本發(fā)明涉及人胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）及其片段和這些片段的類似物的DPP4抑制劑修飾后的新衍生物，它們具有比修飾前GLP-1更長時間的作用曲線，還涉及這些物質的制備方法。
背景技術：
：2型糖尿病發(fā)病和進展的一個重要原因是胰島功能的進行性衰退，包括β細胞胰島素分泌缺陷和α細胞胰升糖素不適當?shù)姆置谠黾釉斐傻囊葝u素：胰升糖素比例失調。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是一種在食物營養(yǎng)物質刺激下，由腸道內分泌細胞合成分泌的腸促胰素(Incretin)，具有葡萄糖依賴性促胰島素分泌的特性，可通過促進β細胞的胰島素分泌、抑制僅細胞不適當?shù)囊壬撬胤置?、延緩胃排空及抑制食欲等多個途徑參與機體血糖穩(wěn)態(tài)調節(jié)。同時，GLP-1還可促進β細胞增殖、抑制p細胞凋亡，增加胰島素合成、改善β細胞功能。但內源性活性GLP-l半壽期極短，迅速被二肽基肽酶(DPP-4)裂解而失活，不能達到2型糖尿病治療濃度。人工合成和修飾的難被DPP-4裂解的GLP-1類似物(又稱GLP-l受體激動劑)，具有較長的半壽期和生物活性；DPP-4抑制劑可選擇性抑制DPP-4活性，阻止內源性活性GLP-1裂解，延長其半壽期，提高其血漿水平和效能。因此，GLP-1及其受體與DPP4成為2型糖尿病新的治療靶點。胰高血糖素樣肽（glucagon-likepeptide），包括胰高血糖素樣肽-1（glucagon-likepeptide-1,GLP-1)和包括胰高血糖素樣肽-2（glucagon-likepeptide-2,GLP-2)主要是由食物刺激小腸表皮細胞分泌的單肽類化合物。二者均來源于胰高血糖素原（proglucagon），后者是由158個氨基酸組成，在不同的部位被切割成不同的肽鏈，如下所示。因為GLP-1具有促進胰島素分泌，保護胰島β細胞，抑制胰高血糖素分泌，抑制胃排空，降低食欲的藥理作用，臨床可用于二型糖尿病和肥胖癥的治療；GLP-2是一種營養(yǎng)因子，具有促進小腸生長，抑制細胞凋亡，促進胃排空，增加食欲的藥理作用，臨床上可用于治療小腸短小綜合癥。人體內具有生物活性的GLP-1主要是GLP-1（7-36）酰胺和GLP-1（7-37），GLP-2為GLP-2（1-33），天然GLP-1和GLP-2均被二肽基肽酶Ⅳ（dipeptidylpeptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）迅速水解失活（半衰期小于5min），不具有臨床使用價值，因此對GLP-1和GLP-2結構修飾，形成具有同樣藥理活性類似物，并掩蓋DPP-Ⅳ的結合位點，延長半衰期是該類藥物研發(fā)的主要課題。本發(fā)明的創(chuàng)新點在于將DPP4抑制劑直接修飾至GLP-1或者GLP-1類似物上，如利拉魯肽的二位DPP4抑制劑修飾，得到了全新的GLP-1類似物。該化合物可以通過阻斷DPP4對于GLP-1的酶活性作用，具體表現(xiàn)為阻斷DPP4對于GLP-1或者GLP-1類似物的氨基末端二位氨基酸的快速降解，從而延長了GLP-1在體內的半衰期。而DPP4酶對于GLP-1的酶切點在肽鏈氮端的二位氨基酸，因此二位修飾會更易達到抑制DPP4酶活性并保留GLP-1活性的設計目標，在確保療效和用藥安全的前提下提高了糖尿病患者的用藥順應性。GLP-1、GLP-1類似物以及它們的片段尤其在治療1型和2型糖尿病中非常有效。然而高清除率限制了這些化合物的有效性，因此在這方面還需要改進。相應的，本發(fā)明的一個目的是提供一種DPP4抑制劑修飾的GLP-1衍生物具有比已上市GLP-1類藥物更長時間的作用曲線。本發(fā)明的進一步目的是提供GLP-1及其類似物的衍生物，這些衍生物具有比GLP-1（7-37）更低的清除率。本發(fā)明的目的也包括提供一種治療胰島素依賴性或非胰島素依賴性糖尿病和治療肥胖癥的方法。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明人合成了一種全新的GLP-1類似物，其特點為在GLP-1（7-37）肽鏈的氨基酸側鏈上用簡單的化學鍵修飾上DPP4抑制劑小分子。并對不同的DPP4抑制劑、小分子修飾的位置及修飾的橋鏈的一系列化合物進行了篩選。將七種不同的DPP4抑制劑及其類似物修飾至GLP-1（7-37）肽鏈上，分別通過二硫鍵及酰胺鍵的方式將肽鏈與DPP4小分子橋聯(lián)起來。本發(fā)明的合成路線如下：首先通過液相方法合成賴氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Mpa-DPP4、Fmoc-Asp(DPP4)-OH和Fmoc-Glu(DPP4)-OH，其次在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-Gly-OH偶聯(lián)得到Fmoc-Gly-樹脂，然后通過固相合成法，按照目標肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，最后裂解，純化，凍干，得到GLP-1（7-37）類似物。本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義；Fmoc：芴甲氧羰基Fmoc-AA：芴甲氧羰基保護的氨基酸DIC：N，N′-二異丙基碳化二亞胺DCC：N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺PyBOP：六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯HOBt：1-羥基苯駢三唑HOSu：N-羥基琥珀酰亞胺tBu：叔丁基Trt：三苯甲基Boc：叔丁氧羰基Palmitoyl：棕櫚?；鵓bf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺?；鵗yr：酪氨酸Ile：異亮氨酸Gln：谷氨酰胺Asn：天冬酰胺Cys：半胱氨酸Pro：脯氨酸Leu：亮氨酸Gly：甘氨酸Arg：精氨酸Val：纈氨酸Trp：色氨酸Ala：丙氨酸Phe：苯丙氨酸Glu：谷氨酸Lys：賴氨酸Ser：絲氨酸Asp：天冬氨酸Thr：蘇氨酸His：組氨酸DMF：N，N′-二甲基甲酰胺MeOH：甲醇DCM：二氯甲烷NMP：N-甲基吡咯烷酮DMSO：二甲基亞砜TFA：三氟醋酸EDT：乙二硫醇Piperidine：六氫吡啶DMAP：4-二甲氨基吡啶DIEA：N，N′-二異丙基乙胺TMP：2,4,6-三甲基吡啶。為此本發(fā)明提供兩種GLP-1（7-37）類似物的合成方法，其步驟如下：方法一：步驟1，通過液相方法合成賴氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步驟2，在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-Gly-OH偶聯(lián)得到Fmoc-Gly-樹脂；步驟3，通過固相合成法，按照目標肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步驟4，裂解，液相修飾，純化，凍干，得到GLP-1（7-37）類似物。其中，步驟1所述的固相合成方法，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成為：正十六烷酸、HOSu、DCC偶聯(lián)得到Palmitoyl-OSu活化脂，然后和H-Glu-OtBu反應得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu、DCC偶聯(lián)得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，然后和Fmoc-Lys-OH反應得到賴氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。其中，步驟2所述的固相合成方法，所述樹脂固體載體采用2-CTC樹脂，所述活化劑系統(tǒng)選自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-樹脂為0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC樹脂。其中，步驟2所述的固相合成方法，所述樹脂固體載體采用王樹脂，所述活化劑系統(tǒng)由DIC、HOBt和DMAP組成，所述Fmoc-Gly-王樹脂為0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王樹脂。其中，步驟3所述的固相合成方法，1）采用由體積比為1:4的哌啶和DMF組成的去保護液脫除Fmoc-Gly-樹脂上的Fmoc保護基，得到H-Gly-樹脂；2）在偶聯(lián)劑系統(tǒng)的存在下，H-Gly-樹脂和Fmoc保護且側鏈保護的精氨酸偶聯(lián)得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-樹脂；3）重復步驟1）、2），按照目標肽主鏈肽序依次進行氨基酸的偶聯(lián)，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH,偶聯(lián)氨基酸順序為：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH。所述偶聯(lián)劑系統(tǒng)包括縮合劑和反應溶劑，所述縮合劑選自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反應溶劑選自DMF、DCM、NMP、DMSO或他們之間的任意組合。方法二：步驟1，通過液相方法合成賴氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步驟2，在活化劑系統(tǒng)的存在下，由樹脂固相載體和Fmoc-Gly-OH偶聯(lián)得到Fmoc-Gly-樹脂；步驟3，通過固相合成法，按照目標肽主鏈肽序依次偶聯(lián)具有N端Fmoc保護且側鏈保護的氨基酸，其中賴氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；步驟4，裂解，純化，凍干，得到GLP-1（7-37）類似物。其中，步驟1所述的固相合成方法，所述片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成為：正十六烷酸、HOSu、DCC偶聯(lián)得到Palmitoyl-OSu活化脂，然后和H-Glu-OtBu反應得到二肽片段Palmitoyl-Glu-OtBu；Palmitoyl-Glu-OtBu、HOSu、DCC偶聯(lián)得到Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，然后和Fmoc-Lys-OH反應得到賴氨酸三肽片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH。其中，步驟2所述的固相合成方法，所述樹脂固體載體采用2-CTC樹脂，所述活化劑系統(tǒng)選自DIEA、TMP或NMM，所述Fmoc-Gly-樹脂為0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-CTC樹脂。其中，步驟2所述的固相合成方法，所述樹脂固體載體采用王樹脂，所述活化劑系統(tǒng)由DIC、HOBt和DMAP組成，所述Fmoc-Gly-王樹脂為0.10~0.35mmol/g取代度的Fmoc-Gly-王樹脂。其中，步驟3所述的固相合成方法，1）采用由體積比為1:4的哌啶和DMF組成的去保護液脫除Fmoc-Gly-樹脂上的Fmoc保護基，得到H-Gly-樹脂；2）在偶聯(lián)劑系統(tǒng)的存在下，H-Gly-樹脂和Fmoc保護且側鏈保護的精氨酸偶聯(lián)得到Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-樹脂；3）重復步驟1）、2），按照目標肽主鏈肽序依次進行氨基酸的偶聯(lián)，其中賴氨酸采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH,偶聯(lián)氨基酸順序為：Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(DPP4)-OH或Fmoc-Glu(DPP4)-OH、Boc-His(Trt)-OH。所述偶聯(lián)劑系統(tǒng)包括縮合劑和反應溶劑，所述縮合劑選自DIC/HOBt、PyBOP/HOBt/DIEA或HATU/HOBt/DIEA；所述反應溶劑選自DMF、DCM、NMP、DMSO或他們之間的任意組合。本發(fā)明的GLP-1衍生物可用于治療胰島素依賴性或非胰島素依賴性糖尿病，具體地說，預計GLP-1衍生物對于制備具有更長時間的作用曲線的用于治療胰島素依賴性或非胰島素依賴性糖尿病和治療肥胖癥的藥物將是有用的。具體實施方式以下通過實施例進一步說明本發(fā)明。實施例一：Palmitoyl-OSu活化脂的合成稱取25.64g正十六烷酸（100mmol），13.81gHOSu（120mmol）加入200mlTHF中，冰水浴下加入24.76gDCC（120mmol），反應1小時，升溫到室溫反應3小時，反應液過濾，母液旋干，加DCM溶解，過濾，飽和碳酸氫鈉洗3遍，純水2遍，反萃2遍，合并有機相，無水碳酸鈉干燥，旋干，冰乙醇重結晶3次，過濾，固體油泵拉干的到31.46gPalmitoyl-OSu活化脂，收率89%。實施例二：Palmitoyl-Glu-OtBu的合成稱取10.16gH-Glu-OtBu（50mmol）和7.95gNa2CO3（75mmol）加入到50ml水和50mlTHF的混合溶液中溶解，稱取17.68gPalmitoyl-OSu（50mmol）加入到50mlTHF，溶解后滴加上述混合溶液中，室溫下反應過夜，用10%稀鹽酸調節(jié)PH到7，旋蒸除去THF，之后調節(jié)PH到3。得到大量白色沉淀，過濾。將得到的白色沉淀用冰乙醇重結晶。固體油泵拉干的到19.21gPalmitoyl-Glu-OtBu，收率87%。實施例三：Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu的合成稱取8.83gPalmitoyl-Glu-OtBu（20mmol），2.76gHOSu（24mmol）加入100mlTHF中，冰水浴下加入4.95gDCC（24mmol），反應1小時，升溫到室溫反應3小時，反應液過濾，母液旋干，加DCM溶解，過濾，飽和碳酸氫鈉洗3遍，純水2遍，反萃2遍，合并有機相，無水碳酸鈉干燥，旋干，冰乙醇重結晶3次，過濾，固體油泵拉干的到9.48gPalmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化脂，收率88%。實施例四：Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH的合成稱取3.67gFmoc-Lys-OH（10mmol）和1.59gNa2CO3（15mmol）加入到10ml水和10mlTHF的混合溶液中溶解，稱取5.39gPalmitoyl-Glu(OSu)-OtBu（0.1mol）加入到10mlTHF，溶解后滴加上述混合溶液中，室溫下反應過夜，用10%稀鹽酸調節(jié)PH到7，旋蒸除去THF，之后調節(jié)PH到3。得到大量白色沉淀，過濾。將得到的白色沉淀用冰乙醇重結晶。固體油泵拉干的到6.72gFmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH，HPLC純度為97.40%，收率85%。實施例五：Mpa(Trt)-Sitagliptin的合成稱取418.2mgMpa(Trt)-OH(1.2mmol)、407.3mg西他列?。?.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得1.26gMpa(Trt)-Sitagliptin。實施例六：Mpa-Sitagliptin的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至1.26gMpa(Trt)-Sitagliptin中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.96gMpa(Trt)-Sitagliptin。實施例七：Mpa(Trt)-Alogliptin的合成稱取418.2mgMpa(Trt)-OH(1.2mmol)、339.4mg阿格列?。?.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得1.12gMpa(Trt)-Alogliptin。實施例八：Mpa-Alogliptin的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至1.12gMpa(Trt)-Alogliptin中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.89gMpa-Alogliptin。實施例九：Fmoc-Asp(Sitagliptin)-OtBu的合成稱取432.0mgFmoc-Asp-OtBu（1.05mmol）、407.3mg西他列汀（1.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.97gFmoc-Asp(Sitagliptin)-OtBu。實施例十：Fmoc-Asp(Sitagliptin)-OH的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至0.97gFmoc-Asp(Sitagliptin)-OtBu中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.83gFmoc-Asp(Sitagliptin)-OH。實施例十一：Fmoc-Asp(Alogliptin)-OtBu的合成稱取432.0mgFmoc-Asp-OtBu（1.05mmol）、339.4mg阿格列?。?.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.83gFmoc-Asp(Alogliptin)-OtBu。實施例十二：Fmoc-Asp(Alogliptin)-OH的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至0.83gFmoc-Asp(Alogliptin)-OtBu中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.77gFmoc-Asp(Alogliptin)-OH。實施例十三：Fmoc-Glu(Sitagliptin)-OtBu的合成稱取446.7mgFmoc-Glu-OtBu（1.05mmol）、407.3mg西他列?。?.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.98gFmoc-Glu(Sitagliptin)-OtBu。實施例十四：Fmoc-Glu(Sitagliptin)-OH的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至0.98gFmoc-Glu(Sitagliptin)-OtBu中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.82gFmoc-Glu(Sitagliptin)-OH。實施例十五：Fmoc-Glu(Alogliptin)-OtBu的合成稱取446.7mgFmoc-Glu-OtBu（1.05mmol）、339.4mg阿格列?。?.0mmol）和624.5mgPyBop（1.2mmol）加入至5mlDMF中攪拌溶解后，加入397μlDIEA(2.4mmol)，室溫反應2h。母液加至10%檸檬酸水溶液中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.85gFmoc-Glu(Alogliptin)-OtBu。實施例十六：Fmoc-Glu(Alogliptin)-OH的合成量取5mlTFA：TIS=95:5裂解液加至0.85gFmoc-Glu(Alogliptin)-OtBu中，室溫反應2h。母液加至純水中，用DCM萃取，飽和碳酸氫鈉洗3遍，飽和食鹽水2遍，合并有機相，無水硫酸鈉干燥，旋干得0.73gFmoc-Glu(Alogliptin)-OH。實施例十七：Cys2（Mpa-Sitagliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.943g粗肽樹脂。稱取0.943g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽349.3mg。將粗肽和457.6mgMpa-Sitagliptin用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，用氨水調節(jié)PH至8后，加入雙氧水350μl，反應2h后，用醋酸調節(jié)PH至6。而后通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（25.2mg，5.91%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4261.2514（理論量為4261）。實施例十八：Cys2（Mpa-Alogliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.979g粗肽樹脂。稱取0.979g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽358.2mg。將粗肽和418.5mgMpa-Alogliptin用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，用氨水調節(jié)PH至8后，加入雙氧水350μl，反應2h后，用醋酸調節(jié)PH至6。而后通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（21.7mg，5.17%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4193.0525（理論量為4193）。實施例十九：Asp2（Sitagliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(Sitagliptin)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.979g粗肽樹脂。稱取0.979g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽332.1mg。將粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（26.3mg，6.31%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4169.3654（理論量為4169）。實施例二十：Asp2（Alogliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(Alogliptin)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.953g粗肽樹脂。稱取0.953g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽332.1mg。將粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（20.3mg，4.96%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4091.2357（理論量為4091）。實施例二十一：Glu2（Sitagliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(Sitagliptin)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.935g粗肽樹脂。稱取0.935g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽374.2mg。將粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（30.3mg，7.24%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4183.1425（理論量為4183）。實施例二十二：Glu2（Alogliptin）Lys20(Glu(Nα-Palmitoyl)-OH)Arg28GLP-1（7-37）的制備稱取0.476g（0.1mmol）取代度為0.21mmol/g的Fmoc-Gly-王樹脂，加入固相反應柱中，用DMF洗滌1次，用DMF溶脹Fmoc-Gly-王樹脂30分鐘后，用DMF:吡啶體積比為4:1的混合溶液脫去Fmoc保護，然后用DMF洗滌6次，稱取0.324gFmoc-Arg(Pbf)-OH（0.5mmol）、0.068gHOBt（0.5mmol）加入體積比為1:1的DCM和DMF混合溶液，冰水浴下加入80μlDIC（0.5mmol）活化后，加入上述裝有樹脂的反應柱中，室溫下反應2小時后，以茚三酮法檢測判斷反應終點，如果樹脂無色透明，則表示反應完全；樹脂顯色，則表示反應不完全，需要再反應1小時，此判斷標準適用于后續(xù)氨基酸偶聯(lián)中以茚三酮法檢測判斷反應終點。重復上述脫除Fmoc保護和加入相應氨基酸偶聯(lián)的步驟，依次完成Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Glu(Alogliptin)-OH、Boc-His(Trt)-OH的偶聯(lián)。偶聯(lián)完畢，將肽樹脂用DMF洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，DCM洗滌3次，MeOH洗滌3次，抽干得到0.947g粗肽樹脂。稱取0.947g全保護的肽樹脂，加入到25mL的三口圓底燒瓶中，按TFA:苯甲硫醚:苯甲醚:EDT=90:5:3:2的體積比配置裂解液10L，將裂解液加入上述樹脂中，室溫反應2小時，過濾，用少量TFA洗滌裂解后的樹脂3次，合并濾液，濃縮，將濃縮后的液體加入到冰乙醚中沉淀1小時，離心，無水乙醚離心洗滌6次，真空干燥，得到粗肽373.5mg。將粗肽用50%乙腈+50%水的混合溶液700ml溶解后，通過C18或C8柱2次純化、轉鹽、冷凍干燥后得到目標產(chǎn)物（28.1mg，6.84%），用MALDI-TOF分析產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質子化的分子離子峰的m/z值為4105.6412（理論量為4105）。生物學觀察DPP4抑制劑修飾后的GLP-1（7-37）類似物的肽圖分析：取測試化合物用水溶解后，加入DPP4酶，在37℃下進行培養(yǎng)，每隔4h后取樣進行檢測。照高效液相色譜法測定。色譜條件多肽分析用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫為30℃±5℃，供試品保存溫度為4℃±0.5℃；以0.1%三氟乙酸的水溶液為流動相A液，以0.1%三氟乙酸的乙腈溶液為流動相B液，流速為每分鐘1ml，梯度洗脫70分鐘(A液從100%至30%，B液從0至70%)，檢測波長為214nm。檢查法取供試品溶液及對照品溶液（均為每1ml中含1mg的溶液，如供試品和對照品濃度不夠，則應濃縮至相應的濃度），分別用1%碳酸氫銨溶液充分透析，按1∶50（mg/mg）加入DPP4酶溶液［取甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮處理過的（或序列分析純）DPP4酶適量，加1%碳酸氫銨溶液溶解，制成每1ml中含0.5μg的溶液］到供試品溶液與對照品溶液中，按1∶10加入50%醋酸溶液，以每分鐘10000轉離心5分鐘，精密量取上清液100μl，分別注入液相色譜儀，梯度洗脫，記錄色譜圖。將供試品溶液與對照品溶液的圖譜進行比較，即得。測試化合物半衰期測試化合物半衰期Exenatide4hLiraglutide12h例1796h例1888h例1952h例2056h例2140h例2248h對表達克隆的人GLP-1受體的細胞系內cAMP形成的刺激作用：為證實GLP-1衍生物的效能，測定了它們在表達克隆的人GLP-1受體的細胞系內刺激cAMP形成的能力。從劑量-響應曲線計算出EC50。使用表達人胰腺GLP-1受體的幼倉鼠腎（BHK）細胞（Knudsen和Pridal,1996,歐洲藥理學雜志，318,429-435）。通過在緩沖液（10mmol/lTris-HCl和30mmol/lNaClpH7.4，另外還含有1mmol/l二硫蘇糖醇，5mg/l亮抑酶肽（sigma,St.Louis,MO,USA），5mg/l抑胃酶肽（sigma,St.Louis,MO,USA），100mg/l桿菌肽（sigma,St.Louis,MO,USA）和16mg/l抑酶肽（NovoNordiskA/S，Bagsvaerd，Denmark）中勻漿制備質膜（Adelhorst等，1994，生物化學雜志，269,6275）。勻漿物在41w/v%蔗糖層上部離心。將兩層之間的白色條帶在緩沖液中稀釋并離心。質膜保存在-80℃?zhèn)溆谩Ｔ?6孔微量滴定板中以總體積140μl進行測定。所用的緩沖液為50mmol/lTris-HCl，pH7.4，還加入1mmol/lEGTA、1.5mmol/lMgSO4、1.7mmol/lATP、20mMGTP，2mmol/l3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.01％吐溫-20和0.1％人血清白蛋白(Reinst，BehringwerkeAG，Marburg，德國)。將欲測其激動劑活性的化合物溶解并稀釋在緩沖液中，加入到質膜制劑中，將混合物在37℃保溫2小時，加入25μl0.05mol/l鹽酸終止反應。將樣品稀釋10倍后用閃爍親近測定法(scintillationproximityassay)(RPA538，Amersham，UK)分析cAMP。得到以下結果：4測試化合物EC50，pM測試化合物EC50，pMExenatide58Liraglutide45例1726例1832例1947例2046例2149例2243當前第1頁1 2 3