本申請是申請?zhí)枮?01180030974.9的中國專利申請的分案申請，原申請是2011年5月6日提交的pct國際申請pct/us2011/035651于2012年12月21日進入中國國家階段的申請。

相關申請

依據(jù)美國法典第35編第119(e)節(jié)，本申請要求于20010年5月6日提交的美國臨時專利申請序列號61/332,124的優(yōu)先權，其整體通過引用并入本文。

關于聯(lián)邦政府資助研發(fā)的聲明

本發(fā)明在nih授予的ca109345和美國陸軍醫(yī)學研究和材料司令部授予的w81xwh-08-1-0478的政府支持下完成。政府享有本發(fā)明的一些權利。

本發(fā)明的領域是涉及類視黃醇受體選擇性通路的方法和組合物。

背景技術：

非甾體抗炎藥(nonsteroidalanti-inflammatorydrugs，nsaid)的抗癌作用是公認的(tegeder，i.等，fasebj15(12)，2057-2072(2001)；kashfi，k.&rigas，b.，biochempharmacol70(7)，969-986(2005))。nsaid通過抑制環(huán)氧合酶(cox-1和cox-2)阻斷類花生酸產生。自從發(fā)現(xiàn)定期使用阿司匹林降低結腸癌發(fā)生率以后，nsaid作為理想的癌癥化學預防劑就受到了重點關注。遺憾的是，伴隨出現(xiàn)的副作用(包括已知與cox-2抑制有關的威脅生命的心血管并發(fā)癥)使得nsaid的理想抗癌作用黯然失色。盡管cox-2與致癌作用之間有聯(lián)系，但是nsaid誘導既不包含cox-1也不包含cox-2的癌細胞的凋亡，這表明存在另外的細胞內靶點(tegeder，i.等，fasebj15(12)，2057-2072(2001)；kashfi，k.&rigas，b.，biochempharmacol70(7)，969-986(2005))。

技術實現(xiàn)要素：

實施方案涉及有關類視黃醇受體選擇性通路的方法和組合物。在一些實施方案中，該通路靶向操縱腫瘤微環(huán)境。在一個實施方案中，提供了在癌細胞中誘導凋亡的方法。例如，可以提供用于預防或治療癌癥的組合物，例如本文所述的式(ii)的化合物。在一些實施方案中，本文所述的包含化合物k-80003或k-80003類似物的組合物被用于治療癌癥。

如本文所示，舒林酸硫化物(sulindacsulfide)(下文中為“舒林酸”或“舒林酸硫化物”)與化合物rxrα以臨床相關濃度結合并且以rxrα依賴性方式誘導凋亡，從而證明rxrα是舒林酸作用的細胞內靶點。還如本文所示，舒林酸強烈抑制癌細胞中的關鍵存活激酶akt(蛋白激酶b)的活化。此外，n-端截短的rxrα(trxrα)表現(xiàn)出調節(jié)癌細胞中的存活信號。如本文所述，當與tnfα組合時，舒林酸抑制tnfα誘導的trxrα/p85α相互作用，引起死亡受體介導的凋亡通路活化。此外，如本文所述設計并合成的舒林酸類似物k-80003表現(xiàn)出增加的與rxrα的親和力并且無cox抑制活性，而且在抑制動物的trxrα依賴性akt活化和trxrα腫瘤生長方面顯示出增強的功效。

本文描述了用于癌癥治療的靶向凋亡通路的舒林酸衍生的rxrα配體。在一個實施方案中，提供了在癌細胞中誘導凋亡的方法，其包括：上調癌細胞中的腫瘤壞死因子-α(tnfα)活性，從而使癌細胞對akt抑制敏感；以及使敏化的癌細胞與化合物相接觸，其中已知所述化合物與類視黃醇x受體-α(rxrα)相互作用，并且其中已知所述化合物以環(huán)氧合酶-2(cox-2)通路非依賴性方式抑制蛋白激酶b(akt)的活性。在本實施方案的一個方面中，上調tnfα活性包括將外源性tnfα引入癌細胞。在本實施方案的另一方面中，上調tnfα活性包括上調癌細胞中的內源性tnfα。在本實施方案的又一方面中，癌細胞是選自以下的癌細胞：肺癌細胞、乳癌細胞、前列腺癌細胞、肝癌細胞和結腸癌細胞。在本實施方案的又一方面中，癌細胞是選自以下的癌細胞：a549細胞、h460細胞、zr-75-1細胞、mcf-7細胞、lncap細胞、pc3細胞、hepg2細胞、caco2細胞和sw480細胞。在本實施方案的又一方面中，候選化合物是舒林酸的類似物，并且其中所述類似物表現(xiàn)出至少一種選自以下的特性：與rxrα結合時ic50小于舒林酸的ic50和與cox-2結合時ic50大于舒林酸的ic50。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是選自以下的化合物：k-80001、k-80002、k-80003、k-80004和k-80005。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是k-80003。

在另一個實施方案中，提供了一種篩選能夠在癌細胞中誘導凋亡的候選化合物的方法，其包括：向癌細胞提供候選化合物；和確定候選化合物是否能夠具有至少一種選自以下的活性：在癌細胞中抑制akt活性、活化胱天蛋白酶-8、活化bax、抑制cflip和降解bid。在本實施方案的一個方面中，確定候選化合物是否能夠抑制akt活性包括：通過用全反式視黃酸(全反式-retinoicacid，atra)或9-順式-ra對癌細胞進行預處理；并且在施用候選化合物之后測量癌細胞中akt水平的變化。

在又一個實施方案中，提供了一種篩選能夠在細胞中誘導凋亡的候選化合物的方法，其包括：向細胞提供候選化合物；以及確定候選化合物是否能夠選擇性地與截短的rxrα(trxrα)蛋白結合。在本實施方案的一個方面中，候選化合物是選自以下的化合物：肽、蛋白質、核酸和小分子。

在又一個實施方案中，提供了篩選能夠在細胞中誘導凋亡的候選化合物的方法，其包括：向細胞提供候選化合物；以及確定候選化合物是否能夠調節(jié)trxrα蛋白。在本實施方案的一個方面中，候選化合物是選自以下的化合物：肽、蛋白質、核酸和小分子。在本實施方案的另一方面中，確定候選化合物是否能夠調節(jié)trxrα蛋白包括確定候選化合物是否能夠防止trxrα與p85α蛋白結合。在本實施方案的又一方面中，確定候選化合物是否能夠調節(jié)trxra蛋白包括確定候選化合物是否能夠防止rxrα經歷蛋白質修飾。在本實施方案的又一方面中，所述蛋白質修飾包括磷酸化。在本實施方案的又一方面中，確定候選化合物是否能夠調節(jié)trxrα蛋白包括確定候選化合物是否能夠防止trxrα蛋白從細胞核遷移至細胞質。

在又一個實施方案中，提供了一種篩選能夠在細胞中誘導凋亡的候選化合物的方法，其包括：鑒定表達trxrα的細胞；使細胞與候選化合物相接觸；以及確定候選化合物是否誘導細胞凋亡。在本實施方案的一個方面中，所述候選化合物是選自以下的化合物：肽、蛋白質、核酸和小分子。在本實施方案的另一方面中，所述候選化合物是來自小分子文庫的化合物。在本實施方案的又一方面中，所述候選化合物是來自肽文庫的化合物。在本實施方案的又一方面中，所述細胞來自乳房或肝。

在又一個實施方案中，提供了一種篩選能夠抑制腫瘤生長的候選化合物的方法，其包括：鑒定表達trxrα的腫瘤；使腫瘤與候選化合物相接觸；以及確定候選化合物是否抑制腫瘤生長。在本實施方案的一個方面中，所述候選化合物是選自以下的化合物：肽、蛋白質、核酸和小分子。在本實施方案的另一方面中，所述候選化合物是來自小分子文庫的化合物。在本實施方案的又一方面中，所述候選化合物是來自肽文庫的化合物。在本實施方案的又一方面中，所述腫瘤是乳房或肝的腫瘤。

在又一個實施方案中，提供了一種預防對象癌癥的方法，其包括：鑒定相對于一般人群具有升高的癌癥風險的對象；并且向對象提供抑制akt活性的物質，其中所述物質與對象細胞表面上的rxrα的結合導致了akt活性的抑制。在本實施方案的一個方面中，所述方法還包括在施用所述物質之前向對象施用tnfα，從而使對象的癌細胞對所述物質的akt抑制敏感。在本實施方案的另一方面中，所述物質是舒林酸的類似物。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是選自以下的化合物：k-80001、k-80002、k-80003、k-80004和k-80005。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是k-80003。

在又一個實施方案中，提供了一種治療哺乳動物癌癥的方法，其包括：鑒定患有癌癥的哺乳動物，并且向哺乳動物提供治療有效量的物質，所述物質已知以環(huán)氧合酶-2(cox-2)通路非依賴性方式抑制akt活性。在本實施方案的一個方面中，所述方法還包括在施用所述物質之前向哺乳動物施用tnfα，從而使哺乳動物的癌細胞對所述物質的akt抑制敏感。在本實施方案的另一方面中，所述物質是舒林酸的類似物。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是選自以下的化合物：k-80001、k-80002、k-80003、k-80004和k-80005。在本實施方案的又一方面中，所述類似物是k-80003。在本實施方案的又一方面中，所述哺乳動物是人。

在又一個實施方案中，提供了一種預防或治療哺乳動物癌癥的方法，其包括向有此需要的哺乳動物施用包含式(i)化合物的組合物，其中a為芳基或雜芳基，并且其中a可任選地被r3和0、1或2個r4取代；其中b為芳基或雜芳基，并且其中b可任選地被0、1或2個r4取代；其中r1為(cr5r6)ncooh；其中r2選自h、c1-10烷基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、鹵烷基、烷基o、烷基s和鹵烷基o；其中r3和r4獨立地選自h、c1-10烷基、鹵烷基、鹵素、cn、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基o、烷基s、(cr4r6)nconr7r8、oh、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基o和烷氧基烷基；其中r5和r6：獨立地選自h、c1-7烷基、oh、烷氧基、環(huán)烷基；或者一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)基；并且其中n為0、1、2或3。

在又一個實施方案中，提供了一種預防或治療哺乳動物癌癥的方法，其包括向有此需要的哺乳動物施用包含式(ii)化合物的組合物，其中所述化合物表現(xiàn)出至少一種選自以下的特性：與rxrα結合時ic50小于舒林酸的ic50和與cox-2結合時ic50大于舒林酸的ic50。在本實施方案的一個方面中，r1選自ch2cooh和ch2ch2cooh；其中r2選自ch3和h；并且其中r3選自4-sch3、4-ch3、4-ch2ch3和4-ch(ch3)2。

在又一個實施方案中，提供了一種篩選能夠以rxrα-選擇性方式在癌細胞中誘導凋亡的候選化合物的方法，其包括：向癌細胞提供候選化合物；以及確定候選化合物是否能夠在癌細胞中與rxrα結合并且不抑制cox-2活性。在本實施方案的一個方面中，確定候選化合物是否能夠與rxrα結合包括檢測癌細胞中rxrα對胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)消化的敏感性改變。在本實施方案的另一方面中，確定候選化合物是否能夠與rxrα結合包括檢測癌細胞中差示掃描量熱法(differentialscanningcalorimetry，dsc)特征的改變。

在又一個實施方案中，提供了包含式(i)化合物的組合物，其中a為芳基或雜芳基，并且其中a可任選地被r3和0、1或2個r4取代；其中b為芳基或雜芳基，并且其中b可任選地被0、1或2個r4取代；其中r1為(cr5r6)ncooh；其中r2選自h、c1-10烷基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、鹵烷基、烷基o、烷基s和鹵烷基o；其中r3和r4獨立地選自h、c1-10烷基、鹵烷基、鹵素、cn、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基o、烷基s、(cr4r6)nconr7r8、oh、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基o和烷氧基烷基；其中r5和r6獨立地選自h、c1-7烷基、oh、烷氧基、環(huán)烷基；或者一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)基；并且其中n為0、1、2或3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(ii)化合物的組合物，其中所述組合物表現(xiàn)出至少一種選自以下的特性：與rxrα結合時ic50小于舒林酸的ic50和與cox-2結合時ic50大于舒林酸的ic50。

在又一個實施方案中，提供了包含式(ii)化合物的組合物，其中r1選自ch2cooh和ch2ch2cooh；其中r2選自ch3和h；并且其中r3選自4-sch3、4-ch3、4-ch2ch3和4-ch(ch3)2。在本實施方案的一個方面中，所述組合物選自k-80001、k-80002、k-80003、k-80004和k-80005。在本實施方案的又一方面中，所述組合物是k-80003。

在又一個實施方案中，提供了包含式(iii)化合物的組合物，其中r1選自ch3、f和cl；其中r2選自h、ch3、cl和f；并且其中r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(iv)化合物的組合物，其中r1選自ch3、f和cl；其中r2選自h、ch3、cl和f；并且其中r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(v)化合物的組合物，其中r1選自cooh、ch2ch2cooh、ch＝chcooh、ch2-四唑、ch2-ch2-四唑、ch2cooch3、ch3、ch2conh2、ch2conhch3、ch2oh、ch2ch2oh和ch2nh2；其中r2選自h、cl、ch2ch3、och3、nh2、nhch3、cf3、ch2nh2、ch2oh、ch2cl、ch(ch3)2和och2ch3；其中r3選自h、ch＝ch2、cch、c(ch3)3、cf3、oh、och3、och2ch3、nh2、nhch3、cn、nhcoch3、

并且其中r4選自h、cl、ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、och3、ochch3、nh2和nhch3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(iii)化合物的組合物，其中r1選自ch3、f和cl；r2選自h、ch3、cl和f；并且其中r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(iv)化合物的組合物，其中r1選自ch3、f和cl；其中r2選自h、ch3、cl和f；并且其中r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。

在又一個實施方案中，提供了包含式(v)化合物的組合物，其中r1選自cooh、ch2ch2cooh、ch＝chcooh、ch2-四唑、ch2-ch2-四唑、ch2cooch3、ch3、ch2conh2、ch2conhch3、ch2oh、ch2ch2oh和ch2nh2；其中r2選自h、cl、ch2ch3、och3、nh2、nhch3、cf3、ch2nh2、ch2oh、ch2cl、ch(ch3)2和och2ch3；其中r3選自h、ch＝ch2、cch、c(ch3)3、cf3、oh、och3、och2ch3、nh2、nhch3、cn、nhcoch3、

并且其中r4選自h、cl、ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、och3、ochch3、nh2和nhch3。

在又一個實施方案中，提供了包含舒林酸類似物的組合物，其中所述類似物表現(xiàn)出至少一種選自以下的特性：與rxrα結合時ic50小于舒林酸的ic50和與cox-2結合時ic50大于舒林酸的ic50。

在又一個實施方案中，提供了包含選自以下化合物的組合物：3-(4-氟苯基)-2-甲基丙烯酸、3-(4-氟苯基)-2-甲基丙酸、6-氟-2-甲基-2，3-二氫茚-1-酮、2-(6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸乙酯、(z)-2-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸、(z)-2-(3-(4-甲基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸、(z)-2-(3-(4-乙基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸、(z)-2-(3-(4-異丙基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸、2-(6-氟-3h-茚-1-基)乙酸乙酯、(e)-2-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-3h-茚-1-基)乙酸、螺(二氫-2(3h)呋喃酮-5-1’(2’h)(3’h)-6-氟-二氫化茚、3-(6-氟-3h-茚-1-基)丙酸甲酯、(e)-3-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-3h-茚-1-基)丙酸甲酯、k-80003類似物no.1、k-80003類似物no.2、k-80003類似物no.3、k-80003類似物no.4、k-80003類似物no.5、k-80003類似物no.6、k-80003類似物no.7、k-80003類似物no.8、k-80003類似物no.9、k-80003類似物no.10、k-80003類似物no.11、k-80003類似物no.12、k-80003類似物no.13、k-80003類似物no.14、k-80003類似物no.15、k-80003類似物no.16、k-80003類似物no.17、k-80003類似物no.18、k-80003類似物no.19、k-80003類似物no.20、k-80003類似物no.21、k-80003類似物no.22、k-80003類似物no.23、k-80003類似物no.24、k-80003類似物no.25、k-80003類似物no.26、k-80003類似物no.27、k-80003類似物no.28、k-80003類似物no.29、k-80003類似物no.30、k-80003類似物no.31、k-80003類似物no.32、k-80003類似物no.33、andk-80003類似物no.34。

附圖說明

圖1示出舒林酸與rxrα結合。(a)舒林酸與[³h]9-順式-ra或未標記的9-順式-ra孵育的rxrαlbd蛋白的結合。(b)如通過hplc分析所測定的，舒林酸與在穩(wěn)定表達rxrα、nur77或rarβ的hek293細胞中的rxrα的結合。(c)舒林酸所致的rxrαlbd或gst-rxrα對胰凝乳蛋白酶的敏感性改變。(d)在不存在和存在rxrαlbd或nur77蛋白的情況下舒林酸的¹⁹fnmr譜比較。如通過(trepal)2-tk-cat活性(zhang等，nature358，587-591(1992a))(e)或者βrare-tk-cat活性(zhang等，nature355，441-446(1992b))(f)所測定的，舒林酸抑制rxrα同二聚體和異二聚體的反式活化(transactivation)。

圖2示出舒林酸誘導rxrα依賴性凋亡和bax活化。如通過dapi染色(a)、parp切割(b)和dna片段化(c)所分析的舒林酸在f9或缺少rxrα的f9細胞(f9rxrα^-/-)中的凋亡作用。rxrαsirna抑制舒林酸誘導的凋亡。用舒林酸處理經對照或rxrαsirna(d)轉染的h460肺癌細胞并通過dapi染色分析凋亡(e)。(f)rxrα的轉染增強舒林酸的凋亡作用。用舒林酸處理經gfp-rxrα轉染的cv-1細胞并通過dapi染色分析。(g)破壞rxrαlbp削弱舒林酸的凋亡作用。用舒林酸處理經gfp-rxrα或gfp-rxrα/f313s/r316e轉染的cv-1細胞并通過dapi染色分析。評價經受體轉染的細胞中凋亡的得分。bax在凋亡誘導中的作用。用或者不用舒林酸處理hct116細胞或缺少bax的hct116細胞(bax^-/-)。通過parp切割(h)和dapi染色(i)測定凋亡。(j，k)rxrαsirna抑制舒林酸誘導的bax活化。通過免疫印跡揭示rxrαsirna所致的hct116細胞中的rxrα敲減(knockingdown)。用舒林酸處理經或者不經rxrαsirna或對照sirna轉染的hct116細胞，并且分析bax寡聚化(j)以及使用bax/δ21、bax/6a7或抗hsp60抗體通過免疫染色/共聚焦顯微鏡分析bax構象改變和線粒體靶向(k)。

圖3示出舒林酸抑制tnfα誘導的akt活化和trxrα-p85α相互作用。(a)舒林酸對akt活化的抑制。使hct116、sw480、hepg2、zr75-1、mcf-7、pc3、lncap、hacat和raw264.7細胞饑餓過夜并用舒林酸處理，通過免疫印跡分析akt活化。(b)rxrαsirna對基礎akt活化的抑制。用舒林酸處理經rxrαsirna轉染的hepg2細胞。通過免疫印跡對akt活化和rxrα表達進行分析。(c)舒林酸和rxrαsirna對tnfα誘導的akt活化的抑制。用舒林酸對經rxrα或對照sirna轉染的a549肺癌細胞進行預處理并暴露于tnfα。通過免疫印跡對akt活化和rxrα表達進行分析。(d)舒林酸和tnfα對akt活化的協(xié)同抑制。用舒林酸對zr-75-1和pc3細胞進行預處理并暴露于tnfα。通過免疫印跡對akt活化進行分析。(e)用于免疫共沉淀和免疫印跡測定的抗rxrα抗體的示意圖(上)。d20抗體識別n-端a/b結構域中的2-21位氨基酸，而δn197抗體識別c-端e/f結構域(下)。還示出約44kda的rxr截短蛋白。(f)多種癌細胞系中trxrα的表達。使用δn197rxrα抗體通過免疫印跡對用或者不用9-順式-ra處理的hct116、sw480、zr75-1、mcf-7、pc3、lncap、hepg2、hacat、caco2、mef、raw和bhk細胞系進行分析。

圖4示出trxrα在akt活化和非錨定依賴性細胞生長中的作用。(a)trxrα的細胞密度依賴性生產和akt活化。使用δn197抗體分析以不同細胞密度接種的mef的rxrα表達并通過免疫印跡分析akt活化。(b)在使用抗rxrα(δn197)進行免疫染色后通過共聚焦顯微鏡觀察mef中內源性rxrα的亞細胞定位。還通過dapi對細胞進行染色以觀察細胞核。(c)rxrα/1-134的穩(wěn)定表達誘導rxrα切割和akt活化。用9順式-ra對hela或穩(wěn)定表達rxrα/1-134的hela細胞進行處理并對akt活化和rxrα表達進行分析。(d)在軟瓊脂中hela/rxrα/1-134和hela細胞的生長。(e)舒林酸抑制hela/rxrα/1-134細胞的克隆性存活。(f)與腫瘤周圍組織和正常組織相比，人乳房(6個中的5個)或肝(6個中的4個)的腫瘤組織中trxrα的產生。(g)通過δn197抗體對肝腫瘤樣本中rxrα的胞質定位進行免疫染色。t：腫瘤組織；s：腫瘤周圍組織。

圖5示出n-端截短的rxrα在tnfα活化pi3k/akt及癌細胞生長中的作用。用經myc表位標記的flag-p85α和rxrα、rxrα/δ80、或rxrα/δ100對hek293t細胞進行轉染，經tnfα處理，并使用抗flag抗體通過免疫共沉淀進行分析。(b)rxrα的n-端a/b結構域與p85α相互作用。將flag-p85α與gfp-rxrα-1-134和gfp-rxrα-224-462一起共轉染到hek293t細胞中，并且使用抗flag抗體通過免疫共沉淀對其相互作用進行分析。(c)rxrα/δ80是有效的akt活化劑。正如免疫印跡測定經rxrα/δ80或rxrα/δ100轉染的hek293t、hela、a549和mcf-7細胞的akt活化。(d)rxrα/δ80和p85α的胞質共定位。將myc-rxrα/δ80和p85α共轉染到pc3和zr-75-1細胞系中，經抗myc和抗p85α抗體免疫染色，并且通過共聚焦顯微鏡顯示其亞細胞定位。(e)rxrα/δ80免疫沉淀物對pi3k的活化。用tnfα和/或舒林酸對經flag-p85α和myc-rxrα/δ80轉染的a549細胞進行處理，通過抗myc抗體免疫沉淀，并進行體外pi3k測定。(f)rxrα/δ80的穩(wěn)定表達。通過免疫印跡對經gfp-rxrα/δ80或對照gfp載體穩(wěn)定轉染的細胞進行分析。(g)rxrα/δ80促進癌細胞的克隆性存活。(h，i)rxrα/δ80促進裸鼠中的癌細胞生長。

圖6示出舒林酸活化tnfα誘導的外在凋亡通路。(a)舒林酸/tnfα組合對凋亡的協(xié)同誘導以及rxrα配體對其的抑制。用sr11237，然后用tnfα和/或舒林酸對在具有1％fbs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hepg2細胞進行處理，通過免疫印跡進行分析。(b)rxrαsirna對舒林酸/tnfα誘導的胱天蛋白酶-8切割的抑制。用tnfα和/或舒林酸對經對照或rxrαsirna轉染的hepg2細胞進行處理并且通過免疫印跡進行分析。胱天蛋白酶-8抑制劑(c)和sirna(d)對舒林酸/tnfα誘導的parp切割的抑制。用tnfα和舒林酸對經對照或胱天蛋白酶-8sirna轉染或經zietd-fmk預處理的hepg2細胞進行處理并且通過免疫印跡進行分析。(e)舒林酸和tnfα對bax的活化。用bax/6a7抗體對經tnfα和/或舒林酸處理的hepg2細胞進行免疫染色。(f)akt對舒林酸/tnfα誘導的胱天蛋白酶-8切割的調節(jié)。用tnfα和/或舒林酸對經ca-akt或dn-akt轉染的pc3細胞進行處理，并且通過免疫印跡進行分析。tnfα和舒林酸對胱天蛋白酶-8(g)和bax(h)的活化。用tnfα和舒林酸對經ca-akt轉染的hepg2細胞進行處理，并且用抗切割的胱天蛋白酶-8或bax/6a7抗體進行免疫染色。(i)tnfα和舒林酸對c-flip表達的調節(jié)。通過免疫印跡對經tnfα和/或舒林酸處理的細胞進行分析。

圖7示出rxrα-選擇性舒林酸類似物的設計、合成和評價。(a)參照9-順式-ra的舒林酸硫化物與rxrα之lbp的對接。配體中內的側鏈顯示為灰色。(b)對接的舒林酸硫化物與9-順式-ra、dha和bms649的晶體結構的取向和位置比較。(c)rxrα結合和舒林酸類似物對cox-1和cox-2活性的抑制。通過競爭性配體結合測定對rxrα結合進行測量。(d)舒林酸和類似物對pge2產生的抑制。用舒林酸或類似物對經tnfα刺激的a549細胞進行處理。(e)在不存在或存在rxrαlbd的情況下k-80003的¹⁹fnmr譜的比較。

圖8表明k-80003是rxrα-依賴性akt活化的強力抑制劑。(a)在tnfα存在下舒林酸或k-80003對akt活化的抑制。(b)k-80003對akt活化的rxrα依賴性抑制。用k-80003對經rxrα或rarγsirna轉染的pc3細胞進行預處理后暴露于tnfα(prxrα：磷酸化rxrα)。(c)舒林酸和k-80003對rxrα/δ80與p85α相互作用的抑制。在暴露于tnfα之前，用flag-p85α和myc-rxrα/δ80對a549細胞進行轉染，用舒林酸或k-80003進行處理，并且使用抗flag抗體通過免疫共沉淀進行分析。(d)舒林酸或k-80003在tnfα存在下對parp切割的誘導。用免疫印跡分析經tnfα和/或舒林酸或k-80003處理的zr-75-1細胞。(e)在tnfα存在下k-80003對胱天蛋白酶-8的活化。通過免疫印跡對經tnfα和/或k-80003處理的細胞進行分析。(f)舒林酸和k-80003對rxrα/1-134細胞和rxrα/δ80穩(wěn)定克隆的克隆性存活的抑制。(g)舒林酸和k-80003對動物中rxrα/δ80腫瘤生長的抑制。

圖9a-c與圖1有關并且示出舒林酸與rxrα的結合以及其對rxrα反式活化的作用。

圖10與圖1b有關并且示出通過hplc分析測定的舒林酸與rxrα蛋白的結合。

圖11a-d與圖2g有關并且示出rxrα突變體rxr/f313s/r316e介導舒林酸凋亡作用的削弱的能力。

圖12a-e與圖3有關并且示出舒林酸對akt活化和trxrα-p85α相互作用的抑制作用。

圖13與圖4b和5d有關并且示出使用細胞分級測定的trxrα的胞質定位。

圖14與圖4有關并且示出通過rxrα/1-134的穩(wěn)定表達產生內源性trxrα。

圖15a-b與圖5e有關并且示出trxrα在a549肺癌細胞中發(fā)生免疫沉淀物。

圖16a-d與圖6有關并且示出舒林酸誘導的凋亡通過死亡受體依賴性外在凋亡通路介導。

圖17a-b與圖6有關并且示出在hepg2和hct116癌細胞系二者中舒林酸/tnfα組合對胱天蛋白酶-8的協(xié)同活化，并且示出akt活化抑制舒林酸/tnfα組合誘導的凋亡。

圖18a-b與圖7有關并且示出本文所述的rxrα-選擇性舒林酸類似物中一些的設計。

圖19與圖8有關并且示出舒林酸類似物k-80003的合成。

圖20與圖8有關并且示出k-80003在通過全反式視黃酸抑制akt活化方面比舒林酸更有效。

圖21a-c示出口服施用k-80003對小鼠中mcf-7乳房腫瘤生長的生長抑制作用。(a)經口服k-80003或對照處理的小鼠中隨時間的乳房腫瘤體積。(b)來自經對照處理小鼠的乳房腫瘤組織。(c)來自經k-80003處理的小鼠的乳房腫瘤組織。

圖22a-c示出對于k-80003臨床前研究的毒性和pk特征。(a)毒性數(shù)據(jù)。(b)生物利用度數(shù)據(jù)。(c)藥代動力學數(shù)據(jù)。

具體實施方式

本文所述的多種實施方案一般性地針對關于類視黃醇受體選擇性通路的組合物和方法。如本文所述可操縱該通路以治療或降低患癌癥的風險。

如本文所示，trxrα組成型地駐留于細胞質中，與p85α相互作用，活化akt，并且賦予細胞的非錨定依賴性生長。這些觀察結果揭示了癌細胞中trxrα介導的存活通路，這為rxrα及其配體在癌癥中的作用提供了新見解。rxrα的蛋白酶解加工對pi3k/akt存活通路的這種活化與截短的bid(tbid)對凋亡通路的活化以及截短的notch蛋白對notch通路的活化相似。有趣的是，bid和notch切割也改變其亞細胞定位，這與對rxrα截短的作用相似。rxrα充當舒林酸作用的細胞內靶點的發(fā)現(xiàn)促進了本文所述用于抑制akt活性的rxrα-選擇性舒林酸衍生物的設計。例如，本文提供了舒林酸衍生的rxrα配體k-80003的設計和合成，其與rxrα具有更高的親和力，并且在抑制akt方面具有增強的功效，但是缺少cox抑制活性。此外，如本文所述，上調內源性tnfα和/或引入外源性tnfα可用于刺激癌細胞應答。

在一些實施方案中，組合物包含具有式i的核心結構：

在一些實施方案中，a為芳基或雜芳基，并且可任選地被r3和0、1或2個r4取代。在一些實施方案中，b為芳基或雜芳基，并且可任選地被0、1或2個r4取代。在一些實施方案中，r1為(cr5r6)ncooh。在一些實施方案中，r2選自h、c1-10烷基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、鹵烷基、烷基o、烷基s、鹵烷基o、nh2和烷基n。在一些實施方案中，r3和r4獨立地選自h、c1-10烷基、鹵烷基、鹵素、cn、芳基、雜芳基、芳烷基、雜芳烷基、烷基o、烷基s、(cr4r6)nconr7r8、oh、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、環(huán)烷基o和烷氧基烷基。在一些實施方案中，r5和r6均獨立地選自h、c1-7烷基、oh、烷氧基、環(huán)烷基；或者一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)基。在一些實施方案中，n選自0、1、2或3。

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式ii的核心結構：

在一些實施方案中，r1選自ch2cooh和ch2ch2cooh。在一些實施方案中，r2選自ch3和h。在一些實施方案中，r3選自4-sch3、4-ch3、4-ch2ch3和4-ch(ch3)2。

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式iii的核心結構：

在一些實施方案中，n＝2。在一些實施方案中，r1選自ch3、f和cl。在一些實施方案中，r2選自h、ch3、cl和f。在一些實施方案中，r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。在一些實施方案中，b和/或d為雜環(huán)(例如，限制于雜原子)。

在一些實施方案中，式iii中的cooh被四唑所替代。例如，在一些實施方案中，所述組合物包含具有式iv的核心結構：

在一些實施方案中，n＝2。在一些實施方案中，r1選自ch3、f和cl。在一些實施方案中，r2選自h、ch3、cl和f。在一些實施方案中，r3選自ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、c(ch3)3、ch2cl、och3和sch3。在一些實施方案中，b和/或d為雜環(huán)(例如，限制于雜原子)。

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式v的核心結構：

在一些實施方案中，r1選自cooh、ch2ch2cooh、ch＝chcooh、ch2-四唑、ch2-ch2-四唑、ch2cooch3、ch3、ch2conh2、ch2conhch3、ch2oh、ch2ch2oh和ch2nh2。在一些實施方案中，r2選自h、cl、ch2ch3、och3、nh2、nhch3、cf3、ch2nh2、ch2oh、ch2cl、ch(ch3)2和och2ch3。在一些實施方案中，r3選自h、ch＝ch2、cch、c(ch3)3、cf3、oh、och3、och2ch3、nh2、nhch3、cn、nhcoch3、

在一些實施方案中，r4選自h、cl、ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、och3、ochch3、nh2和nhch3。此外，r1至r4中任何一個可以是本領域技術人員已知的任何其它合適的基團。

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式vi的核心結構：

其中r1選自cooh、ch2ch2cooh、ch＝chcooh、ch2-四唑、ch2-ch2-四唑、ch2cooch3、ch3、ch2conh2、ch2conhch3、ch2oh、ch2ch2oh和ch2nh2。

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式vii的核心結構：

其中r2選自h、cl、ch2ch3、och3、nh2、nhch3、cf3、ch2nh2、ch2oh、ch2cl、ch(ch3)2和och2ch3。

在一些實施方案中，組合物包含具有式viii的核心結構：

其中r3選自h、ch＝ch2、cch、c(ch3)3、cf3、oh、och3、och2ch3、nh2、nhch3、cn、nhcoch3、

在一些實施方案中，所述組合物包含具有式ix的核心結構：

其中r4選自h、cl、ch3、ch2ch3、ch(ch3)2、och3、ochch3、nh2和nhch3。

本發(fā)明的一些實施方案還提供了化合物的類似物，包括實施例16中所示的化合物的類似物和衍生物，其具有式i至ix中任一個的核心結構，和/或本文提供的另一些結構。應理解可以使用已知方法對本文所述化合物做多種修飾以生成類似物。還應理解可以改變多種核心結構中的r基。還應理解本領域技術人員通過使用化學合成的已知方法并且進行構效關系(structureactivityrelationship，sar)研究，可以容易地制備本文所述的化合物的類似物。此外，本領域技術人員使用本文所述方法可容易地對多種類似物的活性進行測定。

在一些實施方案中，所述類似物與rxrα結合的ic50是舒林酸與rxrα結合時之ic50的約1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。

在一些實施方案中，所述類似物與cox-1結合的ic50比舒林酸與cox-1結合時之ic50高約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％，45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些實施方案中，所述類似物與cox-1結合的ic50比舒林酸與cox-1結合時之ic50高約1.5x、2x、2.5x、3x、3.5x、4x、4.5x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、50x、100x、250x、500x或1000x。

在一些實施方案中，所述類似物與cox-2結合的ic50比舒林酸與cox-2結合時之ic50高約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。在一些實施方案中，所述類似物與cox-2結合的ic50比舒林酸與cox-2結合時之ic50高約1.5x、2x、2.5x、3x、3.5x、4x、4.5x、5x、6x、7x、8x、9x、10x、50x、100x、250x、500x或1000x。

列出以下定義以闡明并限定用于描述本發(fā)明的多個術語的含義和范圍。

本文使用的“烷氧基”指通過氧原子與母體分子部分連接的烷基。

本文使用的“烷氧基烷基”指被一個、兩個或三個烷氧基取代的烷基。

本文使用的“烷基”指衍生自直鏈或支鏈飽和烴且包含一至十個碳原子的基團。

本文使用的“芳基”指苯基或雙環(huán)稠合環(huán)系統(tǒng)，其中環(huán)中的一個或兩個為苯基。雙環(huán)稠合環(huán)系統(tǒng)由與四至六元芳族或非芳族碳環(huán)稠合的苯環(huán)組成。本公開內容的芳基可以通過基團中任意合適的碳原子與母體分子部分連接。芳基的代表性實例包括但不限于茚滿基、茚基、萘基、苯基和四氫萘基。

本文使用的“芳烷基”指被一個、兩個或三個芳基取代的烷基。

本文使用的“環(huán)烷基”指具有三至十個碳原子和零個雜原子的飽和單環(huán)或雙環(huán)烴環(huán)系統(tǒng)。環(huán)烷基的代表性實例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)丁基和環(huán)戊基。

本文使用的“環(huán)烷基烷基”指被一個、兩個或三個環(huán)烷基取代的烷基。

本文使用的“鹵”和“鹵素”指f、cl、br和i。

本文使用的“鹵烷基”指被一個、兩個、三個或四個鹵素原子取代的烷基。

本文使用的“雜環(huán)基”指包含獨立選自氮、氧和硫的一個、兩個或三個雜原子的五、六或七元環(huán)。五元環(huán)具有零至兩個雙鍵，六和七元環(huán)具有零至三個雙鍵。術語“雜環(huán)基”還包括其中雜環(huán)與四至六元芳族或非芳族環(huán)或另一個單環(huán)雜環(huán)基稠合的雙環(huán)基團。本公開內容的雜環(huán)基通過基團中的碳原子或氮原子與母體分子部分連接。雜芳基的實例包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基(pyrrolopyridinyl)、吡咯基、噻唑基、噻吩基和硫代嗎啉基。

本文使用的“可藥用或治療用載體”指不干擾活性成分生物活性效力并且對宿主或患者的毒性很小的載體介質。

本文使用的“立體異構體”指與另一種化合物具有相同分子量、化學組成和構造，但是原子聚集(group)不同的化合物。即，某些相同的化學部分在空間上取向不同，因此在純化時能夠旋轉偏振光平面。但是，一些純的立體異構體可具有輕微的旋光度使得其不能通過現(xiàn)有儀器檢測。本文所述化合物可具有一個或更多個不對稱碳原子并因此包括多種立體異構體。所有的立體異構體都包括在本發(fā)明范圍內。

本文使用的“抑制”akt活性指akt活性的防止、下降、消除、或任何其他的減少。例如，抑制akt活性可包括降低akt的基礎水平或抑制akt活化。

本文使用的如應用于所公開組合物的“治療或藥學有效量”指足以誘導期望生物結果的組合物的量。該結果可以是預防、緩解、或改善體征、癥狀、病因、或生物系統(tǒng)中任何其它期望的改變。例如，該結果可包括降低和/或逆轉癌細胞生長。

本文使用的術語“抑制劑”可交換地用于表示“拮抗劑”。這兩種術語定義了能夠降低某酶活性或與所述酶的底物競爭活性或功能的組合物。

本文使用的“癌癥”和“癌”指哺乳動物中細胞的任何惡性增殖。

本文所述的藥物組合物可用于預防和治療本領域技術人員已知的任何惡性腫瘤，包括激素難治性前列腺癌、前列腺癌、乳癌、卵巢癌、結腸癌、黑素瘤或其他皮膚癌、肺癌、肝癌、急性髓細胞性白血病、膀胱癌、宮頸癌、膽管癌、慢性髓細胞性白血病、結腸直腸癌、胃肉瘤、膠質瘤、白血病、淋巴癌、多發(fā)性骨髓瘤、骨肉瘤、胰腺癌、胃癌或局部腫瘤(包括不能手術的腫瘤或其中局部治療腫瘤有益的腫瘤和實體瘤)。

對于體內應用，給定細胞毒性物質的適當劑量取決于物質及其制劑，并且在本領域的普通技術中優(yōu)化給定患者的劑量和制劑是可取的。因此，例如，使用制劑的標準方法可以將這樣的物質配制用于經口服、皮下、腸胃外、粘膜下、靜脈內、或其他合適路徑施用。不論施用是治療的或預防的，化合物的有效量和施用方法都將根據(jù)患者的性別、年齡、重量和疾病分期、以及本領域技術人員所顯而易見的其它因素而改變。

例如，根據(jù)對象體重、病痛的嚴重性、施用方式和處方醫(yī)師的判斷，本領域技術人員將得到施用的適當劑量和計劃表以適應患者的具體情況和需要。通常，向患者施用的組合物的劑量范圍可以為患者體重的約0.5至1000mg/kg。根據(jù)患者需要，劑量可以在一天或更多天期間給藥一次或者一系列的兩次或更多次。在一些實施方案中，本發(fā)明使用相同劑量，或者關于類似物已建立的人劑量的約0.1％至500％、更優(yōu)選約25％至250％的劑量。合適的人劑量也可以由ed50或id50值、或者來源于體外或體內研究的其它適當值(例如，如通過動物中的毒性研究和功效研究限定的)推斷。

盡管精確劑量可以基于藥物-藥物基礎進行測定，但是在大多數(shù)情況下，可以做出關于劑量的一些概括。對于成年人患者的日劑量方案可以是，例如，口服劑量0.1mg至500mg、優(yōu)選約1mg至約250mg，例如約150至約200mg。在一些實施方案中，口服劑量形式為約5mg、10mg、25mg、50mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg或1000mg?？梢栽谶B續(xù)治療期間施用化合物，例如一周或更多周，或者數(shù)月或數(shù)年。

可以單獨調整劑量和間隔以提供足以維持調整作用的活性部分的血漿水平，或最小有效濃度(minimaleffectiveconcentration，mec)。對于每種化合物mec不同，但是可以通過體外數(shù)據(jù)進行估算。為了達到mec的劑量將取決于個體特征和施用路徑。但是，hplc測定或生物測定可用于確定血漿濃度。

如果需要，組合物可存在于小盒或分配器裝置中，其可包含含有活性成分的一種或更多種單位劑型。小盒或分配器裝置可帶有施用說明書。小盒或分配器裝置也可帶有容器有關的通知書，所述容器的形式由規(guī)范藥物制造、施用或出售的政府機構規(guī)定，所述通知書表明機構對用于人或動物施用的藥物形式的批準。例如，這種通知書可以是由美國食品和藥物管理局批準的處方藥的標記，或者是批準的產品插入物。還可以制備被配制成相容性藥物載體的包含本發(fā)明化合物的組合物，放置在適當容器中，并且進行標記以治療指示病癥。

實施例

實施例1.舒林酸與rxrα的結合

進行了hek293t細胞中舒林酸與rxrα、nur77或rarβ結合的競爭性配體結合測定(圖1a)和hplc分析(圖1b)。在存在或不存在舒林酸或未標記的9-順式-ra的情況下將rxrαlbd蛋白與[³h]9-順式-ra進行孵育。通過液體閃爍計數(shù)對結合的[³h]9-順式-ra進行定量(圖1a)。用或者不用100μm舒林酸硫化物對穩(wěn)定表達與c-端tap標簽(stratagene，lajolla，ca)融合的rxrα的hek293t細胞進行處理3小時。處理之后，純化細胞并通過hplc分析舒林酸硫化物的存在。使用舒林酸硫化物的標準溶液得到校準曲線。特征峰譜和駐留時間用于鑒定，并且計算了用于定量的最大峰面積(圖1b和10)。舒林酸硫化物與rxrα結合的ic50為80μm(圖1a)，其在誘導凋亡的濃度范圍中。hplc分析表明舒林酸與細胞中的rxrα，而不是其他核受體(例如rar和nur77)直接結合(圖1b和10)。

在存在或不存在舒林酸或未標記的全反式-ra的情況下將純化的rarγ.蛋白與[³h]全反式-ra進行孵育。通過液體閃爍計數(shù)對結合的[³h]全反式-ra進行定量。舒林酸不與rarγ結合，這與圖1b所示的基于細胞的實驗一致(圖9a)。

將受體表達載體和報告基因(對于rxrα/trα異二聚體為trepal2-tk-cat(圖9b)，并且對于rxrα/pparγ異二聚體為dr1tk-cat(圖9c))瞬時轉染到cv-1細胞中。在存在或不存在舒林酸的情況下用或者不用配體(環(huán)格列酮，10^-6m；t3，10^-7m)對細胞進行處理。測定cat活性。舒林酸抑制rxrα/pparγ異二聚體，而不抑制rxr/tr異二聚體的反式活化(圖9b，c)。

還測定了rxrα配體結合結構域(lbd)通過舒林酸(100μm)對胰凝乳蛋白酶(μg/ml)的敏感性改變(圖1c)；以及在不存在或存在10μmrxrαlbd或nur77蛋白的情況下比較舒林酸(100μm)¹⁹fnmr譜的差示掃描量熱法(dsc)掃描(圖1d)。通過舒林酸(100μm)使rxrα對胰凝乳蛋白酶消化的敏感性改變(圖1c)和差示掃描量熱法(dsc)(圖1d)確定了與rxrα的結合。此外，測量了通過舒林酸對經sr11237(10^-6m)活化的rxrα反式活化的抑制(圖1f，參見實施例2)。

將nur77和/或rxrα瞬時轉染到cv-1細胞中。在存在或不存在舒林酸的情況下，用或者不用sr11237(10^-6m)(rxr選擇性激動劑)對細胞進行處理。測定了(trepal)2-tk-cat(zhang等，nature358，587-591(1992a))(圖1e)和βrare-tk-cat(zhang等，nature355，441-446(1992b))(圖1f)的cat活性。在報告測定(圖1e，f和圖10)中舒林酸結合抑制rxrα同型二聚物和異源二聚物的反式活化，這證實舒林酸是rxrα轉錄拮抗劑。

實施例2.舒林酸的死亡作用

為了確定rxrα在舒林酸誘導凋亡中的作用，檢查了舒林酸在f9細胞或缺少rxrα(f9-rxrα-/-)的f9細胞中的死亡作用。

為了進行核形態(tài)變化分析，對細胞進行胰蛋白酶消化，用pbs洗滌，經3.7％多聚甲醛固定，并且用dapi(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)(1mg/ml)染色以通過熒光顯微鏡使核顯現(xiàn)。通過計數(shù)至少300個具有核片段化和/或染色質凝聚的gfp陽性細胞來確定凋亡細胞的百分數(shù)。為了確定dna片段化，使用細胞死亡檢測elisa^plus試劑盒(celldeathdetectionelisa^plus)(rocheappliedscience，penzberg，bavaria，germany)。

rxrαsirnasigenomesmarpool(m-003443-02)、rarγsirnasigenomesmarpool(m-003439-01)和sirna非特異性對照ix(d-001206-09-05)購買自dharmacon(lafayette，co)。根據(jù)制造商建議，使用oligofectamine試劑(invitrogen，carlsbad，ca)將每孔2.5μl等份的20mmsirna轉染到在12孔板中生長的細胞中。轉染兩天后，收集細胞用于western印跡。

用舒林酸處理f9細胞或缺少rxrα(f9-rxrα-/-)的f9細胞24小時并且通過dapi染色(圖2a)、聚(adp-核糖)聚合酶(parp)切割(圖2b)和dna片段化(圖2c)進行分析。用對照或rxrαsirna對h460肺癌細胞進行轉染，用舒林酸(75μm)處理24小時，并通過dapi染色對凋亡進行分析(圖2d和2e)。

用gfp-rxrα(圖2f)或gfp-rxrα/f313s/r316e(圖2g)對cv-1細胞進行轉染，用舒林酸(75μm)處理24小時，并通過dapi染色進行分析。經gfp-rxrα轉染的細胞發(fā)生大量的核片段化和凝聚(圖2f)。對經受體轉染的細胞中的凋亡進行計數(shù)檢查(圖2g和11)。破壞rxrα配體結合口袋削弱了其同二聚體的反式活化(圖11a和11b)。此外，破壞rxrα配體結合口袋削弱了其異二聚體的反式活化(圖11c，11d)。將rxrα(20ng)、rxrα/f313s/r316e(20ng)、β-半乳糖苷酶(100ng)和/或nur77(100ng)表達載體與(trepal)2-tk-cat(100ng)(圖11a，11b)或βrare-tk-cat(100ng)(圖11c，d)一起瞬時轉染到cv-1細胞中。在存在或不存在升高濃度的舒林酸(10、37.5、75、150、300μm)的情況下用或者不用sr11237(10^-6m)對細胞進行處理。測定cat活性。

舒林酸誘導f9細胞的大量凋亡，而對f9-rxrα-/-細胞作用很小(圖2a-2c)。舒林酸的凋亡作用在經rxrαsirna轉染的細胞中也降低(圖2e)，而rxrα的轉染增強了其死亡作用(圖2f，g)。rxrα/f313s/r316e不能對配體誘導的同二聚體或異二聚體的反式活化作出應答(圖11)，并且表明對舒林酸作出應答的凋亡減少(圖2g)。因此，發(fā)現(xiàn)rxrα參與舒林酸誘導的凋亡。

用或者不用舒林酸(75μm)處理hct116細胞或缺少bax的細胞(bax-/-)24小時。通過parp切割(圖2h)和dapi染色(圖2i)對凋亡進行測定。用舒林酸處理經或者不經rxrαsirna或對照sirna轉染48小時的hct116細胞6小時，并且分析bax寡聚化(圖2j)以及使用bax/δ21、bax/6a7或抗hsp60抗體通過免疫染色/共聚焦顯微鏡分析bax構象改變和線粒體靶向(圖2k)。約60％的細胞表現(xiàn)出bax構象改變。

舒林酸誘導hct116結腸癌細胞中而不誘導缺少bax的hct116細胞(bax-/-)中的parp切割(圖2h)和凋亡(圖2i)。hct116細胞缺少cox-2的事實證實舒林酸誘導的凋亡可以不依賴cox-2。免疫印跡測定表明bax在線粒體上經受大量寡聚化，其被rxrαsirna消除(圖2j)。此外，使用抗bax抗體(bax/δ21)的免疫染色和bax構象敏感性抗體bax/6a7的免疫染色(nechushtan等，biochembiophysrescommun254，388-394(1999))證實舒林酸誘導的bax構象改變和線粒體靶向被rxrαsirna削弱(圖2k)。總之，這些結果證實rxrα可充當介導舒林酸凋亡作用的細胞內靶點。

實施例3.rxrα突變體

為了討論舒林酸與rxrα結合的作用，構建了rxrα突變體(rxrα/f313s/r316e)，其中改變了維持rxrα配體結合口袋(lbp)功能完整性所必需的氨基酸(bourguet，w.等，molcell5(2)，289-298(2000))。

使用正向引物5’-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3’(seqidno：1)和反向引物5’-acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’(seqidno：2)通過聚合酶鏈式反應(pcr)構建flag-p85α。pcr產物經ecori和sali消化并被克隆到pcmv-flag載體中。通過以下寡核苷酸作為引物，使用誘變試劑盒(stratagene，lajolla，ca)構建rxrα突變體：rxrα/f313s/r316e，5’-ggaacgagctgctgatcgcctcctcctcccacgagtccatagctgtgaaaga

tggg(正向-seqidno：3)和5’-cccatctttcacagctatggactcgtgggaggaggaggcgatcagcagctcgttcc(反向-seqidno：4)；rxrα/δ80，5’-ccggaattcggaccacacccaccctgggc-3’(正向-seqidno：5)；和5’-ccgctcgagctaagtcatttggtgcggcg-3’(反向-seqidno：6)；rxrα/δ100，5’-ccggaattcgggtcagcagcagcgaggac-3’(正向-seqidno：5)；和5’-ccgctcgagctaagtcatttggtgcggcg-3’(反向-seqidno：6)。pcr產物經ecori和xhoi消化并被連接到pcmv-myc載體中。

將rxrα(20ng)、rxrα/f313s/r316e(20ng)、β-半乳糖苷酶(100ng)和/或nur77(100ng)表達載體與(trepal)2-tk-cat(100ng)(圖11a)或βrare-tk-cat(100ng)(圖11b)一起瞬時轉染到cv-1細胞中。用或者不用sr11237(10^-6m)對細胞進行處理。測定cat活性。

突變體不能對配體誘導的反式活化作出應答(圖11)并且示出對舒林酸作出的應答減少(圖2g)(參見實施例2)。

實施例4.舒林酸對akt活化的抑制

研究舒林酸對akt(負責癌細胞存活的關鍵蛋白質)活化的抑制。

使hepg2、sw480、raw264.7、hct116、lncap、pc3、zr-75-1和hacat細胞饑餓過夜并用舒林酸(100μm)處理1小時，然后通過免疫印跡分析akt活化(圖3a)。也用rxrαsirna對hepg2細胞進行轉染48小時，用舒林酸(100μm)處理1小時，然后通過免疫印跡分析akt活化和rxrα表達(圖3b)。

使mef和mcf-7細胞饑餓過夜，用舒林酸(100μm)預處理1小時，然后用egf(100ng/ml)刺激15分鐘。通過免疫印跡分析akt活化(圖12a)。使mef和caco-2細胞饑餓過夜并用舒林酸(100μm)預處理30分鐘，然后暴露于全反式視黃酸(atra)(10^-7m)30分鐘并分析akt活化(圖12b)。通過免疫印跡還分析了經rxrαsirna轉染后暴露于9-順式-ra(10^-7m)30分鐘的zr-75-1乳癌細胞中的akt活化(圖3c)。用舒林酸(100μm)對經rxrα或對照sirna轉染的a549肺癌細胞(圖3c)以及zr-75-1和pc3細胞(圖3d)進行預處理1小時后暴露于tnfα(10ng/ml)30分鐘，并且通過免疫印跡分析akt活化和rxrα表達。

在多種癌細胞系(包括cox-2陰性sw480和hct116結腸癌細胞)中觀察到舒林酸對基礎akt活化的顯著抑制(圖3a)，從而表明不依賴cox-2的機制。舒林酸不能抑制通過egf的akt活化，但是強烈抑制通過視黃酸的akt活化。rxrαsirna的轉染顯著降低組成型akt活化(圖3b)，與舒林酸作用相似。用全反式-ra(atra)處理細胞30分鐘強烈地誘導了akt活化，并且其被舒林酸以劑量依賴性方式(圖12b)和rxrαsirna(圖12c)抑制。盡管舒林酸不能抑制通過表皮生長因子誘導的akt活化(圖12a)，但是其以rxrα依賴性方式強烈抑制通過視黃酸誘導的akt活化(圖12b，c)。因此，舒林酸可干擾ra誘導的快速rxrα依賴性akt活化。

檢查舒林酸抑制tnfα誘導的akt活化。tnfα使a549肺癌細胞中的akt強烈活化，其被舒林酸和rxrαsirna強烈抑制(圖3c)，表明akt的tnfα活化依賴rxrα。盡管tnfα不能活化具有高基礎akt活化的細胞(例如zr-75-1和pc3細胞)中的akt并且舒林酸在這些細胞中對akt活化表現(xiàn)出的抑制作用很小，但是舒林酸與tnfα組合協(xié)同地，并且?guī)缀跬耆种芶kt活化(圖3d)。因此，tnfα能夠使癌細胞對通過舒林酸的akt抑制敏感，表明tnfα可能通過將akt活化由rxrα不依賴性轉化為rxrα依賴性方式可促進癌細胞對舒林酸作出應答。

用9-順式-ra(10^-7m)處理mcf-7和幼倉鼠腎(bhk)細胞30分鐘，并且使用d20或δn197抗rxrα抗體通過免疫共沉淀分析rxrα-p85α相互作用(圖12d)。用9-順式-ra和/或舒林酸(100μm)處理h292肺癌細胞30分鐘，使用δn197抗體通過免疫共沉淀分析rxrα-p85α相互作用(圖12e)。舒林酸不能抑制通過egf的akt活化，但是強烈抑制通過視黃酸的akt活化。此外，當使用δn197抗rxrα抗體，而不使用d20抗rxrα抗體時，9-順式視黃酸促進trxrα與p85α的相互作用。

實施例5.p85α與trxrα和rxrα的相互作用

檢查rxrα與p85α的相互作用。將抗rxrα抗體(santacruzbiotechnology，santacruz，ca)用于免疫共沉淀(co-ip)和western印跡(wb)測定。用atra(10^-7m)處理bhk細胞30分鐘。制備裂解物并使用d20抗rxrα或δn197抗rxrα抗體之一分析rxrα-p85α相互作用(圖12d)。

盡管抗rxrα抗體使rxrα蛋白發(fā)生有效免疫沉淀，但是使用針對rxrα(d20)nh2端序列的抗rxrα抗體通過免疫共沉淀測定的最初嘗試沒能檢測清楚的相互作用。但是，當使用針對rxrα(δn197)cooh端配體結合結構域(ligandbindingdomain，lbd)的另一種抗rxrα抗體時，p85α容易以tnfα(圖3e)或ra依賴性方式(圖12d，e)發(fā)生免疫共沉淀。d20抗rxrα抗體識別n-端a/b結構域中的2-21位氨基酸，而δn197抗rxrα抗體識別c-端e/f結構域(圖3e)。通過δn197抗rxrα抗體的p85α免疫共沉淀伴隨有截短的rxrα(trxrα)的免疫沉淀，而通過d20抗rxrα抗體并未檢測到，這表明其缺少n-端序列(圖12d)。使用δn197抗rxrα抗體，tnfα增強而舒林酸抑制p85α與trxrα和/或rxrα的相互作用(圖3e)。在tnfα存在下p85α與trxrα的相互作用也被舒林酸抑制(圖12e)。這些結果表明trxrα與p85α結合導致了akt活化。

實施例6.rxrα的80至100位氨基酸對干與p85α結合十分關鍵

檢查細胞內蛋白水解切割。用或者不用9-順式-ra(10^-7m)處理細胞30分鐘并且使用δn197rxrα抗體通過免疫印跡對裂解物進行分析(圖3f)。免疫印跡證實在不同細胞環(huán)境和生物過程中rxrα經常在其氨基端被切割(圖3f)。

用或者不用9-順式-ra處理a549肺癌細胞30分鐘。使用d20或δn197抗rxrα抗體通過免疫印跡對細胞核(nu)和細胞質(cyt)級分進行分析。為了確保制備純度，在hsp60(細胞質特異性)和parp(細胞核特異性)蛋白的存在下也對級分進行免疫印跡(圖13)。在使用抗rxrα(δn197)進行免疫染色之后，通過共聚焦顯微鏡觀察mef中內源rxrα的亞細胞定位。還通過dapi對細胞進行染色以使細胞核顯現(xiàn)(圖4b)。

rxrα存在于質膜中(圖4a，上圖)并且在一些細胞的細胞膜上呈點狀結構(圖4a，下圖)。mef中44-kdatrxrα的產生還受細胞密度調節(jié)(圖4a)。以低密度培養(yǎng)的細胞中所觀察到的44-kdatrxrα水平在細胞生長至高密度時降低，并且伴隨有更小rxrα片段的出現(xiàn)。有趣的是，44-kdatrxrα蛋白水平與akt活化有關系(圖4a)，表明rxrα的細胞密度依賴性蛋白水解切割可以是調節(jié)akt活化的重要機制。與trxrα的細胞質定位一致(圖13)的是，當通過δn197抗rxrα抗體對mef細胞進行免疫染色時，發(fā)現(xiàn)rxrα主要在細胞質中(圖4b)。因此，rxrα的僅n-端末端序列缺失可改變其亞細胞定位，賦予其與p85α結合的能力。本文所述的p85α與trxrα免疫共沉淀的觀察結果表明trxrα可與p85α結合，導致了trxrα依賴性akt活化。

以不同細胞密度接種mef細胞并制備裂解產物，然后通過免疫印跡分析akt活化。還使用δn197抗rxrα抗體通過免疫印跡對裂解產物進行檢查(圖4a)。小鼠胚胎成纖維細胞(mef)中的trxrα水平以細胞密度依賴性方式與akt活化相關聯(lián)(圖4a)。與trxrα的細胞質定位一致的是，mef經常表現(xiàn)出rxrα的質膜定位(圖4b)。

為了直接研究trxrα在p85α相互作用和akt活化中的作用，構建缺失其n-端80個氨基酸的rxrα突變體(rxrα/δ80)，其產生與內源性trxrα分子量相似的rxrα突變體蛋白。當將myc-標記的rxrα/δ80與flag-p85α一起共轉染到細胞中時，它們發(fā)生強烈的相互作用，并進一步被tnfα增強(圖5a)。相比之下，全長rxrα和缺失100個n-端氨基酸的rxrα突變體(rxrα/δ100)在相同條件下不能與flag-p85α相互作用。因此，rxrα的80至100位氨基酸對于與p85α結合十分關鍵。在這個支持下，rxrαn-端a/b結構域(rxrα/1-134)，而不是其lbd(rxrα/224-462)與p85α相互作用(圖5b)。與trxrα的細胞質定位(圖13)一致的是，rxrα/δ80主要存在于細胞質中，表現(xiàn)出擴散的且有時為點狀的質膜定位(圖5d)。rxrα/δ80，而不是rxrα/δ100的轉染，也強烈活化多種細胞類型中的akt(圖5c)。

在體外檢查rxrα/δ80免疫復合物的pi3k活性。將myc-標記的rxrα/δ80與p85α共轉染到a549細胞中，并且通過抗myc抗體使含rxrα/δ80的復合物發(fā)生免疫沉淀并且測定pi3k活性。由細胞制備的特異性myc-rxrα/δ80免疫沉淀物表現(xiàn)出tnfα依賴性方式的強pi3k活性(圖5e和15)，這與其與p85α相互作用的能力(圖5a)和akt活化(圖5c)有很好的相關性。因此，發(fā)現(xiàn)tnfα誘導的trxrα/p85α相互作用活化pi3k/akt信號轉導。

rxrα/δ80在sw480和hct116結腸癌細胞中穩(wěn)定表達，并且所得穩(wěn)定克隆sw480/rxrα/δ80和hct116/rxrα/δ80表現(xiàn)出升高的akt活化并且誘導其下游靶點c-myc和細胞周期蛋白d1(圖5f)。使用克隆性存活測定來評價sw480/rxrα/δ80和hct116/rxrα/δ80的生長。穩(wěn)定克隆比對照細胞形成的集落多得多(圖5g)。在動物中檢查rxrα/δ80對癌細胞生長的作用。為此，將相同數(shù)目的表達rxrα/δ80的細胞或對照細胞注入到同一裸鼠的不同肋部并且測定其生長。在動物中由sw480/rxrα/δ80和hct116/rxrα/δ80形成的腫瘤比由對照細胞形成的腫瘤生長得要快得多(圖5h-i)。總之，這些結果證實n-端截短的rxrα是體內癌細胞生長的有效促進劑。

實施例7.akt活化和細胞轉化中的內源trxrα

全長rxrα不能與p85α相互作用的觀察結果表明在rxrα中a/b結構域中的p85α結合基序被掩蔽。因此，rxrα的n-端a/b結構域可與全長rxrα相互作用(補充圖8a)，揭示了分子內相互作用。

將表達載體gfp-rxrα/1-134和myc-rxrα轉染到hek293t細胞中。使用抗myc抗體通過co-ip對相互作用進行分析(補充圖8a)。將在其n-末端與gfp融合的全長rxrα或rxrα/1-134和在其c-末端標記有myc表位的全長rxrα共轉染到hek293t細胞中。36小時之后，使用抗myc抗體通過ip和wb對細胞裂解產物進行分析。

n-端a/b結構域與rxrα結合(補充圖8a)。rxrαn-端片段的表達誘導rxrα切割(補充圖8b)。rxrα/1-134與全長rxrα一起轉染增加了trxrα的水平(補充圖8b)，這可能是因為其通過競爭破壞了分子內相互作用，導致rxrαn-端中蛋白水解部位的暴露。

rxrα的n-端區(qū)域rxrα/1-134的轉染可增加trxrα水平(圖14)。為了研究內源trxrα的作用，使rxrα/1-134在hela細胞中穩(wěn)定表達，從而顯著增加穩(wěn)定表達rxrα/1-134的細胞中的trxrα蛋白，并且伴隨有內源全長rxrα蛋白的減少(圖4c)。與親本hela細胞相比，hela/rxrα/1-134的穩(wěn)定克隆具有較高的akt活化(圖4c)，并且在軟瓊脂中生長迅速(圖4d)，這表明內源性trxrα在akt活化和細胞轉化活性中的作用。在集落形成測定中，舒林酸強烈抑制通過穩(wěn)定克隆形成的集落(圖4e)。在乳癌患者的腫瘤組織中，而并非在相應的腫瘤周圍組織和正常組織中存在trxrα，闡明了trxrα的的臨床相關性(圖4f)。在肝癌患者中得到相似的結果。人肝癌樣本中rxrα的免疫組織化學分析揭示了在腫瘤組織中，而并非相應的腫瘤周圍組織中有強烈的細胞質rxrα染色(圖4g)。總之，這些結果證實trxrα可通過活化akt為癌細胞的生長和存活作出貢獻，以及trxrα介導的活性可被舒林酸負向調節(jié)。

實施例8.舒林酸類似物的合成

rxrα充當舒林酸作用的細胞內靶點的發(fā)現(xiàn)為鑒定用于抑制akt活性的rxrα-選擇性舒林酸衍生物提供了機會。比較舒林酸與rxrα和cox-2的結合(圖7a，18b)以設計有助于rxrα結合而不利于cox結合的舒林酸類似物。比較舒林酸硫化物和吲哚美辛的二維結構(圖18a)。產生在cox-2活性部位中結合的舒林酸與吲哚美辛的重疊(圖18b)。與吲哚美辛類似，將舒林酸直觀地模式化成與cox-2結合。

設計并合成了類似物(圖19)。使用取代的苯甲醛(1)作為起始材料制備取代的茚滿酮衍生物(4)。在perkin反應中，用適當酸酐處理衍生物(1)得到衍生物(2)，然后通過催化加氫還原得到衍生物(3)。多聚磷酸(ppa)催化的分子內friedel-crafts?；忾]5元環(huán)得到1-茚滿酮衍生物(4)。用由乙酸乙酯和六甲基二甲硅烷基氨基鋰(lithiumhexamethyldisilylamide，lhmds)生成的烯醇化物處理衍生物(4)，然后在酸性環(huán)境下脫水得到期望的乙酸酯(5)。使所產生的茚-3-乙酸酯(5)與取代苯甲醛反應(claisen-schmidt反應)，酸化之后得到舒林酸類似物(z-6)。舒林酸類似物(9)合成的一步是二碘化釤(smi2)介導的1-茚滿酮(4)與丙烯酸甲酯的還原偶聯(lián)，得到螺內酯(7)。用催化量的對甲苯磺酸(p-tsoh)處理(7)的甲醇溶液產生脫水產物(8)，經過claisen-schmidt反應和酸化得到舒林酸類似物(9)。值得注意的是，在化合物(5/8)的claisen-schmidt反應中，當r2＝ch3時，主要形成化合物(6/9)的順式(z)-異構體；而在r2＝h的情況下，主要形成化合物(6/9)的反式(e)-異構體。

實施例9.舒林酸類似物的評價

參照9-順式-ra，評價舒林酸與rxrα的lbp的對接，從而鑒定用于舒林酸結構修飾的策略以使其cox抑制與rxrα結合活性分離。圖7a中示出舒林酸與rxrα的對接。將對接的舒林酸的取向和位置與9-順式-ra、dha和bms649的晶體結構進行比較(圖7b)。在模式中結合的舒林酸(其中其羧酸酯基團與所檢查的所有rxrα配體中發(fā)現(xiàn)的羧酸酯基團匹配(圖7b))與rxrαlbp中的arg316相互作用。與rxrαlbp中的疏水區(qū)域結合的舒林酸的芐基甲基硫化物部分與9-順式-ra的紫羅蘭酮環(huán)(a-ionone)重疊。在這種結合模式中，4位的-sch3基(圖7c)與rxrα蛋白的范德華相互作用并非最佳，并且仍有修飾空間以改善與rxrα的結合。舒林酸前藥、舒林酸亞砜和代謝物舒林酸砜不表現(xiàn)出cox抑制活性，而代謝物舒林酸硫化物(本文所用)為強cox抑制劑的事實(haanen，2001)，完全支持了利用4位來設計rxrα選擇性類似物的想法。如圖7a所示，與rxrα配體dha、bms649和9-順式-ra中的等價基團相比，舒林酸的羧酸酯基團遠離arg316。用更龐大的基團例如-ch2ch2cooh代替d位的-ch2cooh將幫助羧酸酯基團更靠近arg316，從而實現(xiàn)如9-順式-ra中所觀察到的良好的電荷-電荷相互作用。

還通過與cox-2的晶體結構對接對候選化合物進行檢查(圖18)以鑒定非cox結合劑?；谶@些考慮，設計并合成了五種類似物(圖7c和19)。這些評價表明所有的類似物都保留rxrα結合活性，并且k-80003最強(比舒林酸高約34倍)，這可能是因為其4位上的異丙基(i-pr)改善了與rxrα的螺旋7(helix7)上疏水殘基的相互作用。顯著地，k-80003和k-80005沒有可檢出的對cox活性的抑制(圖7c)并且不能抑制組成型的和tnfα(圖7d)或il-1β(未示出)誘導的前列腺素e2(pge2)產生。還通過19fnmr結合測定測定了k-80003與rxrα的結合(圖7e)。因此，可將舒林酸的rxrα結合與其cox-結合分離開。

將a549細胞接種到帶有10％胎牛血清的dmem的24孔板上。過夜培養(yǎng)之后，在無血清的dmem培養(yǎng)基中用10ng/mlil-1β刺激細胞24小時。用指示濃度的舒林酸或類似物預處理10分鐘之后，在37℃用10μm花生四烯酸和舒林酸或其類似物一起處理細胞30分鐘。收集培養(yǎng)基并立即測定。通過前列腺素e2eia單克隆試劑盒(prostaglandine2eiakit-monoclonal)根據(jù)制造商說明書(caymanchemical，annarbor，mi)測量pge2產量。將pge2產量(％)表示為在化合物存在下產生的pge2與通過單獨載劑產生的pge2之比。

類似物的評價表明它們都保留rxrα結合活性，并且k-80003最強(比舒林酸高約34倍)，這可能是因為4位上的異丙基(i-pr)改善了與rxrα的螺旋7(helix7)上疏水殘基的相互作用。k-80003和k-80005沒有可檢出的對cox活性的抑制(圖7c)并且不能抑制組成型的或tnfα誘導的(圖7d)或il-1β誘導的前列腺素e2(pge2)產生(未示出)。比較不存在或存在10μmrxrαlbd的情況下k-80003(100μm)的¹⁹fnmr譜(圖7e)。

用指示濃度的舒林酸或k-80003處理caco-2和mef細胞30分鐘，然后用全反式-ra(10^-7m)刺激15分鐘。通過免疫印跡分析akt活化。用k-80003(50μm)對經rxrα或rarγsirna轉染的pc3細胞預處理1小時，然后暴露于tnfα(10ng/ml)30分鐘(prxrα：磷酸化rxrα)。用flag-p85α和myc-rxrα/δ80轉染a549細胞，用舒林酸(50μm)或k-80003(50μm)處理1小時，暴露于tnfα維持30分鐘，并使用抗flag抗體通過免疫共沉淀進行分析。在抑制atra誘導的akt活化(圖20)和tnfα誘導的akt活化(圖8a)、hela/rxrα/1-134穩(wěn)定克隆的集落形成(圖8b)、以及p85α與rxrα/δ80的相互作用(圖8c)方面，k-80003(50μm)比舒林酸(50μm)要強得多。通過sirna降低rxrα表達大大削弱了k-80003對pc3細胞中akt活化的抑制作用。相比之下，通過rarαsirna降低rarα表達未表現(xiàn)出這種作用。因此，k-80003對akt活化的抑制也依賴于rxrα表達(圖8b)。

免疫共沉淀測定證實在不存在或存在tnfα的情況下，與舒林酸作用相比，k-80003都強烈抑制rxrα/δ80與p85α的相互作用(圖8c)。

用tnfα和/或舒林酸(75μm)或k-80003(50μm)處理zr-75-1細胞6小時并通過免疫印跡進行分析。當與tnfα一起在zr-75-1細胞中使用時，在誘導parp切割方面k-80003比舒林酸也要強得多(圖8d)。與舒林酸相似，k-80003與tnfα組合協(xié)同誘導hepg2和pc3細胞中的parp切割和胱天蛋白酶-8活化(圖8e)。

在克隆存活測定中，hela/rxrα/1-134穩(wěn)定克隆和rxrα/δ80穩(wěn)定克隆的集落形成幾乎完全被k-80003抑制，揭示了其抑制細胞生長的能力(圖8f)。k-80003對akt活化的抑制作用被rxrα而不是rarγsirna終止(圖8f)，表明rxrα在介導其作用中的角色。

用玉米油、舒林酸(60mg/kg)或k-80003(60mg/kg)處理小鼠(n＝6)兩周。取出腫瘤并測量。顯著地，k-80003對動物的rxrα/δ80腫瘤生長表現(xiàn)出的抑制作用比舒林酸要強得多(圖8g)?？傊瑀xrα選擇性舒林酸類似物k-80003是rxrα介導的pi3k/akt信號和癌細胞生長的強烈抑制劑。

實施例10.在哺乳動物中篩選舒林酸類似物

選擇舒林酸類似物的組以篩選能夠誘導細胞凋亡的化合物。將每種候選化合物引入小鼠中并且進行分析以確定其是否能夠抑制akt活性、活化胱天蛋白酶-8、活化bax、抑制cflip和/或降解細胞中的bid。在篩選期間鑒定的化合物可被用于本文所公開的進一步的篩選測定或處理方法。

實施例11.治療人患者的癌癥

鑒定有治療癌癥需要的人患者，并且施用已知與rxrα相互作用且不依賴cox-2通路起作用的化合物。監(jiān)測患者由施用化合物引起的癌癥的穩(wěn)定或改善。施用化合物之后觀察患者的抗腫瘤發(fā)生作用。

實施例12.預防人患者的癌癥

鑒定相對于一般人群具有升高的患癌癥風險的人患者，并指導其每天兩次服用150mg包含活性成分k-80003的片劑。監(jiān)測患者并且施用化合物之后不患癌癥。

實施例13.tnfα誘導的外在凋亡通路的舒林酸活化

用sr11237(1μm)處理在帶有1％fbs的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的hepg2細胞1小時，然后用tnfα(10ng/ml)和/或舒林酸(75μm)處理4小時，并通過免疫印跡進行分析。用tnfα和/或舒林酸處理經對照或rxrαsirna轉染的hepg2細胞并通過免疫印跡進行分析。

用舒林酸和tnfα處理hepg2肝癌細胞(圖6a)和其他細胞系(圖16和17)有效誘導了parp切割和胱天蛋白酶-8活化(由被切割的胱天蛋白酶-8產物p43/p41表明)，而用舒林酸或tnfα單獨處理這些細胞的作用很小。rxrα選擇性配體sr11237(圖6a)或rxrαsirna的轉染(圖6b)部分抑制了舒林酸/tnfα組合的凋亡作用，再次證實了rxrα的作用。

用tnfα和舒林酸處理經對照或胱天蛋白酶-8sirna轉染或經zietd-fmk(40μm)預處理1小時的hepg2細胞，并通過免疫印跡進行分析。舒林酸/tnfα誘導的parp切割的完全抑制(圖6c和圖16b-c)。當細胞經胱天蛋白酶-8sirna轉染時得到相似結果(圖6d和16d)。因此，舒林酸/tnfα誘導的凋亡是由外在凋亡通路介導。

舒林酸和tnfα對bax的活化。用bax/6a7抗體對經tnfα和/或舒林酸處理的hepg2細胞進行免疫染色。約15％舒林酸處理的細胞，而約60％舒林酸/tnfα處理的細胞表現(xiàn)出bax染色。還檢查了引起bax活化的可能的外在凋亡通路的舒林酸活化。使用構象敏感性bax/6a7抗體通過免疫染色檢查了經tnfα或舒林酸單獨或一起處理的hepg2細胞的bax活化。只有在用tnfα和舒林酸二者處理細胞時才觀察到顯著的bax染色(圖6e)。外在與內在凋亡通路之間的交叉效應(cross-talk)可以通過bid切割和活化連接起來(li等，cell94(4)，491-501(1998))。事實上，bid在經tnfα和舒林酸處理的細胞中顯著降解(圖6a)，這表明舒林酸/tnfα誘導的bax活化可通過bid活化介導。

用tnfα和/或舒林酸處理經ca-akt或dn-akt轉染的pc3細胞并通過免疫印跡進行分析(圖6f)。舒林酸和tnfα對胱天蛋白酶-8(圖6g)和bax(圖6h)的活化。用tnfα和舒林酸處理經ca-akt轉染的hepg2細胞，并用抗切割的胱天蛋白酶-8或bax/6a7抗體進行免疫染色。約80％未轉染的和15％ca-akt轉染的細胞表現(xiàn)出胱天蛋白酶-8染色。約60％未轉染的和13％ca-akt轉染的細胞表現(xiàn)出bax染色。組成型活性akt(constitutive-activeakt，ca-akt)的轉染抑制舒林酸/tnfα誘導的parp切割，但是顯性負性akt(dominant-negativeakt，dn-akt)的轉染增強舒林酸/tnfα誘導的parp切割(圖6f)。一致地，ca-akt抑制通過舒林酸/tnfα組合的凋亡誘導(圖17b)和胱天蛋白酶-8(圖6g)和bax(圖6h)活化。

通過免疫印跡對經tnfα和/或舒林酸處理6小時的細胞進行分析(圖6i)。對通過抑制胱天蛋白酶-8活化充當外在凋亡通路的強烈抑制劑的c-flip(akt信號的下游靶基因)的表達進行檢查。用tnfα處理hepg2、a549和sw480細胞強烈誘導c-flip的短形式(c-flips)和長形式(c-flipl)二者，并且被舒林酸抑制(圖6i)。因此，舒林酸可通過抑制tnfα對c-flip表達的誘導作用來誘導凋亡。

實施例14.k-80003在乳房腫瘤中的生長抑制

研究口服施用k-80003對小鼠中生長的mcf-7乳房腫瘤組織的生長抑制作用。將k-80003溶解于nahco3(ph8.0)。通過填喂法向帶有mcf-7乳房腫瘤組織的小鼠施用總體積為100ul的15mg/kgk-80003、30mg/kgk-80003、60mg/kgk-80003或對照，每天一次。20天后測量的腫瘤體積表明，與經對照處理的小鼠相比，經口服k-80003處理的小鼠表現(xiàn)出腫瘤體積的劑量依賴性減小(圖21a)。

實施例15.k-80003的臨床前研究

進行k-80003的臨床前研究，包括毒性、生物利用度和藥代動力學的研究。k-80003表現(xiàn)出非常低的毒性(圖22a)，與靜脈內制劑相比口服的生物利用度增加(圖22b)和滿意的pk特征(圖22c)。

實施例16.類似物的生產

3-(4-氟苯基)-2-甲基丙烯酸(2a)

在0℃將丙酸酐(31.0ml，242mmol)加入碳酸鉀(18.2g，132mmol)中。攪拌5分鐘以混合之后，加入對氟苯甲醛(1a)(13.0ml，120mmol)。在160℃將混合物加熱12小時。用冰浴冷卻之后向反應混合物中加入水。過濾所得黃色沉淀物，并用etoac洗滌，產生粗品酸2a，其被原樣用于下一步。通過從meoh中重結晶得到已知丙烯酸2a(40)的分析樣品。2a：淡黃色晶體。熔點：155-158℃(meoh)。

ir(kbr)：vmax＝3429，3076，2972，1665，1596，1508，1425，1313，1298，1224cm^-1；¹hnmr(400mhz，cd3od)δ：2.09(s，3h，cch3)，7.22-7.11(m，2h，ph-h)，7.52-7.43(m，1h，ph-h)，7.69(s，1h，ch＝cch3)ppm；¹³cnmr(100mhz，cd3od)δ：12.7，114.8，115.1，131.4，131.5，132.1，132.2，137.5，161.3，163.75，170.4ppm；ms(esi)m/z179(m-h⁺).

3-(4-氟苯基)-2-甲基丙酸(3a)

在20個大氣壓的氫氣下使甲醇(190ml)中粗品丙烯酸2a(14.3g，79.4mmol)和10％pd/c(1.35g)的混合物氫化10小時。濾出催化劑并濃縮濾液得到粗品3a，其被原樣用于下一步。通過在硅膠上進行快速柱色譜(乙酸乙酯∶pe，1∶2)得到化合物3a(40)的分析樣品。3a：無色油。

ir(film)：vmax＝3406，2972，2933，1701，1560，1509，1460，1406，1223cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.17(d，j＝6.82hz，3h，chch3)，2.77-2.61(m，2h，ch2ch)，3.02(dd，j＝13.18，6.35hz，1h，ch2ch)，7.00-6.93(m，2h，ph-h)，7.16-7.11(m，2h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：16.4，38.4，41.4，115.1，115.1，130.3，130.4，134.5，134.6，160.4，162.8，182.6ppm；ms(esi)m/z181(m-h⁺).

film：膜

6-氟-2-甲基-2，3-二氫茚-1-酮(4a)

將粗品丙酸衍生物3a(3.20g)和多聚磷酸(47.0g)的混合物在80℃加熱4小時。將所得混合物傾入冰水中并用etoac萃取。合并的萃取物用飽和nahco3水溶液洗滌以除去初始的酸，然后用鹽水洗滌，經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物經快速柱色譜(乙酸乙酯∶pe，1∶30)純化得到作為淡黃色油的化合物4a(40)(1.44g，50％)。用濃hcl使nahco3層酸化，用etoac萃取(3×30ml)。合并的萃取物用鹽水洗滌，經無水na2so4干燥，過濾并在減壓下濃縮，得到回收的原始材料3a(34％)。4a的數(shù)據(jù)：

ir(film)vmax＝3064，2968，2932，2873，1716，1611，1509，1486，1444，1264，1158cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.32(d，j＝7.37hz，3h，chch3)，2.82-2.65(m，2h，ch2ch)，3.37(dd，j＝16.71，7.55hz，1h，ch2ch)，7.33-7.26(m，1h，ph-h)，7.44-7.36(m，2h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：16.2，34.4，42.9，76.3，109.7，109.9，122.2，122.5，127.8，127.9，138.1，148.8，149.6，161.1，163.6，208.5ppm；ms(esi)m/z187(m+na⁺).

2-(6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸乙酯(5a)

在0℃向hmds(15.0ml，56.9mmol)的無水thf(38.0ml)溶液中逐滴加入n-buli(在正己烷中的2.5m溶液，17.0ml，42.8mmol)。攪拌約30分鐘之后，使混合物冷卻至-78℃并加入etoac(4.20ml，42.8mmol)。在-78℃將反應物攪拌另外的30分鐘。向所得混合物中逐滴加入二氫茚酮4a的無水thf(40ml)溶液。在-78℃將反應物攪拌另外的4小時，然后用飽和nh4cl水溶液停止反應?；旌衔镉胑toac萃取(3×20ml)。合并的有機層經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。向殘余物中加入hoac/h2so4(10/1，55ml)。室溫下攪拌5小時之后，用ch2cl2(3×15ml)萃取混合物。合并的萃取物依次用水、飽和nahco3和鹽水洗滌，經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物在硅膠上經快速柱色譜(乙酸乙酯∶pe，1∶30)純化得到作為無色油的化合物5a(40)(3.26g，70％)。

ir(film)vmax＝2981，2911，1736，1614，1590，1473，1368，1329，1308，1256，1154，1034cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.25(t，j＝7.13hz，3h，cooch2ch3)，2.12(s，3h，cch3)，3.29(s，2h，phch2c)，3.48(s，2h，phcch2)，4.14(q，j＝7.13hz，2h，cooch2ch3)，6.79(ddd，j＝9.62，8.12，2.41hz，1h，ph-h)，6.96(dd，j＝9.33，2.40hz，1h，ph-h)，7.25(dd，j＝8.17，4.93hz，1h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：14.1，14.3，31.5，42.1，60.9，105.6，105.9，110.2，110.4，123.6，123.7，129.6，129.6，137.2，137.2，144.6，147.8，147.9，161.2，163.6，170.7ppm；ms(esi)m/z257(m+na⁺).

(z)-2-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸

(舒林酸硫化物)(6a)

室溫下向茚5a(650mg，3mmol)的meoh(4.6ml)溶液中加入2nnaome(4.6ml，9mmol)得到橙色混合物。攪拌20分鐘之后，向混合物中加入對(甲硫基)苯甲醛(0.8ml，7.5mmol)。在80℃使所得混合物回流3.5小時。在減壓下濃縮之后，將殘余物傾入1nhcl溶液中。室溫下攪拌另外的10小時之后，用etoac(3×15ml)萃取混合物。合并的有機層經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物經閃式色譜(乙酸乙酯∶pe，1∶2.5)純化，主要得到作為黃色固體的順式(z)異構體6a(舒林酸硫化物)(40)(868mg，85％)。得到的反式(e)異構體為約2％。熔點182-185℃(etoac)(文獻(40)熔點180-184℃)。

ir(kbr)vmax＝3445，3012，2914，2850，1702，1602，1589，1465，1410，1320，1240，1171，1085cm^-1；¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ：2.15(s，3h，c＝cch3)，2.54(s，3h，sch3)，3.57(s，2h，ch2coo)，6.77-6.71(m，1h，vinylh)，7.01(dd，j＝9.31，2.25hz，1h，vinylh)，7.25-7.46(m，5h，ph-h)，12.40(s，1h，cooh)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：10.7，14.7，31.5，106.1，106.4，110.6，110.8，123.4，123.5，125.8，130.0，130.3，131.0，132.1，132.6，138.5，139.5，139.5，139.5，147.2，147.3，161.5，161.6，172.1ppm；ms(esi)m/z331(m+na⁺).

按照舒林酸硫化物(6a)所述的步驟，并且通過茚5a與適當?shù)姆甲迦┛s合，分別合成了化合物k-80001至k-80003。

(z)-2-(3-(4-甲基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸(6b)

(k-80001)

黃色固體。熔點155-158℃。產率：87％。

ir(kbr)vmax＝3426，3022，2959，2915，1733，1717，1655，1599，1512，1470，1408，1381，1214，1172cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：2.19(s，3h，c＝cch3)，2.41(s，3h，ph-ch3)，3.58(s，2h，ch2co2h)，6.59-6.53(m，1h，vinylh)，6.87(dd，j＝8.98，2.40hz，1h，vinylh)，7.44-7.16(m，6h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：10.61，21.43，29.73，31.44，105.54，105.77，110.48，110.71，123.73，123.83，129.21，129.32，129.78，129.80，129.84，129.87，131.00，131.02，133.48，138.29，138.95，139.76，146.13，146.22，161.84，164.29，176.68ppm；ms(esi)m/z363(m+na⁺).

c20h17fo2的分析計算值：c，77.90；h，5.56。測定值：c，77.88；h，5.99。

(z)-2-(3-(4-乙基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸(6c)

(k-80002)

黃色固體。熔點159-162℃。產率：83％。

ir(kbr)vmax＝3082，3024，2965，2923，1705，1604，1473，1465，1413，1312，1229，1168cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.29(t，j＝7.61hz，3h，ch2ch3)，2.20(s，3h，c＝cch3)，2.71(q，j＝7.60hz，2h，ch2ch3)，3.59(s，2h，ch2coo)，6.60-6.54(m，1h，aromaticvinylh)，6.88(dd，j＝8.97，2.39hz，1h，aromaticvinylh)，7.19-7.44(m，5h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：10.6，15.4，28.7，31.4，105.5，105.7，110.5，110.7，123.7，123.8，128.0，129.4，129.7，129.9，131.0，133.7，138.9，139.7，144.6，161.8，164.2，176.4ppm；ms(esi)m/z345(m+na⁺).

c21h19fo2的分析計算值：c，78.24；h，5.94。測定值：c，78.21；h，5.55。

(z)-2-(3-(4-異丙基苯亞甲基)-6-氟-2-甲基-3h-茚-1-基)乙酸(6d)

(k-80003)

黃色固體。熔點146-149℃。產率：79％。

ir(kbr)vmax＝3025，2958，2871，1701，1629，1603，1507，1464，1412，1315，1293，1171，1134cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.31(d，j＝6.95hz，6h，ch(ch3)2)，2.20(s，3h，c＝cch3)，2.97(td，j＝13.81，6.91hz，1h，ch(ch3)2)，3.59(s，2h，ch2coo)，6.61-6.88(m，2h，aromaticvinylh)，7.19-7.46(m，6h，ph-h)；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：10.6，23.9，31.3，34.0，76.7，105.5，105.7，110.5，110.7，123.7，123.8，126.5，129.4，129.7，129.8，131.0，133.7，139.0，139.6，146.1，146.2，149.3，161.8，164.2，176.1ppm；ms(esi)m/z359(m+na⁺).

c22h21fo2的分析計算值：c，78.55；h，6.29。測定值：c，78.13；h，6.02。

2-(6-氟-3h-茚-1-基)乙酸乙酯(5b)

在0℃向異丙胺(0.27ml，2mmol)的無水thf(4ml)溶液中逐滴加入n-buli(在正己烷中的2.5m溶液，0.8ml，2mmol)。攪拌約30分鐘之后，使混合物冷卻至-78℃并加入etoac(0.2ml，2mmol)。在-78℃攪拌另外的30分鐘之后，逐滴加入無水thf(0.7ml)中的二氫茚酮4b(150mg，1mmol)。在-78℃將反應物攪拌另外的2小時，然后用飽和nh4cl停止反應。用etoac萃取(3×5ml)混合物。合并的有機層經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。用acoh/h2so4(10/1，3ml)取出殘余物。室溫下攪拌3小時之后，用ch2cl2(3×5ml)萃取混合物。合并的萃取物依次用水、飽和nahco3和鹽水洗滌。有機相經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物經硅膠上的快速柱色譜(乙酸乙酯：pe，1：30)純化得到作為無色油的5b(99mg，49％)。

ir(film)vmax＝3054，2982，2931，1704，1636，1486，1446，1369，1345，1288，1276cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：1.28(t，j＝7.15hz，3h，ch2ch3)，3.35(s，2h，ch2co2et)，3.56(dd，j＝2.93，1.51hz，2h，ch2ch)，4.19(q，j＝7.15hz，2h，ch3ch2)，6.52(s，1h，c＝ch)，6.93-7.36(m，3h，ph-h)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：14.2，34.1，37.4，61.0，106.4，106.7，111.4，111.6，124.3，124.4，134.1，136.3，136.4，139.2，139.3，146.3，146.4，161.1，163.5，170.72ppm.

c13h＝fo＝的分析計算值：c，70.90；h，5.95。發(fā)現(xiàn)值：c，71.30；h，6.23。

(e)-2-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-3h-茚-1-基)乙酸(6e)

(k-80004)

室溫下向茚衍生物5b(506mg，2.50mmol)的meoh(4ml)溶液中加入2nnaome(4ml，4mmol)。攪拌20分鐘之后，向所得混合物中加入對(甲硫基)苯甲醛(0.65ml，2.50mmol)。在80℃使混合物回流3.5小時。所得溶液在減壓下濃縮，然后傾入1nhcl中。室溫下攪拌另外的10小時之后，用etoac(3×10ml)萃取混合物。合并的有機層經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物經硅膠上的快速柱色譜(乙酸乙酯∶pe，1∶2.5)純化，得到作為黃色固體的反式(e)異構體6e(k-80004)(429mg，48％)。熔點180-182℃(etoac)。

¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：2.54(s，3h，sch3)，3.69(s，2h，ch2coo)，7.09-7.84(m，9h，ph-h)，12.52(s，1h，cooh)ppm；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：13.6，115.5，115.7，127.3，131.7，131.8，139.9，161.5，163.9，174.0ppm.

c19h15fo2s的分析計算值：c，69.92；h，4.63；f，5.82；o，9.80；s，9.82。測定值：c，70.16；h，4.92。

螺(二氫-2(3h)呋喃酮-5-1’(2’h)(3’h)-6-氟-二氫化茚(7a)

用氬氣使6-氟-1-茚滿酮4b(75.0mg，0.50mmol)、異丙醇(0.190ml，2.50mmol)和丙烯酸甲酯(0.45ml，5mmol)的thf(10ml)溶液凈化20分鐘并冷卻至0℃。通過接種針加入sml2(1.50mmol)的thf(15ml)溶液。5分鐘后，用飽和k2co3(2ml)使反應停止。所得混合物用etoac(3×3ml)萃取。合并的有機層用鹽水洗滌，經無水na2so4干燥，過濾并在減壓下濃縮。殘余物經硅膠上的快速柱色譜用etoac-pe(1∶6)洗脫純化，得到作為無色油的化合物7a(74.5mg，0.37mmol，73％)。

ir(film)vmax：3058，2945，2856，1766，1603，1494，1155cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：2.28-2.52(m，4h，arcch2)，2.77(dt，j＝8.0，1.2hz，2h，arcch2ch2co)，2.81-2.90(m，1h，arch2)，3.00-3.09(m，1h，arch2)，6.96-7.03(m，2h，ar-h)，7.18-7.23(m，1h，ar-h)；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：28.7，29.5，33.3，39.4，94.1，109.7(d，jc-f＝22.4hz)116.6(d，jc-f＝22.5hz)，126.2(d，jc-f＝8.3hz)，138.8，144.7(d，jc-f＝7.4hz)，162.2(d，jc-f＝233.5hz)，176.0ppm；

c12h11fo2的分析計算值：c，69.89；h，5.38。測定值：c，69.97；h，5.62。

3-(6-氟-3h-茚-1-基)丙酸甲酯(8a)

向螺(二氫-2(3h)呋喃酮-5-1’(2’h)(3’h)-6-氟-二氫化茚7a(61mg，3mmol)的ch3oh(1.5ml)溶液中加入p-tsoh(6mg)。使混合物回流2小時。用nahco3的飽和水溶液(2.0ml)使反應停止。所得混合物用etoac(3×2ml)萃取。合并的有機相用鹽水洗滌，經無水na2so4干燥，過濾，并在減壓下濃縮。殘余物經硅膠上的快速柱色譜用etoac-pe(1∶300)洗脫純化，得到作為淡黃色油的化合物8a(61mg，0.28mmol，94％)。

ir(film)vmax：2959，2901，1739，1585，1606，1473，1254，1162cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：2.68-2.73(m，2h，ch2coo)，2.82-2.88(m，2h，arcch2)，3.28-3.31(m，2h，arch2)，3.71(s，3h，cooch3)，6.30(t，1h，j＝1.6hz，arc＝ch)，6.83-6.91(m，1h，ar-h)，7.02-7.06(m，1h，ar-h)，7.33-7.38(m，1h，ar-h)；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：22.9，32.4，37.3，51.7，106.0(d，jc-f＝23.1hz)，111.4(d，jc-f＝22.8hz)，124.4(d，jc-f＝8.9hz)，130.3，139.5，142.4(d，jc-f＝3.0hz)，146.9(d，jc-f＝8.5hz)，162.4(d，jc-f＝240.6hz)，173.4ppm；

c13h13fo2的分析計算值：c，70.90；h，5.95。測定值：c，70.50；h，5.97。

(e)-3-(3-(4-(甲硫基)苯亞甲基)-6-氟-3h-茚-1-基)丙酸甲酯(9a)

(k-80005)

用氮氣使3-(6-氟-3h-茚-1-基)丙酸甲酯8a(110mg，0.5mmol)的ch3oh(1ml)溶液凈化10分鐘并冷卻至0℃。逐滴加入新鮮配制的ch3oh(1ml)中的ch3ona(0.75mmol)。攪拌30分鐘之后，逐滴加入4-(甲硫基)苯甲醛(63μl，0.6mmol)。使混合物回流2小時。冷卻之后，用水(3ml)使反應停止并在室溫下攪拌10分鐘，用1mhcl使混合物酸化至ph＝4。在減壓下蒸發(fā)溶劑，并用etoac(3×5ml)萃取殘余物。合并的有機層用鹽水(2ml)洗滌，經無水na2so4干燥，過濾并在真空下濃縮。殘余物經硅膠上的快速柱色譜用etoac-pe(1∶4)洗脫純化，得到作為黃色固體的反式(e)-異構體9a(112mg，66％)。熔點：182-184℃(etoac)；

ir(kbr)vmax：3055，2988，2925，1711，1640，1488，1445，1656，1290，1277cm^-1；¹hnmr(400mhz，cdcl3)δ：2.53(s，3h，sch3)，2.68(t，2h，j＝7.6hz，ch2coo)，2.84(t，2h，j＝7.6hz，arcch2)，6.96-7.84(m，9h，ar-h)，12.21(s，cooh)；¹³cnmr(100mhz，cdcl3)δ：14.3，22.6，32.0，106.1(d，jc-f＝23.4hz)，111.5(d，jc-f＝23.0hz)，120.5(d，jc-f＝9.2hz)，122.6，125.8(2c)，127.3，130.4(2c)，132.8，134.1，136.4，139.4，143.2(d，jc-f＝8.8hz)，146.3，162.2(d，jc-f＝240.5hz)，173.8ppm；

c20h17fo2s的分析計算值：c，70.57；h，5.03；s，9.42。測定值：c，70.20；h，4.62；s，9.01

k-80003類似物no.1(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.2(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.3(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.4(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.5(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.6(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.7(r1變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.8(r2變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.9(r2變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.10(r2變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.11(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.12(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.13(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.14(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.15(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.16(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.17(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.18(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.19(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.20(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.21(r3變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.22(r4變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.23(r4變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.24(r4變體；黃色固體)：

k-80003類似物no.25(r1變體)：

k-80003類似物no.26(r1變體)：

k-80003類似物no.27(r3變體)：

其中r3＝2-cn。

k-80003類似物no.28(r3變體)：

其中r3＝2-cf3。

k-80003類似物no.29(r3變體)：

其中

k-80003類似物no.30(r3變體)：

其中

k-80003類似物no.31(r4變體)：

其中r4＝et。

k-80003類似物no.32(r4變體)：

其中r4＝eto。

k-80003類似物no.33(r4變體)：

其中r4＝i-pr。

k-80003類似物no.34(r4變體)：

其中r4＝cl。

方法摘要

質粒

已描述了rxrα和myc-rxrα的構建(kolluri，s.k.等，procnatlacadsciusa102(7)，2525-2530(2005)；cao，x.，等，retinoidxreceptorregulatesnur77/tr3-dependentapoptosis[corrected]bymodulatingitsnuclearexportandmitochondrialtargeting.molcellbiol24(22)，9705-9725(2004)；masia，s.等，rapid，nongenomicactionsofretinoicacidonphosphatidylinositol-3-kinasesignalingpathwaymediatedbytheretinoicacidreceptor.molendocrinol21(10)，2391-2402(2007)；ohashi，e.等，cancerres69(8)，3443-3450(2009)；balkwill，f.，natrevcancer9(5)，361-371(2009)；han，y.h.等，oncogene25(21)，2974-2986(2006))。使用正向引物5’-ccggaattccatgagtgctgaggggtacc-3’(seqidno：1)和反向引物5’-acgcgtcgactcatcgcctctgctgtgcat-3’(seqidno：2)通過聚合酶鏈式反應(pcr)構建flag-p85α。pcr產物經ecori和sali消化并被克隆到pcmv-flag載體中。通過以下寡核苷酸作為引物，使用誘變試劑盒(stratagene，lajolla，ca)構建rxrα突變體：rxrα/f313s/r316e，5’-ggaacgagctgctgatcgcctcctcctcccacgagtccatagctgtgaaagatggg(正向-seqidno：3)和5’-cccatctttcacagctatggactcgtgggaggaggaggcgatcagcagctcgttcc(反向-seqidno：4)；rxrα/δ80，5’-ccggaattcggaccacacccaccctgggc-3’(正向-seqidno：5)和5’-ccgctcgagctaagtcatttggtgcggcg-3’(反向-seqidno：6)；rxrα/δ100，5’-ccggaattcgggtcagcagcagcgaggac-3’(正向-seqidno：5)和5’-ccgctcgagctaagtcatttggtgcggcg-3’(反向-seqidno：6)。pcr產物經ecori和xhoi消化并被連接到pcmv-myc載體中。

細胞培養(yǎng)

在補加有10％胎牛血清(fbs)的rpmi1640中培養(yǎng)zr-75-1人乳癌、lncap和pc3前列腺癌和h460肺癌細胞。在包含10％fbs的mem中培養(yǎng)hepg2肝癌和mcf-7人癌細胞。在補加有10％fbs的dmem中培養(yǎng)hek293t人胚腎細胞、cv-1綠猴腎細胞、mef細胞、a549人肺癌細胞、hacat人類角化細胞、bhk倉鼠崽腎細胞、caco2人結腸癌癌細胞、sw480人結腸腺癌細胞和hct116人結腸細胞。f9鼠胚胎癌細胞系具有破壞的rxrα等位基因(clifford，j.等，emboj15(16)，4142-4155(1996))。使細胞培養(yǎng)物維持在37℃和5％co2潮濕氣氛下。

抗體和試劑

anti-phospho-akt(ser473，d9e，#4060)來自cellsignalingtechnology(danvers，ma)?？功?肌動蛋白(a1978)和抗flag(m2，f3165)抗體得自于sigma-aldrich(st。louis，mo)?？筽85α(#06-195)抗體購買自millipore(billerica，ma)。akt1(c-20)sc-1618、gfp(b-2)sc-9996、hsp60(n-20)sc-1052、c-myc(9e10)sc-40pi3，rarγ(c-19)sc-550、rxrα(d20)sc-553、rxrα(δn197)sc-774、parp(h-250)sc-7150的抗體來自santacruzbiotechnology(santacruz，ca)。ecl、抗兔和抗小鼠igg、與辣根過氧化酶連接的物種特異性抗體(horseradishperoxidase-linkedspecies-specificantibody)來自gehealthcare(littlechalfont，buckinghamshire，uk)。alexa594山羊抗兔igg(a-11012)和alexa488山羊抗小鼠igg(a-10667)購買自invitrogen(carlsbad，ca)。蛋白a/g瓊脂糖(proteina/gplus-agarose)(sc-2003)來自santacruzbiotechnology(santacruz，ca)。重組人tnfα(210-ta)來自r&dsystems(minneapolis，mn)。蛋白酶抑制劑混合片劑來自roche(basel，switzerland)。9-順式視黃酸(9-順式-ra)(r4643)。將舒林酸硫化物及其類似物以在原液中100mm溶解于二甲亞砜(dmso)。全反式視黃酸(atra)(r2625)和胰凝乳蛋白酶來自sigma-aldrich(st.louis，mo)。sr11237由marciai.dawson博士(burnhaminstitute)友好提供。

配體結合測定

在存在或不存在多種濃度的未標記的9-順式-ra或舒林酸硫化物的情況下，在配體結合測定緩沖液中將細菌表達的his標記的rxrα配體結合結構域(lbd)與[³h]-9-順式-ra(amershambiosciences，amersham，uk)一起孵育。通過涂鎳珠捕獲rxrαlbd蛋白。根據(jù)描述(kolluri，s.k.等，procnatlacadsciusa102(7)，2525-2530(2005))，在閃爍計數(shù)器中測定結合的放射性標記的9-順式-ra。

細胞中舒林酸硫化物與rxrα蛋白結合的hplc分析

使用fugene6轉染劑(roche，basel，switzerland)將包含與c-端tap融合體融合的受體的表達載體(stratagene，lajolla，ca)轉染到hek293細胞中。在補加有10％小牛血清(scs，hyclonelogan，ut)、2mm谷氨酰胺、盤尼西林(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)的完全培養(yǎng)基dmem(mediatechinc.，herndon，va)中以指數(shù)生長形式培養(yǎng)細胞。轉染兩天后，將細胞轉移至包含400mg/mlg418的培養(yǎng)基中直至轉染后20天，此時對盤中的耐藥性集落進行計數(shù)檢查。通過免疫印跡測定rxrα融合蛋白的表達。在4個150mm板上細胞生長至飽和，隨后用或者不用100mm舒林酸處理3小時。處理之后，細胞用50ml冷pbs洗滌兩次，并且如interplay^tm哺乳動物tap系統(tǒng)(stratagene，lajolla，ca)中所述進行基于鏈霉親和素的純化，其通過首先用提供的鏈霉親和素結合緩沖液洗滌鏈霉親和素珠來手動進行。然后加入0.1ml份的稀硫酸溶液(ph2)，然后加入1.0ml的乙腈。之后使樣品在渦流混合器上渦旋30秒后離心(1000g×5分鐘)。然后將液體樣品轉移至另一支管中并在氮氣流下蒸干。將殘余物重新溶解到0.12ml色譜流動相中，并且將0.1ml份注射到hplc。使用microsorb-mv100-3c18100×4.6柱(varian，paloalto，ca)進行hplc分析。流動相由4％v/v的含水乙酸和乙腈(30∶70)組成，以1.0ml/min的流速泵入。使用光電池檢測器(watersmodel2996，waterscorporation，milford，ma)進行舒林酸硫化物的檢測，收集在200與450nm之間的譜圖。使用舒林酸硫化物的標準溶液以得到校準曲線。特征峰譜和駐留時間被用于鑒定，并且通過使用millenniumchromatographymanager軟件(waterscorporation，milford，ma)計算用于定量的4max處的峰面積。示出三個相似實驗中的一個。

蛋白水解保護測定

如先前所述(kolluri，s.k.等，procnatlacadsciusa102(7)，2525-2530(2005)；zhang，x.k.等，nature355(6359)，441-446(1992)；zhang，x.-k.等，nature.358(6387)，587-591(1992))，使用兔網織紅細胞裂解產物(promega，fitchburg，wi)通過體外轉錄-翻譯合成rxrαlbd。用溶劑(1％dmso)、舒林酸(100μm)或9-順式-ra(10^-7m)對體外轉錄的³⁵[s]甲硫氨酸標記的rxrα-lbd進行預孵育30分鐘，然后用指示濃度的胰凝乳蛋白酶進行消化。通過page分離消化片段。

瞬時轉染測定

如所述(kolluri，s.k.等，procnatlacadsciusa102(7)，2525-2530(2005)；cao，x.，等，molcellbiol24(22)，9705-9725(2004))，使用改良的磷酸鈣沉淀方法對接種在24孔板中的細胞(1×10⁵個細胞/孔)進行瞬時轉染。

凋亡測定

對于細胞核形態(tài)變化分析，對細胞進行胰蛋白酶消化，用pbs洗滌，用3.7％多聚甲醛固定，并用dapi(4，6-二脒基-2-苯基吲哚)(1mg/ml)染色，以通過熒光顯微鏡對核進行觀察(masia，s.等，rapid，nongenomicactionsofretinoicacidonphosphatidylinositol-3-kinasesignalingpathwaymediatedbytheretinoicacidreceptor.molendocrinol21(10)，2391-2402(2007)；ohashi，e.等，cancerres69(8)，3443-3450(2009)；balkwill，f.，natrevcancer9(5)，361-371(2009))。通過計數(shù)至少300個具有核片段化和/或染色質凝聚的gfp陽性細胞來確定凋亡細胞的百分數(shù)。為了確定dna片段化，使用細胞死亡檢測elisa^plus試劑盒(celldeathdetectionelisa^plus)(rocheappliedscience，penzberg，bavaria，germany)。示出三個相似實驗中的一個。

rxrα和rarγsirna

rxrαsirnasigenomesmarpool(m-003443-02)、rarγsirnasigenomesmarpool(m-003439-01)和sirnanon-specificcontrolix(d-001206-09-05)購買自dharmacon(lafayette，co)。根據(jù)制造商建議使用oligofectamine試劑(invitrogen，carlsbad，ca)將20mmsirna以2.5μl等份/孔轉染到在12孔板上生長的細胞中。轉染兩天后，收集細胞用于western印跡。

免疫印跡

為了免疫印跡，將細胞裂解產物在sds樣品緩沖液中煮沸，通過sds-聚丙酰胺凝膠電泳分離，并轉移到硝化纖維上。轉移之后，將膜在包含抗體的tbst(10mmtris-hcl，ph.8.0、150mmnacl、0.05％吐溫20)中的5％牛奶中封閉。然后用tbst將膜洗滌三次，然后在室溫下在包含辣根過氧化物酶連接的抗免疫球蛋白的tbst中的5％牛奶中孵育1小時。

免疫共沉淀(coip)測定

為了coip測定，將細胞或經指示表達載體轉染的細胞懸于裂解緩沖液(50mmtris-hci，ph7.4；150mmnacl；20mmedta；1％np-40；1mmpmsf；50mg/ml亮抑肽酶；20mg/ml抑肽酶；0.1mmna3vo4；和1mmdtt)中。通過與蛋白a/g瓊脂糖珠(santacruzbiotechnology，santacruz，ca)孵育清以純化細胞提取物，然后在4℃與適當抗體和30ml蛋白a或g瓊脂糖珠一起孵育過夜。然后洗滌珠子并在laemmli凝膠負載溶液中煮沸后，使用多克隆或單克隆抗體進行sds-page/免疫印跡。使用增強化學發(fā)光系統(tǒng)(ecl^tm)(amershambiosciences，amersham，uk)通過化學發(fā)光檢測免疫反應產物。

hela-rxrα/1-134穩(wěn)定克隆和軟瓊脂測定

將rxrαn-端片段1-134克隆到pntap載體(stratagene，lajolla，ca)中。將所得pntap-rxrα/1-134轉染到hela細胞中。轉染48小時后，用400ng/mlg418對細胞進行選擇2周。撿出單一克隆并通過免疫印跡進行檢查。將helarxr/α1-134穩(wěn)定克隆和經對照pntap載體轉染的hela細胞以5×10³個細胞/孔(6孔板)接種到補加有10％fbs和0.35％瓊脂糖以及0.5％床瓊脂的dmem中。在37℃孵育12天之后，用0.005％結晶紫對集落進行染色1小時并計數(shù)。

集落形成測定

將helarxr/α1-134穩(wěn)定克隆和對照hela細胞接種到6孔板中，350個細胞/孔。5天之后，在0.5％血清培養(yǎng)基中用舒林酸(50μm)和k-80003(25μm)處理細胞3天。用pbs洗滌之后，用pbs中的4％多聚甲醛將細胞固定20分鐘。用0.1％結晶紫對集落進行染色30分鐘，照相并對集落進行計數(shù)。

人組織和評價

通過手術切除從癌癥患者中得到乳房和肝腫瘤組織及其周圍組織。組織學正常的樣本(遠離腫瘤結節(jié)約至少3至5cm)得自于相應患者。該研究由廈門大學生物醫(yī)學研究倫理委員會認可，并且所有的患者都知情同意。

收集來自患原發(fā)性肝細胞癌(hcc，n＝6)或乳癌(n＝6)患者的組織用于檢測rxrα的表達。為了進行免疫印跡測定，單獨準備制備腫瘤及其周圍組織并在改良的ripa緩沖液中進行裂解。裂解產物在8％sds-page凝膠上進行電泳并轉移到pvdf膜上。將膜依次與δn197抗rxrα抗體(1∶1000)在4℃孵育過夜，與辣根過氧化物酶綴合的抗兔igg抗體(1∶5000)在室溫下孵育1小時，然后通過增強化學發(fā)光(ecl^tm)(amershambiosciences，amersham，uk)進行檢測。通過用于負載對照的單克隆抗gapdh抗體(1∶2000)對條狀印跡進行重新探測。為了進行免疫組織化學分析，在4℃將組織部分與δn197抗rxrα抗體(1∶500)一起孵育過夜并在室溫下通過山羊抗兔特異性免疫球蛋白(1∶100)檢測30分鐘。玻片用蘇木精進行對比染色。

共聚焦顯微鏡

將經myc標記的rxrα/δ80和flag標記p85α的轉染的細胞接種到室玻片(chamberslide)上過夜。在包含3.7％多聚甲醛的pbs中使細胞固定10分鐘并用pbs洗滌兩次。然后用pbs中的0.1％tritonx-100對細胞進行透化處理5分鐘。室溫下將固定的細胞在包含5％bsa的pbs中預孵育30分鐘。用多克隆抗myc抗體(1∶500稀釋)和抗flag抗體(1∶500稀釋)，然后用cy3綴合的抗兔igg(1∶1000，sigma-aldrich，st.louis，mo)或fitc標記的抗鼠igg(1∶500，sigma-aldrich，st.louis，mo)對細胞進行染色。原稿中示出的共聚焦顯微鏡數(shù)據(jù)表示至少三組相似實驗。

亞細胞分級分離

如具有小改良的描述進行亞細胞分級分離(cao，x.，等，molcellbiol24(22)，9705-9725(2004)；ohashi，e.等，cancerres69(8)，3443-3450(2009))。

簡言之，使懸于0.5ml低滲緩沖液(250mm蔗糖、20mmhepes-koh、ph7.4，10mmkcl、10mmmgcl2、0.5mmegta、1.5mmedta，ph8.0和1mmdtt)中的細胞(1×10⁷個細胞)與蛋白酶抑制劑混合均勻，并且在800×g下將細胞提取物離心10分鐘。將包含細胞核的沉淀重懸于在低滲緩沖液和蛋白酶抑制劑的200μl1.6m蔗糖中并且在相同緩沖液的1ml2.0m蔗糖中短暫保留，然后在4℃以150,000×g離心90分鐘以得到細胞核級分。在4℃以10,000×g使上清液離心30分鐘以得到胞質級分。將細胞核和細胞質級分重懸于帶有蛋白酶抑制劑混合物的100μl裂解緩沖液(10mmtris，ph7.4，150mmnacl，1％tritonx-100，5mmedta，ph8.0)中用于免疫印跡分析。

cox測定

cox熒光活性測定試劑盒(700200)、cox熒光抑制劑篩選測定試劑盒(700100)和前列腺素e2酶免疫測定(eia)試劑盒(514010)得自于caymanchemical(annarbor，mi)。根據(jù)制造商方案進行cox-1和cox-2活性測定。

化學合成

在brukerav400光譜儀(bremen，germany)上記錄¹hnmr和¹³cnmr譜。在指示溶劑中記錄譜¹hnmr，并且化學位移相對于內參me4si以百萬分之一(δ)為單位表示。在nicoletavatar360ft-ir分光光度計(thermofisherscientific，waltham，ma)上記錄ir譜。通過brukerdaltonesquire3000plus(esi直接噴射)(bremen，germany)記錄質譜。使用variorl分析器進行元素分析。在x-4微量熔點(micromeltingpoint)設備上測定熔點且不修正。用于本研究的6-氟-1-茚滿酮4b可商購。四氫呋喃在使用之前從鈉苯甲酮羰游基(sodiumbenzophenoneketyl)蒸餾得到。二氯甲烷從五氧化二磷中蒸餾得到。甲醇從鎂屑和碘中蒸餾得到。來自煙臺硅膠廠(中國)硅膠(zhifu，300-400目)被用于柱色譜，(除非另有說明)否則用乙酸乙酯/石油醚(pe)(60-90℃)混合物或二氯甲烷/甲醇洗脫。

雖然為了清楚和理解的目的，對本發(fā)明進行了一些詳細描述，但是本領域技術人員應理解在不偏離本發(fā)明真實范圍的情況下可以對形式和細節(jié)做出多種變化。本文所指的所有圖、表、專利、專利申請和公開其整體都通過引用并入本文。