本發(fā)明涉及抗菌肽，特別是能抑制和殺滅細(xì)菌的抗菌肽，具體是一組能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌廣譜高效的抗菌肽及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：抗生素濫用導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生高水平抗藥性和多藥物抗性(multidrugresistance，MDR)已經(jīng)成為世界性的難題。近幾年來(lái)，具有MDR的“超級(jí)病菌”在世界各地相繼爆發(fā)，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命和健康安全。大量研究表明，致病菌通過(guò)基因的水平轉(zhuǎn)移等機(jī)制可獲得MDR，并抵抗多種臨床一線使用的抗生素。為了應(yīng)對(duì)來(lái)自“超級(jí)耐藥細(xì)菌”日益嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，人們除了對(duì)現(xiàn)有抗生素進(jìn)行修飾改良和發(fā)掘新型抗生素外，更寄希望于挖掘抗生素的替代物以緩解“超級(jí)耐藥細(xì)菌”所造成的世界衛(wèi)生安全危機(jī)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一組廣譜高效的抗菌肽，以解決上述
背景技術(shù)：
中存在的問(wèn)題。本發(fā)明提供的一組廣譜高效的抗菌肽，特別是能抑制和殺滅細(xì)菌的廣譜高效抗菌肽，具體是一組能抑制和殺滅多種耐藥性細(xì)菌的廣譜高效的抗菌肽，更具體的是一組能抑制和殺滅以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌，或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌的抗菌肽。本發(fā)明提供的一組廣譜高效的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1-5所示。上述SEQIDNO.1-5所對(duì)應(yīng)的被命名的編碼為XC-16A、XC-17、XH-14B、XH-12A或XH-14C，其序列如下：XC-16A：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Ala-Phe-Trp-Ser-Leu（SEQIDNO.1）XC-17：Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Arg-Lys-Ile-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys（SEQIDNO.2）；XH-14B：Phe-Ile-Lys-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Ile-Lys-Arg（SEQIDNO.3）；XH-12A：Phe-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Lys-Leu-Ile-Arg-Lys-Ile（SEQUDNO.4）XH-14C：Phe-Ile-Lys-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Ile-Trp-Arg（SEQIDNO.5）。上述抗菌肽的制備方法，采用現(xiàn)有的固相化學(xué)合成法中的BOC法制備。具體包括：一、樹(shù)脂合成1)PeptideacidMerrifieldResinandPAMResin2)PeptidecarboxamideMBHAResin二、肽鏈合成1)氨基酸的偶聯(lián)；2)N-端Boc基團(tuán)的切除；在HF切割以前須將N-端Boc保護(hù)基團(tuán)用TFA除去。手工切割N-端Boc基團(tuán)方法是用TFA/DCM比為1：1的溶液在室溫條件下洗滌反應(yīng)15min。三、切割1）切割前的樹(shù)脂準(zhǔn)備:所有樹(shù)脂在切割前必須完全的洗凈和干燥。特殊情況處理:A）His的Dnp保護(hù)基團(tuán)的切割：用最小體積的DMF溶脹樹(shù)脂；用20mol的苯硫酚處理1-2h；將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移到黏結(jié)玻璃漏斗中，在用HF液體或TFMSA處理前以DMF，甲醇和冷乙醚頻繁沖洗。B）含Trp的多肽樹(shù)脂的脫甲?；阂泽w積比為1：10哌啶/DMF液放入圓底燒瓶中，并在冰浴中冷卻；加入多肽樹(shù)脂（1g/10mL），在0℃下攪拌反應(yīng)2h；用DMF（5倍體積）洗兩次，DCM兩次，MeOH兩次；用HF切割前高真空干燥上述所得樹(shù)脂至少4h。2）HF切割標(biāo)準(zhǔn)HF切割法（0.2mmol）A）將多肽樹(shù)脂，聚四氟乙烯管和凈化劑混合物加入反應(yīng)容器中。含Cys的多肽用HF/苯甲醚/DMS/p-苯甲硫酚（10：1：1：0.2），而不含Cys的用HF/DMS/苯甲醚（10：1：1）。B）將蓋子旋緊，切割前在冰的純甲醇中冷卻至少5min。C）在參照生產(chǎn)商的說(shuō)明下蒸餾10mL的HF到瓶中。因?yàn)楹珹rg(Tos)的多肽切割會(huì)持續(xù)2h以上。D）反應(yīng)最后，通過(guò)氮?dú)饬髡舭l(fā)HF和DMS。E）用TFA從樹(shù)脂上吸取出切除下的多肽。F）負(fù)壓下過(guò)濾移走樹(shù)脂，用TFA洗樹(shù)脂兩次。過(guò)濾篩選，加入8-10倍的冷乙醚。有時(shí)需要蒸發(fā)大多數(shù)TFA以得到粗品的沉淀物。3）切割后期處理：A）沉淀，在真空下在Hirsch漏斗中用硬濾紙過(guò)濾沉淀的肽。用冷醚沖洗沉淀物，在合適的緩沖溶液中溶解，然后凍干。B）離心，加入少量體積的叔丁甲醚在殘留物中，研磨，直到得到懸浮物，將懸浮物轉(zhuǎn)移到一個(gè)干凈的離心管中，密閉離心，自動(dòng)離心機(jī)在這過(guò)程中是必須的。然后將醚從管中小心的倒出，并用醚重復(fù)洗滌，在合適的緩沖溶液里溶解殘留物，然后凍干。C）水溶性肽，沉淀后，加水到殘留物中，然后把混合物轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，可以加入少量乙醇助溶。D）充分搖晃堵塞的漏斗，分散混合物，靜止分離，分離下層液（水）。E）加少量水到漏斗中，重復(fù)上述的搖晃-靜止-分離三次，移去上層液，然后放置于干凈的燒瓶中，將混合液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中。F）加少量的新配二乙基醚，重復(fù)上述的搖晃-靜止-分離二到三次，每次都把醚層移去，把水層放到分液漏斗中，收集水層到干凈的燒瓶，凍干。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供包括上述所定義的抗菌肽的組合物。所述組合物包含一種或者一種以上本發(fā)明上述所定義的抗菌肽，以及為實(shí)現(xiàn)組合物的功能和作用而添加的非抗菌肽的成份。上述組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域的已知方法制備。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述抗菌肽及其組合物的用途。所述用途是：在制備治療以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為革蘭氏陰性菌，或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌感染藥物中的應(yīng)用；進(jìn)一步是在制備治療或預(yù)防獸用或人用的藥物中的應(yīng)用，用以殺滅和抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌、大腸桿菌。所述的藥物，包含上述抗菌肽中的一種或一種以上，并混合有一種或一種以上醫(yī)藥上可接受的載體或添加劑，如為了增加分散能力的表面活性劑等。所述用途還涉及在制備畜禽用的飼料和/或飼料添加劑方面的應(yīng)用。本發(fā)明的抗菌肽及其組合物在上述的應(yīng)用中的劑量和使用條件，可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來(lái)確定。本發(fā)明經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，用于抑制和殺滅以耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、李斯特菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌或以大腸桿菌為代表的革蘭氏陰性菌有顯著的效果。附圖說(shuō)明圖1是抗菌肽XC-16A殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖；圖2是抗菌肽XC-17殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖；圖3是抗菌肽XH-14B殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖；圖4是抗菌肽XH-12A殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（C）的效果圖；圖5是抗菌肽XH-14C殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（A）、李斯特菌（B）、大腸桿菌（D）的效果圖；具體實(shí)施方式：實(shí)施例1最小抑菌濃度（MIC）評(píng)估，采用微量肉湯稀釋法。A、抗菌藥物和培養(yǎng)基制備抗菌藥物和培養(yǎng)基制備，同常量肉湯稀釋法。藥敏試驗(yàn)用抗菌藥物濃度范圍：根據(jù)NCCLS抗菌藥物敏感性試驗(yàn)操作標(biāo)準(zhǔn)，藥物濃度范圍應(yīng)包含耐藥、中介和敏感分界點(diǎn)值。培養(yǎng)基：NCCLS推薦使用Mueller-Hinton（MH）肉湯，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厭氧菌在此培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。接種物的制備,用接種環(huán)挑取形態(tài)相似待檢菌落3~5個(gè)，接種于4~5mL的水解酪蛋白（MH）肉湯中，35℃孵育2~6h。增菌后的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期菌液用生理鹽水或MH肉湯校正濃度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)，約含1~2×108CFU/mL。B、MIC板制備MIC板制備：無(wú)菌操作，將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的96孔聚苯乙烯板中，第1至第11孔加藥液，每孔10WμL，第12孔不加藥作為生長(zhǎng)對(duì)照，冰凍干燥后密封，-20℃以下保存?zhèn)溆?。C、接種物制備將用生長(zhǎng)法或直接菌懸液法制備的濃度相當(dāng)于0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌懸液，經(jīng)MH肉湯1：1000稀釋后，向每孔中加100μL，密封后置35℃普通空氣孵箱中，孵育16~20h判斷結(jié)果。此時(shí)，第1孔至第11孔藥物濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/mL。D、結(jié)果判斷結(jié)果判斷：以在小孔內(nèi)完全抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔（即不含抗生素）內(nèi)細(xì)菌明顯生長(zhǎng)試驗(yàn)才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時(shí)，應(yīng)記錄抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最高藥物濃度。結(jié)果見(jiàn)下表　耐甲氧西林金黃色葡萄球菌單核細(xì)胞增生李斯特菌大腸桿菌XC-16A16μg/ml16μg/ml64μg/mlXC-178μg/ml16μg/ml16μg/mlXH-14B32μg/ml16μg/ml32μg/mlXH-12A4μg/ml4μg/ml32μg/mlXH-14C16μg/ml8μg/ml32μg/ml本實(shí)驗(yàn)中使用：大腸桿菌(Escherich)ATCC25922、李斯特菌(Monocuteproliferation)ATCC19115。實(shí)施例2最低殺菌濃度測(cè)試（MBC）最低殺菌濃度測(cè)試（MBC）最小殺菌濃度（minimumbactericidalconcentration，MBC）：殺死99.9%（降低3個(gè)數(shù)量級(jí)）的供試微生物所需的最低藥物濃度。二倍稀釋測(cè)最小殺菌濃度：就是將藥物濃度依次減半（倍比稀釋?zhuān)?，比如?6孔板的某行/列做MBC，每個(gè)孔均加入10μL藥液，第一個(gè)孔藥液濃度是100μg/mL，第二個(gè)孔是50μg/mL，第三個(gè)25μg/mL……。操作起來(lái)就是比如第一個(gè)孔加20μL藥液，從第一個(gè)孔吸取10μL藥液到第二孔，加培養(yǎng)液10μL，混勻后，從中吸取10μL加進(jìn)第三孔里，再加培養(yǎng)液10μL混勻……。最低至哪個(gè)濃度，已經(jīng)沒(méi)有活細(xì)菌了，該濃度即為MBC。結(jié)果見(jiàn)圖1~5。其中，HR---小時(shí)，μg/ml---濃度，CFUreduction%---菌落減少百分比。本實(shí)驗(yàn)中使用：大腸桿菌(Escherich)ATCC25922、李斯特菌(Monocuteproliferation)ATCC19115。XC-16A：Lys-Leu-Leu-Asp-Ile-Val-Lys-Lys-Arg-Val-Arg-Ala-Phe-Trp-Ser-Leu（SEQIDNO.1）XC-17：Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Arg-Lys-Ile-Lys-Phe-Leu-His-Ser-Ala-Lys-Lys（SEQIDNO.2）XH-14B：Phe-Ile-Lys-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Ile-Lys-Arg（SEQIDNO.3）XH-12A：Phe-Phe-Arg-Lys-Val-Leu-Lys-Leu-Ile-Arg-Lys-Ile（SEQUDNO.4）XH-14C：Phe-Ile-Lys-Arg-Ile-Ala-Arg-Leu-Leu-Arg-Lys-Ile-Trp-Arg（SEQIDNO.5）當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3