本發(fā)明屬于醫(yī)藥及其制備和應(yīng)用的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物及其制備方法和在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
腫瘤細(xì)胞的代謝比正常細(xì)胞旺盛，尤其是惡性腫瘤更為明顯。腫瘤細(xì)胞代謝的異常使其對(duì)糖等物質(zhì)的需求更為迫切。糖綴合物的糖鏈大多存在于細(xì)胞表面和細(xì)胞分泌的蛋白上，與細(xì)胞通訊、信號(hào)傳遞密切相關(guān)。同時(shí)，糖類(lèi)化合物對(duì)某些細(xì)胞具有特異性尋靶作用，能夠進(jìn)行藥物的定向轉(zhuǎn)運(yùn)。糖基部分可以通過(guò)增加藥物的溶解性，提高其與腫瘤細(xì)胞結(jié)合的特異性，從而改變母體藥物的藥理活性。有研究表明在kryptogenin的C-3位和C-26位通過(guò)糖苷鍵同時(shí)引入單糖得到糖基化修飾的甾體衍生物如式A和式B所示，其對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞株表現(xiàn)出優(yōu)于母體10倍的抑制作用，半數(shù)抑制濃度IC50分別為4.25μM和8.36μM(Bioorganic&MedicinalChemistryLetters,2007,17(1):156-160)；甾體糖衍生物具有強(qiáng)效的廣譜抗腫瘤活性，甚至對(duì)于白血病耐藥細(xì)胞以及各種肺癌細(xì)胞株同樣有效。如式C所示化合物，其抗腫瘤活性(IC50)是一些常規(guī)臨床抗癌藥如嘧吡霉素C、阿霉素、喜樹(shù)堿以及紫杉醇等的10至100倍(CarbohydrateResearch,2002,337(14):1269-1274)。構(gòu)效關(guān)系分析表明甾體母核以及糖基結(jié)構(gòu)是該類(lèi)化合物保持高效抗腫瘤活性的關(guān)鍵。去氫表雄酮是人體外周循環(huán)中的最常見(jiàn)的內(nèi)源性甾體激素，其主要由腎上腺皮質(zhì)分泌，是生物合成雄激素和雌激素的重要前體物質(zhì)。表雄酮是去氫表雄酮在人體代謝過(guò)程中的重要中間產(chǎn)物之一。作為合成各種甾體激素類(lèi)藥物的重要中間體，去氫表雄酮和表雄酮及其衍生物的抗腫瘤活性在近些年來(lái)受到了越來(lái)越多的關(guān)注。有研究表明，體內(nèi)去氫表雄酮具有廣泛的生物學(xué)活性。目前，從去氫表雄酮的衍生物阿比特龍(Abiraterone)已成為治療去勢(shì)抵抗性前列腺癌的重要藥物；近期中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01410682215.6)報(bào)道了表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑環(huán)衍生物(CH21)和去氫表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑環(huán)衍生物(CH12)具有較好的抑制乳腺癌細(xì)胞株T47D增殖活性。以CH12和CH21作為先導(dǎo)化合物，并引入糖基結(jié)構(gòu)改善其水溶性，進(jìn)而增強(qiáng)其抗腫瘤活性及選擇性，對(duì)開(kāi)發(fā)新的抗腫瘤藥物的具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提出了一種表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物及其制備方法，將苯甲酰保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯與CH21或CH12為原料，形成糖苷鍵；然后脫除糖環(huán)的苯甲?；Ｗo(hù)基，得到所述的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單，合成路線(xiàn)短，原料簡(jiǎn)單易得，適合工業(yè)化的大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明提出了一種表雄酮糖基化衍生物，其結(jié)構(gòu)如式(1)所示：其中，R選自：四種中的一種。本發(fā)明還提出的一種去氫表雄酮糖基化衍生物，所述去氫表雄酮糖基化衍生物結(jié)構(gòu)如式(2)所示：其中，R選自：四種中的一種。本發(fā)明還提出一種表雄酮糖基化衍生物的制備方法，所述方法包括：(1)偶聯(lián)反應(yīng)：將苯甲酰保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯與式(m)所示的表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑環(huán)衍生物CH21在溶劑二氯甲烷中，在三氟甲磺酸三甲基硅脂的催化下室溫進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)6-12小時(shí)，形成糖苷鍵，其中，苯甲?；Ｗo(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯作為單糖活性給體，結(jié)構(gòu)如式(A-3)、(B-3)、(C-3)或(D-3)所示；(2)脫保護(hù)：在體積比為1：1的無(wú)水四氫呋喃和甲醇的混合溶劑中，甲醇鈉為堿水解苯甲?；?，室溫條件下反應(yīng)3-6小時(shí)，脫除糖環(huán)苯甲酰基保護(hù)基得到一類(lèi)如式(1)所示的表雄酮糖基化衍生物；其中，優(yōu)選地，所述表雄酮糖基化衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(A-5-1)、式(B-5-1)、式(C-5-1)和或式(D-5-1)所示。其中，苯甲?；Ｗo(hù)的D-葡萄糖三氯乙酰亞胺酯(A-3)、苯甲?；Ｗo(hù)的D-甘露糖三氯乙酰亞胺酯(B-3)、苯甲?；Ｗo(hù)的D-鼠李糖三氯乙酰亞胺酯(C-3)和苯甲?；Ｗo(hù)的D-半乳糖三氯乙酰亞胺酯(D-3)的制備過(guò)程可參照文獻(xiàn)JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity,2005,22(5):352-354；Tetrahedron,2008,64(30-31):7386-7399；TetrahedronLetters,2005,46(31):2445-2448。其中，CH21化合物的制備過(guò)程為：以表雄酮為原料，經(jīng)羥基保護(hù)、縮合反應(yīng)、關(guān)環(huán)反應(yīng)、羥基脫保護(hù)反應(yīng)得到如下式，制備過(guò)程參照中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01410682215.6)。本發(fā)明還提出的一種去氫表雄酮糖基化衍生物的制備方法，所述方法包括：(1)偶聯(lián)反應(yīng)：將苯甲酰保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯與式(n)所示的去氫表雄酮C-16、C-17位稠合噻二唑環(huán)衍生物CH12在溶劑二氯甲烷中，在三氟甲磺酸三甲基硅脂的催化下進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)6-8小時(shí)，形成糖苷鍵，其中，苯甲?；Ｗo(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯作為單糖活性給體，結(jié)構(gòu)如式(A-3)、(B-3)、(C-3)或(D-3)所示；(2)脫保護(hù)：在體積比為1：1的無(wú)水四氫呋喃和甲醇的混合溶劑中，甲醇鈉為堿水解苯甲酰基，室溫條件下反應(yīng)3-6小時(shí)，脫除糖環(huán)苯甲?；Ｗo(hù)基得到一類(lèi)如式(2)所示的去氫表雄酮糖基化衍生物；其中，優(yōu)選地，所述去氫表雄酮糖基化衍生物的結(jié)構(gòu)式如式(A-5-2)、式(B-5-2)、式(C-5-2)或式(D-5-2)所示。其中，CH12化合物的制備過(guò)程為：以去氫表雄酮為原料，經(jīng)羥基保護(hù)、縮合反應(yīng)、關(guān)環(huán)反應(yīng)、羥基脫保護(hù)反應(yīng)得到如下式，制備過(guò)程參照中國(guó)專(zhuān)利(專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枺?01410682215.6)。本發(fā)明制備方法中，以上反應(yīng)采用薄板層析法來(lái)跟蹤監(jiān)測(cè)反應(yīng)的完成程度，反應(yīng)完畢后采用濃縮、萃取、柱層析分離等對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行后處理，最終產(chǎn)物通過(guò)核磁共振譜。本發(fā)明還提供了表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物在制備抗乳腺癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明表雄酮和去氫表雄酮衍生物在抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移和克隆形成方面具顯著效果，且對(duì)于乳腺癌細(xì)胞(T47D)與正常的成纖維細(xì)胞(HAF)具有較好的選擇性。本發(fā)明抗乳腺癌的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物及其制備方法的優(yōu)點(diǎn)包括，將苯甲酰保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯分別與CH21及CH12反應(yīng)，形成糖苷鍵，然后脫除糖環(huán)苯甲酰基保護(hù)基分別得到一類(lèi)表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物。本發(fā)明制備方法的反應(yīng)條件溫和、所用試劑價(jià)格便宜、環(huán)境友好、合成路線(xiàn)短，合成方法簡(jiǎn)便。本發(fā)明制備方法中，將表雄酮和去氫表雄酮的C-16、C-17位分別引入噻二唑環(huán)得到CH21和CH12，分別與苯甲酰保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯形成糖苷鍵，然后脫除糖環(huán)苯甲?；Ｗo(hù)基分別得到一類(lèi)表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物?？鼓[瘤活性測(cè)試結(jié)果如圖1所示，圖1和表明本發(fā)明所制備的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物均具有抗腫瘤活性，特別是表雄酮糖基化衍生物C-5-1和去氫表雄酮糖基化衍生物C-5-2分別在1.0μM濃度和0.2μM濃度時(shí)表現(xiàn)出比其母體化合物CH21和CH12更強(qiáng)的抑制T47D細(xì)胞增殖的活性；，表1表示本發(fā)明表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞株T47D及人源成纖維細(xì)胞HAF(正常細(xì)胞)的半數(shù)抑制濃度；由表1可以看出本發(fā)明的化合物C-5-1和C-5-2表現(xiàn)出比母體化合物CH21更強(qiáng)的抑制T47D細(xì)胞增殖活性，并且具有對(duì)腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的殺傷選擇性；并且這種增殖抑制作用還具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的明顯選擇性，特別是化合物表雄酮糖基化衍生物C-5-1(IC50HAF/IC50T47D＝1247，其中HAF為正常細(xì)胞，T47D為乳腺癌細(xì)胞)。同時(shí)C-5-1還在較低濃度下表現(xiàn)出了顯著的對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆的抑制活性(IC50＝0.1360μM)和對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移的抑制活性(IC50＝9.478μM)。本發(fā)明所制備的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物可作為潛在腫瘤治療藥物，特別是某一特定類(lèi)型乳腺癌的治療藥物，具有良好應(yīng)用前景。附圖說(shuō)明圖1表示本發(fā)明表雄酮糖基化衍生物、去氫表雄酮糖基化衍生物在0.2μM濃度和1.0μM濃度時(shí)分別對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞系T47D的體外細(xì)胞毒活性即增殖抑制活性；結(jié)果表明化合物A-5-1、B-5-1、C-5-1、D-5-1、A-5-2、B-5-2、C-5-2、D-5-2對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞系T47D均有一定的增殖抑制活性，其中的化合物C-5-1和C-5-2對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞株T47D的抑制活性相對(duì)各自母體化合物CH21和CH12均有明顯提高。圖2表示表雄酮糖基化衍生物C-5-1對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞株T47D細(xì)胞遷移活性的抑制。結(jié)果表明化合物C-5-1能夠在較低濃度下顯著抑制人源乳腺癌細(xì)胞株T47D的遷移。圖3表示表雄酮糖基化衍生物C-5-1對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞株T47D克隆形成的抑制。結(jié)果表明C-5-1能夠在較低濃度下顯著抑制T47D的克隆形成。具體實(shí)施方式結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過(guò)程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專(zhuān)門(mén)提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒(méi)有特別限制內(nèi)容。下述實(shí)施例中，化合物結(jié)構(gòu)由核磁共振儀測(cè)定；試劑主要由上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司提供；產(chǎn)品純化主要通過(guò)柱色譜，硅膠(200-300)由青島海洋化工廠生產(chǎn)。實(shí)施例1：苯甲酰基保護(hù)的單糖三氯乙酰亞胺酯單糖的制備(制備過(guò)程參照文獻(xiàn)JournalofShenyangPharmaceuticalUniversity,2005,22(5):352-354；Tetrahedron,2008,64(30-31):7386-7399；TetrahedronLetters,2005,46(31):2445-2448)【式(A-1)所示化合物】將D-葡萄糖(900mg,5mmol)，DMAP(244mg,2mmol)溶解在無(wú)水吡啶(30mL)中，加入苯甲酰氯(5mL)，室溫反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加入稀鹽酸(100ml)，乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有機(jī)相，飽和食鹽水(30ml×2)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮，硅膠柱層析(PE：EA＝3：1)純化，得如式(A-1)所示的白色固體(3.36g，96％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝7.4Hz,2H),8.04(d,J＝7.5Hz,2H),7.96(d,J＝7.5Hz,2H),7.89(d,J＝7.9Hz,4H),7.67(t,J＝7.4Hz,1H),7.59–7.50(m,4H),7.44(dd,J＝12.3,7.2Hz,3H),7.37(dd,J＝14.4,6.7Hz,3H),7.31(t,J＝7.6Hz,4H),6.87(d,J＝3.2Hz,1H),6.34(t,J＝10.0Hz,1H),5.88(t,J＝9.8Hz,1H),5.70(dd,J＝10.2,3.4Hz,1H),4.64(d,J＝10.2Hz,2H),4.55–4.46(m,1H).【式(B-1)所示化合物】按照化合物A-1的合成方法以D-甘露糖(900mg,5mmol)為原料，合成如式(B-1)所示的白色固體(3.22g，92％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝7.8Hz,2H),8.06(d,J＝7.2Hz,4H),7.92(d,J＝7.8Hz,2H),7.83(d,J＝7.9Hz,2H),7.65(t,J＝7.3Hz,1H),7.59(t,J＝7.4Hz,1H),7.53(dd,J＝9.8,4.4Hz,3H),7.48(t,J＝7.4Hz,1H),7.44–7.32(m,7H),7.25(dd,J＝14.5,6.7Hz,2H),6.60(s,1H),6.26(t,J＝10.1Hz,1H),6.04(dd,J＝10.2,2.8Hz,1H),5.89(s,1H),4.67(d,J＝12.2Hz,1H),4.55(d,J＝10.0Hz,1H),4.48(dd,J＝12.3,3.3Hz,1H).【式(C-1)所示化合物】按照化合物A-1的合成方法以一水L-鼠李糖(910mg,5mmol)為原料，合成如式(C-1)所示的白色固體(2.73g，94％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.18(d,J＝7.7Hz,2H),8.12(d,J＝7.6Hz,2H),7.98(d,J＝7.6Hz,2H),7.83(d,J＝7.4Hz,2H),7.69–7.59(m,2H),7.55–7.48(m,5H),7.45–7.36(m,3H),7.26(t,J＝7.9Hz,2H),6.55(s,1H),5.99(dd,J＝9.6,2.6Hz,1H),5.86(s,1H),5.80(t,J＝8.2Hz,1H),4.35(s,1H),1.40(d,J＝4.6Hz,3H).【式(D-1)所示化合物】按照化合物A-1的合成方法以D-半乳糖(900mg,5mmol)為原料，合成如式(D-1)所示的白色固體(3.20g，91％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.16–8.09(m,4H),7.97(d,J＝7.8Hz,2H),7.87(d,J＝7.9Hz,2H),7.83(d,J＝7.8Hz,2H),7.65(t,J＝7.4Hz,2H),7.56–7.50(m,5H),7.46(t,J＝7.3Hz,2H),7.39(t,J＝7.6Hz,2H),7.29(dd,J＝15.0,7.3Hz,4H),6.97(d,J＝3.3Hz,1H),6.20(s,1H),6.14(dd,J＝10.7,2.9Hz,1H),6.04(dd,J＝10.7,3.4Hz,1H),4.85(t,J＝6.6Hz,1H),4.65(dd,J＝11.2,6.4Hz,1H),4.44(dd,J＝11.3,7.0Hz,1H).【式(A-2)所示化合物】將A-1(3.3g,4.71mmol)溶解在四氫呋喃(20mL)中，緩慢滴加甲胺醇溶液(5mL)，室溫反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加入稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，乙酸乙酯(30ml×3)萃取，合并有機(jī)相，飽和食鹽水(30ml×2)洗滌，無(wú)水Na2SO4干燥，濃縮，硅膠柱層析(PE：EA＝2：1)純化，得到如式(A-2)所示的白色固體(2.3g，82％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.02(d,J＝7.8Hz,2H),7.96(d,J＝7.8Hz,2H),7.91(d,J＝8.0Hz,2H),7.85(d,J＝8.1Hz,2H),7.51–7.45(m,3H),7.40–7.32(m,7H),7.28–7.23(m,2H),6.24(t,J＝9.9Hz,1H),5.75–5.69(m,2H),5.29(dd,J＝10.2,3.1Hz,1H),4.67–4.61(m,2H),4.41(dd,J＝12.3,3.9Hz,1H).【式(B-2)所示化合物】按照化合物A-2的合成方法以化合物B-1(3.2g,4.57mmol)為原料，得到如式(B-2)所示的白色固體(2.4g，88％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝7.7Hz,2H),8.02(d,J＝7.9Hz,2H),7.95(d,J＝7.9Hz,2H),7.84(d,J＝7.8Hz,2H),7.56(t,J＝7.2Hz,2H),7.49(t,J＝7.3Hz,1H),7.42–7.33(m,7H),7.26(t,J＝6.4Hz,2H),6.17(t,J＝10.1Hz,1H),6.00(dd,J＝10.2,2.7Hz,1H),5.74(s,1H),5.53(s,1H),4.76(d,J＝12.2Hz,1H),4.67(d,J＝10.0Hz,1H),4.44(dd,J＝12.2,3.1Hz,1H).【式(C-2)所示化合物】按照化合物A-2的合成方法以化合物C-1(2.7g,4.65mmol)為原料，得到如式(C-2)所示的白色固體(1.86g，84％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝7.8Hz,2H),7.98(d,J＝6.4Hz,2H),7.83(d,J＝7.0Hz,2H),7.59(t,J＝7.0Hz,1H),7.53–7.47(m,3H),7.40(dd,J＝13.4,6.0Hz,3H),7.26(t,J＝7.6Hz,2H),5.94(dd,J＝10.1,3.1Hz,1H),5.73(s,1H),5.47(s,1H),4.51–4.44(m,1H),3.69(s,1H),1.36(d,J＝8.0Hz,3H).【式(D-2)所示化合物】按照化合物A-2的合成方法以化合物D-1(3.10g,4.42mmol)為原料，得到如式(D-2)所示的白色固體(2.19g，83％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.12(d,J＝8.4Hz,2H),8.08–7.97(m,4H),7.83(t,J＝6.8Hz,2H),7.65(t,J＝7.2Hz,1H),7.61–7.50(m,4H),7.47–7.38(m,5H),7.31–7.25(m,2H),6.12(d,J＝7.7Hz,1H),6.05–5.89(m,1H),5.78–5.65(m,1H),5.12–4.87(m,1H),4.74–4.63(m1H),4.51–4.41(m1H).【式(A-3)所示化合物】將A-2(2.25g,3.77mmol)溶解在無(wú)水二氯甲烷(20mL)中，依次加入三氯乙腈(3.78mL,37.7mmol)、DBU(0.29mL,1.89mmol)室溫反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)完全后，減壓除去溶劑，硅膠柱層析(PE：EA＝5：1)純化，得到如式(A-3)所示的白色固體(2.43g，87％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.63(s,1H),8.06–8.02(m,2H),7.98–7.94(m,4H),7.90–7.85(m,2H),7.56(t,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.4Hz,2H),7.46–7.42(m,3H),7.37(t,J＝7.8Hz,4H),7.30(t,J＝7.8Hz,2H),6.84(d,J＝3.7Hz,1H),6.28(t,J＝10.0Hz,1H),5.82(t,J＝9.8Hz,1H),5.63(dd,J＝10.2,3.7Hz,1H),4.67–4.63(m,2H),4.49(dd,J＝12.9,5.5Hz,1H).【式(B-3)所示化合物】按照化合物A-3的合成方法以化合物B-2(2.35g,3.94mmol)為原料，得到如式(B-3)所示的白色固體(2.36g，81％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.85(s,1H),8.06(dd,J＝14.5,7.2Hz,4H),7.95(d,J＝7.3Hz,2H),7.83(d,J＝7.2Hz,2H),7.61–7.55(m,2H),7.50(t,J＝7.4Hz,1H),7.43–7.34(m,7H),7.28–7.24(m,2H),6.56(d,J＝1.7Hz,1H),6.23(t,J＝10.2Hz,1H),5.99–5.92(m,2H),4.72(dd,J＝12.3,2.4Hz,1H),4.66–4.59(m,1H),4.49(dd,J＝12.3,4.1Hz,1H).【式(C-3)所示化合物】按照化合物A-3的合成方法以化合物C-2(1.80g,3.78mmol)為原料，得到如式(C-3)所示的白色固體(1.97g，84％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.83(s,1H),8.12(d,J＝8.3Hz,2H),7.99(d,J＝7.1Hz,2H),7.83(d,J＝8.3Hz,2H),7.66–7.62(m,1H),7.55–7.50(m,3H),7.46–7.39(m,3H),7.29–7.27(m,2H),6.50(d,J＝1.5Hz,1H),5.94–5.87(m,2H),5.82–5.76(m,1H),4.44–4.39(m,1H),1.43(d,J＝6.2Hz,3H).【式(D-3)所示化合物】按照化合物A-3的合成方法以化合物D-2(2.15g,3.60mmol)為原料，得到如式(D-3)所示的白色固體(2.14g，80％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.64(s,1H),8.11–8.08(m,2H),7.99–7.95(m,4H),7.81(dd,J＝8.3,1.1Hz,2H),7.66–7.62(m,1H),7.55–7.49(m,4H),7.47–7.44(m,1H),7.41(t,J＝7.8Hz,2H),7.36(t,J＝7.8Hz,2H),7.28–7.25(m,2H),6.92(d,J＝3.7Hz,1H),6.16(d,J＝2.4Hz,1H),6.08(dd,J＝10.7,3.3Hz,1H),5.97(dd,J＝10.7,3.7Hz,1H),4.87(t,J＝6.4Hz,1H),4.62(dd,J＝11.4,6.9Hz,1H),4.44(dd,J＝11.5,6.0Hz,1H).實(shí)施例2：表雄酮糖基化衍生物的制備【式(A-4-1)所示化合物】將A-3(889mg,1.2mmol)、CH21(200mg,0.6mmol)溶解在無(wú)水二氯甲烷(20mL)中，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂(0.24mL,0.3mmol)，室溫反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)完全后，減壓除去溶劑，加入水(30mL)，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析(PE：EA＝3：1)純化，得到如式(A-4-1)所示的白色固體(442mg，81％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.04(d,J＝8.3Hz,2H),7.98(d,J＝7.2Hz,2H),7.92(d,J＝8.2Hz,2H),7.84(d,J＝8.2Hz,2H),7.56–7.49(m,3H),7.40(dd,J＝16.9,9.2Hz,5H),7.35(t,J＝7.7Hz,2H),7.27(t,J＝7.7Hz,2H),5.94(t,J＝9.6Hz,1H),5.66(t,J＝9.6Hz,1H),5.25(d,J＝4.5Hz,1H),4.92(d,J＝7.5Hz,1H),4.62–4.56(m,2H),4.18–4.15(m,1H),3.59–3.49(m,1H),3.02(dd,J＝15.1,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.0,12.0Hz,1H),2.48(d,J＝12.5Hz,1H),2.23–2.15m,3H),2.08–2.02(m,1H),1.97(d,J＝12.2Hz,1H),1.95–1.84(m,1H),1.10(s,3H),0.97(s,3H).【式(B-4-1)所示化合物】按照化合物A-4-1的合成方法以化合物B-3(889mg,1.2mmol)和CH21(200mg,0.6mmol)為原料，得到如式(B-4-1)所示的白色固體(426mg，78％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11–8.04(m,4H),8.00–7.95(m,2H),7.86–7.81(m,2H),7.61–7.56(m,2H),7.51(t,J＝7.4Hz,1H),7.45–7.35(m,7H),7.26(dd,J＝4.8,2.7Hz,2H),6.05(t,J＝10.0Hz,1H),5.93(dd,J＝10.1,3.3Hz,1H),5.64(dd,J＝3.2,1.8Hz,1H),5.25(d,J＝1.4Hz,1H),4.70(dd,J＝11.8,2.1Hz,1H),4.54–4.51(m,1H),4.47(dd,J＝11.9,5.1Hz,1H),3.74–3.65(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.48–2.40(m,1H),2.23–2.17(m,1H),1.96(d,J＝10.5Hz,1H),1.60–1.49(m,3H),1.36–1.21(m,4H),1.10(s,3H),0.93(s,3H).【式(C-4-1)所示化合物】按照化合物A-4-1的合成方法以化合物C-3和CH21為原料，得到如式(C-4-1)所示的白色固體(89％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.13(dd,J＝8.3,1.3Hz,2H),7.95(dd,J＝8.3,1.2Hz,2H),7.81(dd,J＝8.3,1.2Hz,2H),7.63–7.58(m,1H),7.55–7.47(m,3H),7.45–7.34(m,3H),7.29–7.24(m,3H),5.85(dd,J＝10.1,3.4Hz,1H),5.68(t,J＝10.0Hz,1H),5.63(dd,J＝3.4,1.8Hz,1H),5.19(t,J＝4.3Hz,1H),4.33–4.23(m,1H),3.66–3.55(m,1H),3.11–3.00(m,1H),2.65(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.54–2.43(m,2H),2.39(dd,J＝17.8,6.7Hz,1H),2.27–2.21(m,1H),2.14–2.43(m,1H),2.04–1.92(m,3H),1.86–1.70(m,5H),1.38(d,J＝6.3Hz,3H),1.16(s,3H),1.14(s,3H).【式(D-4-1)所示化合物】按照化合物A-4-1的合成方法以化合物D-3和CH21為原料，得到如式(D-4-1)所示的白色固體(421mg，77％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝7.3Hz,2H),8.03(d,J＝7.2Hz,2H),7.97(d,J＝7.3Hz,2H),7.79(d,J＝7.3Hz,2H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(dd,J＝13.1,5.7Hz,1H),7.53–7.46(m,3H),7.44–7.38(m,5H),7.27–7.22(m,2H),5.98(d,J＝2.9Hz,1H),5.78(dd,J＝10.3,8.0Hz,1H),5.60(dd,J＝10.4,3.4Hz,1H),4.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.69(dd,J＝11.2,6.9Hz,1H),4.42(dd,J＝11.2,6.5Hz,1H),4.33(t,J＝6.7Hz,1H),3.62–3.52(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.48(d,J＝12.5Hz,1H),2.26–2.16(m,3H),2.08–1.98(m,2H),1.93–1.86(m,1H),1.81–1.78(m,2H),1.76–1.59(m,5H),1.11(s,3H),1.01(s,3H).【式(A-5-1)所示化合物】將A-4-1(420mg,0.46mmol)溶解在無(wú)水四氫呋喃(10mL)和甲醇(10mL)混合溶劑中，加入甲醇鈉(497mg,9.2mmol)，室溫反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)完全后，除去溶劑，加入稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析(DCM：MeOH＝5：1)分離純化，得到如式(A-5-1)所示的白色固體(200mg，88％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.89(d,J＝4.5Hz,1H),4.87–4.83(m,2H),4.43(t,J＝5.8Hz,1H),4.23(d,J＝7.8Hz,1H),3.67–3.63(m,1H),3.45–3.37(m,2H),3.16(t,J＝4.2Hz,1H),3.11(dd,J＝8.6,4.6Hz,1H),3.06(d,J＝5.3Hz,2H),3.02(d,J＝5.9Hz,1H),2.92–2.87(m,1H),2.71–2.61(m,1H),2.31–2.23(m,1H),2.14(dd,J＝17.2,11.1Hz,1H),1.76(dd,J＝17.2,6.6Hz,3H),1.72–1.62(m,5H),1.55–1.37(m,2H),1.01(s,3H),0.85(s,3H).【式(B-5-1)所示化合物】按照化合物A-5-1的合成方法以化合物B-4-1(420mg,0.46mmol)為原料，得到如式(B-5-1)所示的白色固體(198mg，87％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.03(s,1H),3.99(s,2H),3.94(s,2H),3.75(d,J＝14.3Hz,1H),3.61(d,J＝11.1Hz,1H),3.55(s,1H),2.99(dd,J＝15.4,6.0Hz,1H),2.58(dd,J＝15.1,12.2Hz,1H),2.50–2.36(m,1H),2.20–2.14(m,1H),1.89(d,J＝8.7Hz,1H),1.82(d,J＝10.9Hz,1H),1.74(s,4H),1.55(d,J＝7.3Hz,2H),1.43–1.26(m,5H),1.08(s,3H),0.89(s,3H)【式(C-5-1)所示化合物】按照化合物A-5-1的合成方法以化合物C-4-1為原料，得到如式(C-5-1)所示的白色固體(86％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.95(s,1H),3.89(s,1H),3.83–3.77(m,1H),3.76–3.71(m,1H),3.62–3.51(m,1H),3.49–3.43(m,1H),3.01(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.59(dd,J＝15.3,12.1Hz,1H),2.48–2.39(m,1H),2.24–2.17(m,1H),1.82(d,J＝11.1Hz,2H),1.77(d,J＝12.3Hz,4H),1.66(s,4H),1.54(dd,J＝17.3,10.8Hz,2H),1.31(d,J＝6.1Hz,3H),1.27–1.23(m,1H),1.09(s,3H),0.90(s,3H).【式(D-5-1)所示化合物】按照化合物A-5-1的合成方法以化合物D-4-1為原料，得到如式(D-5-1)所示的白色固體(87％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ4.78(d,J＝3.4Hz,1H),4.51–4.44(m,2H),4.29(d,J＝3.2Hz,1H),4.19(d,J＝6.6Hz,1H),3.69(s,1H),3.66(t,J＝6.4Hz,1H),3.55–3.45(m,4H),3.44–3.37(m,2H),3.04(dd,J＝15.8,6.3Hz,1H),2.67(dd,J＝15.8,12.0Hz,1H),2.29–2.25(m,1H),2.18–2.12(m,1H),1.84–1.77(m,2H),1.73–1.66(m,4H),1.60(d,J＝12.6Hz,1H),1.54–1.47(m,1H),1.36–1.24(m,5H),1.02(s,3H),0.85(s,3H).實(shí)施例3：去氫表雄酮糖基化衍生物的制備【式(A-4-2)所示化合物】將A-3(889mg,1.2mmol)、CH12(200mg,0.6mmol)溶解在無(wú)水二氯甲烷(20mL)中，加入三氟甲磺酸三甲基硅脂(0.24mL,0.3mmol)，室溫反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)完全后，減壓除去溶劑，加入水(30mL)，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，合并有機(jī)相，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析(PE：EA＝3：1)純化，得到如式(A-4-2)所示的白色固體(415mg，76％))。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(d,J＝8.2Hz,2H),7.97(d,J＝8.2Hz,2H),7.90(d,J＝8.2Hz,2H),7.83(d,J＝8.2Hz,2H),7.55–7.48(m,3H),7.40(dd,J＝16.9,9.2Hz,5H),7.34(t,J＝7.7Hz,2H),7.29(t,J＝7.7Hz,2H),5.90(t,J＝9.6Hz,1H),5.64(t,J＝9.7Hz,1H),5.50(dd,J＝9.3,8.3Hz,1H),5.26(d,J＝4.5Hz,1H),4.95(d,J＝7.8Hz,1H),4.62–4.57(m,2H),4.18–4.15(m,1H),3.59–3.49(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.48(d,J＝12.5Hz,1H),2.23–2.17m,3H),2.08–2.00(m,1H),1.96(d,J＝12.4Hz,1H),1.92–1.85(m,1H),1.11(s,3H),0.99(s,3H).【式(B-4-2)所示化合物】按照化合物A-4-2的合成方法以化合物B-3和CH12為原料，得到如式(B-4-2)所示的白色固體(73％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11–8.04(m,4H),8.00–7.95(m,2H),7.51(t,J＝7.4Hz,1H),7.45–7.35(m,7H),7.26(dd,J＝4.8,2.7Hz,2H),6.05(t,J＝10.0Hz,1H),5.64(dd,J＝3.2,1.8Hz,1H),5.25(d,J＝1.4Hz,1H),4.70(dd,J＝11.8,2.1Hz,1H),4.69–4.66(m,1H),4.54–4.51(m,1H),4.47(dd,J＝11.9,5.1Hz,1H),3.74–3.65(m,1H),3.03(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.48–2.40(m,1H),2.23–2.17(m,1H),1.96(d,J＝10.5Hz,1H),1.60–1.49(m,3H),1.36–1.21(m,4H),1.10(s,3H),0.93(s,3H).【式(C-4-2)所示化合物】按照化合物A-4-2的合成方法以化合物C-3和CH12為原料，得到如式(C-4-2)所示的白色固體(78％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.10(dd,J＝8.3,1.2Hz,2H),7.98(dd,J＝8.3,1.2Hz,2H),7.82(dd,J＝8.3,1.2Hz,2H),7.64–7.59(m,1H),7.55–7.47(m,3H),7.45–7.36(m,3H),7.28–7.24(m,3H),5.86(dd,J＝10.1,3.4Hz,1H),5.67(t,J＝10.0Hz,1H),5.61(dd,J＝3.4,1.8Hz,1H),5.45–5.39(m,1H),5.17(t,J＝4.3Hz,1H),4.31–4.23(m,1H),3.66–3.55(m,1H),3.11–3.00(m,1H),2.65(dd,J＝15.5,11.9Hz,1H),2.54–2.43(m,2H),2.39(dd,J＝17.8,6.7Hz,1H),2.27–2.21(m,1H),2.14–2.43(m,1H),2.04–1.92(m,3H),1.86–1.69(m,5H),1.35(d,J＝6.3Hz,3H),1.16(s,3H),1.15(s,3H).【式(D-4-2)所示化合物】按照化合物A-4-2的合成方法以化合物D-3和CH12為原料，得到如式(D-4-2)所示的白色固體(72％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.11(d,J＝7.3Hz,2H),8.03(d,J＝7.2Hz,2H),7.97(d,J＝7.3Hz,2H),7.79(d,J＝7.3Hz,2H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.56(dd,J＝13.1,5.7Hz,1H),7.53–7.46(m,3H),7.44–7.38(m,5H),7.27–7.22(m,2H),5.98(d,J＝2.9Hz,1H),5.78(dd,J＝10.3,8.0Hz,1H),5.60(dd,J＝10.4,3.4Hz,1H),5.26(d,J＝4.4Hz,1H),4.92(d,J＝8.0Hz,1H),4.69(dd,J＝11.2,6.9Hz,1H),4.42(dd,J＝11.2,6.5Hz,1H),4.33(t,J＝6.7Hz,1H),3.62–3.52(m,1H),3.02(dd,J＝15.5,6.3Hz,1H),2.61(dd,J＝15.5,12.0Hz,1H),2.48(d,J＝12.5Hz,1H),2.26–2.16(m,3H),2.08–1.98(m,2H),1.93–1.86(m,1H),1.81–1.78(m,2H),1.76–1.59(m,5H),1.11(s,3H),1.01(s,3H).【式(A-5-2)所示化合物】將A-4-2(400mg,0.44mmol)溶解在無(wú)水四氫呋喃(10mL)和甲醇(10mL)混合溶劑中，加入甲醇鈉(475mg,8.8mmol)，室溫反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)完全后，除去溶劑，加入稀鹽酸調(diào)pH呈弱酸性，乙酸乙酯(30mL×3)萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥，硅膠柱層析(DCM：MeOH＝5：1)分離純化，得到如式(A-5-2)所示的白色固體(178mg，83％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.95(d,J＝3.2Hz,1H),5.38(d,J＝3.3Hz,1H),4.94(d,J＝4.6Hz,1H),4.92–4.88(m,1H),4.45(s,1H),4.23(d,J＝7.7Hz,1H),3.64(dd,J＝11.2,5.4Hz,1H),3.52–3.45(m,1H),3.42(dd,J＝9.8,3.8Hz,1H),3.18–3.11(m,1H),3.05(d,J＝4.7Hz,3H),2.93–2.88(m,1H),2.70(dd,J＝15.6,12.0Hz,1H),2.41(dd,J＝13.0,3.3Hz,1H),2.31(d,J＝11.2Hz,1H),2.23–2.12(m,2H),2.09–2.01(m,1H),1.05(s,6H).【式(B-5-2)所示化合物】按照化合物A-5-2的合成方法以化合物B-4-2為原料，得到如式(B-5-2)所示的白色固體(85％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.35(dd,J＝11.1,8.3Hz,1H),4.78(d,J＝1.2Hz,1H),4.69(d,J＝5.0Hz,1H),4.66(d,J＝4.3Hz,1H),4.53(d,J＝5.9Hz,1H),4.43(t,J＝5.9Hz,1H),3.65(dd,J＝10.3,6.2Hz,1H),3.56(s,1H),3.49–3.39(m,4H),3.40–3.35(m,2H),3.17(d,J＝5.2Hz,1H),3.08(dd,J＝15.8,6.4Hz,1H),2.71(dd,J＝15.8,11.9Hz,1H),2.41–2.36(m,1H),2.35–2.30(m,1H),2.25(d,J＝11.3,1H),2.22–2.15(m,1H),2.09–2.02(m,1H),1.91–1.82(m,3H),1.75–1.67(m,4H),1.41–1.33(m,1H),1.06(d,J＝1.6Hz,1H).【式(C-5-2)所示化合物】按照化合物A-5-2的合成方法以化合物C-4-2為原料，得到如式(C-5-2)所示的白色固體(94％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.38(s,1H),4.97(s,1H),3.96(d,J＝36.0Hz,2H),3.78–3.73(m,1H),3.57–3.52(m,1H),3.50–3.45(m,1H),3.02(dd,J＝15.4,6.2Hz,1H),2.62(dd,J＝15.4,12.0Hz,1H),2.48(d,J＝12.2Hz,1H),2.38(d,J＝10.5Hz,1H),2.24–2.18(m,2H),2.14–2.04(m,1H),1.97–1.85(m,3H),1.84–1.68(m,4H),1.60(dd,J＝23.5,10.8Hz,1H),1.31(d,J＝15.8Hz,3H),1.12(s,3H),1.09(s,3H).【式(D-5-2)所示化合物】按照化合物A-5-2的合成方法以化合物D-4-2為原料，得到如式(D-5-2)所示的白色固體(86％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ5.37(dd,J＝11.0,8.3Hz,1H),4.80(d,J＝3.6Hz,1H),4.54–4.46(m,2H),4.29(d,J＝3.7Hz,1H),4.20(d,J＝6.9Hz,1H),3.69(s,1H),3.64(t,J＝6.1Hz,1H),3.52–3.43(m,4H),3.42–3.37(m,2H),3.00(dd,J＝14.7,6.8Hz,1H),2.69(dd,J＝15.1,11.3Hz,1H),2.28–2.25(m,1H),2.16–2.10(m,1H),1.86–1.77(m,2H),1.73–1.67(m,4H),1.61(d,J＝12.6Hz,1H),1.55–1.46(m,1H),1.38–1.25(m,5H),1.02(s,3H),0.85(s,3H)。實(shí)施例4：表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物抗腫瘤細(xì)胞增殖測(cè)試采用SRB法在乳腺癌細(xì)胞系T47D和人成纖維細(xì)胞系HAF中測(cè)試本發(fā)明的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物對(duì)相應(yīng)細(xì)胞的增殖抑制率。計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)進(jìn)行比較。1、測(cè)試原理：磺酰羅丹明B(SRB)是一種粉紅色陰離子染料，易溶于水，在酸性條件下可特異性地與細(xì)胞內(nèi)組成蛋白質(zhì)的堿性氨基酸結(jié)合，其在515nm波長(zhǎng)處產(chǎn)生吸收峰。在一定吸光度范圍內(nèi)，吸光度與細(xì)胞數(shù)量成線(xiàn)性正相關(guān)，故可用作細(xì)胞數(shù)量的定量檢測(cè)。2、樣品測(cè)試(1)各細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到96孔板上，經(jīng)過(guò)24小時(shí)培養(yǎng)后，實(shí)驗(yàn)組給予不同濃度的本發(fā)明的衍生物處理96小時(shí)，對(duì)照組使用正常培養(yǎng)基。(2)藥物作用96小時(shí)后，取出培養(yǎng)板，每孔加入25μL50％TCA溶液固定細(xì)胞，4℃放置1小時(shí)以上。(3)取出固定后的培養(yǎng)板，用水沖洗5遍，自然晾干或吹風(fēng)機(jī)吹干后，每孔加入50μL0.4％SRB溶液，染色10分鐘，棄去染色液，1％冰醋酸洗滌并用吹風(fēng)機(jī)吹干。(4)用100μLTris-base堿液(10mM)溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料，采用酶標(biāo)儀515nm處測(cè)定光吸收值。(5)IC50用GraphPad軟件計(jì)算得到。3、結(jié)論各測(cè)試化合物對(duì)人源乳腺癌細(xì)胞T47D分別在0.2μM和1μM濃度下的抑制率見(jiàn)圖1和表1，結(jié)果表明化合物A-5-1、B-5-1、C-5-1、D-5-1、A-5-2、B-5-2、C-5-2、D-5-2均有較好的抑制乳腺癌細(xì)胞T47D增殖的能力，特別是化合物C-5-1(IC50＝0.0696μM)抑制乳腺癌細(xì)胞T47D增殖的能力明顯強(qiáng)于其母體化合物CH21(IC50＝1.22μM)，以及表雄酮(IC50＝1.23μM)和去氫表雄酮(IC50＝2.55μM)，且對(duì)正常成纖維HAF細(xì)胞增殖的抑制能力很小(IC50＝86.8μM)，表現(xiàn)出了對(duì)正常成纖維細(xì)胞HAF很低的細(xì)胞毒性，以及對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T47D和正常成纖維細(xì)胞HAF的極大的選擇性(IC50HAF/IC50T47D＝1247)。該選擇性與母體化合物CH21(IC50HAF/IC50T47D＝32)相比提高了39倍，與表雄酮(IC50HAF/IC50T47D＝35)相比提高了36倍，與去氫表雄酮(IC50HAF/IC50T47D＝21)相比提高了59倍。因此，本發(fā)明所涉及的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物可作為一種潛在的治療乳腺癌的藥物。表1.表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞以及人成纖維細(xì)胞HAF體外細(xì)胞毒活性實(shí)施例5：C-5-1抑制乳腺癌細(xì)胞系T47D的細(xì)胞遷移活性采用微孔濾膜培養(yǎng)小室系統(tǒng)(Transwell試驗(yàn))測(cè)試化合物C-5-1對(duì)乳腺癌細(xì)胞系T47D的細(xì)胞遷移能力的影響。1、測(cè)試原理：Transwell小室的底層是一張帶有微孔具有通透性的膜，孔徑大小為0.1－12.0μm，本發(fā)明采用的是一般常用的聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)。將Transwell小室放入培養(yǎng)板中，小室內(nèi)稱(chēng)上室，培養(yǎng)板內(nèi)稱(chēng)下室，上室內(nèi)盛裝上層培養(yǎng)液，下室內(nèi)盛裝下層培養(yǎng)液，上下層培養(yǎng)液以聚碳酸酯膜相隔。將細(xì)胞接種在上室內(nèi)，由于聚碳酸酯膜有通透性，下層培養(yǎng)液中的成分可以影響到上室內(nèi)的細(xì)胞，從而可以研究下層培養(yǎng)液中的成分對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)等的影響。應(yīng)用不同孔徑和經(jīng)過(guò)不同處理的聚碳酸酯膜，就可以進(jìn)行共培養(yǎng)、細(xì)胞趨化、細(xì)胞遷移、細(xì)胞侵襲等多種方面的研究。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中，可以通過(guò)對(duì)濾膜下面的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，來(lái)反映細(xì)胞的遷移情況。1、化合物抑制遷移活性測(cè)試：(1)消化并計(jì)數(shù)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的T47D細(xì)胞，細(xì)胞重懸在無(wú)血清并含有不同濃度(0，0.5，2.5，12.5μM)待測(cè)化合物的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，細(xì)胞以5x104個(gè)/孔(200μL)接種至Transwell小室的上室中，對(duì)照組加入等量的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。下室中則加入600μL含有對(duì)應(yīng)濃度待測(cè)化合物的完全培養(yǎng)基。(2)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14h。(3)取出Transwell小室用多聚甲醛固定小室細(xì)胞20min。(4)2‰結(jié)晶紫染液將細(xì)胞染色處理5min，清洗小室，將未結(jié)合的結(jié)晶紫洗掉，用棉簽輕輕擦拭Transwell小室的上側(cè)，將未遷移到下側(cè)的細(xì)胞擦掉。(5)自然干燥，顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)多個(gè)視野的細(xì)胞數(shù)目。(6)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，細(xì)胞遷移率(％)＝加藥物細(xì)胞遷移數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)*100％。3、結(jié)論：實(shí)驗(yàn)結(jié)果如(圖2)所示，圖2表明C-5-1能夠在體外實(shí)驗(yàn)中以劑量依賴(lài)性的方式抑制T47D細(xì)胞的遷移。在12.5μM的濃度下，即表現(xiàn)出了與對(duì)照組的極顯著差異(P<0.01)；到25μM濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞遷移的抑制率達(dá)到了70％左右。實(shí)施例6：C-5-1抑制乳腺癌細(xì)胞系T47D的克隆形成實(shí)驗(yàn)采用體外克隆形成實(shí)驗(yàn)的方法測(cè)試化合物對(duì)T47D細(xì)胞克隆形成能力的影響。1、測(cè)試原理細(xì)胞克隆形成率即細(xì)胞接種存活率，表示接種細(xì)胞后貼壁的細(xì)胞成活并形成克隆的數(shù)量。貼壁后的細(xì)胞不一定每個(gè)都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細(xì)胞必為貼壁和有增殖活力的細(xì)胞。克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴(lài)性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。2、樣品測(cè)試(1)消化處理處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的相應(yīng)細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，每孔2x103個(gè)細(xì)胞接種于六孔板中，確保接種的細(xì)胞分布均勻。(2)待細(xì)胞貼壁后換液，加入含有不同濃度(0，0.1，0.5，2.5μM)測(cè)試化合物的完全培養(yǎng)基。(3)培養(yǎng)一周后，用吸泵吸掉原來(lái)的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗3次，用多聚甲醛溶液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定處理(20min)，然后2‰結(jié)晶紫染液將細(xì)胞染色5min，最后用緩慢流動(dòng)的自來(lái)水輕輕清洗，以洗掉未結(jié)合的結(jié)晶紫染液，室溫自然干燥。(4)顯微鏡下拍照，計(jì)算細(xì)胞克隆形成數(shù)量3、結(jié)論實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，圖3表明C-5-1能夠在體外實(shí)驗(yàn)中以劑量依賴(lài)性的方式抑制T47D細(xì)胞的克隆形成數(shù)量和形成克隆的大小。在0.1μM的濃度下，即表現(xiàn)出了與對(duì)照組的極顯著差異(P<0.001)；到2.5μM濃度時(shí)，對(duì)細(xì)胞克隆形成的抑制率達(dá)到了90％以上。綜上，本發(fā)明制備的表雄酮糖基化衍生物和去氫表雄酮糖基化衍生物可作為一種潛在的制備抗乳腺癌的藥物。本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書(shū)為保護(hù)范圍。