本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及重組鱸魚抗菌肽Hepcidin-LJ及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抗菌肽(Antimicrobialpeptide,AMPs)是一類小分子多肽(12-60個氨基酸)，廣泛存在于生物有機(jī)體中，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物學(xué)功能。魚類中目前已報道的AMPs有150多種，是魚體固有免疫系統(tǒng)的重要組成成分。Hepcidin是一類由肝臟分泌的多肽類激素，是抗菌肽家族中的一員，是病原體感染和炎癥反應(yīng)等急性反應(yīng)中的重要作用因子。目前，在植物、無脊椎動物以及高等脊椎動物體內(nèi)已分離得到了多種Hepcidin蛋白。天然形成的Hepcidin抗菌肽，其N端都含有一段信號肽，在蛋白質(zhì)的后期的修飾中將信號肽切除，剩下的原前體肽隨著血液循環(huán)進(jìn)入血液中，經(jīng)前體肽轉(zhuǎn)化酶切掉前體肽后，最終形成具有生物活性的成熟肽。Hepcidin基因組結(jié)構(gòu)高度保守，目前發(fā)現(xiàn)的Hepcidin基因均含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，成熟肽中含有6-8個用于形成二硫鍵的半胱氨酸殘基，一般情況下魚類的Hepcidin成熟肽含有8個保守的半胱氨酸殘基，與哺乳類的Hepcidin同源性較高的區(qū)域僅限于成熟肽?？咕氖且环N新型的抗微生物多肽，其殺菌機(jī)制主要是通過靜電相互作用吸引并結(jié)合到帶負(fù)電的細(xì)菌細(xì)胞膜表面，進(jìn)一步在細(xì)菌細(xì)胞膜上形成跨膜的孔洞，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，從而導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞的死亡。相對于傳統(tǒng)抗生素抑制細(xì)菌代謝不同，抗菌肽介導(dǎo)的殺菌作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于傳統(tǒng)抗生素，并且不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐受性。Hepcidin具有較好的抗菌活性，不僅對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、某些真菌以及病毒具有非常強(qiáng)的殺菌活性。多數(shù)抗菌肽的研究基于化學(xué)合成，但是多對二硫鍵（>3）的存在使得化學(xué)合成的價格相對較高，從而導(dǎo)致后期的應(yīng)用受到成本的限制。本發(fā)明提供一種低成本重組表達(dá)鱸魚的Hepcidin抗菌肽的方法，及重組蛋白在抗菌活性方面的應(yīng)用。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種重組鱸魚Hepcidin-LJ抗菌肽，所述抗菌肽的序列為：Gln-Ser-His-Leu-Ser-Leu-Cys-Arg-Trp-Cys-Cys-Asn-Cys-Cys-Arg-Gly-Tyr-Lys-Gly-Cys-Gly-Phe-Cys-Cys-Lys。本發(fā)明的抗菌肽可用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染的抗生物制劑中，因此，本發(fā)明保護(hù)涉及本發(fā)明的抗菌肽或其活性成分在用于預(yù)防或治療細(xì)菌感染抗生物試劑制備中的應(yīng)用，所述抗生物制劑可具體為抗細(xì)菌制劑，所述細(xì)菌可為巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(E.coli)、鰻弧菌(V.anguillarum)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)。本發(fā)明提供的抗菌肽Hepcidin-LJ，對多數(shù)細(xì)菌有很好的抑制作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。說明書附圖圖1為抗菌肽Hepcidin-LJ的SDS-PAGE電泳圖。圖中，M為蛋白marker，1為培養(yǎng)12h的上清液，2-為培養(yǎng)24h的上清液，3-為培養(yǎng)48h的上清液，4為培養(yǎng)72h的上清液，5為甲醇誘導(dǎo)前培養(yǎng)液。圖2為抗菌肽Hepcidin-LJ對大腸桿菌的作用圖。圖中，A為150μLPBS，B為30μLHepcidin蛋白，C為15μL10mg/mL的卡那霉素，D為60μLHepcidin蛋白。圖3為抗菌肽Hepcidin-LJ細(xì)菌凝集活性分析圖。具體實施方式為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實施例1：重組鱸魚抗菌肽hepcidin-LJ的制備1.1鱸魚hepcidin-LJ基因的克隆鱸魚肝臟總RNA提取，mRNA純化，mRNA反轉(zhuǎn)錄及cDNA文庫構(gòu)建，設(shè)計引物，利用PCR方法獲得鱸魚hepcidin-LJ基因。所獲陽性單克隆進(jìn)行基因核苷酸序列測定，基因測序結(jié)果表明編碼鱸魚hepcidin-LJ的cDNA編碼框273bp，序列表1所示。表達(dá)的最終成熟肽段含有25個氨基酸，分子量3006.1Da，序列表2所示。1.2重組鱸魚hepcidin-LJ抗菌肽的制備根據(jù)已知的cDNA序列設(shè)計引物PCR，將擴(kuò)增出的成熟肽序列DNA片段連接入pPICZαA，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115細(xì)胞。具體包括：（1）畢赤酵母感受態(tài)的制備：接種畢赤酵母的單菌落到3mL的YPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)后，按照1∶100的比例轉(zhuǎn)培養(yǎng)于50mLYPD培養(yǎng)基中，30℃過夜培養(yǎng)，直至OD600值約為1.3-1.5，2000rpm離心5min棄上清，加入10mLEZ1溶液重懸菌體，2000rpm離心5min棄上清，加入1mL的EZ重懸菌體后分裝，置入-80℃冰箱保存。（2）畢赤酵母表達(dá)菌株的轉(zhuǎn)化：取50μL的畢赤酵母感受態(tài)與0.2-1μg的線性化的質(zhì)粒，加入500μL的EZ3溶液，充分混勻，30℃培養(yǎng)45min，可延長到2-3h效果更佳，培養(yǎng)期間取出混勻幾次，培養(yǎng)結(jié)束后取50-150μL菌液，涂布于含50μg/mL博來霉素(Zeocin)的YPD固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3-5d，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。（3）重組蛋白的表達(dá)與純化：將畢赤酵母轉(zhuǎn)化子接種于BMGY培養(yǎng)基中，28-30℃,250-300rpm過夜培養(yǎng)；按照1∶100的比例將過夜菌株轉(zhuǎn)培養(yǎng)至30-50mLBMGY培養(yǎng)基中，30℃，250rpm振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，約16-18h；3000g離心5min，棄上清后將沉淀用BMMY重懸至OD600值為1左右，加入誘導(dǎo)劑甲醇，終濃度為1%；將重懸后的畢赤酵母于30℃,250rpm振蕩培養(yǎng)，12-72h后取樣，10000rpm，離心10min，收集上清，對重組蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE分析表達(dá)情況見圖1，結(jié)果表明，重組蛋白hepcidin-LJ存在于畢赤酵母培養(yǎng)液的上清液中。實施例2：制備的抗菌肽的抑菌活性分析2.1抑菌能力分析挑取保存于斜面上的試驗菌株大腸桿菌（E.coli）均勻涂布于MH固體培養(yǎng)基平板上，將經(jīng)過滅菌的0.5cm直徑的濾紙片置于培養(yǎng)基表面，滴加一定濃度的重組Hepcidin-LJ樣品溶液，于37℃倒置培養(yǎng)18－20小時，觀察抑菌圈形成與否。結(jié)果如圖2所示，表明Hepcidin-LJ重組蛋白對大腸桿菌（E.coli）具有較強(qiáng)的抑制作用，2.2最小抑菌濃度測定試驗菌株接種到MH液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期，用新鮮MH液體培養(yǎng)基稀釋到2×105cfu/ml。在1.9mL培養(yǎng)基中加入經(jīng)0.22um孔徑膜過濾的一定濃度的重組Hepcidin-LJ樣品0.1mL作為第一管，混勻后取1mL加入第2管，依次倍比稀釋，自第9管吸出1mL棄去，第10管系對照管，如表1所示。表1稀釋方法試管號12345678910培養(yǎng)基（mL）1.9111111111樣品（mL）0.1111111111(棄去)向各管中加入已稀釋好的菌液0.05mL，混勻后放置37℃緩慢振蕩培養(yǎng)18小時，于600nm波長處測定光吸收。最小抑菌濃度為看不見細(xì)菌生長的最低樣品濃度。結(jié)果如表2所示。表2重組Hepcidin-LJ蛋白最小抑菌濃度細(xì)菌細(xì)菌類型最小抑菌濃度巨大芽孢桿菌(B.megaterium)革蘭氏陽性8μg/mL枯草芽孢桿菌(B.subtilis)革蘭氏陽性5μg/mL大腸桿菌(E.coli)革蘭氏陰性50μg/mL鰻弧菌(V.anguillarum)革蘭氏陰性60μg/mL肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)革蘭氏陰性30μg/mL綠膿桿菌(P.aeruginosa)革蘭氏陰性30μg/mL金黃色葡萄球菌(S.aureus)革蘭氏陽性50μg/mL蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)革蘭氏陽性40μg/mL表2結(jié)果表明，制備的Hepcidin-LJ重組蛋白對巨大芽孢桿菌(B.megaterium)和枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、大腸桿菌(E.coli)、鰻弧菌(V.anguillarum)、肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、綠膿桿菌(P.aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)均有較強(qiáng)的抑制作用。2.3重組Hepcidin-LJ抗菌肽的細(xì)菌凝集活性分析由圖3可知，重組Hepcidin-LJ抗菌肽可以凝集鰻弧菌(V.anguillarum)、大腸桿菌(E.coli)、蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)，對于巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、金黃色葡萄球菌(S.aureus)和肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)凝集作用不明顯。重組Hepcidin-LJ蛋白對多數(shù)試驗菌株都具有非常好的抗菌活性，具有一定的廣譜抗菌的特點。<110>山東群英醫(yī)學(xué)研究有限公司<120>重組鱸魚抗菌肽Hepcidin-LJ及其應(yīng)用<160>2<210>1<211>275<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atgaaggcatttagcattgcagttgcagtgacacactcgtgctcgcctttatttgcattc60tggagagctctgccatcccattcaccggggtgcaaaatctggaggaggaagggagcaatg120acactccagttgcggtatatcaaggaatgtcaatggaatcgaagatgatgccaggtcact180tcaggcagaagcgtcagagccacctctccttgtgccgctggtgctgcaactgctgcaggg240gctacaagggctgcggcttctgctgcaagttctga275<210>2<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223><400>2GlnSerHisLeuSerLeuCysArgTrpCysCysAsnCysCysArgGly151015TyrLysGlyCysGlyPheCysCysLys2025當(dāng)前第1頁1 2 3