本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種pdk1抑制劑、含有該抑制劑的組合物及用途。

背景技術(shù)：

1920年中世紀大蕭條時期，農(nóng)夫們發(fā)現(xiàn)大量牛羊死于異常出血。獸醫(yī)與農(nóng)夫們共同尋找原因，最終鎖定了一種被當做飼料的植物即草木犀。威斯康星農(nóng)業(yè)大學的卡爾·林克和他的學生們用了6年的時間將這種植物提純，最終找到了使得血液不能正常凝固的物質(zhì)—香豆素。

1941年，威斯康星校友研究基金會支持了通過氧化香豆素合成具有拮抗維生素k作用的雙香豆素這項研究。幾乎在同時期，林克將香豆素及其衍生物用作滅鼠劑，同時具有前瞻思維的紐約醫(yī)院/康奈爾醫(yī)療中心的醫(yī)生歐文萊特將其用于治療血栓，但由于醫(yī)生們依然畏懼給予病人滅鼠劑，所以其臨床應用仍不廣泛。直到1955年，香豆素通過華林法用于治療心肌梗死開創(chuàng)了先河，自此香豆素類抗凝劑在臨床應用中迅猛發(fā)展起來。

目前所知，香豆素類衍生物具有抗凝血、抗腫瘤、降壓、抗細胞增生、抗菌、抗艾滋病、抗疲勞及增強自身免疫能力等功效，其中雙香豆素為臨床上實用的抗凝血劑。另外，隨著科學的不斷發(fā)展進步，近年來還發(fā)現(xiàn)了雙香豆素可作為抗菌劑、hiv-1整合酶、脲酶等的抑制劑。雙香豆素為香豆素類抗凝藥物，目前臨床上一般將其與肝素一起用于深靜脈血栓。雙香豆素的化學結(jié)構(gòu)與維生素k類似，因此可通過競爭性抑制肝臟對維生素k的利用，進而干擾肝臟對凝血因子的正常合成，而起到抗凝血作用。

要了解雙香豆素抗凝作用的機制，則需要對維生素k的代謝有較好的理解。維生素k可由正常飲食及胃腸道菌群產(chǎn)生，吸收入人體內(nèi)后大部分儲存在肝臟中，在nadh醌酮氧化還原酶(nqo1)的作用下可以還原成維生素kh2的形式，維生素kh2在γ羧化酶的作用下可使凝血因子(11，vii，ix，x，蛋白c和s)氨基末端的谷氨酸鹽羧化，進而活化凝血因子。維生素kh2此時已被氧化為維生素k環(huán)氧化物，其可在維生素k環(huán)氧化物還原酶(vkor)的作用下還原成維生素kh2。另外，雙香豆素可以與nqo1及vkor相結(jié)合，抑制其生物活性，干擾維生素k的代謝，進一步抑制凝血因子的活化，起到抗凝作用。

對于癌癥的治療目前一直是醫(yī)學領(lǐng)域的一大難題，雖然全世界每年都會有大量的經(jīng)費投入到癌癥的治療中，然而腫瘤的治療依然是目前科學界無法取得突破的一個難點。目前臨床上常用的抗腫瘤藥物主要是細胞毒類藥物，而這類藥物普遍存在選擇性差，毒副作用強，易產(chǎn)生耐藥性等缺點。隨著醫(yī)學科技的發(fā)展，惡性腫瘤細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞周期調(diào)節(jié)、細胞凋亡的誘導、血管生成以及細胞與胞外基質(zhì)的相互作用等過程被逐漸闡明。基于此，一些與腫瘤細胞分化增殖及轉(zhuǎn)移相關(guān)的細胞信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵酶作為藥物篩選的靶點，發(fā)現(xiàn)選擇性作用于靶點的高效、低毒且特異性強的抗癌藥物正逐漸成為一個新的抗癌研究方向。例如，2007年，《癌癥細胞》雜質(zhì)就刊登了一篇關(guān)于加拿大阿爾伯塔大學學者的一篇論文，揭示了dca(二氯乙酸鈉)的抗癌特性。如今，dca被作為特異性地pdk1抑制劑進而用于腫瘤治療。然而人們慢慢發(fā)現(xiàn)，長期暴露于該藥物，易引起外周神經(jīng)毒性。因此，提供新型的pdk1抑制劑，且不引起外周神經(jīng)毒性的物質(zhì)用于腫瘤的治療中是學者們亟待深入研究的一個新的研究方向和科研思路。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是提供一種雙香豆素在制備用于治療和/或預防卵巢癌的藥物中的應用，本申請通過探究雙香豆素和卵巢癌的關(guān)系從而為卵巢癌的治療或者預防提供了思路，同時也從新的角度解開雙香豆素在防治卵巢癌的機制。

更為具體的，在本申請的，雙香豆素是通過作為pdk1的抑制劑實現(xiàn)在制備治療和/或預防卵巢癌的藥物中的應用的。對于以nqo1的抑制劑為出發(fā)點的腫瘤防治中，值得一提的是，nqo1做為酶，其主要功能是解毒作用，它可以降低活性氧的積累，因此其抑制劑有抗腫瘤的作用。

經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，雙香豆素可以同時抑制sapk及nf-κb的活性，雖然抑制sapk的活性可以上調(diào)nqo1缺失細胞nqo1基因的表達進而抗調(diào)亡，然而雙香豆素抑制nf-κb的活性占主要作用，其抗凋亡作用的減弱間接促進了tnfα誘導的hela細胞的凋亡。事實上，雙香豆素抗腫瘤的探討正逐漸增多，人們研究了其對膠質(zhì)瘤、乳腺癌、泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌及粒細胞性白血病等各個系統(tǒng)腫瘤的影響，這些研究中大部分探討的是雙香豆素通過抑制nqo1活性起到抗腫瘤作用。

而在本申請中，開創(chuàng)性地、具體地揭示了雙香豆素與卵巢癌的關(guān)系，并從新的角度分析了雙香豆素防治卵巢癌的機制。雙香豆素通過抑制卵巢癌細胞中pdk1活性進而使細胞p-pdh表達下降，并進一步地促進細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，增加了細胞內(nèi)活性氧簇，細胞內(nèi)活性氧簇的增加促使線粒體膜電勢降低并使得線粒體膜通透性下降、細胞色素c增加，增加了腫瘤細胞內(nèi)線粒體的凋亡，并導致卵巢癌細胞細胞凋亡(也即本申請所提供的雙香豆素其可以擴展至降低細胞p-pdh表達、促進細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)、增加細胞內(nèi)活性氧簇、促使線粒體膜電勢降低并使得線粒體膜通透性下降、增加細胞色素c、促使線粒體凋亡等方面新的用途)。

本發(fā)明的第二目的在于提供一種pdk1的抑制劑，該抑制劑為雙香豆素和/或雙香豆素類化合物，現(xiàn)有技術(shù)中以往報道的pdk1抑制劑多為二氯乙酸鈉，然而二氯乙酸鈉長期暴露會造成外周神經(jīng)毒性，因此存在極大的安全隱患，而本申請?zhí)峁┑男滦蚿dk1的抑制劑-雙香豆素或雙香豆素類化合物其不但可以對pdk1具有很好的抑制效果，而且還不會引起外周神經(jīng)毒性，使用安全。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種活性成份為雙香豆素和/或雙香豆素類化合物，且用于治療和/或預防卵巢癌的藥物，該藥物為卵巢癌的預防或者治療具有重大的價值。

優(yōu)選的，該藥物包括雙香豆素和/或雙香豆素類化合物以及藥學上可接受的輔料。另外，該藥物的劑型可以為現(xiàn)有技術(shù)中任一可以實現(xiàn)的劑型，如膠囊劑、丸劑、針劑、顆粒劑和片劑等。

更為具體的，本發(fā)明結(jié)合雙香豆素的抑制效果，還特異性地結(jié)合了多種中藥組份，實現(xiàn)了以雙香豆素和多種活性成分復配并進一步地治療卵巢癌的藥物配制。

所述藥物組合物主要包括以重量份數(shù)計的如下組份制成：雙香豆素50-70份、老牛揣10-40份、火炭母草根25-35份、蜘蛛果20-35份、人工牛黃11-24份、血竭1-5份、人參3-10份、清半夏10-15份、厚樸10-12份、枳殼15-40份、郁金22-35份、茸毛木藍11-24份、川芎2-4份、白蠟樹子10-20份、魚腥草素2-8份、芝麻素6-12份和萘普生15-20份。

其中，老牛揣，具有清熱解毒之效，火炭母草根含有多種氨基酸以及雙糖，具有清熱解毒，治主體乏力之功效，蜘蛛果具有清熱理氣，止痛補虛之效。人工牛黃、血竭、人參以及清半夏的配伍可以實現(xiàn)縮減或抑制卵巢腫瘤塊的效果，厚樸、枳殼、郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子等以特定的組分配伍，互補所短，具有消炎、行氣解郁，涼血破瘀之效。更為關(guān)鍵的是，申請人發(fā)現(xiàn)白蠟樹子與蜘蛛果、老牛揣按照特定比例互配后對于藥物組合物抗卵巢癌效果起到了非常關(guān)鍵的效果。此外，魚腥草素、芝麻素和萘普生等物質(zhì)與雙香豆素互配制劑是本領(lǐng)域中未見先例的，本申請中，最為關(guān)鍵的是，本申請的藥物實現(xiàn)了以雙香豆素為活性成分，集合了現(xiàn)有技術(shù)中具有不同功效的中藥組份，通過合理的配伍以輔助實現(xiàn)防治卵巢癌的效果。需要說明的是，在本申請中對于中藥組分的選擇配伍，一方面在考慮其本身所具備的療效，另一方面，是出于結(jié)合雙香豆素以及魚腥草素、芝麻素和萘普生綜合考量所取，以實現(xiàn)配伍后既不與雙香豆素藥理相克，也不與魚腥草素、芝麻素和萘普生相克?？梢源_定的是，雙香豆素與魚腥草素、芝麻素和萘普生的配伍、或者與上述多種中藥組分的配伍在本領(lǐng)域中是前所未有的，具有開拓性地。此外，退一步而言，通過實驗證明，雙香豆素與上述的藥物組分特定結(jié)合后對于卵巢癌的治療起到了預料不到的技術(shù)效果。

在上述方案的基礎(chǔ)之上，為了實現(xiàn)本發(fā)明藥物制劑的制備，所述藥物組合物還包括填充劑8-11份、ph調(diào)節(jié)劑2-3份(根據(jù)劑型可適當選取)和穩(wěn)定劑4-8份；其中，所述填充劑包括甘露醇、山梨醇或葡糖糖中的一種或多種；ph調(diào)節(jié)劑包括枸櫞酸、乳酸或碳酸氫鈉中的一種或多種；穩(wěn)定劑包括硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、精氨酸、谷氨酸或亞硫酸鈉中的一種或多種。

上述輔料的選取是基于主料藥物成分而定的，一方面可保證輔料加入后對藥物的成型過程起到關(guān)鍵幫助，此外還可確保其加入后對藥物的活性效果不帶來損害。

另外，本發(fā)明還提供了一種實現(xiàn)上述藥物組合物制備的方法，包括以下步驟：

1)、將老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼混合后置于質(zhì)量為混合藥材總量3-5倍量的水中煎煮0.8-1.5小時，得到水煎液和藥渣，將所述水煎液濃縮成浸膏，并將所述浸膏干燥后粉碎得到第一藥粉，將所述藥渣干燥后粉碎至60-80目的藥渣粉；

2)、將郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子混合后粉碎至60-80目，并與所述藥渣粉混合后加入至質(zhì)量為混合粉6-10倍且濃度為95％乙醇中，于80-90℃回流提取，得到醇提液，將所述醇提液濃縮干燥后粉碎，得到第二藥粉；

3)、分別將人工牛黃、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三藥粉；并將所述第三藥粉、第一藥粉和第二藥粉混合均勻后，超微粉碎至200-350目，得到微粉；

4)、將所述微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后制劑，得到藥物組合物。

上述的方法通過對不同屬性藥物進行針對性的處理(如對老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼采用以水提為主，醇提為輔；郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子則以醇提為主)，通過提取(煎煮、醇提以及結(jié)合)、粉碎以及制劑等操作實現(xiàn)了上述特定配伍關(guān)系的藥物組合物的制備。另外，該制備方法中，對于制備流程以及工藝參數(shù)的限定都是基于藥物原料的特定組分而特定選擇的，若工藝參數(shù)稍有不當，則對整個藥物組合物的藥物影響至關(guān)重要，需要說明的是，在步驟1)中，對于煎煮后所得的藥渣，進行特定目數(shù)要求地粉碎，后與步驟2)中的原料一起進行醇提的操作，可以保證藥物成分提供完全，并且還發(fā)現(xiàn)該操作易于使得郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子等活性成分更加完全地被提取。

此外，超微粉碎不但可以保證所得微粉的制劑需求，還可以進一步地保證所得2種活性粉末中的活性成分不受損害。

優(yōu)選的，在步驟4)中，具體包括：將微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后，加入甘露醇、精氨酸以及微晶纖維素，制成膠囊劑、顆粒劑或者片劑中的一種或多種。甘露醇、精氨酸以及微晶纖維素為本申請結(jié)合藥物原料而特定所限的輔料，便于形成膠囊劑、顆粒劑或者片劑等劑型。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)、提供了雙香豆素在制備用于治療和/或預防卵巢癌的藥物中的應用，通過探究雙香豆素和卵巢癌的關(guān)系從而為卵巢癌的治療或者預防提供了思路，同時也從新的角度解開雙香豆素在防治卵巢癌的機制，此外，還針對性地提供了一種不引起外周神經(jīng)毒性的pdk1抑制劑。

(2)、解開了雙香豆素治療卵巢癌的具體機制，即雙香豆素通過抑制卵巢癌細胞中pdk1活性進而使細胞p-pdh表達下降，并進一步地促進細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，增加了細胞內(nèi)活性氧簇，細胞內(nèi)活性氧簇的增加促使線粒體膜電勢降低并使得線粒體膜通透性下降、細胞色素c增加，增加了腫瘤細胞內(nèi)線粒體的凋亡，并導致卵巢癌細胞細胞凋亡，為卵巢癌的治療和預防提供了堅實的理論資料和臨床研究方向。

(3)、本發(fā)明以雙香豆素作為實現(xiàn)治療和/或預防卵巢癌的有效成分，并輔以中藥提取物以及魚腥草素、芝麻素和萘普生，從而制成不同的藥物制劑。其中，中藥原料的配伍合理，提取工藝得當，以該配伍關(guān)系以及特定制備工藝所獲得的藥物組合物對于卵巢癌具有非常明顯的治療效果。

附圖說明

圖1為雙香豆素對pdk1活性影響的檢測結(jié)果圖；

圖2為mtt方法檢測雙香豆素對卵巢癌細胞skov3活力影響結(jié)果圖；

圖3為免疫印跡法檢測雙香豆素對pdk1活性影響的結(jié)果圖；

圖4-圖5為ocr/ecar檢測雙香豆素對skov3細胞的氧耗及胞外酸化率的影響的結(jié)果圖；

圖6-圖7為葡萄糖及乳酸定量實驗檢測雙香豆素對skov3代謝影響的結(jié)果圖；

圖8-圖10為流式細胞術(shù)檢測雙香豆素對skov3線粒體膜電勢、ros的水平影響的結(jié)果圖；

圖11-圖14為雙香豆素對腫瘤生長的影響以及抑制異種移植物pdk1活性的檢測結(jié)果圖；

圖15-圖16為免疫組化tunel實驗探究雙香豆素抑制腫瘤生長以及通過降低p-pdh表達量反映雙香豆素可以抑制pdk1活性的檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明制備廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明提供了一種雙香豆素在制備用于治療和/或預防卵巢癌的藥物中的應用，通過探究雙香豆素和卵巢癌的關(guān)系從而為卵巢癌的治療或者預防提供了思路，同時也從新的角度解開雙香豆素在防治卵巢癌的機制。本申請中，雙香豆素是通過作為pdk1的抑制劑實現(xiàn)在制備治療和/或預防卵巢癌的藥物中的應用的。更具體的，雙香豆素通過抑制卵巢癌細胞中pdk1活性進而使細胞p-pdh表達下降，并進一步地促進細胞內(nèi)三羧酸循環(huán)，增加了細胞內(nèi)活性氧簇，細胞內(nèi)活性氧簇的增加促使線粒體膜電勢降低并使得線粒體膜通透性下降、細胞色素c增加，增加了腫瘤細胞內(nèi)線粒體的凋亡，并導致卵巢癌細胞細胞凋亡。

另外，本申請還提供了一種pdk1的抑制劑，該抑制劑是雙香豆素和/或雙香豆素類化合物，此外，本申請還提供了一種用于預防和/或治療卵巢癌的藥物組合物，藥物的活性成分包括雙香豆素和/或雙香豆素類化合物；該藥物包括雙香豆素和/或雙香豆素類化合物以及藥學上可接受的輔料。

作為一種實現(xiàn)方式，該藥物組合物以重量分數(shù)計，包括雙香豆素50-70份、老牛揣10-40份、火炭母草根25-35份、蜘蛛果20-35份、人工牛黃11-24份、血竭1-5份、人參3-10份、清半夏10-15份、厚樸10-12份、枳殼15-40份、郁金22-35份、茸毛木藍11-24份、川芎2-4份、白蠟樹子10-20份、魚腥草素2-8份、芝麻素6-12份和萘普生15-20份。更進一步地，所述的藥物組合物還包括填充劑8-11份、ph調(diào)節(jié)劑2-3份和穩(wěn)定劑4-8份；其中，所述填充劑包括甘露醇、山梨醇或葡糖糖中的一種或多種；所述ph調(diào)節(jié)劑包括枸櫞酸、乳酸或碳酸氫鈉中的一種或多種；所述穩(wěn)定劑包括硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、精氨酸、谷氨酸或亞硫酸鈉中的一種或多種。

本發(fā)明藥物組合物的制備方法，包括以下步驟：

將老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼混合后置于質(zhì)量為混合藥材總量3-5倍量的水中煎煮0.8-1.5小時，得到水煎液和藥渣，將所述水煎液濃縮成浸膏，并將所述浸膏干燥后粉碎得到第一藥粉，將所述藥渣干燥后粉碎至60-80目的藥渣粉；

將郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子混合后粉碎至60-80目，并與所述藥渣粉混合后加入至質(zhì)量為混合粉(具體為藥渣粉和郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子組成的混合粉)6-10倍且濃度為95％乙醇中，于80-90℃回流提取，得到醇提液，將所述醇提液濃縮干燥后粉碎，得到第二藥粉；

分別將人工牛黃、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三藥粉；并將所述第三藥粉、第一藥粉和第二藥粉混合均勻后，超微粉碎至200-350目，得到微粉；

將所述微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后制劑，得到藥物組合物。

接下來，本發(fā)明基于雙香豆素、以其為有效成分制成的藥物給出以下具體實施例，另外需要說明的是，本申請所提及的雙香豆素購于上海源葉生物科技有限公司。

實施例1

雙香豆素對pdk1活性的影響的檢測

s11：從abcam購買p-pdha1elisa試劑盒及pdk1活性酶。

s12：按照說明書準備試劑(incubation,washbuffer)，收集、裂解并定量skov3細胞。

s13：將定量后的蛋白加入到96孔板中，250mg/50μl/well，蓋上蓋子，室溫孵育2h(96孔板離心機，300rpm)，吸掉液體，洗2次(300μl1*washbuffer)，最后一次吸掉液體后將其倒扣在干凈的紙上去除殘余液體。

s14：準備磷酸化溶液以及pdk1加入；

在干凈的50ml離心管中加入22ml1*washbuffer,mgcl2(1mm)，atp(2mm)。根據(jù)實驗組的設(shè)計加入pdk1。(在含有200μl磷酸化溶液的ep管中孵育pdk12μg/well，dca50mm+pdk12μg/well，dmso2％+pdk12μg/well，雙香豆素100μm+pdk12μg/well，雙香豆素200μm+pdk12μg/well)，ep管在30℃水浴鍋中孵育1h。

s15：將預熱好的藥物混合物加入到96孔板，200μl/well，每個組設(shè)置3個副孔，孵育10min，30℃(96孔板離心機300rpm)，吸掉液體，洗2次。

s16：50μl1*detector抗體(用1*incubation配好的)孵育1h，室溫(300rpm)，吸掉液體，洗2次。

s17：50μl1*hrp標記的二抗(用1*incubation配好的)孵育1h，室溫(300rpm)，吸掉液體，洗2次。加入100μltmb，呈藍色；再加入100μl(1mol/lhci)，呈棕黃色，終止后測od450nm。

檢測結(jié)果如圖1所示，發(fā)現(xiàn)雙香豆素對pdk1活性起到了一定的影響。

實施例2

mtt方法檢測雙香豆素對卵巢癌細胞skov3活力的影響

s21：將對數(shù)生長期skov3細胞進行消化處理，細胞計數(shù)。

s22：取96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入100μl含有8×10³細胞的細胞懸液，設(shè)空白調(diào)零組每孔只加入100μl不含細胞的培養(yǎng)液。37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)。細胞融合度80％時進行加藥處理細胞。

s23：藥物處理細胞；

對照組：含有10％fbs的1640細胞培養(yǎng)液100μl/孔；

實驗組：單加雙香豆素組-藥物濃度800μm、400μm、200μm、100μm、50μm、25μm、12.5μm、6.25μm、3.125μm、1.5625μm，進行倍比稀釋；終體積均為100μl/孔；每組設(shè)5個復孔，37℃、5％co2孵箱中培養(yǎng)24h。

s24：加入濃度為10mg/ml的mtt液體10μl/孔，繼續(xù)孵育4h，小心棄掉培養(yǎng)液每孔加入150μldmso，在振蕩器上震蕩5min，讓顆粒充分溶解。

s25：利用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測od570nm處各孔的吸光值，記錄結(jié)果；吸光度值同細胞生存率成正比，以藥物劑量為橫坐標、吸光度值為縱坐標，計算細胞存活率。

檢測結(jié)果如圖2所示，發(fā)現(xiàn)隨著雙香豆素添加量的遞增，卵巢癌細胞skov3活力明顯受到影響。

實施例3

免疫印跡法檢測雙香豆素對pdk1活性的影響

s31：樣本制備；

每次上樣蛋白質(zhì)量為50μg，根據(jù)蛋白質(zhì)濃度計算出每次上樣需要的蛋白體積。每次上樣終體積為15μl，5×loadingbuffer：(蛋白質(zhì)體積+補充雙蒸水體積)＝1:4，稀釋樣品，為方便使用、減少誤差，每次制備出8次所需樣本?；旌虾脴颖局?，95℃水浴，10min；37℃水浴，10min。樣本保存于-20℃。

s32：配膠；根據(jù)配方分別制備相應分離膠、濃縮膠。

s33：電泳；上層濃縮膠100v，25-30min，下層分離膠200v，30-60min，待溴酚藍指示劑到達膠底部為佳，適當延長或者縮短時間。

s34：切膠和轉(zhuǎn)膜；

根據(jù)待檢測蛋白的分子量將分離膠切割，利用濕式轉(zhuǎn)膜儀，將膠與pvdf膜、上下各3層濾紙、海綿相疊加，250mm，40-90min不等，轉(zhuǎn)膜時間由蛋白分子量決定，分子量小的蛋白轉(zhuǎn)膜時間適當縮短、分子量大的蛋白轉(zhuǎn)膜時間適當延長。

s35：封閉；

轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜放入10％脫脂奶粉中，水平搖床室溫封閉1h。

s36：一抗孵育；

封閉結(jié)束后用pbst洗膜3次，每次10min；加入按比例稀釋一抗，4℃過夜(或水平搖床室溫1.5h)。

s37：二抗孵育；

一抗孵育結(jié)束后用pbst輕柔洗膜3次，每次10min；加入按比例稀釋好的、與一抗相對應的二抗，置于水平搖床，室溫孵1.5-2h。

s38：顯色；

二抗孵育結(jié)束后將膜用pbst洗膜3次，每次10min；按比例配置ecl發(fā)光試劑、增強型化學發(fā)光液孵育膜2min，利用ecl發(fā)光儀顯影分析系統(tǒng)進行顯色，保存圖像，利用灰度值分析軟件imagej進行統(tǒng)計分析。

檢測結(jié)果如圖3所示，通過圖3可以看出，雙香豆素可以抑制pdk1的活性，并促進skov3細胞凋亡。

實施例4

ocr/ecar檢測雙香豆素對skov3細胞的氧耗及胞外酸化率的影響

s41：將處于對數(shù)生長期skov3細胞接種于細胞培養(yǎng)板中，接種密度為8×10⁴個/孔；10％fbs+rpmi-1640培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)。

s42：第二天將不同濃度雙香豆素、陽性對照(dca)、溶劑對照(dmso2％)與探針(mito-xpress或ph-xtra)預熱混合后加入到96孔板中，設(shè)置3個復孔。

s43：用多功能酶標儀測時間分辨熒光強度，計算斜率。以斜率為縱坐標，繪制柱形圖。

結(jié)果如圖4和5所示，發(fā)現(xiàn)雙香豆素可以將腫瘤細胞skov3的糖代謝方式從有氧糖酵解逆轉(zhuǎn)為有氧氧化。

實施例5

葡萄糖及乳酸定量實驗檢測雙香豆素對skov3代謝的影響

s51：將處于對數(shù)生長期細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，接種密度為4×10⁵個/孔。10％fbs+rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，至融合率80％后，收集con組的培養(yǎng)液于ep管中，收集con組細胞；其他5個孔不同濃度雙香豆素，陽性對照，溶劑對照處理24h，實驗重復3次。

s52：收集其余5個孔的培養(yǎng)液濃度并收集藥物處理后的細胞。

s53：將收集的培養(yǎng)液按照試劑盒說明書進行操作，并用酶標儀測od505(葡萄糖)和od530(乳酸)。

s54：將收集好的細胞裂解并定量蛋白，用蛋白量標準化測得的od值。

結(jié)果如圖6和7所示，發(fā)現(xiàn)雙香豆素促進skov3細胞攝糖量增加，乳酸生成減少。

實施例6

流式細胞術(shù)檢測雙香豆素對skov3線粒體膜電勢、ros水平

s61：將處于對數(shù)生長期細胞接種于6孔板中，接種密度為4×10⁵個/孔，10％fbs+rpmi-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，至融合率80％后雙香豆素處理24h。

s62：收集細胞；

收集培養(yǎng)液，利用不含edta的胰酶消化細胞，密切觀察消化狀態(tài)，切勿過度消化，利用培養(yǎng)液終止消化，輕柔吹打，吹打次數(shù)不宜過多，細胞懸液離心800rpm，5min。

s63：棄上清，預冷的pbs洗滌細胞2次，手彈重懸，相同條件離心棄上清。

s64：每個樣品加入1×jc-1染色液或1×mitosox染色液，顛倒混勻數(shù)次，37℃避光孵育30min。

s65：離心棄上清后，超純水洗2遍，繼續(xù)離心棄上清，培養(yǎng)液重懸，用流式細胞術(shù)檢測。

檢測結(jié)果如圖8-10所示，發(fā)現(xiàn)雙香豆素可使skov3細胞線粒體膜電勢降低，線粒體ros升高，促進細胞凋亡。

實施例7

裸鼠皮下成瘤實驗檢測雙香豆素對腫瘤生長的影響以及雙香豆素通過抑制異種移植物pdk1活性，抑制腫瘤生長的檢測過程

s71：25只balb/c雌性(6-8)周裸鼠(14-16g)隨機分為每組5只，收集skov3細胞按1×10⁷/ml/只，2ml/只皮下植入到裸鼠背部。

s72：在裸鼠皮下成瘤體積達到100mm³(s＝1/2ab²，a為最長軸，b為垂直最長軸的軸，單位均為mm)的時候，腹腔注射藥物?？瞻捉Mnacl，陽性對照組dca，溶劑對照組naoh，實驗組分為雙香豆素50mg/kg，30mg/kg。隔天給藥一次，一次2ml。隔天稱體重一次，量體積一次。

s73：12天后用頸椎脫臼法處死裸鼠。將取下的腫瘤組織分為3部分，1部分用于western，1份用于免疫組化，另一部分備用。

檢測結(jié)果如圖11-圖14所示，發(fā)現(xiàn)雙香豆素可以抑制異種移植物pdk1活性，抑制腫瘤生長。

實施例8

免疫組化tunel實驗探究雙香豆素抑制腫瘤生長,促使p-pdh表達量降低并反映雙香豆素可以抑制pdk1活性的檢測過程

s81：常規(guī)程序制備石蠟組織塊和5mm厚石蠟組織切片。

s82：然后按照tunel原位細胞凋亡檢測試劑盒的標準步驟進行tunel染色。

s83：對于石蠟切片：

a.二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘，90％乙醇2分鐘，70％乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。

b.滴加20μg/ml不含dnase的蛋白酶k，20-37℃作用15-30分鐘

c.用pbs洗滌3次。

d.在用pbs配制的3％過氧化氫溶液(3％h2o2inpbs)中室溫孵育10分鐘，以滅活切片內(nèi)源的過氧化物酶。隨后用pbs洗滌3次

s84：tunel液或p-pdh一抗孵，相應二抗孵育，dab顯色后光學顯微鏡拍照計數(shù)陽性細胞。

檢測結(jié)果如圖15-16所示，可以看出，免疫組化tunel實驗發(fā)現(xiàn)雙香豆素可以抑制腫瘤生長，p-pdh表達量降低反映了雙香豆素可以抑制pdk1活性。

另外，下述實施例9-13為以雙香豆素為活性成分的用于治療卵巢癌的中藥組合物及其具體制備方法的舉例。

實施例9

中藥組合物的原料配伍關(guān)系如下：

雙香豆素50份、老牛揣10份、火炭母草根25份、蜘蛛果20份、人工牛黃12份、血竭1份、人參3份、清半夏10份、厚樸10份、枳殼20份、郁金25份、茸毛木藍18份、川芎2份、白蠟樹子10份、魚腥草素2份、芝麻素6份和萘普生15份。

制備方法如下：

s91：將老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼混合后置于質(zhì)量為混合藥材總量3倍量的水中煎煮1-1.5小時，得到水煎液和藥渣，將所述水煎液濃縮成浸膏，并將所述浸膏干燥后粉碎得到第一藥粉，將所述藥渣干燥后粉碎至80目的藥渣粉；

s92：將郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子混合后粉碎至80目，并與所述藥渣粉混合后加入至質(zhì)量為混合粉8倍且濃度為95％乙醇中，于85℃回流提取，得到醇提液，將所述醇提液濃縮干燥后粉碎，得到第二藥粉；

s93：分別將人工牛黃、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三藥粉；并將所述第三藥粉、第一藥粉和第二藥粉混合均勻后，超微粉碎至250目，得到微粉；

s94：將所述微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后制劑，得到藥物組合物。

實施例10

中藥組合物的原料配伍關(guān)系如下：

雙香豆素60份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黃20份、血竭3份、人參7份、清半夏12份、厚樸12份、枳殼35份、郁金30份、茸毛木藍20份、川芎3份、白蠟樹子15份、魚腥草素5份、芝麻素9份和萘普生17份。

制備方法如下：

s101：將老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼混合后置于質(zhì)量為混合藥材總量4倍量的水中煎煮1.5小時，得到水煎液和藥渣，將所述水煎液濃縮成浸膏，并將所述浸膏干燥后粉碎得到第一藥粉，將所述藥渣干燥后粉碎至60目的藥渣粉；

s102：將郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子混合后粉碎至70目，并與所述藥渣粉混合后加入至質(zhì)量為混合粉7倍且濃度為95％乙醇中，于90-回流提取，得到醇提液，將所述醇提液濃縮干燥后粉碎，得到第二藥粉；

s103：分別將人工牛黃、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三藥粉；并將所述第三藥粉、第一藥粉和第二藥粉混合均勻后，超微粉碎至300目，得到微粉；

s104：將所述微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后制劑，得到藥物組合物。

實施例11

中藥組合物的原料配伍關(guān)系如下：

雙香豆素70份、老牛揣40份、火炭母草根35份、蜘蛛果35份、人工牛黃24份、血竭5份、人參10份、清半夏15份、厚樸10-12份、枳殼40份、郁金35份、茸毛木藍24份、川芎4份、白蠟樹子20份、魚腥草素8份、芝麻素12份和萘普生20份。

制備方法如下：

s111：將老牛揣、火炭母草根、人參、清半夏、厚樸和枳殼混合后置于質(zhì)量為混合藥材總量5倍量的水中煎煮1-1.2小時，得到水煎液和藥渣，將所述水煎液濃縮成浸膏，并將所述浸膏干燥后粉碎得到第一藥粉，將所述藥渣干燥后粉碎至80目的藥渣粉；

s112:將郁金、茸毛木藍、川芎和白蠟樹子混合后粉碎至80目，并與所述藥渣粉混合后加入至質(zhì)量為混合粉6-10倍且濃度為95％乙醇中，于90-回流提取，得到醇提液，將所述醇提液濃縮干燥后粉碎，得到第二藥粉；

s113：分別將人工牛黃、血竭和蜘蛛果粉碎后混合，得到第三藥粉；并將所述第三藥粉、第一藥粉和第二藥粉混合均勻后，超微粉碎至350目，得到微粉；

s114：將所述微粉與雙香豆素、魚腥草素、芝麻素和萘普生混合后制劑，得到藥物組合物。

實施例12

雙香豆素60份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黃20份、血竭3份、人參7份、清半夏12份、厚樸12份、枳殼35份、郁金30份、茸毛木藍20份、川芎3份、白蠟樹子15份、魚腥草素5份、芝麻素9份、萘普生17份、填充劑10份和穩(wěn)定劑6份。

制備方法同實施例10，區(qū)別僅在于在制劑的過程加入了以等重量的甘露醇與山梨醇組成的填充劑和以等質(zhì)量的精氨酸與微晶纖維素組成的穩(wěn)定劑。

對比例1

老牛揣10份、火炭母草根25份、蜘蛛果20份、人工牛黃12份、血竭1份、人參3份、清半夏10份、厚樸10份、枳殼20份、郁金25份、茸毛木藍18份、川芎2份、白蠟樹子10份、魚腥草素2份、芝麻素6份和萘普生15份。

制備方法：基于上述的配伍關(guān)系參照同實施例9相同的方法制成相同的劑型。

對比例2

雙香豆素10份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、人工牛黃20份、血竭3份、人參7份、清半夏12份、厚樸12份、枳殼35份、郁金30份、茸毛木藍20份、川芎3份、魚腥草素5份、芝麻素9份和萘普生17份。

制備方法如下：基于上述的配伍關(guān)系參照同實施例10相同的方法制成相同的劑型。

對比例3

雙香豆素50份、老牛揣25份、火炭母草根30份、蜘蛛果30份、厚樸12份、枳殼35份、郁金30份、茸毛木藍20份、川芎3份、魚腥草素5份和萘普生17份。

制備方法如下：基于上述的配伍關(guān)系參照同實施例10相同的方法制成相同的劑型。

試驗例

將本發(fā)明實施例9-12以及對比例1-3所制成的粉末制劑，以200mg/kg的給藥劑量對實驗組小鼠(即模型組小鼠，每個模型組設(shè)置多個平行)進行給藥，每天持續(xù)給藥2次，共計給藥20天，檢測小鼠腫瘤大小變化情況，結(jié)果如下表1所示：

其中，模型組小鼠按照以下方法構(gòu)建：收集skov3細胞按1×10⁷/ml/只，2ml/只皮下植入到裸鼠背部，在裸鼠皮下成瘤體積達到100mm³(s＝1/2ab²，a為最長軸，b為垂直最長軸的軸，單位均為mm)的時候，模型構(gòu)建成功。

表1實施例9-12以及對比例1-3的制劑對小鼠腫瘤大小影響的檢測結(jié)果

綜上，本發(fā)明為雙香豆素提供了一種新的用途，即作為pdk1的新型抑制劑從而實現(xiàn)了其在治療/預防卵巢癌方面的應用，此外，本發(fā)明還以雙香豆素為出發(fā)點提供了用于治療/預防卵巢癌的新型藥物組合物，以實現(xiàn)治療和/或預防卵巢癌的同時，不會引起外周神經(jīng)毒性。該雙香豆素的用途以及含有雙香豆素的藥物為卵巢癌的預防或治療具有重大的醫(yī)學價值。

盡管已用具體實施例來說明和描述了本發(fā)明，然而應意識到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。