭頭所指的三個(gè)100％保守的半胱氨酸殘基(C)，其為結(jié)合鐵(或鐵硫中心)的位置。

除非另外指出，本發(fā)明的實(shí)施方式可使用生物技術(shù)、有機(jī)化學(xué)、無(wú)機(jī)化學(xué)等的常規(guī)技術(shù)，顯然除在上述說(shuō)明和實(shí)施例中所特別描述之外，還可以別的方式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。其它在本發(fā)明范圍內(nèi)的方面與改進(jìn)將對(duì)本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，許多改變和變化是可行的，因此其在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本文所提到的所有專利、專利申請(qǐng)與科技論文均據(jù)此通過(guò)引用并入本文中。