本發(fā)明是關(guān)于治療登革熱病毒(DENV)感染的式(A)化合物、藥物組合物，以及這類化合物的合成方法、制劑方法和用于這些合成中的化合物。具體地，本發(fā)明提供一類雜環(huán)肽類化合物，含有這類化合物的藥物組合物及這類化合物治療登革熱病毒感染的方法。發(fā)明背景登革熱(denguefever)是由登革熱病毒(denguevirus，DENV)引起、伊蚊作為傳播媒介的一種傳染病，主要分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。其特點(diǎn)為急性起病，發(fā)熱，全身肌肉、骨、關(guān)節(jié)痛，極度疲乏，皮疹，淋巴結(jié)腫大及血液白細(xì)胞、血小板減少。臨床上最常見(jiàn)的是類似感冒的急性高熱，少數(shù)病例會(huì)發(fā)展為突發(fā)性出血-登革出血熱(denguehaemorrhagicfever)，最嚴(yán)重的發(fā)展為以循環(huán)衰竭為特征的登革休克綜合癥(dengueshocksyndrome)。近年來(lái)，由于全球環(huán)境的惡化和氣候變暖，登革熱發(fā)病率在全球大幅度上升，占世界五分之二的人口面臨罹患登革熱危險(xiǎn)。2008年，NIH將登革熱列為嚴(yán)重危害公共健康的危險(xiǎn)性疾病。世衛(wèi)組織估計(jì)全球每年有超過(guò)5000萬(wàn)的感染病例，其中50萬(wàn)人發(fā)展為嚴(yán)重的登革出血熱和登革休克綜合癥。我國(guó)登革熱疫情主要流行于東南沿海地區(qū)，因其癥狀嚴(yán)重、死亡率高，按照《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》的規(guī)定將其列為乙類傳染病。隨著登革熱的發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，針對(duì)登革熱病毒的疫苗，小分子藥物以及抗體的研究開(kāi)發(fā)不斷地見(jiàn)諸于報(bào)道，但臨床上尚未研制有效的疫苗可以預(yù)防登革熱，也沒(méi)有特效的藥物治療登革熱。因此，需要發(fā)展可用來(lái)治療登革熱病毒感染的有效藥物。登革熱病毒的直徑約為40-60nm，是具有包膜的單股正鏈RNA病毒，在病毒學(xué)上與日本腦炎病毒、黃熱病毒、西尼羅病毒等都屬于黃病毒科黃病毒屬。已知的登革熱病毒依抗原性不同分為4個(gè)血清型，其中2型最為廣泛。登革熱病毒具有一個(gè)開(kāi)放讀碼框，編碼長(zhǎng)為3000-3500個(gè)氨基酸殘基的多聚前體蛋白，進(jìn)一 步酶解成為具有不同功能的蛋白，包括三個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(核蛋白C，膜結(jié)合蛋白preM和包膜蛋白E)和七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b和NS5)。登革熱病毒NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)區(qū)域(NS3proteasedomain，NS3pro)位于NS3蛋白的N端1/3區(qū)，屬于絲氨酸蛋白酶家族，由180個(gè)氨基酸組成。絲氨酸蛋白酶(serineprotease)與其輔助因子NS2B形成異源二聚體復(fù)合物發(fā)揮蛋白酶活性，可以切割NS2A/NS2B，NS2B/NS3，NS3/NS4A，NS4B/NS5連接位點(diǎn)及核蛋白C，NS2A，NS3，NS4A分子內(nèi)的切割位點(diǎn)。切割點(diǎn)的P2-P1位殘基通常為L(zhǎng)ys-Arg，Arg-Arg，Arg-Lys，少數(shù)情況下為Gln-Arg。絲氨酸蛋白酶在病毒多聚蛋白轉(zhuǎn)錄及水解過(guò)程中扮演了一個(gè)重要的角色，干擾其蛋白酶活性，將破壞登革熱病毒的生長(zhǎng)、繁殖。發(fā)展抗病毒藥物的一般策略是鈍化(inactive)主要用于病毒復(fù)制的病毒編碼的酶。因而，登革熱病毒絲氨酸蛋白酶為針對(duì)性開(kāi)發(fā)具有高效、低毒的抗登革熱小分子靶向藥物提供了機(jī)會(huì)；以絲氨酸蛋白酶為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)小分子酶抑制劑，引起了廣泛的關(guān)注。登革熱病毒NS2B-NS3pro復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB：2FOM)于2006年被報(bào)道，成功地完成第一個(gè)活性登革熱蛋白酶的單晶衍射結(jié)構(gòu)圖的測(cè)定工作，并且解析了四肽醛抑制劑和西尼羅病毒絲氨酸蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)；2011年底報(bào)道了四肽醛抑制劑Bz-nKRR-H和登革熱病毒絲氨酸蛋白酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(PDB：3U1I)。NS3pro具有絲氨酸蛋白酶常見(jiàn)的催化活性區(qū)域，這一催化部位由His51，Asp75和Ser135構(gòu)成。His51在絲氨酸蛋白酶水解底物時(shí)起堿性催化作用，可以吸引Ser135γ羥基上的氫原子，促使Ser135成為一個(gè)很強(qiáng)的親核試劑，進(jìn)攻底物肽鍵的羰基碳原子，成為四面體形式的過(guò)渡態(tài)；同時(shí)Asp75羧基上的氧原子與His51咪唑環(huán)上的氫原子形成氫鍵，有助于過(guò)渡態(tài)的穩(wěn)定。絲氨酸蛋白酶活性依賴于NS2B，NS2B激活的絲氨酸蛋白酶活性比單獨(dú)的蛋白酶切活性提高數(shù)千倍。因此可被特異性識(shí)別的選擇性小分子抑制絲氨酸蛋白酶的作用是治療登革熱病毒感染的有效手段，絲氨酸蛋白酶成為治療登革熱病毒引起的疾病的重要藥物靶點(diǎn)。本發(fā)明基于登革熱病毒絲氨酸蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)特征，通過(guò)結(jié)合活性區(qū)域的催化位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一系列雜環(huán)肽衍生物類絲氨酸蛋白酶抑制劑。本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其提供的雜環(huán)肽抑制劑，可有效地抑制登革熱病毒絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的第二個(gè)優(yōu)點(diǎn)是其提供的雜環(huán)肽抑制劑，可有效地抑制西尼羅病毒絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以用于制備治療絲氨酸蛋白酶誘發(fā)疾病藥物，如流行性乙型腦炎、丙肝等。通過(guò)生物活性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)化合物XI，XVII，XXIX對(duì)登革熱病毒絲氨酸蛋白酶顯示了非常好的抑制活性，在活體內(nèi)具有良好的藥物動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的目標(biāo)是發(fā)現(xiàn)一類抗登革熱病毒特別有效的小分子化合物，并提供用于所說(shuō)蛋白酶抑制劑化合物合成的中間體和這些合成的合成方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)登革熱絲氨酸蛋白酶抑制劑的現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種含式(A)類登革熱絲氨酸蛋白酶抑制劑，本發(fā)明另一個(gè)目的是要提供所描述蛋白酶抑制劑化合物中間體的合成和用于這些合成的合成方法。本發(fā)明涉及式(A)的新型環(huán)肽類化合物和/或藥學(xué)上可接受的鹽和/或水合物。這些化合物作為其藥學(xué)上可接受的鹽和/或水合物，或者作為藥物組合物成分(無(wú)論其是否與其他治療登革熱的抗病毒劑，抗感染藥，免疫調(diào)節(jié)劑或抗生素)而用于抑制登革熱病毒的絲氨酸蛋白酶，或者預(yù)防/治療一項(xiàng)或多項(xiàng)登革熱病毒感染癥狀。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成了一類具有全新結(jié)構(gòu)母核的絲氨酸蛋白酶抑制劑。體外實(shí)驗(yàn)表明其無(wú)細(xì)胞毒性且具有顯著的體外抑酶活性，有望成為一類抗登革熱病毒的候選藥物。更具體的說(shuō)，本發(fā)明涉及式(A)化合物和/或藥學(xué)上可接受的鹽和/或水合物制備治療登革熱病毒感染疾病藥物的應(yīng)用：其中，R1和R2可以獨(dú)立地取自于以下烷基，環(huán)烷基，雜烷基，雜環(huán)烷基，雜環(huán)基，鏈烯基，環(huán)烯基，雜烯基，雜環(huán)烯基，鏈炔基，環(huán)炔基，雜炔基，環(huán)雜炔基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基。以上所述芳基是苯基或萘基，雜芳基是通過(guò)環(huán)碳原子或氮原子連接的具有1，2或3個(gè)選自N，O，S的雜原子的五元或六元芳環(huán)，且雜環(huán)基是通過(guò)環(huán)碳原子或氮原子連接的具有1，2，3或4個(gè)選自N，O，S的雜原子的飽和或不飽和的非芳香性環(huán)，其中芳基，雜芳基，雜環(huán)基，環(huán)烷基，烷基，環(huán)烷氧基，烷氧基任選可被1到4個(gè)取代基所取代，所述1到4個(gè)取代基選自鹵素，-OH，-NR7R8，-SH，-NO2，-CN，胍基，鹵C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，三氟甲基。以上所述環(huán)烷基，環(huán)烷氧基，芳基，雜芳基或雜環(huán)基上的兩個(gè)相鄰取代基任選地一起形成0-3個(gè)含有O，N，S的雜原子的3-6元環(huán)。R7和R8獨(dú)立地選自氫，烷基，雜烷基，環(huán)烷基，鏈烯基，環(huán)烯基，雜烯基，雜環(huán)烯基，鏈炔基，雜炔基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基。R3表示醛基，羧基，三氟甲基酮基團(tuán)，α-酮酰胺基團(tuán)，硼酸基團(tuán)，噻唑基團(tuán)；M表示5到10個(gè)飽和或不飽和的亞烷基鏈，可視需要含有0至3個(gè)雜原子，分別選自O(shè)，S，NR5；該亞烷基鏈可含有一個(gè)芳環(huán)或環(huán)己烷，其中芳環(huán)是苯基或萘基；其中M的兩個(gè)相鄰碳原子上的兩個(gè)取代基任選得一起形成含有0-3個(gè)O，N，S的雜原子的3-6元環(huán)。R5表示氫，C1-6烷基，C2-6烯基或-C(O)-R6，其中R6表示，C1-6烷基，C2-6烯基，C3-8環(huán)烷基或芳基。R4表示氫或在該鏈M上任一個(gè)碳原子被1到4個(gè)取代基所取代，所述1到4個(gè)取代基選自鹵素，-OH，-NH2，-SH，-NO2，-CN，鹵C1-8烷基，C1-8烷氧基，C1-6烷基羰基，C1-6烷硫基，C1-8烷氧羰基，C1-8氮烷基，C1-8硫烷基，雜烷基，雜環(huán)烷基，雜環(huán)基，鏈烯基，環(huán)烯基，雜烯基，雜環(huán)烯基，鏈炔基，環(huán)炔基，雜炔基，環(huán)雜炔基，芳基，芳烷基，雜芳基，雜芳烷基。本發(fā)明范圍內(nèi)包括的藥物組合物，包含抗登革熱病毒有效量的式(A)化合物或其治療上可接受的鹽，與在藥學(xué)上可接受的藥物載體或助劑。本發(fā)明的一個(gè)重要方面，涉及在哺乳動(dòng)物中，通過(guò)對(duì)該哺乳動(dòng)物給予有效抗登革熱病毒的含量的式(A)化合物，或其在治療上可接受的鹽或酯，或上述組合物，以治療登革熱病毒感染的方法。本發(fā)明的另一個(gè)重要方面，涉及通過(guò)使病毒暴露在抑制登革熱病毒的絲氨酸蛋白酶的含量的式A，或其在治療上可接受的鹽或酯，如上述的組合物之下，以抑制登革熱病毒復(fù)制的方法。其他的方面涉及的藥物組合物，可另外包括其他抗DENV制劑，還可包括登革熱病毒的其他靶標(biāo)的抑制劑，如解旋酶，NTP酶，RNA依賴的RNA聚合酶。優(yōu)選方案的詳細(xì)說(shuō)明定義：如本文所述，除非另行提及，均適用下列的定義：關(guān)于實(shí)例，(R)或(S)用于指明不對(duì)稱中心的絕對(duì)構(gòu)型，這指明是用于整個(gè)化合物的說(shuō)明而不是單獨(dú)取代基的說(shuō)明。在本文中使用“P1，P2，P3”標(biāo)識(shí)時(shí)，意指從肽類似物的C-端開(kāi)始，并朝向N-端延伸的氨基酸的殘基的位置，即P1代表從C端開(kāi)始的第一個(gè)位置，P2為從C端開(kāi)始的第二個(gè)位置(參見(jiàn)BergerA.&SchechterI.，TransactionsoftheRoyalSocietyLondonseriesB257，249-264(1970))。本文所用的“鹵素”一詞是指鹵素取代基，即選自碘，溴，氯或氟。本文所用的“C1-6烷基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指非環(huán)形的直鏈或支鏈烷基取代基，它包含1到6個(gè)碳原子，包括例如甲基、乙基、丙基、丁基、己基、1-甲基乙基，1，1-二甲基乙基，1-甲基丙基及2-甲基丙基。本文所用的“C1-8烷氧基”一詞，不論單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指非環(huán)形的直鏈或支鏈烷氧基取代基，它包含1到8個(gè)碳原子，包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、己氧基、1-甲基乙氧基，2，2-二甲基丁氧基，1-甲基己氧基及庚氧基。本文所用的“C1-8鹵烷基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指非環(huán)形的、直鏈或支鏈烷基取代基，它包含1到8個(gè)碳原子，具有一個(gè)或多個(gè)選自氟，氯，溴或碘取代的氫。本文所用的“C1-6硫基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指非環(huán)形的、直鏈或支鏈烷基取代基，含有硫醇基團(tuán)，例如硫丙基。本文所用的“C3-8環(huán)烷基”一詞，不管單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)， 是指非環(huán)形的直鏈或支鏈烷基取代基，它包含3到8個(gè)碳原子，包括例如環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)己基，環(huán)庚基及環(huán)辛基。本文所用的“不飽和非芳香環(huán)”一詞，意指不飽和的環(huán)烷基，例如取代基環(huán)己烯基本文所用的“C3-8環(huán)烷氧基”一詞，不論單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，意指取代基包含3到8個(gè)碳原子的-O-C3-8環(huán)烷基，包括例如-O-環(huán)丙基，-O-環(huán)丁基，-O-環(huán)戊基等。本文所用的“C1-6烷基羰基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指通過(guò)羰基連接的C1-6烷基，即-C(O)-C1-6烷基。本文所用的“芳基”一詞，意指含有6個(gè)碳原子的芳香族單環(huán)系統(tǒng)，或含有10個(gè)原子的芳香族雙環(huán)系統(tǒng)，例如苯基和萘基-環(huán)系統(tǒng)。本文所用的“雜芳基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，意指通過(guò)環(huán)碳原子或氮原子連接的具有1，2或3個(gè)選自N，O，S的雜原子的五元，六元或七元不飽和的雜環(huán)，移除氫而衍生的單價(jià)取代基。適當(dāng)?shù)碾s環(huán)實(shí)例如：噻吩，呋喃，吡咯，咪唑，吡唑，噻唑，噁唑，異噁唑，1，2，3-三唑，1，2-噻二唑，吡啶，吡嗪，嘧啶，1，2，4-三嗪，苯并噁唑，苯并噻唑，喹啉。本文所用的“低碳烷基，低碳烯基，低碳炔基”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，是指包含1到6個(gè)碳原子的非環(huán)形的、直鏈或支鏈烷基，烯基或炔基取代基。本文所用的“藥學(xué)可接受的酯”一詞，單獨(dú)使用或與另一取代基組合使用時(shí)，意指化合物式(A)的酯，其中該分子的任何羧基官能基，優(yōu)選的是羧基終端，被烷氧羰基官能團(tuán)置換：其中R，R’部分是選自烷基(如甲基、乙基、丙基、丁基、己基)；烷氧烷基(如甲氧乙基)；烷氧酰基(如乙酰氧基甲基)；芳烷基(如芐基)；芳氧烷基(如苯氧乙基)；芳基(如苯基)?？梢曅枰畸u素，C1-4烷基或C1-4烷氧基取代。其他適當(dāng)?shù)那八庻?，將其列入本文中以作參考。這類在藥學(xué)上可接受的酯，通常在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，被水解轉(zhuǎn)化為化合物式(A)的酸形式。關(guān)于上述的酯類，除非另行指定，任何存在的烷基部分均有利地含有1到6個(gè)碳原子，特別是1至6個(gè)碳原子。任何存在于該酯類中的芳基部分，均有利地包括苯基基團(tuán)。本文中“藥物上可接受的鹽”一詞是指式A化合物的鹽，其在正常醫(yī)學(xué)治療中，適用于人及動(dòng)物的組織接觸而無(wú)毒性，無(wú)刺激性，無(wú)過(guò)敏反應(yīng)等。一般是水溶性或油溶性，或是易分散的，并在其使用上是有效的。此詞包括藥物上可接受的酸加成鹽和藥物上可接受的堿加成鹽?！八幬锷峡山邮艿乃峒映甥}”一詞是指保持生物活性及游離態(tài)堿的性質(zhì)，并且是非生物上或其他方面不需要的，其與無(wú)機(jī)鹽如硫酸，硝酸，磷酸，鹽酸，氫溴酸，氨基磺酸等，及有機(jī)酸如醋酸，三氟醋酸，三氯醋酸，肉桂酸，檸檬酸，馬來(lái)酸，己二酸，藻酸，抗壞血酸，天冬氨酸，苯甲酸，苯磺酸，乙醇酸，蘋果酸，乳酸，丙二酸，草酸，煙酸，丁二酸，水楊酸，硬脂酸，酒石酸，對(duì)氨基苯磺酸，三甲基苯磺酸，對(duì)甲基苯磺酸，扁桃酸，果膠酯酸，苦味酸，丙酸等所形成的鹽?！八幬锷峡山邮艿膲A加成鹽”一詞是指保持生物活性及游離態(tài)酸的性質(zhì)，并且是非生物上或其他方面不需要的，其是與無(wú)機(jī)堿如氨或銨或金屬陽(yáng)離子如，鈉，鎂，銅，鋅，鈣，鉀，鋁等的氫氧化物或碳酸鹽所形成的鹽，特別優(yōu)選的是銨，鉀，鈉，鈣，鎂鹽。由藥物上可接受的有機(jī)的非毒性的堿衍生的鹽包括伯胺，仲胺及叔胺，季銨化合物，經(jīng)取代的胺，包括天然的經(jīng)取代的胺，環(huán)胺以及堿離子交換樹(shù)脂，如甲基胺，二甲基胺，三甲基胺，乙基胺，二乙基胺，三乙基胺，三丙基胺，異丙基胺，三丁基胺，乙醇胺，二乙醇胺，二環(huán)己基胺，賴氨酸，精氨酸，組氨酸，咖啡因，膽堿，甜菜堿，亞乙基二胺，葡糖胺，甲基葡糖胺，可可堿，哌嗪，哌啶，嘌呤，四甲基銨化合物，四乙基銨化合物，吡啶，N，N二甲基苯胺，N-甲基哌啶，N-甲基嗎啉，N，N-二芐基苯乙胺等所形成的鹽。特別優(yōu)選 的有機(jī)非毒堿是異丙基胺，二乙基胺，乙醇胺，三甲基胺，二環(huán)己基胺，膽堿，咖啡因。優(yōu)選的方案R1：本發(fā)明的優(yōu)選方案包括式(A)化合物，其中R1優(yōu)選C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基；最佳的是當(dāng)R1為C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基時(shí)，碳鏈末端優(yōu)選氨基或胍基取代。R2：本發(fā)明的優(yōu)選方案包括式(A)化合物，其中R2優(yōu)選C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基；最佳的是當(dāng)R2為C1-6烷基，C2-6烯基，C2-6炔基時(shí)，碳鏈末端優(yōu)選氨基或胍基取代。R3：本發(fā)明的優(yōu)選方案包括式(A)化合物，其中R3優(yōu)選醛基，α-酮酰胺，三氟甲基酮基團(tuán)。M：本發(fā)明的優(yōu)選方案包括式(A)化合物，其中M優(yōu)選可含有1至3個(gè)雜原子的5到10個(gè)飽和或不飽和的亞烷基鏈。本發(fā)明的雜環(huán)肽類化合物可以游離形式或以鹽形式存在。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多化合物類型的藥學(xué)上可接受的鹽及其制備方法。藥學(xué)上可接受的鹽包括常規(guī)的無(wú)毒性的鹽，包括這樣的化合物堿與無(wú)機(jī)或有機(jī)酸形成的季銨鹽。本發(fā)明的化合物可形成水合物或溶劑合物。本領(lǐng)域熟練人員已知將化合物與水一起凍干時(shí)所形成的水合物或在溶液中與合適的有機(jī)溶劑濃縮時(shí)形成溶劑合物的方法。本發(fā)明包含含有治療量本發(fā)明化合物的藥物，和一種或多種藥學(xué)上可接受載體和/或賦形劑的藥物組合物。載體包括如鹽水，緩沖鹽水，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它們的結(jié)合物。載體或賦形劑還可以包括本領(lǐng)域已知的時(shí)間延遲材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，還可包括蠟，乙基纖維素，羥丙基甲基纖維素，異丁烯酸甲酯等等。如果需要，該組合物還可以包含較小量的潤(rùn)濕劑或乳化劑，或pH緩沖劑。該組合物可以是液體，懸浮液，乳劑，片劑，丸劑，膠囊，持續(xù)釋放制劑或粉末。該組合物可以用傳統(tǒng)的黏合劑和載體如三酸甘油酯配制成栓劑?？诜苿┛梢园?biāo)準(zhǔn)載體如藥物品級(jí)的甘露糖醇，乳糖，淀粉，硬脂酸鎂，糖精鈉，纖維素和碳酸鎂等等。視需要制劑而定，配制可以設(shè)計(jì)混合，制粒和壓縮或溶解成分。在另一個(gè)途徑中，該組合物可以配制成納米顆粒。本發(fā)明的藥物組合物可以以各式各樣的藥物形式給藥。使用的藥物載體可以為固體或者液體。如果使用固體載體，制劑可以為片劑，被放入硬膠囊中的粉末或小藥丸形式或錠劑或糖錠形式。固體載體的量在很大程度上變化，但是優(yōu)選從約25mg到約1.0g。典型的固體載體包括乳糖，石膏粉，蔗糖，滑石，凝膠，瓊脂，果膠，阿拉伯膠，硬脂酸鎂，硬脂酸等等。固體載體可以包括一種或多種可能同時(shí)作為增香劑，潤(rùn)滑劑，增溶劑，懸浮劑，填料，助流劑，壓縮助劑，粘合劑或片劑-崩解劑的物質(zhì)；它還可以是包封材料。在粉末中，載體為精細(xì)粉碎的固體，它與精細(xì)粉碎的活性成分的混合。在片劑中活性成分與具有必要的壓縮性質(zhì)的載體以合適的比例混合，以需要的形狀和大小壓縮。粉末和片劑優(yōu)選包含至多99％活性成分。如果使用液體載體，制劑可以為糖漿，乳劑，軟膠囊，在安瓿或小瓶或非水的液體懸浮液中的無(wú)菌注射溶液或懸浮液。典型的液體載體包括糖漿，花生油，橄欖油，水，等等。液體載體用于制備溶液，懸浮液，乳劑，糖漿，酊劑和密封的組合物?；钚猿煞挚梢匀芙饣驊腋∮谒帉W(xué)上可接受的液體載體如水，有機(jī)溶劑，二者的混合物或藥學(xué)上可接受的油類或脂肪。液體載體可以包含其他合適的藥物添加劑如增溶劑，乳化劑，緩沖劑，防腐劑，增甜劑，增香劑，懸浮劑，增稠劑，顏料，粘度調(diào)節(jié)劑，穩(wěn)定形或滲透壓-調(diào)節(jié)劑。用于口服和腸胃外給藥的液體載體的合適的例子包括水(部分地包含如同上述的添加劑，例如纖維素衍生物，優(yōu)選羧甲基纖維素鈉鹽溶液)，醇(包括一元醇和多元醇，例如乙二醇)和它們的衍生物，和油類(例如分餾椰子油和花生油)。用于腸胃外給藥的載體還可以為油脂如油酸乙酯和異丙基肉豆蔻酸鹽。無(wú)菌的液體載體用于腸胃外給藥的無(wú)菌的液態(tài)組合物。用于加壓組合物的液體載體可以為鹵代烴或其他藥學(xué)上可接受的推進(jìn)劑。無(wú)菌溶液或懸浮溶液液體藥物組合物可以用來(lái)，例如，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)或皮下注射?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域的已知技術(shù)，使用適當(dāng)?shù)姆稚┗驖駶?rùn)劑(如吐溫80)和懸浮劑來(lái)調(diào)配該懸浮液。注射時(shí)可單次推入或逐漸注入30分鐘的經(jīng)脈內(nèi)灌注。該化合物還可以以液體或者固體組合物的形式口服給藥。本文中所用的腸胃外一詞，包括皮下、皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)和病灶內(nèi)注射或輸液技術(shù)。為了獲得穩(wěn)定的水溶性的劑型，可以將化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽溶于有 機(jī)或無(wú)機(jī)酸的水溶液，0.3M琥珀酸或檸檬酸溶液。選擇性地，酸性的衍生物可以溶于合適的堿性溶液。如果得不到可溶形式，可將化合物溶于合適的共溶劑或它們的結(jié)合。這樣的合適的共溶劑的例子包括，但是不局限于，濃度范圍從0-60％總體積的乙醇，丙二醇，聚乙二醇300，聚山梨酸酯80，甘油，聚氧乙烯脂肪酸酯，脂肪醇或甘油羥脂肪酸酯等等。本發(fā)明的藥物組合物可口服、非經(jīng)腸胃或通過(guò)植入的儲(chǔ)存器給藥，口服給藥或通過(guò)注射給藥時(shí)優(yōu)選的。各種釋放系統(tǒng)是已知的并且可以用于化合物或其他各種制劑的給藥，這些制劑包括片劑，膠囊，可注射的溶液，脂質(zhì)體中的膠囊，微粒，微膠囊，等等。引入的方法包括但是不局限于皮膚的，皮內(nèi)，肌內(nèi)，腹膜內(nèi)的，靜脈內(nèi)的，皮下的，鼻腔內(nèi)的，肺的，硬膜外的，眼睛的和(通常優(yōu)選的)口服途徑?；衔锟梢酝ㄟ^(guò)任何方便的或者其它適當(dāng)?shù)耐緩浇o藥，例如通過(guò)注入或快速濃注，通過(guò)上皮的或粘膜線路(例如，口腔粘膜，直腸和腸粘膜，等等)吸收或通過(guò)負(fù)載藥物的支架以及可以于其他生物活性劑一起給藥?？梢匀砘蚓植拷o藥。用于鼻，支氣管或肺疾病的治療或預(yù)防時(shí)，優(yōu)選的給藥途徑為口服，鼻給藥或支氣管煙霧劑或噴霧器?？晒┥衔奶峒暗恼{(diào)配物和組合物使用的其他適當(dāng)?shù)馁x形劑或載體，可在標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)教科書中找到，例如在“Remington’sPharmaceuticalSciences”，第19版中。為了預(yù)防和治療登革熱病毒引起的登革熱，在單一治療中，在本文中所描述的絲氨酸蛋白酶抑制劑化合物，在約0.01到約100mg/kg體重每天之間的劑量范圍是有用的，優(yōu)選的是0.5到75mg/kg體重每天之間。通常，本發(fā)明的藥物組合物將每天給藥約1到5次，或另外一連續(xù)的輸液。這類藥物可用作慢性或急性的治療?？膳c載體物質(zhì)混合，產(chǎn)生單一劑量形式的活性成分的含量，可根據(jù)待處理的宿主和給藥的特定模式而改變。代表性的制劑將含有約5％到約95％活性成分(重量/重量)。優(yōu)選的是，這類制劑含有約20％到約80％的活性化合物。熟悉本領(lǐng)域這將理解可能需要比上文提及的更高或更低的劑量。對(duì)特定患者的特定劑量和處理方式應(yīng)該按照各種因素而定，包括所使用的特定化合物的活性，患者的年齡、體重、性別、一般的健康狀態(tài)、飲食、給藥的時(shí)間、代謝率、藥物的組合，以及感染的嚴(yán)重性和過(guò)程、患者對(duì)感染的傾向，還有處理醫(yī)師的判斷。一般而言，以實(shí)質(zhì)上低于該化合物的最佳劑量的小劑量開(kāi)始治療。隨后通過(guò)少量的增加而增加劑量，直到在該情況下達(dá)到最佳的效果為止。一般而言，要求以通 常足以產(chǎn)生有效的抗病毒結(jié)果，但不引起任何有害或不利的副作用的濃度含量來(lái)投予該化合物。當(dāng)本發(fā)明的組合物包括式(A)化合物與一種或多種另外的治療或預(yù)防劑組合時(shí)，該化合物與另外的制劑的存在量應(yīng)該以約10到100％之間的劑量含量提供，更優(yōu)選的是約10至80％的劑量，通常以單次治療法給予。當(dāng)這些化合物或其在藥學(xué)上可接受的鹽類與在藥學(xué)上可接受的載體一起調(diào)配時(shí)，將所得的組合物在活體內(nèi)給予哺乳動(dòng)物，如人類，以便抑制登革熱病毒絲氨酸蛋白酶，或治療或預(yù)防登革熱病毒感染。也可使用本發(fā)明化合物與下列制劑混合，來(lái)完成這類治療，包括但不局限于：免疫調(diào)節(jié)劑，如α，β，δ-干擾素；其他的抗病毒制劑，如病毒唑，金剛烷胺；其他的登革熱病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑；對(duì)在登革熱病毒生活循環(huán)中其他靶標(biāo)的抑制劑，如RNA聚合酶，解旋酶；或其組合物?？蓪⒘硗獾闹苿┡c本發(fā)明化合物混合，以產(chǎn)生單一的劑量形式。另外，也可將這類另外的制劑可分別投予哺乳動(dòng)物，成為多個(gè)劑量形式的一部分。因此，本發(fā)明其他的具體方案提供一種在哺乳動(dòng)物中，通過(guò)給予式(A)化合物，其中取代基如同上文定義，來(lái)抑制登革熱病毒絲氨酸蛋白酶活性的方法。在優(yōu)選的具體方案中，這些方法在哺乳動(dòng)物中有用于降低登革熱絲氨酸蛋白酶活性。如果藥物組合物僅包括作為活性成分的本發(fā)明化合物，這類方法可另外包括對(duì)該哺乳動(dòng)物給予選自免疫調(diào)節(jié)劑，抗病毒劑，其他登革熱病毒絲氨酸蛋白酶抑制劑，或?qū)υ诘歉餆岵《旧h(huán)中的其他靶標(biāo)，如RNA聚合酶抑制劑和解旋酶抑制劑的步驟?？稍诮o予本發(fā)明組合物之前、同時(shí)或之后，將這類另外的制劑給予哺乳動(dòng)物。工藝流程本發(fā)明式(A)化合物可以用本發(fā)明方法有效地制備，包括采用下述一般合成方法。這些合成方法中的R1，R2，M，R4定義如上。工藝流程I中間體7經(jīng)流程I的路線合成得到，在該流程中，以N′-芴甲氧羰基-N-芐氧羰基-L-賴氨酸(Fmoc-Lys(Cbz)-OH)為原料，首先用N，O-二甲基羥胺對(duì)羧基保護(hù)，形成Weinreb酰胺，隨后脫掉N端保護(hù)基芴甲氧羰基(Fmoc)，游離出氨基；然后 和N-芴甲氧羰?；?2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸反應(yīng)形成二肽，利用和前面相同的方法脫掉N端保護(hù)基芴甲氧羰基，得到一個(gè)具有游離氨基的二肽；接下來(lái)利用二肽和N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸縮合形成具有保護(hù)基團(tuán)的三肽，最后脫掉保護(hù)基團(tuán)芴甲氧羰基，得到一個(gè)具有游離氨基的三肽關(guān)鍵中間體。步驟a(2S)-2-芴甲氧酰胺基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(2)的制備稱取原料N′-芴甲氧羰基-N-芐氧羰基-L-賴氨酸Fmoc-Lys(Cbz)-OH(4.00g，7.97mmol，1.0eq)，用二氯甲烷(50mL)溶于250mL的圓底燒瓶中，冰浴攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(2.28g，11.94mmol，1.5eq)，HOBt(1.61g，11.94mmol，1.5eq)，HN(OCH3)CH3·HCl(1.55g，15.92mmol，2.0eq)，攪拌十分鐘后，緩慢滴加三乙胺Et3N(3.61g，31.84mmol，4.0eq)，冰浴條件下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(石油醚-乙酸乙酯＝1∶2，Rf＝0.7)，得白色粉末狀固體3.80g，產(chǎn)率：85.5％。步驟b((2S)-2-氨基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(3)的制備將(2S)-2-芴甲氧酰胺基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(2，3.80g，6.97mmol)以二氯甲烷(100mL)為溶劑溶于250mL的圓底燒瓶中，緩慢滴加二乙胺Et2NH(10mL)，室溫反應(yīng)8h后用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后減壓蒸餾旋干溶劑，然后加入二氯甲烷，旋干溶劑，反復(fù)三次以盡量除凈二乙胺，用硅膠柱分離純化(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.15)，得到無(wú)色油狀物1.16g，產(chǎn)率：96％。步驟c(2S)-2-[N-芴甲氧羰?；?2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(4)的的制備將(2S)-2-氨基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(3，1.92g，5.94mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(50mL)中，冰浴下攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(2.28g，11.94mmol，2.0eq)，HOBt(1.61g，11.94mmol，2.0eq)，N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH，5.78g，8.92mmol，1.5eq)，攪拌十分鐘后，用滴液漏斗緩慢滴加三乙胺Et3N(2.40g，23.76mmol，4.0eq)，冰浴條件下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝20∶1，Rf＝0.60)，得白色粉末狀固體4.70g，產(chǎn)率：81.3％。步驟d(2S)-2-{N-[N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(6)的制備將(2S)-2-[2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(5，3.23g，4.42mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(50mL)中，冰浴下攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(0.69g，8.84mmol，2.0eq)，HOBt(1.19g，8.84mmol，2.0eq)，N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH(3.11g，6.63mmol，1.5eq)，攪拌十分鐘后，緩慢滴加三乙胺Et3N(2.40g，23.76mmol，4.0eq)，冰浴下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝20∶1，Rf＝0.4)，得白色粉末狀固體4.66g，產(chǎn)率：86.8％。步驟a，b，c，d：簡(jiǎn)言之，可用傳統(tǒng)的肽鍵偶合方式合成得到。工藝流程II大環(huán)的形成根據(jù)M的不同，通過(guò)不同的方案合成得到。方案1.大環(huán)的形成可以通過(guò)在縮合劑(如DPPA)作用下，碳鏈的左末端和右末端的官能團(tuán)間的縮合反應(yīng)而進(jìn)行，比如形成酰胺鍵。方案2.構(gòu)建大環(huán)可以通過(guò)使用Ru-基的催化試劑的烯烴置換反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)，如用已報(bào)道的Grubbs’催化劑，Horeyda’s催化劑，Nolan’s催化劑。比如利用Grubbs’催化劑進(jìn)行環(huán)化反應(yīng)。實(shí)施舉例通過(guò)下列不受限制的實(shí)例，更詳細(xì)地說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明不局限于以下實(shí)例。以攝氏度數(shù)提供溫度。除非另行陳述，溶液百分比表示重量對(duì)體積的關(guān)系，且溶液比例表示體積對(duì)體積的關(guān)系。在Bruker300MHz的分光計(jì)上記錄核磁共振(NMR)廣譜；以百萬(wàn)分之一(ppm)表述化學(xué)位移(δ)，并參考內(nèi)部的氘代試劑。在實(shí)施例中所使用的縮寫包括Cbz：芐氧羰基；Boc：叔丁氧羰基；Fmoc：芴甲氧羰基；Pbf：2，3-二氫-2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺?；籇PPA：疊氮磷酸二苯酯；DCM：二氯甲烷；THF：四氫呋喃；DMF：二甲基甲酰胺；DMSO：二甲亞砜；DMAP：二甲氨基吡啶；TEA：三乙胺；DIPEA：二異丙基乙胺；DME：1，2-二甲氧基乙烷；Et：乙基；EtOH：乙醇；EtOAc：乙酸乙酯；Me：甲基；MeOH：甲醇；ESMS：電噴霧質(zhì)譜分析；MS：質(zhì)譜分析；HPLC：高效液相色譜法。本發(fā)明實(shí)施方案的實(shí)例如下所述：實(shí)施例1(2S)-2-芴甲氧酰胺基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(2)的制備稱取原料N′-芴甲氧羰基-N-芐氧羰基-L-賴氨酸Fmoc-Lys(Cbz)-OH(4.00g，7.97mmol，1.0eq)，用二氯甲烷(50mL)溶于250mL的圓底燒瓶中，冰浴攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(2.28g，11.94mmol，1.5eq)，HOBt(1.61g，11.94mmol，1.5eq)，HN(OCH3)CH3·HCl(1.55g，15.92mmol，2.0eq)，攪拌十分鐘后，緩慢滴加三乙胺Et3N(3.61g，31.84mmol，4.0eq)，冰浴條件下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后， 以硅膠柱分離純化(石油醚-乙酸乙酯＝1∶2，Rf＝0.7)，得白色粉末狀固體3.80g，產(chǎn)率：85.5％。1H-NMR(300MHz，CDCl3)：δ7.75-7.35(m，8H)，7.31(m，5H)，5.06(s，2H)，4.74(m，1H)，4.34(d，J＝6.9，2H)，4.19(t，J＝6.9，1H)，3.75(s，3H)，3.20(s，3.20)，3.17(m，2H)，1.72(m，2H)，1.55(m，2H)，1.40(m，2H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ172.9，171.2，156.5，143.9，141.3，136.8，128.5，128.1，128.0，127.7，127.1，125.2，120.0，66.9，66.5，61.6，50.7，47.2，40.1，32.1，29.2，22.5，21.1.實(shí)施例2(2S)-2-氨基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(3)的制備將(2S)-2-芴甲氧酰胺基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(2，3.80g，6.97mmol)以二氯甲烷(100mL)為溶劑溶于250mL的圓底燒瓶中，緩慢滴加二乙胺Et2NH(10mL)，室溫反應(yīng)8h后用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后減壓蒸餾旋干溶劑，然后加入二氯甲烷，旋干溶劑，反復(fù)三次以盡量除凈二乙胺，用硅膠柱分離純化(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.15)，得到無(wú)色油狀物1.16g(2.47mmol)，產(chǎn)率：96％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.32(s，5H)，5.01(s，2H)，3.66(s，3H)，3.17(m，6H)，1.40-1.49(m，6H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ176.6，156.5，136.7，128.4，128.0，127.9，66.3，61.4，50.8，40.7，34.3，32.4，29.6，22.9.實(shí)施例3(2S)-2-[N-芴甲氧羰?；?2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(4)的制備將(2S)-2-氨基-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(3，1.92g，5.94mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(50mL)中，冰浴下攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(2.28g，11.94mmol，2.0eq)，HOBt(1.61g，11.94mmol，2.0eq)，N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸(Fmoc-Arg(Pbf)-OH，5.78g，8.92mmol，1.5eq)，攪拌十分鐘后，用滴液漏斗緩慢滴加三乙胺Et3N(2.40g，23.76mmol，4.0eq)，冰浴條件下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝20∶1，Rf＝0.60)，得白色粉末狀固體4.70g，產(chǎn)率：81.3％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.75-7.33(m，8H)，7.28(m，5H)，5.00(s，2H)，4.78(s，1H)，4.56(s，1H)，4.32(m，2H)，4.16(m，2H)，3.81(s，3H)，3.17-3.11(m，7H)，2.91(s，2H)，2.63(s，2H)，2.54(s，2H)，2.06(s，2H)，1.63-1.42(m，16H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ172.9，171.2，158.7，156.7，156.2，144.0，143.8，141.2，138.6，138.4，136.8，132.8，132.5，128.5，127.8，127.7，127.1，125.2，124.6，119.9，117.5，86.3，67.0，66.3，61.5，60.4，53.8，53.3，50.3，47.1，43.2，40.2，32.3，30.0，29.1，28.6，22.8，21.1，19.5，18.1，14.2，12.6.實(shí)施例4(2S)-2-[2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(5)的制備將(2S)-2-[N-芴甲氧羰酰基-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(3，4.75g)以二氯甲烷(100mL)為溶劑溶于250mL的圓底燒瓶中，緩慢滴加二乙胺Et2NH(10mL)到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)8h后用用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后減壓蒸餾旋干溶劑，然后加入二氯甲烷，再旋干溶劑，反復(fù)三次以盡量除凈二乙胺，用硅膠柱分離純化(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.25)，得到無(wú)色油狀物3.23g，產(chǎn)率：90.2％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.35(br.s，5H)，5.31(s，1H)，5.04(s，2H)，4.85(s，1H)，3.76(s，3H)，3.65(t，J＝5.6，1H)，3.17(br.s，7H)，2.93(s，2H)，2.56(s，3H)，2.49(s，3H)，2.07(s，3H)，1.85-1.30(m，16H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ174.1，172.6，158.7，156.7，156.5，138.3，136.7，132.9，132.2，128.5，128.0，127.9，124.6，117.4，86.4，66.4，61.6，54.0，49.4，43.2，40.6，32.1，31.4，31.2，29.7，29.2，28.6，25.1，22.7，19.3，18.0，12.5.實(shí)施例5(2S)-2-{N-[N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(6)的制備將(2S)-2-[2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸]-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(5，3.23g，4.42mmol，1.0eq)溶于二氯甲烷(50mL)中，冰浴下攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(0.69g，8.84mmol，2.0eq)，HOBt(1.19g，8.84mmol，2.0eq)，N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸Fmoc-Arg(Pbf)-OH(3.11g，6.63mmol，1.5eq)，攪拌十分鐘后，緩慢滴加三乙胺Et3N(2.40g，23.76mmol，4.0eq)，冰浴下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝20∶1，Rf＝0.4)，得白色粉末狀固體4.66g，產(chǎn)率：86.8％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.72-7.24(m，13H)，5.16(dd，J＝12.4，1H)，5.02(dd，J＝12.4，2H)，4.84(s，1H)，4.61(s，1H)，4.30-4.17(m，3H)，3.43-2.95(m，9H)，2.86(s，2H)，2.56(s，3H)，2.49(s，3H)，2.04(s，3H)，1.90-1.29(m，31H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ172.8，172.6，171.8，158.7，156.6，156.5，156.3，143.9，141.2，138.3，136.8，133.0，132.2，131.2，128.9，128.4，127.1，125.2，124.6，119.9，117.4，86.3，78.9，67.2，66.4，62.9，61.5，60.4，55.0，53.5，52.7，49.6，47.0，43.2，40.6，40.1，37.4，36.3，32.2，31.2，29.4，29.1，28.6，28.5，25.3，22.7，19.4，18.0，14.2，12.5.實(shí)施例6(2S)-2-{N-[N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(7)的制備將(2S)-2-{N-[N-α-芴甲氧羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(6，4.66g)以二氯甲烷(100mL)為溶劑溶于250mL的圓底燒瓶中，緩慢滴加二乙胺Et2NH(10mL)到反應(yīng)液中，室溫反應(yīng)8h后用用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后減壓蒸餾旋干溶劑，然后加入二氯甲烷，再旋干溶劑，反復(fù)三次以盡量除凈二乙胺，用硅膠柱分離純化(乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1，Rf＝0.25)，得到無(wú)色油狀物3.26g，產(chǎn)率：82.7％。1H-NMR(400MHz，CDCl3)：δ7.32(br.s，5H)，5.31(m，1H)，5.06(s，2H)，4.80(s，1H)，4.61(s，1H)，3.79(s，3H)，3.27-3.03(m，9H)，2.94(s，3H)，2.59(s，3H)，2.52(s，3H)，2.08(s，3H)，1.72-1.41(m，31H).13C-NMR(100MHz，CDCl3)：δ173.7，172.5，172.0，158.6，156.7，156.6，156.3，138.2，136.7，132.8，132.1，128.4，127.9，127.6，124.6，117.4，86.3，78.8，66.3，61.5，54.4，52.8，49.6，43.2，42.3，40.5，40.1，33.5，32.2，31.0，28.5，28.4，25.1，22.6，22.4，19.3，18.0，14.5，11.2.實(shí)施例7N-[N-α-二乙醇酸單乙酯羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(8)的制備將(2S)-2-{N-[N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(7，3.0g，1eq)溶于二氯甲烷(50mL)中，冰浴下攪拌十分鐘，然后繼續(xù)依次加入EDC·HCl(0.69g，1.2eq)，HOBt(0.48g，1.2eq)，二乙醇酸單乙酯(0.6g，1.2eq)，攪拌十分鐘后，緩慢滴加三乙胺Et3N(0.48mL，4eq)，冰浴下反應(yīng)3h后用TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)。反應(yīng)完成后依次用檸檬酸水溶液，飽和碳酸氫鈉水溶液，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾蒸除溶劑后，經(jīng)硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝10∶1，Rf＝0.40)，得白色粉末狀固體3.16g，產(chǎn)率：90.5％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.31-7.30(m，5H)，5.04(s，2H)，4.39(s，2H)，4.21-4.07(m，5H)，3.78(s，3H)，3.15(s，3H)，3.10-2.96(m，8H)，2.55(s，3H)，2.49(s，3H)，2.05(s，3H)，1.42(s，6H)，1.39(s，9H)，1.99-1.39(m，15H).13C-NMR(100MHz，CD3OD)：δ173.9，173.7，172.1，171.9，159.7，158.7，158.3，158.0，139.3，138.4，134.4，133.4，129.4(2)，128.9，128.7(2)，125.9，118.3，87.6，79.7，71.4，69.4，67.2，62.2，62.1，61.4，54.3，53.9，50.8，43.9，41.4，41.0，32.8，32.4，31.8，30.4，30.2，28.8(3)，28.7(2)，26.5，24.0，23.9，20.8，19.6，18.4，14.4，12.5.實(shí)施例8N-[N-α-二乙醇酸羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(9)的制備將N-[N-α-二乙醇酸單乙酯羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(8，3.0g，1eq)以50mL四氫呋喃為溶劑溶于圓底燒瓶中，加入氫氧化鋰(96mg，1.5eq)，室溫下反應(yīng)4h后用TLC監(jiān)測(cè)。反應(yīng)完成后先用稀鹽酸水溶液淬滅反應(yīng)，然后用乙酸乙酯萃取分液，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥除水。減壓蒸餾旋干溶劑后，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝10∶1，Rf＝0.25)，得白色粉末狀固體2.87g，產(chǎn)率：95.5％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.14-7.13(m，5H)，5.03(s，2H)，4.24-3.93(m，6H)，3.61(s，3H)，2.83(s，3H)，3.04-2.83(m，6H)，2.38(s，3H)，2.32(s，3H)，1.91(s，3H)，1.27(s，6H)，1.239(s，9H)，1.99-1.39(m，12H).13C-NMR(100MHz，CD3OD)：δ175.1，174.0，173.9，173.7，172.1，158.7，158.3，138.3，129.4(2)，128.8，128.7(2)，79.7，71.4，69.2，67.2，62.1，54.8，54.5，50.8，43.6，41.5，41.0，32.6，32.4，31.8，30.8，30.4，30.2，30.1，28.7(3)，28.6(2)，24.0，23.9，20.7，19.6，18.2，12.5.實(shí)施例9N-[N-α-二乙醇酸羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(10)的制備將N-[N-α-二乙醇酸羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-6-芐氧酰胺基-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(9，2.5g，1eq)溶解于100mL甲醇中，然后再把鈀碳(0.125g，5％)加入反應(yīng)液，將反應(yīng)瓶氫氣保護(hù)后，常壓下置于40C反應(yīng)12h。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)，用硅藻土過(guò)濾反應(yīng)液除去催化劑，用甲醇洗滌硅藻土濾餅兩次，合并濾液，減壓蒸餾蒸除溶劑，得到粉末狀的白色固體。經(jīng)核磁數(shù)據(jù)測(cè)定，產(chǎn)物純度較高，得白色粉末狀固體2.22g，產(chǎn)率：81％，可以直接用于下一步的反應(yīng)。1HNMR(400MHz，CD3OD)：δ4.21(m，3H)，3.94(s，3H)，3.62(s，3H)，3.01(s，3H)，3.01-2.80(m，6H)，2.40(s，3H)，2.33(s，3H)，1.89(s，3H)，1.26(s，6H)，1.24(s，9H)，1.82-1.24(m，15H).13C-NMR(100MHz，CD3OD)：δ175.6，175.4，174.3，173.7，172.4，159.6，158.2，157.9，139.2，134.2，133.3，125.8，118.2，87.5，79.6，71.2，70.7，62.1，54.8，54.5，50.3，43.8，40.9，40.4，32.5，31.5，30.8，30.3，29.7，28.8，28.7，27.6，26.6，24.1，23.4，20.9，19.6，18.4，12.5.實(shí)施例10(2S，5S，8S)-8-(N-甲氧基-N-甲基甲酰基)-5-[1-(2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰胺基)-丙基]-2-(1-叔丁氧酰胺-丁基)-3，6，9，12，13，16-氧代-1，4，7，10，16-氮雜十八烷(11)的制備向1L圓底燒瓶加入稱取好的碳酸氫鈉(168mg，10eq)和溶劑DMF(500mL)，然后再將DPPA(220mg，4eq)，滴加到反應(yīng)體系中，室溫下攪拌十分鐘，將化合物N-[N-α-二乙醇酸羰基-N-ε-叔丁氧羰基-L-賴氨酸]-2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并 呋喃-5-磺酰-L-精氨酸}-N-甲氧基-N-甲基己酰胺(10，2g，1eq)溶解于50mLDMF，用自動(dòng)進(jìn)樣器以5mL/h的速度均勻進(jìn)樣，10h后，進(jìn)樣完成，室溫反應(yīng)36h用TLC監(jiān)測(cè)，減壓蒸餾旋干溶劑，再用二氯甲烷溶解，用硅藻土過(guò)濾除去不溶物，以二氯甲烷洗滌硅藻土濾餅兩次，合并濾液，再次減壓蒸餾旋干溶劑，以硅膠柱分離純化(乙酸乙酯-甲醇＝10∶1，Rf＝0.1)，得白色粉末狀固體0.80g，產(chǎn)率：40％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ4.33-4.29(m，3H)，4.04-4.19(m，4H)，3.77(s，3H)，3.12(s，3H)，3.17-2.96(m，6H)，2.57(s，3H)，2.50(s，3H)，2.06(s，3H)，1.42(s，6H)，1.41(s，9H)，1.99-1.41(m，15H).13C-NMR(100MHz，CD3OD)：δ174.3，173.7，173.0，172.9，171.9，159.7，158.3，157.9，154.1，154.0，139.3，134.3，133.4，125.9，118.3，87.5，79.7，72.0，71.6，62.0，61.4，55.3，54.9，51.2，43.9，40.9，39.4，32.3，32.2，32.1，30.3，29.5，28.8(3)，28.7(2)，26.9，24.2，24.1，20.8，19.6，18.4，14.4，12.5.實(shí)施例11(2S，5S，8S)-8-(甲醛基)-5-[1-(2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰胺基)-丙基]-2-(1-叔丁氧酰胺-丁基)-3，6，9，12，13，16-氧代-1，4，7，10，16-氮雜十八烷(12)的制備稱取氫化鋰鋁(40mg，3eq)加入干燥的圓底燒瓶，對(duì)反應(yīng)體系氮?dú)獗Ｗo(hù)后，在-78℃條件下，加入5mL除水的四氫呋喃。將(2S，5S，8S)-8-(N-甲氧基-N-甲基甲?；?-5-[1-(2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰胺基)-丙基]-2-(1-叔丁氧酰胺-丁基)-3，6，9，12，13，16-氧代-1，4，7，10，16-氮雜十八烷(11，300mg)溶于5mL四氫呋喃，緩緩滴加到反應(yīng)體系中，反應(yīng)1h升溫至0℃，繼續(xù)反應(yīng)，并用TLC監(jiān)測(cè)。待反應(yīng)完成后，淬滅反應(yīng)-先加入冰水(40μL)，再加入15％氫氧化鈉溶液(40μL)，最后加入冰水(120μL)。淬滅后，室溫?cái)嚢璋雮€(gè)小時(shí)。硅藻土過(guò)濾除去不溶物，用二氯甲烷洗滌硅藻土濾餅兩次，合并濾液，減壓蒸餾旋干溶劑，以硅膠柱分離 純化(乙酸乙酯-甲醇＝5∶1，Rf＝0.2)，得白色粉末狀固體，產(chǎn)率：60％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ4.33-4.29(m，6H)，3.68(s，3H)，3.27(s，3H)，3.27-2.94(m，6H)，2.55(s，3H)，2.48(s，3H)，2.04(s，3H)，1.81-1.39(m，30H)實(shí)施例12(2S，5S，8S)-8-(甲醛基)-5-丙基-2-丁基-3，6，9，12，13，16-氧代-1，4，7，10，16-氮雜十八烷(13)的制備稱取(2S，5S，8S)-8-(甲醛基)-5-[1-(2，2，4，6，7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰胺基)-丙基]-2-(1-叔丁氧酰胺-丁基)-3，6，9，12，13，16-氧代-1，4，7，10，16-氮雜十八烷(12，200mg，1eq)加入干燥的10mL圓底燒瓶，對(duì)反應(yīng)體系氮?dú)獗Ｗo(hù)后，緩緩滴加2mL配制好的混合溶劑(三氟乙酸∶二異丙基硅烷∶水∶二氯甲烷＝90∶2.5∶2.5∶5)。室溫下反應(yīng)1h。用無(wú)水乙醚沉淀反應(yīng)液，過(guò)濾，濾出不溶物，用色譜甲醇溶解，最后用高效液相色譜分離得到最終產(chǎn)物。產(chǎn)率：20％。1H-NMR(400MHz，CD3OD)：δ4.28-3.91(m，3H)，4.16(s，4H)，3.52-2.99(m，6H)，1.89-1.30(m，16H).13C-NMR(100MHz，CD3OD)：δ174.1，173.3，172.2，163.1，116.5，71.7，71.3，65.3，55.3，54.7，52.9，41.9，41.7，40.3，31.9，31.7，29.8，27.7，26.1，24.2，23.5.實(shí)施例13.DENV絲氨酸蛋白酶抑制劑體外酶活篩選實(shí)驗(yàn)采用熒光標(biāo)記技術(shù)測(cè)定針對(duì)登革熱絲氨酸蛋白酶的抑制劑的酶活，根據(jù)絲氨酸蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)底物：tBoc-Gly-Arg-Arg-4-methylcoumaryl-7-amide(GRR-AMC)抑制劑最終濃度分別為：1mM，500μM，250μM，125μM，62.5μM，31.25μM，15.625μM，7.8125μM，3.9μM，1.95μM，976nM，488nM，244nM，122nM，61nM，30.5nM，15.3nM，3.8nM，1.9nM，0.95nM，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。利用96孔 板測(cè)定酶活，100μl反應(yīng)體系包括：50mMTris，pH8.5，10μg/mlBSA，10nMDENV絲氨酸蛋白酶，20μM熒光底物和不同濃度的抑制劑，37℃反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，所得數(shù)據(jù)利用軟件GraphPadPrism5處理得到抑制劑的IC50。觀察結(jié)果表明，化合物XI，XVII的IC50小于10μM。實(shí)施例14.WNV絲氨酸蛋白酶抑制劑體外酶活篩選實(shí)驗(yàn)采用熒光標(biāo)記技術(shù)測(cè)定針對(duì)西尼羅河病毒(WNV)絲氨酸蛋白酶的抑制劑的酶活，根據(jù)絲氨酸蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)設(shè)計(jì)底物：AcLKKR-pNA抑制劑最終濃度分別為：1mM，500μM，250μM，125μM，62.5μM，31.25μM，15.625μM，7.8125μM，3.9μM，1.95μM，976nM，488nM，244nM，122nM，61nM，30.5nM，15.3nM，3.8nM，1.9nM，0.95nM，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。利用96孔板測(cè)定酶活，100μl反應(yīng)體系包括：50mMTris，pH8.5，10μg/mlBSA，10nMWNV絲氨酸蛋白酶，20μM熒光底物和不同濃度的抑制劑，37℃反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度(405nm)，所得數(shù)據(jù)利用軟件GraphPadPrism5處理得到抑制劑的IC50。觀察結(jié)果表明，化合物XXIX的IC50小于1μM。