技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促性腺激素領(lǐng)域。特別地，提供了改進的重組人促卵泡激素(rhFSH)。這種改進的rhFSH可用于不育癥的治療，特別是用于人類患者。
背景技術(shù)：
：促性腺激素是一組蛋白質(zhì)激素，其調(diào)控雄性和雌性的性腺功能，因此在人類能育中起到重要作用。其是由脊椎動物腦垂體的促性腺細胞在受到促性腺激素釋放激素(GnRH)刺激后分泌的。促性腺激素為異二聚體糖蛋白，包括促卵泡激素(FSH)、促黃體激素(LH)及絨毛促性腺激素(CG)。這些促性腺激素具有相同的α-亞基，但包含不同的β-亞基，后者能確保其的受體結(jié)合特異性。FSH包含一個92個氨基酸的α-亞基以及一個111個氨基酸的β-亞基，后者賦予其對FSH受體的特異性結(jié)合。所述天然蛋白質(zhì)的兩個亞基都受到糖基化修飾。α-亞基在Asn52和Asn78處而β-亞基在Asn7和Asn24處進行天然糖基化。在細胞中兩種亞基都是以前體蛋白質(zhì)產(chǎn)生然后加工并分泌的。FSH調(diào)控身體的發(fā)育、生長、青春期成熟及生殖過程。特別地，其刺激生殖細胞的成熟并因此參與精子發(fā)生及卵泡發(fā)生。卵泡發(fā)生是由FSH誘導(dǎo)的，例如通過FSH對粒層細胞表面上的FSH受體的結(jié)合。FSH受體為G蛋白偶聯(lián)受體，其在FSH結(jié)合時激活偶聯(lián)的G蛋白。然后所述G蛋白進而激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP——一種二級信使分子的產(chǎn)生。細胞中cAMP濃度的增加激活數(shù)種下游靶標(biāo)，特別是cAMP依賴的蛋白質(zhì)激酶，后者然后引起黃體酮和雌激素的合成。黃體酮和雌激素是由粒層細胞分泌的，誘導(dǎo)卵泡發(fā)生。在粒層細胞受到FSH刺激時，其還釋放抑制素-B，這形成了一個負反饋環(huán)，從而抑制垂體中FSH的產(chǎn)生和分泌。已有顯示抑制素B為很好替代標(biāo)記物，提示有FSH造成的卵巢刺激。FSH在對不育癥的治療中有廣泛使用，可以單獨或與其他試劑(特別是LH)組合使用。在本領(lǐng)域中，通用已經(jīng)使用了純化自絕經(jīng)期后人尿液的FSH(尿FSH)或由中國倉鼠卵巢(CHO)細胞重組產(chǎn)生的FSH用于人類治療。然而，由于存在不同異構(gòu)體，所以有極大的與不同F(xiàn)SH制備相關(guān)的異質(zhì)性。個體FSH異構(gòu)體顯示相同的氨基酸序列，但在其糖基化程度和本質(zhì)上有差異。具體的異構(gòu)體的特征在于碳水化合物支鏈結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性以及不同量的唾液酸(一種帶負電的末端單糖單元)，這二者都影響了異構(gòu)體的特異生物活性。因此，F(xiàn)SH的糖基化形式對其生物學(xué)活性有顯著的影響。然而，來自不同供體和不同制備物的尿液FSH在其碳水化合物結(jié)構(gòu)上有顯著的變化，形成高度的批-批變化?？紤]到尿液制品中病毒的存在，還存在安全問題。進一步地，獲自CHO細胞的FSH顯示的糖基化形式特異于這些倉鼠細胞，這與人類糖基化形式不相同。這些差異導(dǎo)致所獲得的FSH有變化的生物學(xué)活性及副作用，因此要施用于患者的藥用制備物也具有這些性質(zhì)。鑒于此，本發(fā)明的一個目標(biāo)就是提供改進的FSH制備物。進一步地，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供具有新型治療或藥用特征的FSH制備物。進一步地，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供具有改進的糖基化形式的FSH制備物。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)獲自人類細胞的改進的FSH制備物(優(yōu)選地，是以優(yōu)化的糖基化水平選擇的制備物)能夠以比對應(yīng)的獲自人尿液或CHO細胞的FSH制備物更低的濃度誘導(dǎo)性類固醇如雌激素和黃體酮的分泌。因此，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物具有可用于治療的驚人的特征。本發(fā)明在第一方面提供了重組的FSH制備物，其中制備物中的重組FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征：(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20％；(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30％；和/或(iii)2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30％；和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在第二方面，本發(fā)明提供了重組FSH制備物，其可通過在人類細胞或人類細胞系中生產(chǎn)而獲得，特別是細胞系GT-5s(DSMACC3078,保藏于2010年7月28日)。據(jù)發(fā)現(xiàn)在各細胞系中產(chǎn)生的FSH產(chǎn)生了改進的糖基化譜，如上文和下文所描述的。還提供了一種藥用組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的重組FSH。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于治療不育癥。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物，用于不依賴于cAMP而誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌。一些實驗顯示根據(jù)本發(fā)明的FSH的低濃度效應(yīng)在特定環(huán)境中不依賴于靶標(biāo)細胞中的cAMP信號傳導(dǎo)。因此，這些實驗表明根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物可在一定濃度下誘導(dǎo)性類固醇如黃體酮的分泌而不增加cAMP的分泌。因此，認為根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物的特定實施方式能夠誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而導(dǎo)致性類固醇的分泌，所述通路不同于對通常使用的FSH制備物所描述的使用cAMP作為第二信使的已知信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于通過不依賴于cAMP信號的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細胞的成熟。進一步地，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或藥用組合物用于誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌的用途，在這些FSH濃度下不會誘導(dǎo)顯著的cAMP釋放。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征、優(yōu)勢及方面通過以下描述及附隨的權(quán)利要求對本領(lǐng)域技術(shù)人員變得明顯。然而，要理解的是以下描述、附隨的權(quán)利要求及指出本應(yīng)用優(yōu)選的實施方式的特異實施例都只是以示例說明的方式給出。在閱讀下文后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會容易理解在所公開的發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的多種變化和修飾。定義:如本文所使用的，以下詞語通常優(yōu)選地具有下文提出的意義，除非其使用的上下文中另有指出。如本文所使用的，詞語“包含”除了其常規(guī)意義外還包括并特異性指代詞語“基本上由……組成”及“由……組成”。因此，詞語“包含”指的是這樣的實施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主題物質(zhì)不包含其他元素，還包括這樣的實施方式，其中“包含”特異性列出的元素的主體物質(zhì)可能和/或確實包含其他元素。術(shù)語“FSH”指的是促卵泡激素，一種促性腺激素。FSH為一種糖蛋白，其包含兩個亞基的糖蛋白，標(biāo)記為α和β亞基。優(yōu)選地，F(xiàn)SH為人類FSH，特別是由具有SEQIDNO：1的氨基酸序列的α亞基和具有SEQIDNO：2的氨基酸序列的β亞基組成的人類FSH。然而，在其中一個或兩個亞基中可能存在一個或多個，如1個、1或2個、多至3個、多至5個、多至10個或多至20個氨基酸的置換、添加和/或刪除。優(yōu)選地，α亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列共有的整體同源性或同一性為至少80％、更優(yōu)選地至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。進一步地，β亞基的氨基酸序列與根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列共有的整體同源性或相同性優(yōu)選為至少80％、更優(yōu)選地至少85％、至少90％、至少95％或至少98％。所述FSH的亞基優(yōu)選地為兩條分離的多肽鏈，然而，如本文所使用的，術(shù)語“FSH”還包括這樣的實施方式，其中這兩個亞基共價地彼此相連，例如通過交聯(lián)試劑或連接多肽鏈，還包括這樣的實施方式，其中一個或兩個亞基被進一步劃分為數(shù)條多肽鏈。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的FSH能夠結(jié)合及/或激活FSH受體，優(yōu)選地為人類FSH受體。如本文所使用的，術(shù)語“FSH”具體指代制備物中的所有FSH蛋白質(zhì)。因此，術(shù)語“FSH”具體指代FSH制備物或組合物中所有FSH蛋白質(zhì)的全體。優(yōu)選地，所述FSH蛋白質(zhì)的兩個亞基都包含一個或多個連接于多肽鏈的碳水化合物結(jié)構(gòu)。更優(yōu)選地，這些碳水化合物結(jié)構(gòu)是連接于這些亞基的天冬氨酸殘基上的。在尤其優(yōu)選的實施方式中，α亞基包含兩個碳水化合物結(jié)構(gòu)，分別連接于Asn52和Asn78，而/或β亞基含兩個碳水化合物結(jié)構(gòu)，分別連接于Asn7和Asn24。攜帶這些碳水化合物結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基以相對于根據(jù)SEQIDNO:1和2的相應(yīng)α和β亞基的人類氨基酸序列的方式進行標(biāo)注。人類FSH的糖部分優(yōu)選地由果糖、半乳糖、甘露糖、半乳糖胺、葡萄糖胺和/或唾液酸構(gòu)成。根據(jù)本發(fā)明使用的FSH優(yōu)選地為重組FSH，更優(yōu)選地為重組人類FSH。術(shù)語“重組FSH”指的是FSH并非由活的人類或動物體天然產(chǎn)生并因此獲自來源于其的樣品，如尿液、血液或其他體液、排泄物或人類或動物體的組織。優(yōu)選地，重組FSH獲自經(jīng)過生物技術(shù)工程改造的細胞，特別是以編碼FSH或者FSH的α或β亞基的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細胞。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，重組FSH獲自包含編碼FSH的外源核酸的人類細胞。相應(yīng)的外源核酸可例如通過使用一種或多種表達載體而引入，其可例如經(jīng)由轉(zhuǎn)染而引入宿主細胞。用于重組產(chǎn)生蛋白質(zhì)和FSH的相應(yīng)方法在在先技術(shù)中已熟知，無需其他描述。根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類FSH，可通過在人類細胞，優(yōu)選地為人類細胞系中產(chǎn)生而獲得。所述人類細胞系優(yōu)選地來源于人類血細胞，特別是髓細胞系，優(yōu)選地為髓性白血病細胞系。所述細胞系優(yōu)選地是永生化的。在一個優(yōu)選的實施方式中，用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的FSH的細胞系為細胞系GT-5s(其根據(jù)布達佩斯協(xié)議于2010年7月28日以登記號DSMACC3078保藏于德意志微生物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen(DSMZ),因霍芬大街7B，38124布倫瑞克(德國))，保藏人為GlycotopeGmbH,Robert--Str.10，13125Berlin(DE))或來源于此的細胞系，或同源細胞系。GT-5s為一種永生化人類髓性白血病細胞系，能夠提供如本文所描述的特異糖基化形式。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“GT-5s”和“GT-5s細胞系”還包括來源于GT-5s的細胞或細胞系。來源于GT-5s的細胞系可例如通過隨機或特異性地從GT-5s培養(yǎng)物中選擇單一克隆或一組細胞而獲得，任選地在之前已經(jīng)對GT-5s細胞進行了增強突變率的處理，或通過遺傳改變GT-5s細胞系而獲得。所選擇的克隆或一組細胞可進一步如上文所述的方法進行處理和/或可進行其他的篩選輪。同源于GT-5s的細胞系特別是永生化人類髓細胞系。優(yōu)選地，來源于或同源于GT-5s的細胞系能夠提供的FSH具有的糖基化形式類似于獲自GT-5s的形式。優(yōu)選地，由來源于或同源于GT-5s的細胞系產(chǎn)生的FSH具有一種或多種本文所描述的糖基化特征，特別是攜帶N-平分型乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20％；和/或攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30％；和/或2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30％；及/或多樣的糖基化形式。根據(jù)一個實施方式，來源于或同源于GT-5s的細胞系能夠表達具有如本文描述的優(yōu)選糖基化形式的FSH，特別是選自表1的糖基化形式。由來源于或同源于GT-5s的細胞系產(chǎn)生的FSH的類似的糖基化形式優(yōu)選地與獲自GT-5s的FSH的糖基化形式在一種或多種，優(yōu)選地為所有糖基化特性上的差異為20％或更少、更優(yōu)選地為15％或更少、10％或更少或5％或更少，所述糖基化特性選自bisGlcNAc的相對量、唾液酸化聚糖的相對量、硫酸化聚糖的相對量、2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量、果糖相對量、四天線型聚糖的相對量、攜帶半乳糖的聚糖支鏈相對量及Z數(shù)。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH優(yōu)選地為FSH，更優(yōu)選地為人類FSH，其具有一種或多種本文公開的特異性糖基化特征，優(yōu)選地具有選自表1的糖基化形式。細胞系GT-5s以及由其來源的細胞系及與其同源的細胞系尤其有優(yōu)勢，因為其提供了非常穩(wěn)定和均一的蛋白質(zhì)生產(chǎn)，尤其是就FSH蛋白質(zhì)而言。其具有很好的批次一致性，即，從不同生產(chǎn)運行中獲得的或以不同規(guī)模和/或用不同培養(yǎng)步驟所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)及其糖基化形式是類似的。特別地，如本文所描述的多樣的糖基化形式在使用這些細胞系表達FSH的不同生產(chǎn)運行中是高度可復(fù)制的。根據(jù)本發(fā)明的FSH是糖基化的，即，其是由一個或多個，優(yōu)選地為四個連接于多肽鏈的寡糖修飾的。這些寡糖，即聚糖或碳水化合物可以為線性或分支的糖鏈，并且優(yōu)選地為復(fù)合型N-連接寡糖鏈。根據(jù)寡糖的分支數(shù)，稱為單-、二-、三-或四天線型(或甚至五天線型)。單天線型寡糖是不分支的，而二-、三-或四天線型寡糖分別具有一個、兩個或三個分支。因此具有更多天線的糖蛋白具有更多的寡糖終點并可攜帶更多的功能性末端糖單元，如唾液酸。如本文所使用的，“至少三天線型”指的是具有至少3個天線的寡糖，包括三天線型、四天線型和五天線型寡糖。如本文所使用的，“至少四天線型”指的是具有至少4個天線的寡糖，包括四天線型和五天線型寡糖。對于復(fù)合型N-聚糖，優(yōu)選地認為平分型GlcNAc殘基不是分支或天線，因此不加到FSH的天線之內(nèi)。本文所指代的FSH的糖基化形式特別指的是根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物中所有FSH蛋白質(zhì)的整體糖基化形式。特別地，在糖基化形式中考慮到并反映了FSH制備物中在FSH蛋白質(zhì)中包含并由此連接于FSH多肽鏈的任何聚糖結(jié)構(gòu)。術(shù)語“唾液酸”特別指代任何神經(jīng)氨酸的N-或O-置換衍生物。其可指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸或5-N-羥乙酰神經(jīng)氨酸，但優(yōu)選地僅僅指代5-N-乙酰神經(jīng)氨酸。唾液酸，特別是5-N-乙酰神經(jīng)氨酸，優(yōu)選地通過2,3-或2,6-連接與碳水化合物鏈相連。優(yōu)選地，本文描述的FSH制備物中存在有2,3-及2,6-偶聯(lián)唾液酸二者。FSH的唾液酸化程度通常以Z數(shù)表示。Z數(shù)表示糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)上的相對負電荷。Z數(shù)是通過以下公式計算的：Z＝A1％*1+A2％*2+A3％*3+A4％*4其中A1％為帶-1電荷的聚糖的百分比，A2％為帶-2電荷的聚糖的百分比，A3％為帶-3電荷的聚糖的百分比，而A4％為帶-4電荷的聚糖的百分比。這些百分比是相對連接于FSH的所有聚糖計算的，包括帶電及不帶電的聚糖。聚糖的的電荷可由聚糖中包含的任何帶電的單糖單元或置換物提供，尤其是由唾液酸殘基和/或硫酸基團和/或磷酸基團提供。由于FSH的聚糖的電荷通常只是通過其的唾液酸殘基確定而FSH通常具有四個聚糖結(jié)構(gòu)，所以Z數(shù)指示了FSH上的唾液酸的量或FSH的酸性。然而，當(dāng)FSH還包括顯著量的硫酸聚糖時，Z數(shù)指示了唾液酸和硫酸基團的組合量。根據(jù)本發(fā)明，“聚糖的相對量”指代連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中FSH糖蛋白的聚糖的特定百分比或百分比范圍。特別地，聚糖的相對量指的是FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物的FSH多肽鏈的所有聚糖的特定百分比或百分比范圍。100％的聚糖指的是分別連接于FSH制備物或包含F(xiàn)SH的組合物中的FSH糖蛋白的所有聚糖。例如，攜帶平分型GlcNAc的聚糖的相對量為60％指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的60％包含平分型GlcNAc殘基，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH多肽鏈的所有聚糖中的40％不包含平分型GlcNAc殘基。本文給出的數(shù)值，特別是特異糖基化特性的相對量優(yōu)選地理解為近似數(shù)值。特別地，這些數(shù)值優(yōu)選地可高出或低于多至10％，特別是高出或低于多至9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％?！癋SH制備物”可為任何包含或由FSH構(gòu)成的組合物或物質(zhì)。其可為固態(tài)或液態(tài)形式，可包含F(xiàn)SH之外的其他成分。特別地，F(xiàn)SH制備物可為溶液，包含F(xiàn)SH及合適溶劑如水和/或乙醇，或為例如含有FSH的溶液凍干后獲得的粉末。FSH制備物的合適實例為在細胞中表達FSH后獲得的組合物，特別是在FSH的純化之后，或包含F(xiàn)SH的藥用組合物。FSH制備物可在FSH之外含有例如溶劑、稀釋劑、輔料、穩(wěn)定劑、防腐劑、鹽、佐劑和/或表面活性劑。術(shù)語“FSH制備物”在本文使用的意義特別是“包含F(xiàn)SH的組合物”。這些術(shù)語優(yōu)選地在本文以同義詞使用?！?,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量”指代為2,6-偶聯(lián)唾液酸的唾液酸的總量的特定百分比或百分比范圍。因此2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為100％意味著所有唾液酸為2,6-偶聯(lián)唾液酸。例如，2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為60％指的是這樣的FSH制備物，其中FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的60％是以2,6-連接而連接，而FSH蛋白質(zhì)中包含并因此連接于所述FSH制備物中FSH蛋白質(zhì)的寡糖鏈的所有唾液酸中的40％不是以2,6-連接而連接，而是經(jīng)由2,3-連接或2,8-連接而連接.術(shù)語“多樣糖基化形式”特別指的是制備物或組合物中FSH蛋白質(zhì)的糖基化形式，這些糖基化形式包含多種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。不同的聚糖結(jié)構(gòu)為寡糖結(jié)構(gòu)在至少一個寡糖單元的存在/不存在、量和/或位置及/或至少一種化學(xué)修飾例如硫酸殘基、乙酰殘基等等上有差異。特定的“不同聚糖結(jié)構(gòu)”優(yōu)選地在其相對量為糖基化形式中聚糖結(jié)構(gòu)總量的至少0.02％、更優(yōu)選地至少0.03％、至少0.05％、至少0.07％、至少0.1％、至少0.15％、至少0.2％、至少0.25％、至少0.3％或者至少0.5％時只以這方面考慮。多樣糖基化形式特別是包含至少5種不同聚糖結(jié)構(gòu)的糖基化形式。優(yōu)選地，多樣糖基化形式包含至少7、更優(yōu)選地至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55且最優(yōu)選地至少60種不同的聚糖結(jié)構(gòu)。多樣糖基化形式特別還指代制備物或組合物中FSH的糖基化形式，所述糖基化形式包含比在相應(yīng)制備物或組合物中獲自CHO細胞的的FSH更多的不同聚糖結(jié)構(gòu)。特別地，糖基化形式比獲自CHO細胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少10％、優(yōu)選地至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％且最優(yōu)選地至少100％。術(shù)語“核酸”包括單鏈和雙鏈核酸及核糖核酸，以及脫氧核糖核酸。其可包含天然發(fā)生的及合成的核苷酸，也可天然或人工修飾，例如有甲基化、5'-和/或3'-帽化。術(shù)語“載體”在本文使用的是其最通用的意義，包含核酸的任何中間媒介物，其能使得所述核酸例如引入原核及/或真核宿主細胞，并在恰當(dāng)?shù)臅r候整合入宿主細胞的基因組中。此種類型的載體優(yōu)選地在宿主細胞中復(fù)制和/或表達。載體優(yōu)選地包含一種或多種選擇標(biāo)記物以選擇包含所述載體的宿主細胞。合適的選擇標(biāo)記物為抗性基因，其為宿主細胞提供例如針對特異抗生素的抗性。其他合適的選擇標(biāo)記物為例如酶類基因如DHFR或GS。使得重組蛋白質(zhì)(包括FSH)能夠表達的載體以及能夠使得重組蛋白質(zhì)在宿主中以高產(chǎn)量表達的合適的表達盒及表達元件在在線技術(shù)中已熟知，也是商業(yè)可得的，因此無需在本文進行詳細描述。術(shù)語“細胞”和“多個細胞”以及“細胞系”可交換使用，優(yōu)選地指代一種或多種哺乳動物細胞，特別是人類細胞。該術(shù)語包括細胞的子代或細胞群體。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認識到“多個細胞”包括單一細胞的子代，而由于天然、偶然、或認為突變和/或改變的原因，子代不必(在形態(tài)或總DNA互補物上)完全相同于起始親本細胞。“細胞”優(yōu)選地指代分離的細胞核/或培養(yǎng)的細胞，其沒有并入活的人類或動物體。術(shù)語“患者”根據(jù)本發(fā)明指的是人類、非人靈長動物或其他動物，特別是哺乳動物如奶牛、馬、豬、綿羊、山羊、狗、貓或嚙齒動物如小鼠和大鼠。在一個具體優(yōu)選的實施方式中，患者為人類。在人類患者的情況下，F(xiàn)SH優(yōu)選地為人類FSH?；颊呖梢詾樾坌曰虼菩裕瑑?yōu)選地為雌性。術(shù)語“藥用組合物”特別指代適合施用于人類或動物的組合物，即含有藥用可接受組分的組合物。優(yōu)選地，藥用組合物包含活性化合物或鹽或其原藥，以及載體、稀釋劑或藥用輔料如緩沖液、防腐劑及張力調(diào)節(jié)劑。FSH的國際單位(IU)指的是人尿液FSH和LH的第四套國際標(biāo)準(zhǔn)(thefourthInternationalStandardforHumanUrinaryFSHandLH)(Storring,P.L.&GainesDas,R.E.(2001)JournalofEndocrinology171,119-129)，是根據(jù)增廣卵巢增重法(aaugmentedovarianweightgainmethod)確定的(Steelman,S.L.&Pohley,F.M.(1953)Endocrinology53,604-616)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“不育癥治療”指的是對人類或動物受試者生殖或能育性相關(guān)的功能不良或疾病的治療。特別地，不育癥治療包括輔助生殖技術(shù)、排卵誘導(dǎo)、體外受精、宮腔內(nèi)人工受精以及生殖細胞成熟如卵泡發(fā)生或精子發(fā)生的實現(xiàn)或改進。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“其中未釋放顯著量的cAMP”或類似的詞語特別指的是細胞或組織釋放的cAMP的量占由以導(dǎo)致最大cAMP釋放的濃度的FSH刺激后的細胞或組織獲得的cAMP釋放量的少于25％、優(yōu)選地為少于20％、更優(yōu)選地為少于15％、少于10％、少于7.5％、少于5％或少于2.5％。這些細胞或組織易感或敏感于FSH的刺激，如粒層細胞或睪丸支持細胞(Sertolicell)。不依賴于FSH的cAMP釋放，即在FSH不存在時也會發(fā)生的cAMP釋放不應(yīng)當(dāng)在這一方面考慮。優(yōu)選地，“釋放顯著量的cAMP”或“cAMP的顯著釋放”是高于FSH不存在時cAMP釋放的任何cAMP釋放，特別是在測量的不精確度之上的任何可檢測的cAMP釋放。用于測量cAMP釋放的標(biāo)準(zhǔn)步驟在實施例中有所描述，可用于確定顯著或不顯著的cAMP釋放?！癱AMP的釋放”指的是cAMP的細胞內(nèi)釋放及/或cAMP的細胞外釋放或分泌，優(yōu)選地只指代cAMP的分泌。cAMP指代環(huán)磷酸腺苷，其在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起第二信使分子的作用。cAMP是由腺苷環(huán)化酶從ATP合成的?！安灰蕾嘽AMP信號傳導(dǎo)”的生物學(xué)過程或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑優(yōu)選地不涉及腺苷環(huán)化酶的活化?！靶灶惞檀肌保卜Q為性腺類固醇或性激素，特別指代與脊椎動物的雄激素和雌激素受體相互作用的類固醇激素。術(shù)語“性類固醇”包括雄性激素如合成代謝類固醇、雄烯二酮、脫氫表雄酮、二氫睪丸酮和睪丸酮；雌激素如雌二醇、雌三醇和雌素酮；以及黃體酮。優(yōu)選地，性類固醇指代天然發(fā)生的性類固醇，更優(yōu)選地指代天然人類性類固醇。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的性類固醇為雌二醇和黃體酮，尤其是黃體酮。本發(fā)明根據(jù)一個方面基于的是一項發(fā)現(xiàn)，具有優(yōu)化糖基化形式的改進的重組FSH制備物能夠在低的不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度下誘導(dǎo)性類固醇如黃體酮的分泌。特別地，在此特定方面，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH在比通常所用的尿液FSH或獲自CHO細胞的重組FSH低很多的濃度下誘導(dǎo)性類固醇分泌。因此，改進的FSH可以低很多的劑量施用，這減少了副作用的風(fēng)險，并進一步降低了生產(chǎn)成本。進一步地，如果以可比的劑量施用，在此實施方式中改進的FSH比通常使用的FSH在患者體內(nèi)提供更長久的活性，因為在施用一段很長的時間后只有很低濃度的FSH留存在循環(huán)系統(tǒng)中，但是根據(jù)本發(fā)明的這個實施方式的FSH仍然發(fā)揮其生物學(xué)活性并優(yōu)選地刺激或共刺激生殖細胞成熟和/或釋放性類固醇。此外，在高濃度下，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH以及通常使用的尿液或來源于CHO的FSH顯示出可比的效應(yīng)。因此，相比于通常使用的FSH，劑量過大沒有其他風(fēng)險。進一步地，本發(fā)明者已經(jīng)在獼猴中證明根據(jù)本發(fā)明的改進FSH與通常使用的尿液或來源于CHO的FSH相比具有類似甚至較高的藥學(xué)效應(yīng)。這一點尤其意外，因為根據(jù)本發(fā)明的FSH在大鼠和猴中顯示了比獲自尿液或CHO細胞的常用FSH制備物更低的最大血清濃度(Cmax)及循環(huán)半衰期。雖然改進的FSH的生物可及性較低，但卻具有類似或更高的藥學(xué)效應(yīng)，因此可以推論根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH具有比尿液或CHO來源的FSH更高的特異性治療活性。根據(jù)所獲得的臨床數(shù)據(jù)，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH在人類中比常用FSH制備物有顯著更高的Cmax；然而，改進的FSH的循環(huán)半衰期稍低卻也是可比的。最意外的是，根據(jù)本發(fā)明的改進FSH制備物甚至在只施用了單次劑量之后都在人類中顯示出治療效應(yīng)，特別是卵泡生長的效應(yīng)。相反，以單次劑量施用常用FSH制備物后未觀察到任何效應(yīng)。因此，預(yù)期的是以所述改進的FSH可對患者進行更精確的治療。特別地，有可能使用確切定時、定量的劑量治療并改進患者的不育癥，也可能不需要長期的連續(xù)治療。因此，也減少了多胎妊娠的風(fēng)險?？傊?，根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH制備物更加有效。因此，可對患者施用較小的劑量，這引起更少的副作用，對患者更加方便也花費更少。進一步地，用改進的FSH可設(shè)計更特異和詳細的劑量方案。進一步地，減少的半衰期可減少不期望的副作用并進一步使得治療終止后FSH能更快從人體移除。不受此理論的約束，本發(fā)明的發(fā)明人推論根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物的更高的特異性治療活性是基于改進的糖基化形式。特別地，高量的平分型GlcNAc殘基和/或高量的2,6-偶聯(lián)唾液酸以及高量的硫酸化聚糖可產(chǎn)生高的活性。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物還顯示了更多樣復(fù)雜的糖基化形式，意味著相比于例如來源于CHO細胞的常規(guī)FSH制備物，所述制備物中存在更多不同的聚糖結(jié)構(gòu)。據(jù)相信，CHO來源的FSH只能在靶標(biāo)細胞中激活單一的通路，而根據(jù)本發(fā)明的改進的FSH由于其由獨特的糖基化形式，顯然是經(jīng)由多種不同通路發(fā)揮其生物學(xué)活性，產(chǎn)生增加的生物學(xué)應(yīng)答。如本文實驗數(shù)據(jù)所示，這些途徑中有一些涉及cAMP信號傳導(dǎo)，而其他的新型通路是不依賴于cAMP的。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明在第一個方面提供了FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征：(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少20％；(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少30％；和/或(iii)2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30％；和/或(iv)其為多樣的糖基化形式。在特定實施方式中，本發(fā)明提供了FSH制備物，其中制備物中的FSH具有的糖基化形式包含一種或多種以下特征：(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量為至少35％；(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少60％；和/或(iii)2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少30％；優(yōu)選地，所述FSH為重組FSH，因此其可通過宿主細胞中的重組生產(chǎn)而獲得，后者優(yōu)選地為人類宿主細胞。合適的提供相應(yīng)糖基化形式的人宿主細胞隨后有描述。優(yōu)選地，所述糖基化形式包含特征(i)、(ii)和(iii)的至少兩種(特別是特征(i)和(ii)、(i)和(iii)、或(ii)和(iii))，更優(yōu)選地包含全部特征(i)、(ii)和(iii)。進一步地，所述糖基化形式可進一步包含至少四天線型的聚糖，其相對量為至少15％，和/或攜帶一個或多個唾液酸殘基的聚糖，其相對量為至少80％，和/或攜帶半乳糖的聚糖，其相對量為至少95％,和/或攜帶末端半乳糖單元的聚糖分支，其相對量為至少60％，和/或攜帶硫酸基團聚糖，其相對量為至少1％，優(yōu)選地為至少2.5％。所述末端半乳糖單元任選地進一步攜帶唾液酸殘基。所述組合物中的重組FSH優(yōu)選地具有Z數(shù)為至少200。攜帶bisGlcNAc的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少25％、至少27％、至少30％、至少35％、至少38％或至少40％。更優(yōu)選地，其的范圍為大約25％-大約60％，特別是大約35％-大約60％的范圍或大約38％-大約50％的范圍，或大約40％-大約45％的范圍。根據(jù)一個實施方式，為大約42％。攜帶一個或多個唾液酸殘基的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少83％、至少85％或至少88％，更優(yōu)選地為大約85％-大約98％的范圍或大約88％-大約95％的范圍，最優(yōu)選地為大約90％。Z數(shù)優(yōu)選地為至少210、更優(yōu)選地至少215、至少220、至少230或至少240。較高的Z數(shù)可例如通過在FSH制備物中富集酸性和/或負電FSH蛋白質(zhì)而獲得。優(yōu)選地，至少四天線型聚糖的相對量為至少16％、至少17％、至少18％或至少19％、更優(yōu)選地至少20％或至少21％。至少三天線型聚糖，特別是三-和四天線型聚糖的相對量優(yōu)選地為至少25％、至少30％、至少35％或至少40％、更優(yōu)選地至少45％、至少50％或至少55％。優(yōu)選地，攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35％、至少40％、至少50％、至少60％或至少70％、更優(yōu)選地至少75％或至少78％。其可為大約70％-大約90％的范圍，特別是大約75％-大約85％的范圍。優(yōu)選地，2,6-偶聯(lián)的唾液酸的相對量為至少40％、至少45％、至少50％、至少53％、至少55％、至少60％或至少65％，特別是大約40％-大約99％的范圍，優(yōu)選地為大約40％-大約80％、大約50％-大約60％或大約53％-大約70％的范圍。優(yōu)選地，2,3-偶聯(lián)唾液酸對2,6-偶聯(lián)唾液酸的比率范圍為大約1:10-大約7:3，更優(yōu)選地為大約1:5-大約3:2或大約1:2-大約1:1，最優(yōu)選地為大約2:3-大約1:1。在優(yōu)選的實施方式中，2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量超過2,3-偶聯(lián)唾液酸的量。攜帶半乳糖的聚糖的相對量優(yōu)選地為至少97％，最優(yōu)選地為大約98％。優(yōu)選地，攜帶半乳糖單元(任選地由唾液酸殘基修飾)的聚糖分支的相對量為至少65％、更優(yōu)選地至少70％或至少73％。其優(yōu)選地范圍為大約60％-大約95％，更優(yōu)選地范圍為大約70％-大約80％。優(yōu)選地，攜帶硫酸基團的聚糖(硫酸聚糖)的相對量為至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％或至少5％、更優(yōu)選地至少7％、至少10％或至少12％。根據(jù)一個實施方式，攜帶硫酸基團的聚糖的相對量不超過50％，優(yōu)選地不超過40％、35％、30％、25％或20％。在優(yōu)選的實施方式中，制備物中的FSH具有多樣糖基化形式，其中制備物中FSH包含至少45或優(yōu)選地至少50種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少0.05％。根據(jù)一個實施方式，制備物中FSH包含至少35或優(yōu)選地至少40種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少0.1％；和/或制備物中FSH包含至少20或優(yōu)選地至少25中不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少0.5％。在一個進一步的實施方式中，制備物中的FSH比相應(yīng)制備物中獲自CHO細胞的FSH包含的不同聚糖結(jié)構(gòu)多至少40％，優(yōu)選地至少50％，其中每種不同的聚糖結(jié)構(gòu)具有相應(yīng)制備物中FSH的聚糖結(jié)構(gòu)總量的相對量為至少0.05％、0.1％或0.5％。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物不包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(NeuGc)或可檢測量的NeuGc。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地還不含有Galili表位(Galα1,3-Gal結(jié)構(gòu))或可檢測量的Galili表位。本發(fā)明特別提供了具有人類糖基化形式的FSH。由于這些糖基化特性，不存在誘導(dǎo)副作用的外源免疫原性非人結(jié)構(gòu)，這意味著避免了已知由特定外源糖結(jié)構(gòu)如免疫原性非人唾液酸(NeuGc)或Galili表位(Gal-Gal結(jié)構(gòu))(所述二者對于嚙齒動物生產(chǎn)系統(tǒng)也是已知的)或其他結(jié)構(gòu)如已知來自酵母系統(tǒng)的免疫原性高甘露糖結(jié)構(gòu)引起的不期望的副作用或不利之處。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的制備物中重組FSH的糖基化形式包含一種或多種，優(yōu)選地包括全部的以下特征：(i)攜帶平分型N-乙酰葡萄糖胺(bisGlcNAc)的聚糖的相對量范圍為大約25％-大約50％；(ii)攜帶果糖的聚糖的相對量為至少35％；(iii)2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量為至少53％；(iv)攜帶一個或多個唾液酸的聚糖的相對量為至少88％；以及(v)至少四天線型聚糖的相對量為至少16％.在特定的優(yōu)選實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物具有下文表1中列出的糖基化形式之一：表1:特異糖基化參數(shù)所顯示是的是具有以下特性的聚糖的相對量：B:平分型GlcNAc；2,6-S:2,6-偶聯(lián)唾液酸；硫酸化:硫酸聚糖；S>0:至少一個唾液酸；Z:Z數(shù)；四天線型:至少四天線型的聚糖在表1中列出的實施方式1-12中，優(yōu)選地，平分型GlcNAc的相對量為至少25％而不是至少20％；和/或2,6-偶聯(lián)唾液酸的相對量優(yōu)選地為至少55％、更優(yōu)選地至少60％,而不是至少53％；和/或硫酸聚糖的相對量為至少3％、更優(yōu)選地至少10％，而不是至少2.5％。表1中列出的糖基化形式優(yōu)選地為人類糖基化形式和/或不好喊NeuGc和Galili表位。進一步地，本發(fā)明提供重組的FSH制備物，其可通過在人類宿主細胞或人類細胞系中生產(chǎn)而獲得。優(yōu)選地，所述重組FSH可獲自人髓細胞系，優(yōu)選地為永生化人髓性白血病細胞系，特別是細胞系GT-5s或來源于其的細胞系或同源于GT-5s的細胞系。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在所述細胞系中產(chǎn)生的FSH顯示有如上文所描述的糖基化形式，特別顯示了本文描述的有利的治療和藥學(xué)效應(yīng)。因此，本發(fā)明還涉及通過在合適的細胞系中重組表達FSH生產(chǎn)重組FSH制備物的方法，特別是如上文描述的細胞系，特別是細胞系GT-5s、來源于GT-5s的細胞系或同源于GT-5s的細胞系。相應(yīng)產(chǎn)生的重組FSH可進行分離及任選地進行純化。因此，重組FSH制備物優(yōu)選地可通過包括以下步驟的方法獲得：(i)在適合表達FSH的條件下培養(yǎng)人類宿主細胞，優(yōu)選地是來源于細胞系GT-5s的細胞系或同源細胞系，其包含編碼FSHα和β亞基的核酸；以及(ii)分離FSH。用于表達的人類宿主細胞優(yōu)選地為髓細胞，特別是永生化的髓性白血病細胞，優(yōu)選地為或來源于細胞系GT-5s或是與其同源的細胞系。培養(yǎng)這些人類宿主細胞以便其表達FSH。合適的培養(yǎng)條件對技術(shù)人員是已知的。對FSH的分離優(yōu)選地包括以下進一步的步驟：(a)在人類細胞分泌FSH時獲得培養(yǎng)物上清，或在FSH不分泌時裂解人類細胞；(b)使用色譜步驟如反相色譜、體積排阻色譜和/或疏水作用色譜從培養(yǎng)物上清或細胞裂解物中分離FSH；以及(c)任選地通過移除堿性FSH異構(gòu)體獲得FSH的酸性級分，優(yōu)選地通過使用陰離子交換色譜，包括移除堿性FSH異構(gòu)體的洗滌步驟，如在大約pH5.0或大約pH4.5或大約pH4.0下的洗滌步驟。優(yōu)選地，編碼FSHα亞基的核酸及編碼FSHβ亞基的核酸包含在表達盒中的，后者包含在能在人類宿主細胞中表達的合適的表達載體。編碼FSHα亞基的核酸及編碼FSHβ亞基的核酸可包含在相同的載體中，但優(yōu)選地是包含在分離的載體中的。進一步地，使用恰當(dāng)?shù)脑鏘RES元件可將其在一個表達盒中表達。優(yōu)選地，F(xiàn)SH是由人類細胞分泌的。在優(yōu)選的實施方式中，對人類細胞的培養(yǎng)是在發(fā)酵罐和/或在無血清條件下進行的。用于重組FSH的合適的純化方法在美國專利申請?zhí)朥S61/263,931、歐洲專利申請?zhí)朎P09014585.5及PCT專利申請?zhí)朩O2011/063943中有所描述。可通過在人類宿主細胞或人類細胞系中生產(chǎn)而獲得的重組FSH制備物優(yōu)選地顯示出本文描述的、根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物相關(guān)的特征。特別是，其糖基化形式包含一種或多種上文描述的特征，優(yōu)選地為至少一種如表1和/或權(quán)利要求1-6中描述的糖基化形式。在本發(fā)明的方面的優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH為重組人FSH(rhFSH)，優(yōu)選地可通過在人類細胞系如細胞系GT-5s中生產(chǎn)而獲得，所述細胞系包含一種或多種編碼人FSH亞基的核酸及用于在宿主細胞中表達所述一種或多種核酸的元件。優(yōu)選地，rhFSH的α亞基具有根據(jù)SEQIDNO:1的氨基酸序列或在其整個長度上與SEQIDNO:1具有同源性或優(yōu)選地同一性為至少80％、優(yōu)選地至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，rhFSH的α亞基包含52和78號位的天冬氨酸殘基，并在氨基酸Asn52和Asn78處被糖基化。優(yōu)選地，rhFSH的β亞基具有根據(jù)SEQIDNO:2的氨基酸序列或與SEQIDNO:2在其整個長度上具有同源性或優(yōu)選地同一性為至少80％、優(yōu)選地至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的氨基酸序列。在優(yōu)選的實施方式中，rhFSH的β亞基包含7和24號位的天冬氨酸殘基，并在氨基酸Asn7和Asn24處被糖基化。根據(jù)一個實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠(a)在不釋放顯著量的cAMP的濃度下；及/或(b)通過誘導(dǎo)不依賴于cAMP信號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激粒層細胞中的黃體酮釋放。根據(jù)一個實施方式，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠通過不依賴于cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細胞成熟。驚人地，在實驗中發(fā)現(xiàn)上文描述的糖基化形式導(dǎo)致重組FSH的相應(yīng)的新型藥學(xué)譜，其顯示了本文描述的藥學(xué)和治療優(yōu)勢。根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物可能具有一種或多種隨后描述的特征，可在粒層細胞測定中確定(例如在實施例2中描述的)。如這些實施例表明的，具有上文描述的糖基化形式的重組FSH，特別是可通過在細胞系GT-5s中生產(chǎn)而獲得的重組FSH顯示出隨后描述的特征，而引起本文描述的藥學(xué)和治療性優(yōu)勢。所述FSH制備物根據(jù)一個實施方式能夠以低于誘導(dǎo)粒層細胞釋放cAMP所需的最小濃度的濃度刺激粒層細胞釋放黃體酮。下文提到的黃體酮、雌二醇和/或cAMP的釋放指代在大約1*104-大約1*106粒層細胞/ml，優(yōu)選地在大約5*104-大約1*105粒層細胞/ml中的體外釋放，特別是在下文實施例2中描述的條件下的釋放。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠以不誘導(dǎo)cAMP釋放或誘導(dǎo)cAMP釋放少于20pmol/ml、少于15pmol/ml、少于10pmol/ml、少于5pmol/ml的濃度釋放至少100ng/ml、至少150ng/ml、至少200ng/ml、優(yōu)選地至少250ng/ml、至少300ng/ml或至少400ng/ml黃體酮。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地能夠以低于人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH所需濃度的FSH濃度釋放至少100ng/ml、至少200ng/ml、優(yōu)選地至少300ng/ml或至少400ng/ml的黃體酮。其優(yōu)選地能夠以特定濃度釋放至少100ng/ml、至少200ng/ml、優(yōu)選地至少300ng/ml或至少400ng/ml的黃體酮，在此濃度下人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH不會引起黃體酮的對應(yīng)等同的高釋放。如實施例所表明的，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH比人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH更強地誘導(dǎo)并刺激黃體酮的產(chǎn)生。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地能夠以不誘導(dǎo)cAMP釋放或誘導(dǎo)cAMP釋放少于20pmol/ml、少于15pmol/ml、少于10pmol/ml、少于5pmol/ml的FSH濃度釋放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l或至少150nmol/l的雌二醇。進一步地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地能夠以低于人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH所需濃度的FSH濃度釋放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l、至少150nmol/l、至少200nmol/l、至少250nmol/l、至少300nmol/l或至少350nmol/l的雌二醇。因此，其優(yōu)選地能夠以特定濃度釋放至少50nmol/l、至少75nmol/l、至少100nmol/l、至少125nmol/l、至少150nmol/l、至少200nmol/l、至少250nmol/l、300nmol/l或至少350nmol/l的雌二醇，在此濃度下人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH不會引起雌二醇的對應(yīng)等同的高釋放。如實施例所證明的，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物比人尿液FSH或產(chǎn)生于CHO細胞(GonalF)的重組FSH更強地誘導(dǎo)并刺激雌二醇的產(chǎn)生。本文描述的cAMP釋放和性類固醇表達的相應(yīng)特征可使用粒層細胞測定進行分析和確定，例如如實施例2中所描述的。根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物優(yōu)選地存在于藥用組合物中。因此，本發(fā)明的另一方面為包含根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物的藥用組合物，其用于治療如本文限定的不育癥。所述藥用組合物可包括其他的藥用活性試劑，特別是可用于不育癥的治療的其他試劑如其他促性腺激素，特別是LH和/或CG，優(yōu)選地為重組的和/或人類LH或CG。備選地，包含重組FSH的藥用組合物可設(shè)計為與這樣的其他藥用活性試劑組合使用。進一步地，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物或根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物，其用于不育癥的治療，以及用于治療不育癥的方法，包括對患者施用根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物。如上文所討論的，在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物在不釋放顯著量的cAMP的濃度下已經(jīng)能夠刺激或共刺激性類固醇如黃體酮的釋放，特別是粒層細胞中黃體酮的釋放。特別是，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH能夠在低于誘導(dǎo)粒層細胞釋放cAMP所需的最小濃度的濃度下刺激粒層細胞中性類固醇如黃體酮的釋放。進一步地，在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠通過誘導(dǎo)不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路刺激黃體酮的釋放，特別是粒層細胞中黃體酮的釋放。優(yōu)選地，不育癥的治療包括用根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠誘導(dǎo)不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致黃體酮的釋放的刺激。然而，其他包括cAMP信號傳導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還可由所述重組FSH激活。在其他實施方式中，不育癥的治療不涉及根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物對cAMP顯著釋放的誘導(dǎo)。在其他實施方式中，如上文所述，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠通過不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細胞的成熟。因此，本發(fā)明還涉及上文描述的重組FSH制備物或藥用組合物，用于誘導(dǎo)和/或刺激也不依賴于cAMP對的性類固醇的分泌。進一步地，本發(fā)明還涉及上文描述的重組FSH制備物或藥用組合物，用于通過不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細胞的成熟。此外，本發(fā)明還涉及上文描述的重組FSH制備物或藥用組合物，用于以不誘導(dǎo)顯著cAMP釋放的FSH濃度誘導(dǎo)和/或刺激性類固醇的分泌。進一步地，本發(fā)明還涉及上文描述的重組FSH制備物或藥用組合物，用于以比通常使用的尿液FSH或獲自CHO細胞的重組FSH低得多的FSH濃度誘導(dǎo)性類固醇的分泌。相應(yīng)用途，特別是用于治療不育癥的用途的藥學(xué)和治療性優(yōu)勢在上文有詳細討論。特別地，不育癥的治療可包括通過不依賴cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程刺激或共刺激生殖細胞的成熟。然而，不育癥的治療可另外包含通過一種或多種涉及cAMP信號的其他生物學(xué)過程刺激生殖細胞成熟。在其他實施方式中，不育癥的治療不涉及通過這樣的其他生物學(xué)過程刺激生殖細胞成熟。生殖細胞的成熟優(yōu)選地包括卵泡生長和/或精子發(fā)生。進一步地，F(xiàn)SH刺激生殖細胞成熟的生物學(xué)過程可包括性類固醇，特別是黃體酮的分泌，優(yōu)選地是由粒層細胞分泌的。優(yōu)選地，不依賴于cAMP信號傳導(dǎo)的生物學(xué)過程指代性類固醇特別是黃體酮的分泌，優(yōu)選地是由粒層細胞分泌的，這是由不涉及cAMP作為信使分子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)的。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物能夠甚至在只施用單次劑量后發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。特別地，在只施用單次劑量的所述FSH制備物或藥用組合物后，根據(jù)本發(fā)明的FSH制備物或根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物能夠在患者，特別在人患者中誘導(dǎo)卵泡生長和/或卵子成熟。優(yōu)選的，與獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物相比，在只施用單次劑量后達到的生物學(xué)效應(yīng)更高，特別是卵泡生長和/或卵子成熟更顯著及/或在更高比率的經(jīng)治療的患者中達到。所述單次劑量特別包括至少10IUFSH、優(yōu)選地至少15IUFSH、至少20IUFSH或至少25IUFSH，及/或1000IUFSH或更少、優(yōu)選地為750IUFSH或更少、500IUFSH或更少、300IUFSH或更少、200IUFSH或更少、150IUFSH或更少、100IUFSH或更少或50IUFSH或更少。優(yōu)選地，所述單次劑量包含大約10IU-大約500IUFSH，更優(yōu)選地大約20IU-大約300IUFSH，或例如大約25IUFSH、大約75IUFSH或大約100IUFSH。在進一步的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH比獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物具有較短的循環(huán)半衰期。特別地，其在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中有更短的循環(huán)半衰期。優(yōu)選地，循環(huán)半衰期比獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物低至少5％、更優(yōu)選地至少10％、至少15％或低至少20％。在特定實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物比獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物具有更低的生物利用率，特別地，是在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中。優(yōu)選地，生物利用率比獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物低至少5％、更優(yōu)選地至少10％、至少15％或低至少20％。在此方面的生物利用率優(yōu)選地指代在藥效動力學(xué)研究中獲得的曲線下面積(AUC)值，其中在施用限定量的FSH后不同時間點測定血清FSH濃度。優(yōu)選地，循環(huán)半衰期和生物利用率是在通過皮下注射施用FSH后確定的，特別是在單次劑量施用后確定，其中所述的單次劑量優(yōu)選地包含大約10-大約1000IUFSH、更優(yōu)選地為25IU-大約500IUFSH或大約50IU-大約300IUFSH，特別是100IUFSH。特別地，循環(huán)半衰期和生物利用率是如下文實施例6中公開的方式確定的。在優(yōu)選的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物具有與獲自人尿液和/或表達于CHO細胞中的FSH制備物類似或甚至更高的治療效力，特別是在是在人、食蟹猴、大鼠和/或小鼠中的一種或多種中。術(shù)語“治療效力”優(yōu)選地指代在施用于患者時刺激雌二醇和/或抑制素B的釋放的能力。治療效力優(yōu)選地是在通過皮下注射施用FSH后測量一個或多個患者血液或血清中的雌二醇和/或抑制素B的濃度確定的，特別是在單次劑量施用后，其中單次劑量優(yōu)選地包含大約10-大約1000IUFSH、優(yōu)選地大約25IU-大約500IUFSH或大約50IU-大約300IUFSH，特別是大約100IUFSH。特別地，治療效力是如下文實施例5中公開的方式確定的。類似的治療效力特別指的是相應(yīng)的FSH制備物對雌二醇和/或抑制素B釋放的刺激，這樣產(chǎn)生的雌二醇和/或抑制素B的血清濃度相互之間差異不超過25％、優(yōu)選地不超過20％、不超過15％或不超過10％。獲自人尿液的FSH制備物特別獲自絕經(jīng)期后女性的尿液。表達于CHO細胞中的FSH制備物為例如表達于CHO細胞系CHOdhfr-[ATCC號CRL-9096]。獲自人尿液的FSH制備物及表達于CHO細胞中的FSH制備物優(yōu)選地為商業(yè)可得并得到許可的藥用制備物，特別分別為Bravelle和Gonal-f。在比較不同F(xiàn)SH制備物的效應(yīng)特別在比較其循環(huán)半衰期、生物利用率及治療效力時，通過以相同的劑量方案使用相同的施用途徑并使用類似或相同的其他條件將FSH制備物施用于類似的患者組而分析所述制備物。在特定實施方式中，以導(dǎo)致患者循環(huán)系統(tǒng)中的FSH濃度低于5IU/L的劑量將根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物施用于患者。在特定實施方式中，要施用于患者的劑量導(dǎo)致患者循環(huán)系統(tǒng)中的FSH濃度為低于大約4IU/L、特別是低于3IU/L、低于大約2IU/L、低于大約1IU/L或低于大約0.5IU/L?；颊哐h(huán)系統(tǒng)中的FSH濃度例如在大約.0.01-大約5IU/L的范圍，特別是大約0.05-大約2IU/L、大約0.1-大約1.5IU/L或大約0.2-大約1IU/L。特別地，F(xiàn)SH是以不誘導(dǎo)cAMP顯著釋放的劑量施用于患者的。如實施例中所表明的，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物在特定實施方式中在這些濃度下發(fā)揮治療效應(yīng)。然而，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物也可以在患者循環(huán)系統(tǒng)中產(chǎn)生更高FSH濃度的劑量施用。在優(yōu)選的實施方式中，不育癥的治療包括輔助生殖技術(shù)、誘導(dǎo)排卵、體外受精例如通過胞質(zhì)內(nèi)精子注射進行的體外受精、配子輸卵管內(nèi)轉(zhuǎn)移、子宮內(nèi)受精、女性的無卵障礙的治療、女性卵子成熟的嚴(yán)重激素缺陷的治療、男性的精子產(chǎn)生缺陷的治療及/或生殖細胞成熟如卵泡發(fā)生和精子發(fā)生的實現(xiàn)或改進，尤其是例如在體外受精刺激操作流程中和/或進行無卵障礙治療時實現(xiàn)或改進女性卵泡成熟。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的重組FSH制備物用于對患者的腸道外施用。特別地，重組FSH是通過例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下進行注射或灌注施用的。在本發(fā)明的特定實施方式中，重組FSH存在于藥用組合物中。合適的劑量方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定，也可來源于本領(lǐng)域的一般知識。根據(jù)本發(fā)明的藥用組合物可為單劑量單位或多劑量單位形式。優(yōu)選地，所述藥用組合物為包含根據(jù)本發(fā)明的重組FSH的無菌溶液，其進一步包含一種或多種選自以下的成分：溶劑如水、緩沖物質(zhì)、穩(wěn)定劑、防腐劑、輔料、表面活性劑和鹽類。單次劑量單位優(yōu)選地包含大約10IU-大約750IUFSH、更優(yōu)選地為大約25IU-大約500IUFSH、大約50IU-大約400IUFSH或大約100IU-大約300IUFSH。多劑量單位包含足以提供多次單次劑量的FSH，特別是5、至少10、至少20或至少50次的單次劑量。所述藥用組合物可為例如注射筆的形式。附圖說明圖1顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；制備物1：空心方塊、制備物2：實心三角)或獲自CHO細胞的FSH(GonalF；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的cAMP釋放。圖2顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；制備物1：空心方塊、制備物2：實心三角)或獲自CHO細胞的FSH(GonalF；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的雌二醇合成情況。圖3顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；制備物1：空心方塊、制備物2：實心三角)或獲自CHO細胞的FSH(GonalF；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的黃體酮合成情況。圖4顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；空心方塊)或尿液FSH(Fostimon；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的cAMP釋放。圖5顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；空心方塊)或尿液FSH(Fostimon；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的雌二醇合成情況。圖6顯示了以不同濃度的改進的重組人FSH(FSH(本發(fā)明)；空心方塊)或尿液FSH(Fostimon；實心菱形)刺激的分離的粒層細胞的黃體酮合成情況。圖7顯示了使用改進的重組人FSH對比表中尿液FSH及獲自CHO細胞的標(biāo)準(zhǔn)重組FSH進行的Steelman-Pohley測定結(jié)果。將不成熟的雌性大鼠在進行三天的每日施用后的卵巢增重對所使用的FSH濃度作圖。圖8顯示了單次(A)及重復(fù)(B)皮下注射FSH(本發(fā)明)、尿液FSHBravelle或表達于CHO細胞中的重組FSHGonal-f后，食蟹猴中觀察到的雌二醇(E2)和抑制素B的血清濃度。每條棒代表4只動物的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖9顯示了單次靜脈內(nèi)或皮下注射后，雌性食蟹猴中的血清FSH濃度。每種符號代表一組4只動物的平均值。圖10顯示了可連接于FSH糖基化位點的復(fù)雜型聚糖結(jié)構(gòu)的示意圖。顯示了(a)雙天線型、(b)三天線型和(c)四天線型結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)中還可不存在唾液酸及半乳糖殘基，且所述結(jié)構(gòu)可進一步包含例如平分型GlcNAc殘基、果糖殘基及/或硫酸基團。Sia：唾液酸；Gal：半乳糖，本文也稱之為末端半乳糖；GlcNAc:N-乙酰葡萄糖胺；Man:甘露糖。具體實施方式實施例1:FSH(本發(fā)明)的制備通過培養(yǎng)GT-5s細胞生產(chǎn)FSH，所述細胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有兩種表達構(gòu)建體，具有人FSH的α和β鏈(α鏈登記號NT_007299.13；β鏈登記號NT_009237.18)。用于表達FSHα鏈的質(zhì)粒攜帶有突變形式的小鼠二氫葉酸還原酶(dhfr)的基因，該突變形式對該酶的抑制劑甲氨蝶呤比原生形式有更高的抗性；用于表達FSHα鏈的第二種質(zhì)粒攜帶嘌呤霉素抗性基因。用于FSH(本發(fā)明)表達的細胞系轉(zhuǎn)染是通過使用上文描述的兩種表達質(zhì)粒進行細胞核轉(zhuǎn)染而進行。為選擇及擴增穩(wěn)定產(chǎn)生抗體的細胞克隆，以逐漸增加的濃度添加嘌呤霉素和甲氨蝶呤。將擴增的細胞群接種到半固體基質(zhì)上用于使用ClonePixFL技術(shù)進行單細胞克隆或通過有限稀釋法進行單細胞克隆。篩選能夠高度分泌完整的FSH分子的克隆。FSH是在無血清條件下以分批、補料分批或灌注過程發(fā)酵生產(chǎn)FSH的GT-5s克隆而生產(chǎn)。發(fā)酵通常進行2-3周。在發(fā)酵后，將上清濾過2μm濾膜以清除細胞及細胞碎片，隨后使用0.2μm濾膜進行滅菌過濾步驟。該純化過程使用了反相色譜(RPC)進行捕獲步驟，隨后進行濃縮步驟及其后的尺寸排阻色譜(SEC)。任選地，然后將洗脫物加至陰離子交換色譜(AEC)以清除酸性較低的FSH內(nèi)容物。這是通過用pH5.0("在pH5.0下富集")或pH4.5("在pH4.5下富集")的洗滌緩沖液洗滌結(jié)合的FSH而完成的，以在洗脫所需的FSH部分前洗脫酸性較低的FSH異構(gòu)體。使用疏水相互作用色譜(HIC)作為精純步驟獲得高純度的FSH。實施例2:粒層細胞測定為進行粒層細胞測定，在收集卵細胞的過程中從IVF患者的卵泡液中分離原代細胞。使用Ficoll梯度離心法清除了其他細胞類型如血紅細胞后，將粒層細胞接種于24-96孔板在含有雄烯二酮或睪丸酮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-7天。在此階段后，用1pg/ml-2μg/ml范圍內(nèi)的FSH在圖中所示步驟(400μl/孔)中刺激細胞(2-4*104細胞/孔)。在孵育后三至四小時后，收集一半上清進行cAMP測定。再過24h后將細胞于剩余的上清中進行凍融而裂解。將裂解物用于黃體酮和雌二醇測定。FSH(本發(fā)明)與GonalF的比較在第一組實驗中，將FSH(本發(fā)明)與GonalF(MerckSeronoSA)進行比較。GonalF是重組產(chǎn)生于CHO細胞的FSH。結(jié)果顯示于圖1-3。盡管在可比FSH濃度的GonalF和FSH(本發(fā)明)產(chǎn)品下產(chǎn)生的第二信使cAMP的量也是可比的，但是在FSH(本發(fā)明)產(chǎn)品的情況下相比于重組產(chǎn)生于CHO細胞的FSH(GonalF)在低很多的FSH濃度下就釋放出類固醇黃體酮和雌二醇。FSH(本發(fā)明)與Fostimon的比較在另一組實驗中，將FSH(本發(fā)明)對Fostimon(IBSAInstitutBiochimiqueSA，分離自人尿液的FSH產(chǎn)品)進行比較。結(jié)果顯示于圖4-6。雖然在兩種制品FSH劑量范圍可比時的cAMP水平升高情況類似，但是相比于Fostimon，在顯著較低濃度的FSH(本發(fā)明)下就能產(chǎn)生性類固醇。注意：由于這些測定是使用不同供體進行的，因此刺激形式的差異可能歸因于每個測定中使用的供體。實施例3:Steelman-Pohley測定FSH的活性還通過Steelman-Pohley測定法而確定。該測定是根據(jù)藥典進行的。特別地，在施用三種不同F(xiàn)SH濃度，每種每日施用，施用三天后，測量不成熟雌性大鼠的卵巢增重。使用平行線評估計算效力。結(jié)果顯示于圖7。表2:與尿液FSH比較后計算的FSH(本發(fā)明)的活性樣品計算所得活性未富集的FSH(本發(fā)明)6,271IU/mg在pH4.5下富集的FSH(本發(fā)明)7,663IU/mg尿液標(biāo)準(zhǔn)品的活性：7,135IU/mg如Steelman-Pohley測定所表明的，F(xiàn)SH(本發(fā)明)及尿液和重組的標(biāo)準(zhǔn)品FSH的體內(nèi)活性在大鼠中是類似的。實施例4:糖化譜不同F(xiàn)SH制備物的糖化譜是由糖基化的結(jié)構(gòu)分析確定的。糖化譜生成了關(guān)于糖基化位點的復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)的信息。為測定糖化譜，使用PNG酶F從蛋白質(zhì)核心釋放出完整的N-聚糖。消化是在凝膠或凝膠塊中對明確的組別進行的。游離的N-聚糖由熒光標(biāo)記物2-氨基苯甲酰胺標(biāo)記。純化的N-聚糖樣品是通過疏水相互作用色譜(HILIC)結(jié)合熒光光度計檢測的方式分離的。該分析給出以下結(jié)果：表3:不同糖基化特性的相對量樣品FSGBFSH(本發(fā)明)80％90％98％42％Fostimon48％83％91％28％Puregon129％91％91％0％F:果糖；S：唾液酸；G：半乳糖；B：平分型N-乙酰半乳糖胺1:文獻值(K.等人(1990)EuropeanJournalofBiochemistry193,263-271)顯示的是攜帶所示單元的FSH上的N-聚糖的相對量。Puregon為另一種產(chǎn)生于CHO細胞的重組人FSH。進一步地，通過比較唾液酸酶A(裂解2,3-及2,6-偶聯(lián)唾液酸)及唾液酸酶S(只裂解2,3-偶聯(lián)唾液酸)釋放的唾液酸的量分析FSH的聚糖中2,3-偶聯(lián)及2,6-偶聯(lián)唾液酸的比率。表4:唾液酸連接的相對量樣品2,3-連接唾液酸2,6-連接唾液酸FSH(本發(fā)明)43％57％Bravelle75％25％GonalF/Puregon100％0％在FSH(本發(fā)明)中，唾液酸殘基通過2,3-及2,6-鍵以大約1:1的比率偶聯(lián)于聚糖上,甚至包含的2,6-偶聯(lián)唾液酸比2,3-偶聯(lián)唾液酸更多，而在尿液FSHBravelle(FerringPharmaceuticalsInc.)中，比率為大約3:1，2,3-連接唾液酸更多。由于Puregon(Organon/EssexPharma)和GonalF(MerckSerono)是在CHO細胞中重組產(chǎn)生的，所以其不具有任何平分型N-乙酰半乳糖胺，只包含2,3-偶聯(lián)唾液酸。從以上的測定并通過確定聚糖從FSH上釋放后的電荷分布而計算天線型、末端半乳糖單位及Z數(shù)。表5:不同F(xiàn)SH的糖基化天線型樣品二型三型四型FSH(本發(fā)明)42％35％22％Fostimon39％45％16％GonalF1～65％～25％～10％Puregon253％26％12％二型:雙天線型N-聚糖；三型:三天線型N-聚糖；四型:四天線型N-聚糖1:文獻值(Gervais,A.等人(2003)Glycobiology13(3),179-189)2:文獻值(K.等人(1990)EuropeanJournalofBiochemistry193,263-271)顯示的是FSH上雙-、三、及四天線型N-聚糖的相對量。表6:末端半乳糖單位的相對量樣品末端半乳糖FSH(本發(fā)明)75％Fostimon43％顯示的是末端具有半乳糖的FSH上N-聚糖分支的相對量。表7:不同F(xiàn)SH的Z數(shù)樣品Z數(shù)未富集的FSH(本發(fā)明)220富集了酸性異構(gòu)體的FSH(本發(fā)明)245GonalF(rFSH)218Puregon(rFSH)204Fostimon(uFSH)212Bravelle(uFSH)244顯示的是FSH制備物的Z數(shù)即相對酸度。較高的Z數(shù)表示FSH制備酸性更高。總之，根據(jù)本發(fā)明的FSH(FSH(本發(fā)明))具有高度的平分型N-乙酰葡萄糖胺、高天線型及高度的唾液酸化(尤其是在富集了酸性異構(gòu)體后)以及高的硫酸度。我們認為由于FSH(本發(fā)明)具有這三種糖基化參數(shù)中的一種或多種，其相比于常用的重組或尿液FSH制備物有更優(yōu)越的活性。進一步地，F(xiàn)SH(本發(fā)明)還是高度果糖基化的，具有大約1:1的2,3-對2,6-唾液酸化比或甚至更高量的2,6-唾液酸化。進一步地，還通過對所釋放的聚糖進行質(zhì)譜以分析FSH制備物的聚糖結(jié)構(gòu)。獲得了以下結(jié)果：表8:不同糖基化特性的相對量樣品FS0S1S2S3S4S>0G0G1G2G3G4G>0BGonalF551164528998015530141000Bravelle431114534999073939149914FSH(本發(fā)明)43118353115990745302010228顯示的是具有以下特性的聚糖的相對量：F:果糖；S0:無唾液酸；S1:一個唾液酸；S2:兩個唾液酸；S3:三個唾液酸；S4:四個唾液酸；S>0:至少一個唾液酸；G0:無半乳糖；G1:一個半乳糖；G2:兩個半乳糖；G3:三個半乳糖；G4:四個半乳糖；G>0:至少一個半乳糖；B:平分型GlcNAc。表9:不同F(xiàn)SH的糖基化的天線型樣品二型三型四型FSH(本發(fā)明)48％31％21％Bravelle45％43％12％Gonal-f56％30％14％二型:雙天線型N-聚糖；三型:三天線型N-聚糖；四型:四天線型N-聚糖表10:硫酸化聚糖的相對量樣品硫酸化FSH(本發(fā)明)15％Bravelle2％GonalF0％顯示的是攜帶硫酸基團的FSH上的N-聚糖的相對量。實施例5:藥學(xué)效應(yīng)在雌性大鼠和猴中進行不同的體內(nèi)藥學(xué)和毒理學(xué)研究并進行體內(nèi)生物測定以研究FSH(本發(fā)明)的藥學(xué)譜。雌二醇和抑制素B被用作分子標(biāo)記物。這些標(biāo)記物是由卵巢在以FSH刺激時釋放的。雌二醇負責(zé)卵泡生長成熟而抑制素B是天然負反饋機制的一部分。進一步地，先前顯示抑制素B為FSH造成的卵巢刺激的良好的替代標(biāo)記物。5.1對成熟大鼠的FSH處理在以單一皮下劑量為100IUFSH(本發(fā)明)/kg體重處理成熟雌性大鼠時，血清抑制素B水平在施用2-3天后升高并再次下降到基線水平。根據(jù)排卵周期以100IUFSH(本發(fā)明)對大鼠進行重復(fù)給藥，造成血清黃體酮和抑制素B的極大增加，這反映了黃體細胞中激素產(chǎn)生后的多次排卵。類似的發(fā)現(xiàn)也在劑量范圍尋找的研究中觀察到，其中1200IUFSH(本發(fā)明)/kg的劑量重復(fù)施用7-d。相比于相同研究中所研究的含有FSH的參考產(chǎn)品(Gonal-f,Bravelle)，未觀察到FSH(本發(fā)明)的藥效動力學(xué)活性有差異。在雌性大鼠中進行的28天的重復(fù)劑量毒性研究中，在所有劑量組(30、100、300IU/kg體重)中都觀察到有劑量相關(guān)的卵巢增大和格拉夫卵泡數(shù)量增加。與這些發(fā)現(xiàn)相關(guān)的是在處理階段抑制素B水平比對照升高。經(jīng)處理的動物的抑制素B水平從30IUFSH(本發(fā)明)/kg體重/天的低劑量水平開始以劑量相關(guān)方式增加。所有發(fā)現(xiàn)都是完全可逆的。5.2對成熟猴的FSH處理在以單一及重復(fù)劑量施用FSH(本發(fā)明)后，在食蟹猴中評估藥學(xué)形式。由于其與人的緊密相似性，食蟹猴被認為是最相關(guān)的動物模型。本研究包括對性成熟并表現(xiàn)出規(guī)則的月經(jīng)周期的雌性動物施用單次劑量的FSH。基于其排卵周期將這些動物隨機分配至測試組。測試物品對動物的施用開始于月經(jīng)起始的1-3天。該研究包括4組，每組包含4只動物，以單一皮下團注100IU/kg體重的FSH(本發(fā)明)、尿液FSHBravelle或表達于CHO細胞中的重組FSHGonal-f的方式處理這些動物。在給藥前及施用后所指出的時間點進行血液取樣以分析雌二醇和抑制素B水平。選擇的施用后的時間點反映了排卵周期的不同時期。結(jié)果顯示于圖8A。對所有測試的FSH物質(zhì)，在施用測試物質(zhì)后經(jīng)處理動物的雌二醇和抑制素B水平連續(xù)5天增加，并再次降低至基線水平。對幾乎所有動物在14-22測試日觀察到正常的中周期雌二醇激增。FSH(本發(fā)明)顯示了雌二醇水平的最高增加。此實驗表明FSH(本發(fā)明)在較低AUC水平(見實施例6)下至少有可比的藥學(xué)效力，這表示其在受體刺激上有較高活性。此外，進行了類似的研究，其中猴接收重復(fù)的FSH劑量。重復(fù)劑量研究包括3組，每組包含4只動物，以連續(xù)7天每天重復(fù)皮下團注100IU/kg體重的FSH(本發(fā)明)、Bravelle或Gonal-f的方式處理這些動物。血液取樣如單劑量研究中所描述。重復(fù)皮下注射100IUFSH(本發(fā)明)/kg體重、100IUBravelle/kg體重或100IUGonal-f/kg體重處理的動物的雌二醇和抑制素B水平在7天的整個處理階段中都有增加(見圖8B)。在處理末期，激素水平緩慢降低并在5-7天后達到正常水平。在重復(fù)施用FSH(本發(fā)明)后觀察到的最大雌二醇和抑制素B濃度比單次劑量施用也比正常排卵周期的水平高得多。在重復(fù)皮下施用FSH(本發(fā)明)后觀察到的藥效動力學(xué)效應(yīng)與對此產(chǎn)品類別的預(yù)期相同，也比得上相同研究中對參考產(chǎn)品觀察到的效應(yīng)。卵泡生長的誘導(dǎo)在食蟹猴中進行了一項為期4周的亞慢性毒性研究，包括對藥效動力學(xué)參數(shù)的分析。通過以每天一次重復(fù)皮下注射FSH(本發(fā)明)對4組動物進行28天的處理，每組動物包含4只雌性性成熟食蟹猴。對低、中、高劑量組的劑量水平分別為30、100和300IU/kg體重/天。除了這項主要研究，對對照和高劑量組安排每組的2只雌性動物進行6周恢復(fù)期。在處理階段前及末期(給藥前、第1和28天)、第17天施用后6小時及恢復(fù)末期(第70天)取學(xué)樣品分析雌二醇和抑制素B。以30、100或300IUFSH(本發(fā)明)/kg體重/天重復(fù)處理4周導(dǎo)致在最后的處死時絕對及相對卵巢重量增加以及且導(dǎo)致格拉夫卵泡數(shù)的增加。此外，所有劑量組有一些動物顯示了黃體數(shù)的輕微降低。與此項發(fā)現(xiàn)相關(guān)的是在所有劑量組中都觀察到增加的血清雌二醇及抑制素B水平。5.3不利作用分析為分析FSH(本發(fā)明)的任何預(yù)期外的副作用風(fēng)險，在大鼠和食蟹猴中進行的為期4周的關(guān)鍵毒性研究中包括了主要的安全藥學(xué)參數(shù)(ECG、心率、血壓、呼吸率)。這些研究未提供任何FSH(本發(fā)明)對主要系統(tǒng)的起一般作用的證據(jù)，因此可認為FSH(本發(fā)明)是安全的，不顯示不利的副作用。實施例6:藥代動力學(xué)本研究的目的為研究在皮下或靜脈內(nèi)施用于食蟹猴時FSH(本發(fā)明)相比于Bravelle和Gonal-f的生物利用率和藥學(xué)效應(yīng)。本研究是對性成熟并顯示有規(guī)則月經(jīng)周期的雌性動物進行的。基于其排卵周期將這些動物隨機分配至測試組。測試物品對動物的施用開始于月經(jīng)起始的1-3天。該研究包括4組，每組包含4只動物，以單一靜脈內(nèi)團注100IU/kg體重的FSH(本發(fā)明)或單一皮下團注100IU/kg體重的FSH(本發(fā)明)、或的方式處理這些動物。在施用后反映排卵周期不同時期的不同時間點進行血液取樣以分析FSH水平。沒有任何動物在研究過程中提早死亡或顯示系統(tǒng)毒性的臨床表現(xiàn)。未注意到任何測試或參考物品相關(guān)的影響或局部不耐受。186.13mIUFSH/mL的Cmax水平是在以100IUFSH(本發(fā)明)/kg體重進行單一皮下處理施用后8小時記錄到的。FSH(本發(fā)明)的計算平均血清清除半衰期為16.85小時。血清水平顯示于圖9。單一接觸后猴血清中毒性動力學(xué)參數(shù)的平均值在表11中給出。表11:在向雌性食蟹猴單一皮下團注FSH后計算的毒性動力學(xué)參數(shù)。#:獲自FSH血清分析的值n.a.:不適用F:FSH(本發(fā)明)的相對生物利用率[(AUC0-t終點皮下x靜脈內(nèi)劑量)/(AUC0-t終點靜脈內(nèi)x皮下劑量)]x100％##:AUC0-t終點值的比較，組1＝1.00皮下施用后的FSH(本發(fā)明)相比靜脈內(nèi)施用的FSH(本發(fā)明)計算的相對生物利用率(F)為72.77％。單一接觸后記錄的FSH接觸比率如下：FSH(本發(fā)明)(s.c.)<FSH(本發(fā)明)(i.v.)<Bravelle<Gonal-f。從食蟹猴的多次劑量研究及大鼠和裸鼠中的研究中都獲得了類似數(shù)據(jù)：食蟹猴中的重復(fù)劑量研究的進行與單次劑量研究類似。該研究包括3組，每組包括4只動物，連續(xù)7天每天皮下團注100IU/kg體重FSH(本發(fā)明)、Bravelle或Gonal-f以重復(fù)處理動物。參考猴中的藥代動力學(xué)和毒理學(xué)研究選擇劑量，使用了劑量為10-1000IU/kg體重的Gonal-f。沒有任何動物在研究過程中提早死亡或顯示系統(tǒng)毒性的臨床表現(xiàn)。未注意到任何測試或參考物品相關(guān)的影響或局部不耐受。這些結(jié)果顯示猴中FSH(本發(fā)明)的Cmax-和AUC值比含有FSH的參考產(chǎn)品(Gonal-f,Bravelle)是減少的，使得FSH(本發(fā)明)處理的細胞有較低的藥物接觸。然而，在相同研究中獲得的藥學(xué)數(shù)據(jù)顯示這些FSH產(chǎn)品之間其作為FSH受體的效應(yīng)子刺激雌二醇和抑制素B產(chǎn)生的能力沒有差異(見實施例5)。以皮下注射對雌性裸鼠施用5μgFSH，并監(jiān)視血液中的FSH濃度。FSH(本發(fā)明)及Gonal-f和Bravelle的藥代動力學(xué)譜在Cmax和AUC0–t終點值上很大程度是可比的。在單一皮下注射FSH(本發(fā)明)、Bravelle和Gonal-f后觀察到的Cmax水平分別為5.1±1.9％ID、6.7±0.4％ID和5.5±0.4％ID。對FSH(本發(fā)明)、Bravelle和Gonal-f觀察到的AUC0–tlast值分別為71.6±25.4％ID、99.1±12.9％ID和79.7±9.7％ID。對所有所研究的物質(zhì)其從血液中的清除情況及相對藥物暴露量基本上上是可比的；未測得統(tǒng)計學(xué)相關(guān)的差異。在研究所施用的FSH的生物分布時，觀察到卵巢和子宮中的FSH積累(此外還有在腎中的高積累，因為其起到從體內(nèi)清除FSH的作用)。通過皮下注射對雌性大鼠使用單一或多次劑量的100IU/kg體重FSH(本發(fā)明)、Bravelle或Gonal-f，并監(jiān)視血清FSH濃度。結(jié)果顯示在大鼠中，F(xiàn)SH(本發(fā)明)的血清半衰期和AUC值相比含有FSH的參考產(chǎn)品(Gonal-f、Bravelle)有所下降，使得FSH(本發(fā)明)處理的動物具有較低的藥物暴露量。盡管如此，在相同的研究中獲得的藥學(xué)數(shù)據(jù)顯示FSH產(chǎn)品之間在其作為FSH受體的效應(yīng)子刺激雌二醇和抑制素B產(chǎn)生的能力上沒有差異(見實施例5)。實施例7:人中的藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)在一項臨床研究中，將FSH(本發(fā)明)施用于志愿者并確定藥代動力學(xué)和藥效動力學(xué)參數(shù)。健康的雌性志愿者以單一皮下劑量接收25IU、75IU或150IUFSH(本發(fā)明)，并監(jiān)視循環(huán)系統(tǒng)中的FSH濃度。此外，在給藥前后都分析卵泡的數(shù)量和大小。初步結(jié)果是，觀察到的FSH(本發(fā)明)的最大血清濃度(Cmax)相比于不同實驗室測量的尿液和重組FSH的已發(fā)表數(shù)據(jù)，幾乎增加一倍。皮下施用后FSH(本發(fā)明)(～33h±3h)、重組CHO細胞來源FSH(Gonal-f:37h±28h(leCotonnec等人(1994)FertilityandSterility61,679-686)及尿液FSH(MetrodinHP:45h±21h(leCotonnec等人(1993)HumanReproduction8,1604-1611)的循環(huán)半衰期(t1/2)是相當(dāng)?shù)摹Ｋ幮恿W(xué)數(shù)據(jù)顯示在單次劑量25IUFSH(本發(fā)明)下已經(jīng)在有些患者中可見卵泡生長。這在對比物Bravelle和Gonal-f的情況下是不能觀察到的。在75和150IUFSH(本發(fā)明)的情況下，所有受試者都顯示了卵泡增大，其中一名患者的卵泡大小增加一倍。當(dāng)前第1頁1 2 3