亚洲成年人黄色一级片,日本香港三级亚洲三级,黄色成人小视频,国产青草视频,国产一区二区久久精品,91在线免费公开视频,成年轻人网站色直接看

一種用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的方法與流程

文檔序號:12103989閱讀:4817來源:國知局
一種用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的方法與流程

本發(fā)明屬于生物技術領域,具體涉及一種用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的方法。



背景技術:

隨著生物技術的不斷發(fā)展,抗體類藥物以其高特異性、有效性和安全性正在成為藥品市場上的一大類新型診斷和治療劑,并涌現(xiàn)出大批具有良好靶向治療效果的抗體。

單克隆抗體是復雜的四聚體糖蛋白,常呈現(xiàn)微觀不均一性,即“異質(zhì)性”,包括電荷、疏水、形態(tài)等相關的構造體(Liu H,Gaza-Bulseco G,Falad D,et al.Heterogeneity of monoclonal antibodies.J Pharm Sci,2008,97(7):2426-2447)。這些異構體可能來自于抗體分子復雜的生物合成途徑,如細胞系及培養(yǎng)工藝(Karra S,Sager B,Karim MN.Multi-Scale modeling of heterogeneities in mammalian cell culture processes.Ind Eng Chem Res,2010,49(17):7990-8006),也可能來自于純化、制劑等制造過程及儲存過程的任何階段。其中抗體分子所帶的電荷差異造成異質(zhì)性稱為“電荷異構”,一般分為酸性異構體和堿性異構體,這些異構體帶有無數(shù)酸性和堿性側(cè)鏈氨基酸官能團,這些官能團的范圍主要是羧酸類(天冬氨酸和谷氨酸);酚類(酪氨酸);胺類(賴氨酸,組氨酸);胍類(精氨酸)。

基因泰克公司曾對于上市的抗體及臨床前抗體藥物關于電荷變化產(chǎn)生的藥效和藥代等方面的影響做過一個總結,結果表明:1、當電荷變異超過一個pH單位時,會影響藥物的組織分布及藥代動力學;2、增加正電荷,會提高藥物的組織停滯,降低血清清除;3、降低正電荷,會減少藥物的組織停滯,提高藥物全身的清除(Boswell CA,Tesar DB,Mukhyala K.Effects of charge on antibody tissue distribution and pharmacokinetics.Bioconj Chem,2010,21(12):2153-2163)。這些異構體與主要種類的抗體具有至少70%的同源性,優(yōu)選80%的同源性,而且更優(yōu)選至少約90%同源。因此分離電荷異構體,得到均一性質(zhì)的抗體是一個關鍵的挑戰(zhàn)。

在眾多的分離手段中,離子交換層析在分離電荷異構體方面被認為是最有 前景的方法(程洪杰等.單克隆抗體電荷異構體分離方法優(yōu)化,中國醫(yī)藥生物技術,2014,9(5):385-388)。在離子交換層析分離的過程中,通過控制帶電分子與相反電荷的離子交換填料之間的可逆相互作用來實現(xiàn)特定電荷蛋白的結合和分離,從而達到電荷差異蛋白的分離。處于與等電點相同pH值環(huán)境中的蛋白質(zhì)表面凈電荷為零,不會和帶電的填料發(fā)生相互作用。而當所處的環(huán)境pH低于其等電點時,蛋白質(zhì)會同帶有負電荷的填料,也就是陽離子交換填料結合。當所處的環(huán)境的pH高于等電點時,蛋白質(zhì)不會同陽離子交換填料結合,從而分離出蛋白。

因此,尋找出一種既能很好地分離蛋白質(zhì)樣品中的酸堿性異構體,又能很好地去除聚集體和小分子的分離方法,這是我們將要面臨的一個嚴峻的挑戰(zhàn)。



技術實現(xiàn)要素:

本申請的發(fā)明人經(jīng)過大量研究,發(fā)現(xiàn)了一種用陽離子交換層析分離蛋白樣品中酸堿性異構體的方法,同時兼顧去除聚集體和小分子。具體地說,使用上樣緩沖液將蛋白結合在離子交換填料上,并處于該緩沖液環(huán)境中;使用第一pH和/或濃度的Tris緩沖液洗滌酸性異構體和小分子,并回收;再使用第二pH和/或濃度的Tris緩沖液洗脫目標蛋白質(zhì),并回收;最后使用第三pH和/或濃度的Tris緩沖液再生堿性異構體和聚集體,并回收,從而達到精純蛋白,去除酸堿性異構體、聚集體和小分子等雜質(zhì)的目的。

因此,本發(fā)明的目的在于提供一種用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的方法。

為了實現(xiàn)上述目的,本發(fā)明提供了如下技術方案:

一種用離子交換層析純化蛋白質(zhì)的方法,包括以下步驟:

(A)用上樣緩沖液將蛋白質(zhì)結合在離子交換填料上,并處于該緩沖液環(huán)境中;

(B)使用第一pH和/或濃度的Tirs緩沖液洗滌酸性異構體和小分子;

(C)再使用第二pH和/或濃度的Tirs緩沖液洗脫目標蛋白質(zhì)。

進一步的,還包括步驟(D):在步驟(C)之后使用第三pH和/或濃度的Tirs緩沖液或高鹽再生堿性異構體和聚集體。

進一步的,所述離子交換填料為陽離子交換樹脂,所述第二Tirs緩沖液的pH和/或濃度大于第一Tirs緩沖液的pH和/或濃度,所述第三Tirs緩沖液的pH和/或濃度大于第二Tirs緩沖液的pH和/或濃度。

進一步的,所述陽離子交換樹脂選自:Poros XS,Nuvia HRS,Capto MMC Impres或ESHMUNO CPX。

進一步的,所述Tirs緩沖液是用Tris和酸溶液相互調(diào)節(jié)而得到,所述酸溶液包括:鹽酸、檸檬酸或磷酸等,優(yōu)選為鹽酸。

進一步的,所述蛋白質(zhì)為抗體。

更進一步的,所述抗體為單克隆抗體。

更進一步的,所述單克隆抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體、全人抗體。

更進一步的,所述單克隆抗體為貝伐單抗或曲妥珠單抗。

進一步的,所述蛋白質(zhì)為哺乳動物細胞表達或真核細胞表達。

本發(fā)明的有益效果:

磷酸鹽(PB)緩沖液具有穩(wěn)定性好的優(yōu)點,是離子交換層析中常規(guī)的洗脫緩沖液,然而,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用PB緩沖液不能有效地分離酸堿異構體和目標蛋白,在進一步的長期研究過程中,本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)使用Tris緩沖液先洗滌酸性異構體和小分子,再洗脫目標蛋白的方法能夠有效地去除蛋白質(zhì)樣品中的酸堿性異構體、聚集體和小分子,純化后的目標蛋白純度高,具有廣泛的工業(yè)應用前景。

附圖說明

圖1為貝伐單抗的PB洗脫方式終產(chǎn)物的離子交換層析圖譜。

圖2為貝伐單抗的PB洗脫方式終產(chǎn)物的SEC-HPLC檢測色譜疊加圖。

圖3為貝伐單抗的PB洗脫方式終產(chǎn)物的CEX-HPLC檢測色譜疊加圖。

圖4為貝伐單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的離子交換層析圖譜。

圖5為貝伐單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的SEC-HPLC檢測色譜疊加圖。

圖6為貝伐單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的CEX-HPLC檢測色譜疊加圖。

圖7為曲妥珠單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的離子交換層析圖譜。

圖8為曲妥珠單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的SEC-HPLC檢測色譜疊加圖。

圖9為曲妥珠單抗的Tris洗脫方式終產(chǎn)物的CEX-HPLC檢測色譜疊加圖。

具體實施方式

本發(fā)明中,使用一定pH的上樣緩沖液的目的是將蛋白吸附于離子交換填料上,上樣緩沖液可以使用檸檬酸和檸檬酸三鈉相互配制或使用檸檬酸和Tris相互配制,更優(yōu)選檸檬酸和Tris相互配制,pH為4-8,更優(yōu)選pH為5-6。上樣后的平衡要保證相應的pH和電導和平衡緩沖液基本一致后,方能進行下一步。

本發(fā)明中,使用第一pH和/或濃度的Tris緩沖液的目的是洗脫酸性異構體和小分子,使用第二pH和/或濃度的Tris緩沖液的目的是洗脫目標蛋白質(zhì),使用第三pH和/或濃度的Tris緩沖液的目的是洗脫堿性異構體和聚集體。

本發(fā)明中使用的填料優(yōu)選為陽離子交換填料,例如Poros XS、Nuvia HRS、Capto MMC Impres,ESHMUNO CPX等,優(yōu)選為Poros XS。

對于陽離子交換樹脂,所述第二Tirs緩沖液的pH和/或濃度大于第一Tirs緩沖液的pH和/或濃度,所述第三Tirs緩沖液的pH和/或濃度大于第二Tirs緩沖液的pH和/或濃度或為高鹽。

本發(fā)明中所述的Tris為三羥甲基氨基甲烷,用酸溶液調(diào)節(jié)pH配制成需要的緩沖液,所述酸溶液包括:鹽酸、檸檬酸,磷酸等,優(yōu)選為鹽酸(HCl)。由于Tris作為生物緩沖液,pH值隨溫度變化比較大。一般來說,溫度每升高一度,pH值下降0.03,所以使用中要保持溶液和系統(tǒng)溫度恒定或溫度差變化不大的條件下進行。

本發(fā)明中所述的蛋白質(zhì),只要有電荷差異的蛋白質(zhì)都可以適用。例如,全人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、鼠源抗體等,包括但不限于曲妥珠單抗、貝伐單抗等。所述蛋白質(zhì)為哺乳動物細胞表達或真核細胞表達。

以下實施例僅對本發(fā)明進行進一步的說明,不應理解為對本發(fā)明的任何限制。

以下實施例中使用的檢測方法說明如下:

1、SEC-HPLC液相檢測:

液相色譜系統(tǒng)Thermo UItimate 3000

色譜柱TOSOK G300 SWXL

流動相:200mmol/L PB緩沖液 pH:6.8

流速:0.5mL/min。

2、CEX-HPLC液相檢測:

液相色譜系統(tǒng)Agilent 1260

色譜柱Thermo ProPac WCX-104-250mm

流動相:MPA(流動相A)20mmol/L PB pH:6.5

MPB(流動相B)20mmol/L PB+200mmol/L NaCl pH:6.5

流速:1mL/min。

3、紫外檢測:

島津UV-1800

對照溶液:Q水。

以下實施例中所述酸性異構體去除率、堿性異構體去除率、目標蛋白回收率和得率的計算方法具體如下:

酸性異構體去除率(以CEX-HPLC檢測結果計)=(洗滌峰和再生峰中的酸性異構體總量之和)/上樣中的酸性異構體的總和

堿性異構體去除率(以CEX-HPLC檢測結果計)=(洗滌峰和再生峰中的堿性異構體總量之和)/上樣中的堿性異構體的總和

目標蛋白回收率(以CEX-HPLC檢測結果計)=目標峰中的目標蛋白總量/上樣中的目標蛋白的總量

得率=目標峰的蛋白總量/上樣的蛋白總量。

實施例1

1.1、

本實施例以貝伐單抗為純化目標蛋白,樣品使用Poros XS填料進行PB的pH線性梯度(線性梯度:使用洗滌液和洗脫液,在保留時間為5min條件下,進行線性梯度15cv,共75min)層析。

實驗條件說明如下:

層析柱:XK16/20(通用電氣公司GE)

填料:Poros XS(Life Technologies)1cv=35mL H=17.4cm載量:20mg/mL

保留時間:5min

層析系統(tǒng):AKTA Purifier

操作系統(tǒng):unicorn系統(tǒng)(通用電氣公司GE)

樣品來源:發(fā)酵上清通過蛋白A親和層析制備主峰(來源自上海中信國健藥業(yè)股份有限公司),調(diào)節(jié)親和層析制備主峰的pH為5.51

溶液:

平衡液:10mmol/L Tris-檸檬酸緩沖液 pH:5.5

洗滌液:10mmol/L PB緩沖液 pH:7.0

洗脫液:10mmol/L PB緩沖液 pH:9.34

再生液:2mol/L NaCl

消毒液:0.5mol/L NaOH

保存液:20%乙醇

實驗操作流程:平衡6cv→上樣→平衡5cv→洗滌4cv→(洗滌-洗脫)15cv→洗脫3cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

相關主峰收集:以UV280nm為判斷標準,依次收集峰1-峰6。峰1-峰6的離子交換層析圖譜如圖1所示。

收集峰1-峰6的各個中間體使用島津UV-1800設備檢測各個主峰的濃度,并使用各個主峰總蛋白量=主峰濃度*主峰體積,計算出各個主峰的總蛋白量,如表1所示。將各個主峰使用液相檢測SEC-HPLC和CEX-HPLC,檢測結果如表1所示。各個中間體的SEC-HPLC色譜疊加圖譜如圖2所示。各個中間體的CEX-HPLC色譜疊加圖譜如圖3所示。

表1 中間體檢測結果

如表1所示,根據(jù)收集的峰1-峰6的檢測SEC-HPLC和CEX-HPLC結果可以看出只有峰3的目標蛋白的純度比較好(CEX-HPLC≥81%和SEC-HPLC≥98%),相應的得率為21.3%,目標蛋白的回收率為26%。PB洗脫為離子交換層析常規(guī)的洗脫方式,然而通過以上實驗發(fā)現(xiàn)采用常規(guī)的PB緩沖液依次洗脫酸性異構體和小分子以及目標蛋白時,純化得到的目標蛋白的純度較低,并且不能很好地實現(xiàn)去除酸堿異構體、聚集體和小分子等雜質(zhì)的目的,不能滿足工業(yè)化應用需要。

1.2、

本實施例以貝伐單抗為純化目標蛋白,樣品使用Poros XS填料進行Tris-HCl洗脫條件的層析。

層析柱:XK16/20(通用電氣公司GE)

填料:Poros XS(Life Technologies)1cv=25mL H=12.4cm 載量:30mg/mL

保留時間:5min

層析系統(tǒng):AKTA Purifier

操作系統(tǒng):unicorn系統(tǒng)(通用電氣公司GE)

樣品來源:發(fā)酵上清通過蛋白A親和層析制備主峰(來源中信國健藥業(yè)股份有限公司),調(diào)節(jié)親和層析制備主峰的pH為5.5

溶液:

平衡液:10mmol/L Tris-檸檬酸緩沖液 pH:5.5

洗滌液:10mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH:7.8

洗脫液:50mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH:8.2

再生液:2mol/L NaCl

消毒液:0.5mol/L NaOH

保存液:20%乙醇

實驗操作流程:平衡6cv→上樣→平衡5cv→洗滌4cv→洗脫4cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

相關主峰收集:以UV280nm為判斷標準,分別收集洗滌峰、主峰和再生峰。

離子交換層析圖譜如圖4所示。

收集各個中間體使用島津UV-1800設備檢測各個主峰的濃度,并使用各個主峰總蛋白量=主峰濃度*主峰體積,計算出各個主峰的總蛋白量,如表2所示。將各個主峰使用液相檢測SEC-HPLC和CEX-HPLC,檢測結果如表2所示。各個中間體的SEC-HPLC色譜疊加圖譜如圖5所示。各個中間體的CEX-HPLC色譜疊加圖譜如圖6所示。

表2 中間體檢測結果

如表2所示,當采用Tris緩沖液依次洗脫酸性異構體和小分子以及目標蛋白時,通過液相色譜SEC-HPLC檢測結果分析,洗滌峰中含有大量的小分子,再生峰中含有大量的聚集體,主峰中目標蛋白的SEC-HPLC純度為99.67%。從實驗的離子交換層析圖譜4和各個中間體SEC-HPLC檢測色譜疊加圖5能很好地說明本發(fā)明的方法在去除蛋白質(zhì)樣品中的聚集體和小分子方面優(yōu)勢明顯。

通過離子交換層析結果和液相色譜CEX-HPLC檢測結果綜合分析,主峰中目標蛋白的CEX-HPLC純度為91.34%,使用本發(fā)明的方法的酸性異構體去除率為87.8%,堿性異構體去除率為75.8%,目標蛋白的回收率為85.4%。從實驗的離子交換層析圖譜4和各個中間體CEX-HPLC檢測色譜疊加圖6也能很好地說明本發(fā)明的方法在去除蛋白質(zhì)樣品中的酸堿性異構體方面優(yōu)勢明顯。

將實施例1.1的PB洗脫方式和實施例1.2的Tris緩沖液洗脫方式進行對比,結果如表3所示。

表3 PB和Tris緩沖液洗脫方式結果對比表

如表3所示,在得率方面,采用Tris緩沖液洗脫方式的主峰得率和目標蛋白回收率分別為采用PB緩沖液洗脫方式的主峰得率和目標蛋白回收率的2.8倍和3.3倍。在純度方面,采用Tris緩沖液洗脫方式的主峰的目標蛋白的CEX-HPLC純度91.34%顯著高于采用PB緩沖液洗脫方式的主峰的目標蛋白的CEX-HPLC純度81.68%。

綜上所述,采用本發(fā)明的方法在貝伐單抗分離酸堿性異構體、聚集體和小分子方面有明顯優(yōu)勢,目標蛋白的回收率和純度高,能夠很好地滿足工業(yè)應用需要,具有廣泛的工業(yè)應用前景。

實施例2、

本實施例以曲妥珠單抗為純化目標蛋白,使用Poros XS填料進行Tris-HCl洗脫條件的層析

層析柱:XK16/20(通用電氣公司GE)

填料:Poros XS(Life Technologies)1cv=22mL H=11cm

保留時間 5min 載量:10mg/mL

層析系統(tǒng):AKTA Purifier

操作系統(tǒng):unicorn系統(tǒng)(通用電氣公司GE)

樣品來源:發(fā)酵上清通過蛋白A親和層析制備主峰(來源上海中信國健藥業(yè)股份有限公司),調(diào)節(jié)親和層析制備主峰pH為5.5

溶液:

平衡液1:10mmol/L Tris-檸檬酸緩沖液 pH:5.5

平衡液2:20mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH:8.5

洗滌液:90mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH:8.5

洗脫液:130mmol/L Tris-HCl緩沖液 pH:8.5

再生液:2mol/L NaCl

消毒液:0.5mol/L NaOH

保存液:20%乙醇

實驗操作流程:平衡1(6cv)→上樣→平衡1(6cv)→平衡2(5cv)→洗滌4cv→洗脫4cv→再生3cv→消毒→水3cv→保存2cv

主峰收集如下:以UV280nm為判斷標準,分別收集UV有吸收的洗滌峰、主峰和再生峰。離子交換層析圖譜如圖7所示。

收集各個中間體使用島津UV-1800設備檢測各個主峰的濃度,并使用各個主峰總蛋白量=主峰濃度*主峰體積,計算出各個主峰的總蛋白量,如表4所示。將各個主峰使用液相檢測SEC-HPLC和CEX-HPLC,檢測結果如表4所示。各個中間體的SEC-HPLC色譜疊加圖譜如圖8所示。各個中間體的CEX-HPLC色譜疊加圖譜如圖9所示。

表4 中間體檢測結果

如表4所示,通過SEC-HPLC檢測結果分析,洗滌峰中含有大量的小分子,再生峰中含有大量的聚集體,主峰中目標蛋白的SEC-HPLC純度為99.74%。從實驗的離子交換層析圖譜7和各個中間體SEC-HPLC檢測色譜疊加圖8能很好地說明本發(fā)明在去除蛋白質(zhì)樣品中的聚集體和小分子方面優(yōu)勢明顯。

通過液相色譜CEX-HPLC檢測結果分析,主峰中目標蛋白的CEX-HPLC純度為80.07%。使用本發(fā)明的方法的酸性異構體去除率為92.44%,堿性異構體去除率為89.12%,目標蛋白的回收率為73.06%。從實驗的離子交換層析圖譜7和各個中間體CEX-HPLC檢測色譜疊加圖9也能很好地說明本發(fā)明的方法在去除酸堿性異構體方面優(yōu)勢明顯。

綜上所述,本發(fā)明的方法在曲妥珠單抗分離酸堿性異構體、聚集體和小分子方面有明顯優(yōu)勢,目標蛋白的回收率和純度高,能夠很好地滿足工業(yè)應用需要,具有廣泛的工業(yè)應用前景。

當前第1頁1 2 3 
網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
  • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
1