本發(fā)明涉及番茄紅素異構(gòu)體的一種新用途，具體涉及番茄紅素順式異構(gòu)體在制備卵巢癌ho-8910細胞增殖和凋亡影響藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

番茄紅素(lycopene，lyp)具有猝滅活性氧、消除人體自由基，預(yù)防心臟病、減緩動脈粥樣硬化、預(yù)防多種癌癥、抗老化、保護皮膚等生理功能。流行病學研究表明，血液中l(wèi)yp濃度與前列腺癌、食道癌、胰腺癌、胃腸癌、乳腺癌、皮膚癌、膀胱癌等的發(fā)生率呈負相關(guān)。許多體外細胞實驗都證實了這一點，lyp對食管癌細胞系(eca9706)有抑制生長作用，對人前列腺癌pc-3細胞和乳腺癌mda-mb-231細胞均有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用，對宮頸癌hela細胞及小鼠前胃組織癌變也有一定抑制作用。但lyp對具高發(fā)病率的卵巢癌是否有抑制作用在本發(fā)明人研究論文見刊前尚未見報道。

lyp可降低乳腺癌細胞絲裂原的活性，抑制細胞周期停滯于g1期至s期，lyp可以增強細胞間隙連接通訊(gjic)功能，促進吞噬細胞、淋巴細胞間的相互作用，通過分泌細胞活化因子活化細胞，最終表現(xiàn)為對吞噬能力及淋巴細胞轉(zhuǎn)化的促進，增強免疫功能進而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。2012年natuer發(fā)表的一份研究報告報道：乳腺癌遺傳分析顯示其致癌原因與卵巢癌相似。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供番茄紅素順式異構(gòu)體在制備卵巢癌治療藥物中的應(yīng)用。

番茄紅素結(jié)構(gòu)式

番茄紅素，分子式c40h56，相對分子質(zhì)量536.85，是膳食中一種重要的類胡蘿卜素，主要存在于番茄及其制品、西瓜、石榴、秋橄欖和紫色葡萄柚中。天然來源的番茄紅素主要以全反式形式存在，是最穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。在人類血漿中，番茄紅素含量為0.2-1.0μmol/l，主要以順式構(gòu)型存在，反式構(gòu)型只占41％。國外研究證明，順式番茄紅素更容易被人體吸收，也具有更高的生物活性。

國內(nèi)外關(guān)于番茄紅素與癌的關(guān)系文獻中，對順、反異構(gòu)體的作用差異研究尚未見報道。由此，發(fā)明人首次提出假說：由反式番茄紅素可異構(gòu)化得到的順式番茄紅素，且二者對人卵巢癌ho-8910細胞抑制增殖與誘導(dǎo)凋亡作用存在差異性。本發(fā)明中，運用細胞實驗證實了上述假說，初步研究結(jié)果提示，含高比例順式的lyp體外抑制ho-8910細胞的作用比全反式lyp更強一些，且二者濃度在10μg·ml^-1和20μg·ml^-1時，抑制率和凋亡率比較有顯著性差異。

順式番茄紅素采用由全反式番茄紅素異構(gòu)化制備，參照pierrelambelet等的方法進行順式化處理：稱取購自的番茄紅素粉末適量，用經(jīng)膜過濾的乙酸乙酯溶液溶解，制成1mg·ml^-1的溶液，避光100℃水浴回流5h，在4℃條件下放置12h，過濾，去除結(jié)晶(i號藥，全反式番茄紅素)，濾液減壓蒸發(fā)至干，得到紅色針狀晶體(ii號藥，順式番茄紅素粉末)。

番茄紅素順式異構(gòu)體目前尚未用于制備藥物，保健品的劑型為膠囊劑和片劑。

具體實施方式

1材料與方法

1.1實驗材料

番茄紅素粉末(純度90％)(華北制藥股份有限公司)

ho-8910細胞株(中南大學湘雅醫(yī)院細胞中心)

四氮唑鹽(sigma公司)

0.4％臺盼藍(gibco公司)

rpm-1640(gibco公司)

新生小牛血清(杭州四季青)

多西他賽注射液(doc，恒瑞醫(yī)藥)

二甲基亞砜(dmso)

乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯(國藥集團化學試劑有限公司)

1.2順式番茄紅素的合成與分離

參照pierrelambelet等的方法進行順式化處理：稱取購自華北制藥公司的番茄紅素粉末適量，用經(jīng)膜過濾的乙酸乙酯溶液溶解，制成1mg·ml^-1的溶液，避光100℃水浴回流5h，在4℃條件下放置12h，過濾，去除結(jié)晶(i號藥)，濾液減壓蒸發(fā)至干，得到紅色針狀晶體(ii號藥)。

番茄紅素油溶液的制備與紫外光譜掃描：按文獻^[5]方法，分別稱取i、ii號藥及番茄紅素粉末各0.0200g置100ml量瓶中，各瓶先加入dmso0.5ml，再加入葵花籽油稀釋至刻度，搖勻，制成儲備液。精密量取儲備液1ml加葵花籽油定容至100ml量瓶中，搖勻，于200～600nm處掃描紫外吸收光譜。

將i、ii號藥油溶液通過hplc分離：按文獻方法，將i、ii號藥油溶液通過hplc分離檢測純度，色譜條件為色譜柱：cosmosilcholester柱(4.6mm×250mm，5um)，流動相為四氫呋喃∶乙腈＝15∶85(v/v)，進樣量20ul，流速1ml·min^-1，柱溫15℃，檢測波長472nm。以番茄紅素粉末和i號藥作為對照品，ii號藥作為供試品，均制成含番茄紅素0.1mg·ml^-1的對照品和供試品溶液。

1.3ho-8910細胞的培養(yǎng)及分組

用含10％小牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基于37℃、5％co2飽和濕度下培養(yǎng)。培養(yǎng)基中細胞貼壁生長，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。實驗設(shè)9個組(1)空白對照組：僅含培養(yǎng)液；(2)溶劑對照組：含0.5％dmso的培養(yǎng)液；(3)ii號藥低劑量組：順式番茄紅素含量約5μg·ml^-1；(4)ii號藥中劑量組：順式番茄紅素含量約10μg·ml^-1；(5)ii號藥高劑量組：順式番茄紅素含量約20μg·ml^-1；(6)i號藥低劑量組：反式番茄紅素含量約5μg·ml^-1；(7)i號藥中劑量組：反式番茄紅素含量約10μg·ml^-1；(8)i號藥高劑量組：反式番茄紅素含量約20μg·ml^-1；(9)陽性藥對照組：終濃度為0.2μg·ml^-1的doc溶液。

1.4ho-8910細胞生長曲線的測定

收集對數(shù)生長期ho-8910細胞5×10⁵/l接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1ml，然后每孔分別加入1.3項下各組溶液，置37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并在24、48、72、96、120h作細胞計數(shù)。計數(shù)時，用0.4％臺盼藍檢查細胞存活率在95％以上。每組3個復(fù)孔，取其平均值繪制生長曲線。

1.5mtt法

取對數(shù)生長期ho-8910細胞制成1×10⁵個/l的單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，待細胞貼壁后每孔分別加入1.3項下各組溶液，總體積為每孔200ul，每一劑量設(shè)4個復(fù)孔，于48h后，每孔加入5mg/mlmtt20μl繼續(xù)孵育4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(dmso)100μl，充分混勻，酶標儀(ex-800)在570nm處測吸光度(a)值，實驗重復(fù)3次。計算平均a值和抑制率：抑制率(inhibitory，ir)＝[(溶劑對照組a值-實驗組a值)/溶劑對照組a值]×100％。

1.6流式細胞儀pi法檢測順、反異構(gòu)番茄紅素葵花籽油溶液對人卵巢癌ho-8910細胞凋亡率差異取對數(shù)生長期ho-8910細胞制成1×10⁶個/l的單細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入1.3項下各組溶液，培養(yǎng)48h后，收集細胞，pbs洗滌，制成單細胞懸液，用70％的冰乙醇4℃固定12h，用含核糖核酸酶及碘化丙錠的染液染30min，facsort流式細胞儀進行周期分析，低于g1期dna含量細胞為凋亡細胞。

1.7統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以表示，用spss11.0軟件作統(tǒng)計分析，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗，以p＜0.05為差異有顯著性意義。

2結(jié)果

2.1i、ii號藥的定性鑒別：通過紫外光譜圖的對比，i號藥與番茄紅素粉末可認定為全反式番茄紅素，ii號藥中出現(xiàn)了文獻中報道的362nm處的順式峰。

2.2i、ii號藥的純度測定：通過hplc法分離檢測純度，利用外標法定量計算，以番茄紅素粉末作為對照品，求得i號藥中全反式lyp含量為95.82％；以i號藥作為對照品，求得ii號藥中順式lyp含量為79.53％。

2.3順、反異構(gòu)番茄紅素葵花籽油溶液對人卵巢癌ho-8910細胞生長抑制曲線的比較

空白對照組與溶劑對照組細胞生長一致，表明0.5％dmso對細胞的生長無影響；i號藥與ii號藥各劑量組及陽性藥對照組的細胞生長與空白對照組相比均明顯受到抑制；各實驗組于所設(shè)濃度范圍內(nèi)，隨著劑量的增大其抑制作用增強；二個高劑量組對細胞的生長抑制作用均較陽性藥對照組明顯增強；i號藥低劑量組對細胞的生長抑制作用與ii號藥相比無明顯差異，但中、高劑量i號藥組較ii號藥組抑制細胞生長作用弱。見圖1。

2.4順、反異構(gòu)番茄紅素葵花籽油溶液對人卵巢癌ho-8910細胞增殖抑制率比較

溶劑對照組與空白對照組的吸光度相比差異無顯著性(p＞0.05)，說明0.5％dmso對細胞生長無影響。番茄紅素各實驗組及陽性藥對照組與空白對照組相比差異有極顯著性(p＜0.01)。ii號藥與i號藥中、高劑量組分別對應(yīng)比較，結(jié)果具有顯著性差異(p＜0.05)。二個高劑量組與與陽性藥對照組相比有顯著差異(p＜0.05)。ii號藥低、中、高劑量組對ho-8910細胞增殖抑制率分別為17.25％、24.13％、62.03％；i號藥低、中、高劑量組對ho-8910細胞增殖抑制率分別為16.86％、17.57％、54.05％；陽性藥對照組對ho-8910細胞增殖抑制率為44.5％。見表1。

表1順、反異構(gòu)番茄紅素對人卵巢癌ho-8910細胞生長的抑制作用

注：與空白對照組比較，^ap＜0.01；與i號藥中劑量組比較，^bp＜0.05；與i號藥高劑量組比較，^cp＜0.05；與doc0.2μg·ml^-1組比較，^dp＜0.05。

2.5順、反異構(gòu)番茄紅素葵花籽油溶液對人卵巢癌ho-8910細胞凋亡影響的比較

溶劑對照組與空白對照組的細胞凋亡率相比差異無顯著性(p＞0.05)。番茄紅素各實驗組及陽性藥對照組與空白對照組相比差異有極顯著性(p＜0.01)。ii號藥與i號藥中、高劑量組分別對應(yīng)比較，結(jié)果具有顯著性差異(p＜0.05)(p＜0.05)。高劑量組細胞凋亡率高于陽性藥對照組，差異有顯著性(p＜0.05)。ii號藥低、中、高劑量組細胞凋亡率分別為11.5％、29.9％、39.7％；i號藥低、中、高劑量組細胞凋亡率分別為11.8％、23.1％、32.4％；陽性藥對照組細胞凋亡率為24.6％。見圖2。pi檢測凋亡細胞散點圖見圖3。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，lyp分子從反式構(gòu)型變?yōu)轫樖綐?gòu)型時，顏色變淺，熔點降低，吸收峰發(fā)生偏移，熱處理可使番茄汁中的cis-lyp顯著增加。本實驗異構(gòu)過程與文獻相符。該細胞實驗結(jié)果顯示，含高比例順式lyp體外抑制ho-8910細胞的作用比全反式lyp更強一些，且二者濃度在10μg·ml^-1和20μg·ml^-1時，抑制率和凋亡率比較有顯著性差異。

順、反異構(gòu)番茄紅素葵花籽油溶液對人卵巢癌ho-8910細胞生長抑制曲線和凋亡影響的比較見說明書附圖。圖1是順、反異構(gòu)番茄紅素抑制ho-8910細胞的生長曲線圖，圖2是順、反異構(gòu)番茄紅素對人卵巢癌ho-8910細胞凋亡率影響的圖，分組情況為：1.空白對照組，2.溶劑對照組，3.ii號藥低劑量組，4.ii號藥中劑量組，5.ii號藥高劑量，6.i號藥低劑量組，7.i號藥中劑量組，8.i號藥高劑量組，9.doc0.2μg·ml^-1組。分析比較情況為：與空白對照組比較，^ap＜0.01；與i號藥中劑量組比較，^bp＜0.05；與i號藥；高劑量組比較，^cp＜0.05；與doc0.2μg·ml^-1組比較，^dp＜0.05。圖3是凋亡細胞散點圖，分組情況為：1.空白對照組，2.溶劑對照組，3.ii號藥低劑量組，4.ii號藥中劑量組，5.ii號藥高劑量，6.i號藥低劑量組，7.i號藥中劑量組，8.i號藥高劑量組，9.doc0.2μg·ml^-1組。