產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏姆椒ê徒M合物本申請是申請?zhí)枮?00980117663.9的專利申請的分案申請。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2008年5月16日提交的美國臨時申請第61/053955號的優(yōu)先權(quán)，在此將其內(nèi)容全部并入。發(fā)明背景石油是地球上發(fā)現(xiàn)的、液體、氣體或固體形式的有限的天然資源。石油主要由碳?xì)浠衔锝M成，碳?xì)浠衔镏饕商己蜌浣M成。石油還含有大量的處于不同形式的其他元素，例如氮、氧或硫。石油是寶貴資源，但是以相當(dāng)大的金融和環(huán)境代價對石油產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)。首先，必須發(fā)現(xiàn)石油資源。石油勘探是耗資并有風(fēng)險的投資。勘探深水井的費用可以超過1億美元。此外，不能保證這些井會含有石油。據(jù)估計，僅40％的鉆井成為產(chǎn)生商業(yè)碳?xì)浠衔锏纳a(chǎn)井。除經(jīng)濟(jì)費用外，石油勘探存在嚴(yán)重的環(huán)境代價。例如近?？碧綌_亂周圍海洋環(huán)境。發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)井后，必須以巨大代價從地球開采石油。在初次采收(primaryrecovery)中，地下的自然壓力足以開采約20％的井中石油。當(dāng)該自然壓力降低時，如果經(jīng)濟(jì)上合算，則使用二次采收(secondrecovery)。通常，二次采收涉及通過例如水注射、天然氣注射或氣舉等增加井壓。使用二次采油，采收到另外5％至15％的石油。一旦二次采收方法不起作用，如果經(jīng)濟(jì)上合算，可以使用三次采收方法。三次方法涉及降低石油的粘度以使其更易開采。使用三次采收方法，采收到另外5％至15％的石油。因此，即使在最佳條件下，僅可以開采50％的井中石油。石油開采也存在環(huán)境代價。例如，石油開采可以導(dǎo)致大量石油滲漏上升至表面。此外，近海鉆井涉及挖掘河床，這擾亂或破壞周圍海洋環(huán)境。因為石油礦藏不是在地球各處均勻發(fā)現(xiàn)的，所以石油必須從石油產(chǎn)生區(qū)長距離運輸?shù)绞拖膮^(qū)。除運輸費用外，還存在大規(guī)模油泄漏的環(huán)境風(fēng)險。從地球開采的原油在天然形式時具有少數(shù)商業(yè)用途。其是具有不同長度和復(fù)雜性的碳?xì)浠衔?例如，石蠟(或烷)、烯烴(或烯)、炔、環(huán)烷(napthenes)(或環(huán)烷(cylcoalkanes))、脂肪族化合物、芳香族化合物等)的混合物。此外，原油含有其他有機(jī)化合物(例如含有氮、氧、硫等的有機(jī)化合物)和雜質(zhì)(例如硫磺、鹽、酸、金屬等)。因此，在商業(yè)上可以使用前，必須提煉并純化原油。由于其高能量密度及其便利的可運輸性，大部分石油被提煉為燃料，例如運輸燃料(例如汽油、柴油、航空燃料等)、燃用油、液化石油氣等。原油還是用于產(chǎn)生石化產(chǎn)品的原材料的主要來源。兩類主要的來自石油的原材料是短鏈烯烴(例如乙烯和丙烯)和芳香族化合物(例如苯和二甲苯異構(gòu)體)。這些原材料來源于原油中較長鏈的碳?xì)浠衔?，這是通過以相當(dāng)大的費用使用各種方法，例如催化裂化、蒸汽裂化或催化重整，裂化原油。這些原材料用于制造不能直接從原油提煉的石化產(chǎn)品，例如單體、溶劑、去垢劑或粘合劑。來源于原油的原材料的一個實例是乙烯。乙烯被用于生產(chǎn)石化產(chǎn)品，例如聚乙烯、乙醇、氧化乙烯、乙二醇、聚酯、乙二醇醚、乙氧基化物、乙酸乙烯酯、1,2-二氯乙烷、三氯乙烯、四氯乙烯、氯乙烯和聚氯乙烯。原材料的其他實例是丙烯，丙烯用于生產(chǎn)異丙醇、丙烯腈、聚丙烯、氧化丙烯、丙烯二醇、乙二醇醚、丁烯、異丁烯、1,3-丁二烯、合成橡膠、聚烯烴、α-烯烴、脂肪醇、丙烯酸、丙烯聚合物、氯化丙烯、環(huán)氧氯丙烷和環(huán)氧樹脂。然后，這些石化產(chǎn)品可以用于制造特種化學(xué)品，例如塑料、樹脂、纖維、橡膠、藥品、潤滑劑或凝膠?？梢援a(chǎn)自石化材料的具體特種化學(xué)品為：脂肪酸、碳?xì)浠衔?例如長鏈、支鏈、飽和的、不飽和的等)、脂肪醇、酯、脂肪醛、酮、潤滑劑等。特種化學(xué)品具有很多商業(yè)用途。脂肪酸在商業(yè)上被用作表面活性劑，例如在去垢劑和肥皂中。它們還可以被用作燃料中的添加劑、潤滑油、涂料、漆、蠟燭、色拉油、起酥油、化妝品和乳化劑。此外，在橡膠產(chǎn)品中脂肪酸被用作促進(jìn)劑活性劑。脂肪酸還可以被用作生產(chǎn)甲基酯、酰胺、胺、?；?、酐、乙烯酮二聚物以及過氧酸和酯的原料。碳?xì)浠衔锞哂泻芏嗌虡I(yè)用途。例如鏈較短的烷被用作燃料。甲烷和乙烷是天然氣的主要成分。鏈較長的烷(例如5至16個碳)被用作運輸燃料(例如汽油、柴油或航空燃料)。具有多于16個碳原子的烷是燃油和潤滑油的重要組分。即使在室溫下為固體的較長的烷也可以被用作，例如石蠟。含有約35個碳的烷見于用于路面(roadsurfacing)的瀝青中。此外，可以裂化較長鏈的烷以生產(chǎn)商業(yè)上有用的較短鏈的碳?xì)浠衔铩Ｅc短鏈烷類似，短鏈烯被用于運輸燃料中。較長鏈的烯被用于塑料、潤滑劑和合成潤滑劑中。此外，烯被用作生產(chǎn)醇類、酯、增塑劑、表面活性劑、叔胺、增強(qiáng)型采油劑(enhancedoilrevoveryagent)、脂肪酸、硫醇、烯基琥珀酸酐、環(huán)氧化物、氯化烷、氯化烯、蠟、燃油添加劑和粘性流減阻劑。脂肪醇具有很多商業(yè)用途。鏈較短的脂肪醇在化妝品和食品工業(yè)中，用作乳化劑、潤滑劑和增稠劑。由于其兩性分子屬性，脂肪醇起非離子表面活性劑的作用，所述非離子表面活性劑可用作去垢劑。此外，脂肪醇被用于蠟、樹膠、樹脂、藥物軟膏和洗劑、潤滑油添加劑、紡織品抗靜電和整理劑、增塑劑、化妝品、工業(yè)溶劑和脂肪溶劑中。酯具有很多商業(yè)用途。例如作為替代燃料的生物柴油是由酯(例如脂肪酸甲基酯、脂肪酸乙基酯等)組成。一些低分子量的酯是揮發(fā)性的，具有令人愉悅的氣味，這使得它們可用作芳香劑或調(diào)味劑。另外，酯被用作漆、涂料和清漆的溶劑。此外，一些天然存在的物質(zhì)，例如蠟、脂肪和油是由酯組成的。酯還被用作樹脂和塑料中的軟化劑、增塑劑、滅火劑以及汽油和油中的添加劑。此外，酯可以用于制造聚合物、膠片、紡織品、染料和藥品。醛用于生產(chǎn)很多特種化學(xué)品。例如，醛用于生產(chǎn)聚合物、樹脂(例如膠木(Bakelite))、染料、調(diào)味劑、增塑劑、香水、藥品和其他化學(xué)品。一些被用作溶劑、防腐劑或消毒劑。一些天然和合成的化合物，例如維生素和激素是醛。此外，很多糖含有醛基。酮在商業(yè)上被用作溶劑。例如，丙酮常常被用作溶劑，但其也是制造聚合物的原材料。酮還用于漆、涂料、爆炸物、香水和紡織品加工中。此外，酮用于生產(chǎn)醇、烯、烷、亞胺和烯胺。此外，原油是潤滑劑的來源。來自石油的潤滑劑通常由烯烴組成，特別是聚烯烴和α-烯烴。潤滑劑可以從原油提煉或使用提煉自原油的原材料生產(chǎn)。從原油獲得這些特種化學(xué)品需要大量的金融投資以及大量的能量。因為原油中的長鏈碳?xì)浠衔锍３１涣鸦援a(chǎn)生較小的單體，其也是低效的過程。這些單體然后被用作生產(chǎn)更復(fù)雜的特種化學(xué)品的原材料。除勘探、開采、運輸和提煉石油的問題外，石油是有限的并逐漸減少的資源。估計世界石油消耗為每年300億桶。據(jù)估計，以現(xiàn)有生產(chǎn)水平，世界石油儲量預(yù)計在2050年前會耗竭。最后，基于石油的燃料的燃燒釋放溫室氣體(例如二氧化碳)和其他形式的空氣污染(例如一氧化碳、二氧化硫等)。隨著世界對燃料需求的增加，溫室氣體和其他形式的空氣污染的排放也增加。大氣中溫室氣體的累積導(dǎo)致增加全球變暖。因此，除局部破壞環(huán)境外(例如油泄漏、海洋環(huán)境的挖掘等)，燃燒石油還破壞全球環(huán)境。由于石油所引起的內(nèi)在挑戰(zhàn)，存在對于不需要像石油一樣被勘探、開采、長距離運輸或大量提煉的可再生石油資源的需要。存在對于可以經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)而不會產(chǎn)生石油工業(yè)和基于石油的燃料的燃燒所產(chǎn)生的類型的環(huán)境破壞的可再生石油資源?；谙嗨圃?，還存在對于通常來自石油的化學(xué)品的可再生資源的需要。發(fā)明概述本發(fā)明至少部分基于編碼碳?xì)浠衔锷锖铣啥嚯牡乃{(lán)細(xì)菌基因的鑒定。因此，在一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏姆椒?，所述方法包括在宿主?xì)胞中產(chǎn)生包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽或其變體，并從所述宿主細(xì)胞分離所述碳?xì)浠衔?。在一些實施方案中，所述多肽包含與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36具有至少約70％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽包含具有一個或多個氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在其他實施方案中，所述多肽包含具有一個或多個保守型氨基酸取代的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。例如，所述多肽包含一個或多個以下保守型氨基酸取代：諸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替換；絲氨酸被蘇氨酸替換；蘇氨酸被絲氨酸替換；諸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性殘基被另一酸性殘基替換；諸如天冬酰胺和谷氨酰胺的攜帶酰胺基的殘基被另一攜帶酰胺基的殘基替換；諸如賴氨酸和精氨酸的堿性殘基被另一堿性殘基交換；以及諸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族殘基被另一芳香族殘基替換。在一些實施方案中，所述多肽具有約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多的氨基酸取代、添加、插入或缺失。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在其他實施方案中，所述多肽包含以下的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:37或SEQIDNO:38或SEQIDNO:39；或(ii)SEQIDNO:40以及(a)SEQIDNO:37、(b)SEQIDNO:38和(c)SEQIDNO:39中的任一個；或(iii)SEQIDNO:41或SEQIDNO:42或SEQIDNO:43或SEQIDNO:44。在某些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在另一方面，本發(fā)明特征為產(chǎn)生碳?xì)浠衔锏姆椒?，所述方法包括在宿主?xì)胞中表達(dá)多核苷酸，所述多核苷酸包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35。在一些實施方案中，所述方法還包含從所述宿主細(xì)胞分離所述碳?xì)浠衔?。在其他實施方案中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如，在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高的嚴(yán)緊性條件下。在其他實施方案中，所述核苷酸序列編碼包含以下的多肽：(i)SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列；或(ii)具有一個或多個氨基酸取代、添加、插入或缺失的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽包含具有一個或多個保守型氨基酸取代的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在其他實施方案中，所述核苷酸序列編碼與包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽具有相同生物活性的多肽。在一些實施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35，或其片段。在其他實施方案中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的互補(bǔ)物或其片段雜交，例如在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高的嚴(yán)緊性條件下。在一些實施方案中，所述生物活性是脫羰酶活性。在一些實施方案中，所述方法包括用重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，所述重組載體包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述重組載體還包含可操作地連接到所述核苷酸序列的啟動子。在一些實施方案中，所述啟動子是發(fā)育調(diào)節(jié)性、細(xì)胞器特異性、組織特異性、誘導(dǎo)型、組成型或細(xì)胞特異性啟動子。在具體實施方案中，所述重組載體包含至少一個選自以下的序列：(a)可操作地連接到所述核苷酸序列的調(diào)節(jié)序列；(b)可操作地連接到所述核苷酸序列的選擇標(biāo)記；(c)可操作地連接到所述核苷酸序列的標(biāo)記序列；(d)可操作地連接到所述核苷酸序列的純化部分；(e)可操作地連接到所述核苷酸序列的分泌序列；和(f)可操作地連接到所述核苷酸序列的引導(dǎo)序列(targetingsequence)。在某些實施方案中，所述核苷酸序列被穩(wěn)定并入所述宿主細(xì)胞的基因組DNA，并且所述核苷酸序列的表達(dá)受可調(diào)型啟動子區(qū)的控制。在本文所述的任何方面中，所述宿主細(xì)胞可以選自哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、真菌細(xì)胞、絲狀真菌細(xì)胞和細(xì)菌細(xì)胞。在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞是革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞。在其他實施方案中，所述宿主細(xì)胞是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞。在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞選自以下的屬：埃希氏菌屬(Escherichia)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、紅球菌屬(Rhodococcus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、曲霉屬(Aspergillus)、木霉屬(Trichoderma)、鏈孢霉屬(Neurospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、根毛霉屬(Rhizomucor)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、畢赤酵母屬(Pichia)、毛霉菌屬(Mucor)、蝕絲霉屬(Myceliophtora)、青霉屬(Penicillium)、平革菌屬(Phanerochaete)、側(cè)耳屬(Pleurotus)、栓菌屬(Trametes)、金黃孢子菌屬(Chrysosporium)、酵母屬(Saccharomyces)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophamonas)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、耶氏酵母屬(Yarrowia)或鏈霉菌屬(Streptomyces)。在具體實施方案中，所述宿主細(xì)胞為遲緩芽孢桿菌(Bacilluslentus)細(xì)胞、短芽孢桿菌(Bacillusbrevis)細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)細(xì)胞、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalkalophilus)細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacilluscirculans)細(xì)胞、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilis)細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌(Bacillusclausii)細(xì)胞、巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)細(xì)胞、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)細(xì)胞或解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)細(xì)胞。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞為康氏木霉(Trichodermakoningii)細(xì)胞、綠色木霉(Trichodermaviride)細(xì)胞、里氏木霉(Trichodermareesei)細(xì)胞、長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)細(xì)胞、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)細(xì)胞、煙曲霉(Aspergillusfumigates)細(xì)胞、臭曲霉(Aspergillusfoetidus)細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)細(xì)胞、黑曲霉(Aspergillusniger)細(xì)胞、米曲霉(Aspergillusoryzae)細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉(Humicolainsolens)細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉(Humicolalanuginose)細(xì)胞、混濁紅球菌(Rhodococcusopacus)細(xì)胞、米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)細(xì)胞或米黑毛酶(Mucormichei)細(xì)胞。在其他實施方案中，所述宿主細(xì)胞是淺青紫鏈霉菌(Streptomyceslividans)細(xì)胞或鼠灰鏈霉菌(Streptomycesmurinus)細(xì)胞。在其他實施方案中，宿主細(xì)胞是放線菌(Actinomycetes)細(xì)胞。在一些實施方案中，所述宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Cv1細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞。在具體實施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞、例如菌株B、菌株C、菌株K或菌株W大腸桿菌細(xì)胞。在其他實施方案中，所述宿主細(xì)胞是藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞。在具體實施方案中，所述藍(lán)細(xì)菌宿主細(xì)胞是表1中列出的細(xì)胞。在一些實施方案中，所述碳?xì)浠衔镉伤鏊拗骷?xì)胞分泌在某些實施方案中，所述宿主細(xì)胞超表達(dá)本文所述的底物。在一些實施方案中，所述方法還包括用編碼本文所述的酶的核酸轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并且所述宿主細(xì)胞超表達(dá)本文所述的底物。在其他實施方案中，所述方法還包括在至少一種本文所述的底物的存在下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，所述底物是脂肪酸衍生物、?；鵄CP、脂肪酸、?；鵆oA、脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。在一些實施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是不飽和脂肪酸衍生物底物、單不飽和脂肪酸衍生物底物或飽和脂肪酸衍生物底物。在其他實施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是直鏈脂肪酸衍生物底物、支鏈脂肪酸衍生物底物或包括環(huán)狀部分的脂肪酸衍生物底物。在本文所述的方面的某些實施方案中，所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锸峭?。在一些實施方案中，所述烷是C3-C25烷。例如，所述烷是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烷。在一些實施方案中，所述烷是十三烷、甲基十三烷、十九烷、甲基十九烷、十七烷、甲基十七烷、十五烷或甲基十五烷。在一些實施方案中，所述烷是直鏈烷、支鏈烷或環(huán)狀烷。在某些實施方案中，所述方法還包括在飽和脂肪酸衍生物的存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并且所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锸峭?。在某些實施方案中，所述飽和脂肪酸衍生物是C6-C26脂肪酸衍生物底物。例如，所述脂肪酸衍生物底物是C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26脂肪酸衍生物底物。在具體實施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是2-甲基二十烷醛、二十烷醛、十八烷醛、十四烷醛、2-甲基十八烷醛、硬脂醛或棕櫚醛。在一些實施方案中，所述方法還包括從所述宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基分離所述烷。在其他實施方案中，所述方法還包括裂化或提煉所述烷。在本文所述的方面的某些實施方案中，所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锸窍?。在一些實施方案中，所述烯是C3-C25烯。例如，所述烯是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烯。在一些實施方案中，所述烯是十五烯、十七烯、甲基十五烯或甲基十七烯。在一些實施方案中，所述烯是直鏈烯、支鏈烷或環(huán)狀烯。在某些實施方案中，所述方法還包括在不飽和脂肪酸衍生物的存在下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并且所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锸窍?。在某些實施方案中，所述不飽和脂肪酸衍生物是C6-C26脂肪酸衍生物底物。例如，所述脂肪酸衍生物底物是C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25或C26不飽和脂肪酸衍生物底物。在具體實施方案中，所述脂肪酸衍生物底物是十八烯醛、十六烯醛、甲基十六烯醛或甲基十八烯醛。在另一方面，本發(fā)明特征為遺傳改造的微生物，其包含穩(wěn)定并入所述微生物的基因組DNA的外源控制序列。在一個實施方案中，所述控制序列被整合到多核苷酸的上游，該多核苷酸包含與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少約70％的序列同一性的核苷酸序列。在一些實施方案中，所述核苷酸序列與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的序列同一性。在一些實施方案中，所述核苷酸序列是SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35。在一些實施方案中，所述多核苷酸對于所述微生物是內(nèi)源的。在一些實施方案中，所述微生物相對于野生型微生物表達(dá)水平增高的碳?xì)浠衔?。在一些實施方案中，所述微生物是藍(lán)細(xì)菌(cyanobacterium)。在另一方面，本發(fā)明特征為制造碳?xì)浠衔锏姆椒?，所述方法包括在適于基因表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本文所述的遺傳改造的微生物，并分離所述碳?xì)浠衔?。在另一方面，本發(fā)明特征為制造碳?xì)浠衔锏姆椒?，所述方法包括使底物與以下接觸：(i)與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列具有至少70％的同一性的多肽或其變體；(ii)與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少70％的同一性的核苷酸序列所編碼的多肽或其變體；(iii)包含SEQIDNO:37、38或39的氨基酸序列的多肽；(iv)包含SEQIDNO:40以及(a)SEQIDNO:37、(b)SEQIDNO:38和(c)SEQIDNO:39中的任一個的氨基酸序列的多肽；或(v)SEQIDNO:41、42、43或44。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在一些實施方案中，所述多肽與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36具有至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的同一性。在一些實施方案中，所述多肽具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列。在一些實施方案中，所述多肽由與SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的序列同一性的核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，所述多肽由具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸序列編碼。在一些實施方案中，所述生物底物是脂肪酸衍生物、?；鵄CP、脂肪酸、?；鵆oA、脂肪醛、脂肪醇或脂肪酯。在一些實施方案中，所述底物是飽和脂肪酸衍生物，并且所述碳?xì)浠衔锸峭?，例如C3-C25烷。例如，所述烷是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烷。在一些實施方案中，所述烷是十三烷、甲基十三烷、十九烷、甲基十九烷、十七烷、甲基十七烷、十五烷或甲基十五烷。在一些實施方案中，所述烷是直鏈烷、支鏈烷或環(huán)狀烷。在一些實施方案中，所述飽和脂肪酸衍生物是2-甲基二十烷醛、二十烷醛、十八烷醛、十四烷醛、2-甲基十八烷醛、硬脂醛或棕櫚醛。在其他實施方案中，所述生物底物是不飽和脂肪酸衍生物，并且所述碳?xì)浠衔锸窍鏑3-C25烯。例如，所述烯是C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24或C25烯。在一些實施方案中，所述烯是十五烯、十七烯、甲基十五烯或甲基十七烯。在一些實施方案中，所述烯是直鏈烯、支鏈烷或環(huán)狀烯。在一些實施方案中，所述不飽和脂肪酸衍生物是十八烯醛、十六烯醛、甲基十六烯醛或甲基十八烯醛。在另一方面，本發(fā)明特征為由本文所述的任何方法或微生物所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔铩Ｔ诰唧w實施方案中，所述碳?xì)浠衔锸铅?3C為約-15.4或更高的烷或烯。例如，所述烷或烯的為δ13C約-15.4至約-10.9，例如約-13.92至約-13.84。在其他實施方案中，所述烷或烯的fM14C為至少約1.003。例如，所述烷或烯的fM14C為至少約1.01或至少約1.5。在一些實施方案中，所述烷或烯的fM14C為約1.111至約1.124。在另一方面，本發(fā)明特征為包括由本文所述的任何方法或微生物所產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏纳锶剂?。在具體實施方案中，所述碳?xì)浠衔锸铅?3C為約-15.4或更高的烷或烯。例如，所述烷或烯的δ13C為約-15.4至約-10.9，例如約-13.92至約-13.84。在其他實施方案中，所述烷或烯具有至少約1.003的fM14C。例如，所述烷或烯的fM14C為至少約1.01或至少約1.5。在一些實施方案中，所述烷或烯的fM14C為約1.111至約1.124。在一些實施方案中，所述生物燃料是柴油、汽油或噴氣燃料(jetfuel)。在另一方面，本發(fā)明特征為由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的不多于約500個核苷酸組成的分離的核酸。在一些實施方案中，所述核酸由SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的不多于約300個核苷酸、不多于約350個核苷酸、不多于約400個核苷酸、不多于約450個核苷酸、不多于約550個核苷酸、不多于約600個核苷酸或不多于約650個核苷酸組成。在一些實施方案中，所述核酸編碼具有脫羰酶活性的多肽。在另一方面，本發(fā)明特征為由不多于約99％、不多于約98％、不多于約97％、不多于約96％、不多于約95％、不多于約94％、不多于約93％、不多于約92％、不多于約91％、不多于約90％、不多于約85％或不多于約80％的SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸組成的分離的核酸。在一些實施方案中，所述核酸編碼具有脫羰酶活性的多肽。在另一方面，本發(fā)明特征為由SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的不多于約200、不多于約175、不多于約150或不多于約100個氨基酸組成的分離的多肽。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。在另一方面，本發(fā)明特征為由不多于約99％、不多于約98％、不多于約97％、不多于約96％、不多于約95％、不多于約94％、不多于約93％、不多于約92％、不多于約91％、不多于約90％、不多于約85％或不多于約80％的SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸組成的分離的多肽。在一些實施方案中，所述多肽具有脫羰酶活性。定義在整個本說明書中，可以使用縮寫基因名稱或多肽名稱進(jìn)行引用，但是應(yīng)當(dāng)理解到，該縮寫基因或多肽名稱表示基因或多肽的種類。這些基因名稱包括編碼相同多肽和具有相同生理功能的同源多肽的所有基因。多肽名稱包括具有相同活性(例如催化相同基礎(chǔ)化學(xué)反應(yīng)活性)的所有多肽。本文引用的登錄號來自美國國立衛(wèi)生研究院(NationalInstituteofHealth,U.S.A)所維護(hù)的NCBI數(shù)據(jù)庫(國家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation))。除非另作說明，登錄號按照截止到2009年四月的數(shù)據(jù)庫中提供的。EC號由國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)盟命名委員會(NomenclatureCommitteeoftheInternationalUnionofBiochemistryandMolecularBiology(NC-IUBMB))(可獲取自http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/)制定。本文引用的EC號來自由東京大學(xué)部分資助的京都基因與基因組百科全書(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomics)所維護(hù)的KEGG配體數(shù)據(jù)庫。除非另作說明，EC號按照截止到2008年三月的數(shù)據(jù)庫中提供的。本文所用冠詞“a”和“an”是指該冠詞的一個或多于一個(即至少一個)語法對象。作為實例，“元件(anelement)"表示一個元件或多于一個元件。本文所用術(shù)語“約”表示給定數(shù)值的±20％的值。因此，“約60％”表示在60±(60的20％)之間的值(即48至70)。如本文所用術(shù)語“醛”表示具有通式RCHO的碳?xì)浠衔?，所述RCHO特征為不飽和羰基(C＝O)。在優(yōu)選的實施方案中，所述醛是產(chǎn)生自脂肪酸或脂肪酸衍生物的任何醛。在一個實施方案中，R基長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個碳。如本文所用的“醛生物合成基因”或“醛生物合成多核苷酸”是編碼醛生物合成多肽的核酸。如本文所用的“醛生物合成多肽”是作為醛的生物合成途徑的部分的多肽。這些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生醛。在一些情況下，所述醛生物合成多肽具有還原酶活性。如本文所用的術(shù)語“烷”表示僅含有單一碳-碳鍵的碳?xì)浠衔?。如本文所用的“烷生物合成基因”或“烷生物合成多核苷酸”是編碼烷生物合成多肽的核酸。如本文所用的“烷生物合成多肽”是作為烷的生物合成途徑的部分的多肽。這些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生烷。在一些情況下，所述烷生物合成多肽具有脫羰酶活性。如本文所用的“烯生物合成基因”或“烯生物合成多核苷酸”是編碼烯生物合成多肽的核酸。如本文所用的“烯生物合成多肽”是作為烯的生物合成途徑的部分的多肽。這些多肽可以作用于生物底物以產(chǎn)生烯。在一些情況下，所述烯生物合成多肽具有脫羰酶活性。如本文所用的術(shù)語“減弱”表示削弱、降低或縮小。例如，可以通過修飾多肽來減弱多肽以降低其活性(例如，通過修飾編碼所述多肽的核苷酸序列)。如本文所用的術(shù)語“生物柴油”表示可以作為來源于石油的柴油的替代品的生物燃料。生物柴油可以以被稱為“純(neat)”生物柴油的純品形式或作為以任何濃度與基于石油的柴油的混合物用于內(nèi)燃柴油發(fā)動機(jī)。生物柴油可以包括酯或碳?xì)浠衔铮缛┖屯?。如其中所用的術(shù)語“生物燃料”是指來源于生物量的任何燃料。生物燃料可以替代基于石油的燃料。例如，生物燃料包括運輸工具燃料(例如汽油、柴油、噴氣燃料(jetfuel)等)、燃用燃料和發(fā)電燃料。生物燃料是可再生能源。如本文使用，術(shù)語“生物量”是指來源于生物材料的碳源。生物量可以被轉(zhuǎn)變?yōu)樯锶剂?。生物量的一個示例性來源是植物物質(zhì)。例如，玉米、甘蔗或柳枝稷可以用作生物量。生物量的另一非限制性實例是動物物質(zhì)，例如牛糞。生物量還包括來自工業(yè)、農(nóng)業(yè)、林業(yè)和家庭的廢品?？梢杂米魃锪康倪@些廢品的實例是發(fā)酵廢渣、秸稈、無用雜物、污水、垃圾和剩余食物。生物量還包括例如碳水化合物(例如單糖、二糖或多糖)的碳源。如本文所用的短語“碳源”是指適于用作原核或簡單真核細(xì)胞生長的碳的來源的底物或化合物。碳源可以是不同形式的，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和氣體(例如CO和CO2)。這些包括，例如各種單糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如木糖和阿拉伯糖；二糖，例如蔗糖、麥芽糖和松二糖；纖維素原料，例如甲基纖維素和羧甲基纖維素鈉；飽和或不飽和脂肪酸酯，例如琥珀酸酯、乳酸酯和醋酸酯；醇，例如乙醇或其混合物。碳源還可以是光合作用的產(chǎn)物，包括但不限于葡萄糖。優(yōu)選的碳源是生物量。另一優(yōu)選的碳源是葡萄糖。如本文所用的“降低濁點的添加劑”是添加到組合物以減少或降低溶液的濁點的添加劑。如本文所用的短語“液體的濁點”表示溶解的固體不再完全可溶的溫度。在該溫度下，固體開始作為第二相沉淀，給予液體渾濁的外觀。在石油工業(yè)中，濁點是指這樣的溫度：在該溫度下固化物質(zhì)或其他重碳?xì)浠衔镌谠?、提煉油或燃料中結(jié)晶以形成渾濁的外觀。固化物質(zhì)的存在影響該液體的流動特性、該液體堵塞燃料過濾器、噴嘴的傾向等、固化物質(zhì)在冷表面(例如管道或熱交換器污垢)上的聚積以及該液體與水的乳化特性。如果兩個序列的每個堿基都匹配(即能夠形成WatsonCrick堿基對)，則核苷酸序列與另一核苷酸序列是“互補(bǔ)的”。術(shù)語“互補(bǔ)鏈”在本文中與術(shù)語“互補(bǔ)物”互換使用。核酸鏈的互補(bǔ)物可以是編碼鏈的互補(bǔ)物或非編碼鏈的互補(bǔ)物。如本文所用的術(shù)語“足以允許表達(dá)的條件”表示允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生諸如本文所述的多肽、醛或烷的所需產(chǎn)物的任何條件。合適的條件包括，例如發(fā)酵條件。發(fā)酵條件可以包含很多參數(shù)，例如溫度范圍、通氣水平和培養(yǎng)基組分。這些條件中每一個單獨地并聯(lián)合地允許宿主細(xì)胞生長。示例性培養(yǎng)基包括培養(yǎng)液或膠。通常，所述培養(yǎng)基包括諸如葡萄糖、果糖、纖維素等的碳源，該碳源可以直接被宿主細(xì)胞代謝。此外，培養(yǎng)基中可以使用酶以便于動員(例如淀粉或纖維素的解聚為可發(fā)酵的糖)和隨后碳源的代謝。為了確定條件是否足以允許表達(dá)，可以將宿主細(xì)胞培養(yǎng)例如約4、8、12、24、36或48小時。培養(yǎng)中和/或培養(yǎng)后，可以獲取樣品并分析樣品以確定該條件是否允許表達(dá)。例如，可以測試樣品或宿主細(xì)胞在其中生長的培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞的所需產(chǎn)物的存在。當(dāng)測試產(chǎn)物的存在時，可以使用諸如但不限于TLC、HPLC、GC/FID、GC/MS、LC/MS、MS的檢測。應(yīng)當(dāng)理解到，本文所述的多肽可以具有另外的對于多肽功能沒有本質(zhì)影響的保守型或非必需氨基酸取代。特定取代是否會被允許(即不會不利地影響例如脫羧酶活性的所需生物性質(zhì))，可以按照Bowieetal.,Science(1990)247:13061310中所述進(jìn)行測定?！氨Ｊ匦桶被崛〈笔前被釟埢痪哂邢嗨苽?cè)鏈的氨基酸殘基所替代的取代。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族在本領(lǐng)域中已有定義。這些家族包括具有以下側(cè)鏈的氨基酸：堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電荷的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。如本文所用的“控制元件”表示轉(zhuǎn)錄控制元件?？刂圃▎幼雍驮鰪?qiáng)子。術(shù)語“啟動子元件”、“啟動子”或“啟動子序列”是指作為激活基因表達(dá)的開關(guān)發(fā)揮功能的DNA序列。如果基因被激活，認(rèn)為其被轉(zhuǎn)錄或參與轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄涉及由基因合成mRNA。因此，啟動子充當(dāng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件并且還提供基因轉(zhuǎn)錄為mRNA的起始位點。控制元件與參與轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞蛋白特異性相互作用(Maniatisetal,Science236:1237,1987)。如本文所用的術(shù)語“酯合酶”表示能夠產(chǎn)生脂肪酯的肽。更具體而言，酯合酶是將硫酯轉(zhuǎn)變?yōu)橹觉サ碾?。在?yōu)選的實施方案中，所述酯合酶將硫酯(例如?；鵆oA)轉(zhuǎn)變?yōu)橹觉ァＴ诳蛇x的實施方案中，酯合酶使用硫酯和醇作為底物產(chǎn)生脂肪酯。酯合酶能夠使用短和長鏈硫酯作為底物。此外，酯合酶能夠使用短和長鏈醇作為底物。酯合酶的非限制性實例是蠟合酶、蠟酯合酶、?；鵆oA:醇轉(zhuǎn)酰酶、?；D(zhuǎn)移酶和脂肪酰輔酶A:脂肪醇?；D(zhuǎn)移酶。示例性的酯合酶被分在酶分類號EC2.3.1.75中。示例性的GenBank登錄號提供于圖40中。如本文使用，術(shù)語“脂肪酸”表示具有通式RCOOH的羧酸。R表示脂肪族基團(tuán)，優(yōu)選地表示烷基。R可以包含約4到約22個碳原子。脂肪酸可以為飽和的、單不飽和的或多不飽和的。在優(yōu)選的實施方案中，所述脂肪酸由脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。如本文所用的術(shù)語“脂肪酸生物合成途徑”表示產(chǎn)生脂肪酸的生物合成途徑。所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸酶，所述脂肪酸酶可以按照本文所述經(jīng)改造產(chǎn)生脂肪酸，并且在一些實施方案中可以與其他酶一起表達(dá)以產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪酸。如本文所用的術(shù)語“脂肪酸衍生物”表示部分地產(chǎn)生于生產(chǎn)宿主生物體的脂肪酸生物合成途徑的產(chǎn)物?！爸舅嵫苌铩边€包括部分地產(chǎn)生于?；鵄CP或?；鵄CP衍生物的產(chǎn)物。所述脂肪酸生物合成途徑包括脂肪酸合酶酶類，所述脂肪酸合酶酶類可以按照本文所述經(jīng)改造產(chǎn)生脂肪酸衍生物，并且在一些實施例中可以與其他酶一起表達(dá)以產(chǎn)生具有所需碳鏈特征的脂肪酸衍生物。示例性的脂肪酸衍生物包括，例如脂肪酸、酰基CoA、脂肪醛、短和長鏈醇、碳?xì)浠衔?、脂肪醇和?例如蠟、脂肪酸酯或脂肪酯)。如本文所用的術(shù)語“脂肪酸衍生酶”表示在脂肪酸衍生物的產(chǎn)生中可以被表達(dá)或超表達(dá)的所有酶。這些酶在本文統(tǒng)稱為脂肪酸衍生酶。這些酶可以是脂肪酸生物合成途徑的一部分。脂肪酸衍生酶的非限制性實例包括脂肪酸合酶、硫酯酶、?；鵆oA合酶、?；鵆oA還原酶、醇脫氫酶、醇酰基轉(zhuǎn)移酶、脂肪醇形成?；鵆oA還原酶、酯合酶、醛生物合成多肽和烷生物合成多肽。脂肪酸衍生酶將底物轉(zhuǎn)變?yōu)橹舅嵫苌铩Ｔ谝恍嵤├?，所述底物可以是被脂肪酸衍生酶轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌闹舅嵫苌锏闹舅嵫苌铩Ｈ绫疚乃玫男g(shù)語“脂肪醇形成肽”表示能夠催化?；鵆oA轉(zhuǎn)變?yōu)橹敬嫉碾?，包括脂肪醇形成酰基CoA還原酶(FAR，EC1.1.1.*)、酰基CoA還原酶(EC1.2.1.50)或醇脫氫酶(EC1.1.1.1)。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，一些脂肪醇形成肽還會催化其他反應(yīng)。例如，除脂肪酸外，一些?；鵆oA還原酶肽會接受其他底物。因此，還包括這些非特異性肽。編碼脂肪醇形成肽的核酸序列是本領(lǐng)域已知的，并且這些肽是可公開獲取的。示例性的GenBank登錄號提供于圖40中。如本文所用的“脂肪酸酶”表示參與脂肪酸生物合成的任何酶。脂肪酸酶可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)或超表達(dá)以產(chǎn)生脂肪酸。脂肪酸酶的非限制性實例包括脂肪酸合酶和硫酯酶。如本文所用的術(shù)語“脂肪酯”表示酯。在優(yōu)選的實施方案中，脂肪酯是產(chǎn)生自脂肪酸的任何酯，例如脂肪酸酯。在一個實施方案中，脂肪酯含有A側(cè)(即連接于羧基氧的碳鏈)和B側(cè)(即包含母體羧基的碳鏈)。在優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)所述脂肪酯來源于脂肪酸生物合成途徑時，A側(cè)由醇貢獻(xiàn)，并且B側(cè)由脂肪酸貢獻(xiàn)。任何醇可以用于形成脂肪酯的A側(cè)。例如，所述醇可以來自脂肪酸生物合成途徑。可選地，所述醇可以通過非脂肪酸生物合成途徑產(chǎn)生。此外，所述醇可以是外源提供的。例如，在脂肪酯是由生物體產(chǎn)生的情況下，所述醇可以提供在發(fā)酵液(fermentationbroth)中?？蛇x地，例如在脂肪酯是由還產(chǎn)生醇的生物體產(chǎn)生的情況下，諸如脂肪酸或乙酸的羧酸可以是外源提供的。包含A側(cè)或B側(cè)的碳鏈可以是任何長度。在一個實施方案中，酯的A側(cè)的長度為至少約1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16或18個碳。酯的B側(cè)的長度為至少約4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24或26個碳。A側(cè)和/或B側(cè)可以是直鏈或支鏈。支鏈可以具有一個或多個分支點。此外，支鏈可以包括環(huán)狀分支。而且，A側(cè)和/或B側(cè)可以是飽和的或不飽和的。如果是不飽和的，A側(cè)和/或B側(cè)可以具有一個或多個不飽和點。在一個實施方案中，脂肪酯是生物合成產(chǎn)生的。在該實施方案中，首先脂肪酸被“活化”。“活化的”脂肪酸的非限制性實例是?；鵆oA、?；鵄CP和酰基磷酸鹽。?；鵆oA可以是脂肪酸生物合成或降解的直接產(chǎn)物。此外，?；鵆oA可以由游離脂肪酸、CoA或三磷酸腺苷(ATP)合成。產(chǎn)生酰基CoA的酶的實例是?；鵆oA合酶。在脂肪酸被活化后，其可以被容易地轉(zhuǎn)移到接受體親核體。示例性的親核體為醇、硫醇或磷酸鹽。在一個實施方案中，脂肪酯是蠟。蠟可以來自長鏈醇和長鏈脂肪酸。在另一實施方案中，所述脂肪酯可以來自脂肪?；蝓ズ痛?。在另一實施方案中，所述脂肪酯是脂肪酸硫酯，例如脂肪酰輔酶A(CoA)。在其他實施方案中，所述脂肪酯是脂肪酰基泛酸酯、?；d體蛋白(ACP)或脂肪磷酸酯。脂肪酯具有很多用途。例如，脂肪酯可以被用作生物燃料。如本文所用的“現(xiàn)代碳比例(fractionofmoderncarbon)”或“fM”與分別由稱為草酸標(biāo)準(zhǔn)HOxI和HOxII的國家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院(NationalInstituteofStandardsandTechnology(NIST))標(biāo)準(zhǔn)參考物(SRMs)4990B和4990C所定義的具有相同意義?；径x涉及0.95倍的14C/12C同位素比例HOxI(參考AD1950)。這粗略地等于衰變校正的工業(yè)革命前樹木(decay-correctedpre-IndustrialRevolutionwood)。對于現(xiàn)今生命生物圈(植物物質(zhì))而言，fM約為1.1?？梢园凑找韵掠嬎銉蓚€序列之間“同源性”。序列以最佳比較目的進(jìn)行比對(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列之一或兩者中引入空位用于最佳比對，并且為了比較目的可以忽略非同源序列)。在優(yōu)選的實施方案中，用于比較目的的而比對的參考序列長度為參考序列長度的至少約30％、優(yōu)選地至少約40％、更優(yōu)選地至少約50％、更優(yōu)選地至少約60％并且更優(yōu)選地至少約70％、至少約80％、至少約90％或約100％。然后比較位于對應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝恍蛄兄械奈恢帽慌c第二序列中對應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時，則分子在該位置是相同的(如本文所用的，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。兩個序列之間的同一性百分比是序列所共享的相同位置數(shù)的函數(shù)，這考慮到空位數(shù)和每個空位的長度，為了兩個序列的最佳比對需要引入空位?？梢允褂脭?shù)學(xué)算法完成序列的比較和兩個序列之間同源性百分比的測定。在優(yōu)選的實施方案中，使用以下測定兩個氨基酸序列之間的同源性百分比：NeedlemanandWunsch(1970)、J.Mol.Biol.48:444453的算法，其被并入GCG軟件包中的GAP程序中，使用Blossum62矩陣或PAM250矩陣，以及16、14、12、10、8、6或4的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。在另一優(yōu)選的實施方案中，使用以下測定兩個核苷酸序列之間的同源性百分比：GCG軟件包中的GAP程序，使用NWSgapdna.CMP矩陣以及40、50、60、70或80的空位權(quán)重和1、2、3、4、5或6的長度權(quán)重。特別優(yōu)選的參數(shù)組(和如果操作者不確定應(yīng)當(dāng)應(yīng)用哪些參數(shù)確定分子是否在要求的同源性限制內(nèi)而應(yīng)該使用的參數(shù)組)是具有12的空位罰分、4的空位延伸罰分和5的移碼空位罰分的Blossum62評分矩陣。如本文所用的“宿主細(xì)胞”是用于產(chǎn)生本文所述的產(chǎn)物(例如本文所述的醛或烷)的細(xì)胞?？梢愿脑焖拗骷?xì)胞以表達(dá)或超表達(dá)所選擇的基因或具有所選擇的基因的減弱的表達(dá)。宿主細(xì)胞的非限制性實例包括植物、動物、人、細(xì)菌、酵母或絲狀真菌細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語“在低嚴(yán)緊性、中嚴(yán)緊性、高嚴(yán)緊性或非常高的嚴(yán)緊性條件下雜交”描述用于雜交和洗滌的條件。進(jìn)行雜交反應(yīng)的指導(dǎo)可以見于CurrentProtocolsinMolecularBiology(現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗技術(shù)),JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6。該參考資料中描述了水性和非水性方法并且可以使用任一方法。本文涉及的具體雜交條件如下：1)低嚴(yán)緊性雜交條件在約45℃下、在6×氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)中，然后是在至少50℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗滌兩次(對于低嚴(yán)緊性條件，洗滌溫度可以升至55℃)；2)中嚴(yán)緊性雜交條件在約45℃下在、在6×SSC中，然后是在60℃的0.2×SSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次；3)高嚴(yán)緊性雜交條件在約45℃的6×SSC中，然后是在65℃下、在0.2×SSC、0.1％SDS中洗滌一次或多次；以及優(yōu)選地4)非常高嚴(yán)緊性雜交條件為65℃的0.5M磷酸鈉、7％SDS，然后是在65℃下、在0.2×SSC、1％SDS中洗滌一次或多次。除非另作規(guī)定，非常高的嚴(yán)緊性條件(4)是優(yōu)選的條件。本文中涉及諸如DNA或RNA的核酸所用的術(shù)語“分離的”是指分別從所述核酸的天然來源中存在的其他DNA或RNA中隔離的分子。此外，“分離的核酸”包括核酸片段，例如不是天然存在的片段。本文所用的術(shù)語“分離的”還指從其他細(xì)胞蛋白分離的多肽，并且包括純化的內(nèi)源多肽和重組多肽兩者。當(dāng)核酸或多肽是通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生時，本文使用的術(shù)語“分離的”還指基本上游離于細(xì)胞物質(zhì)、病毒物質(zhì)或培養(yǎng)基的核酸或多肽。當(dāng)核酸或多肽是化學(xué)合成時，本文所用的術(shù)語“分離的”還指基本上游離于化學(xué)前體或其他化學(xué)品的核酸或多肽。如本文所用的“細(xì)胞中的基因表達(dá)水平”是指由所述細(xì)胞中基因編碼的mRNA、前體mRNA新生轉(zhuǎn)錄物、轉(zhuǎn)錄加工中間體、成熟mRNA和/或降解產(chǎn)物的水平。如本文所用的術(shù)語“微生物”表示來自古菌域、細(xì)菌域和真核域的原核和真核微生物種類，后者包括酵母和絲狀真菌、原生動物、藻類或高等原生生物。如本文所用的術(shù)語“微生物細(xì)胞”表示來自微生物的細(xì)胞。如本文所用的術(shù)語“核酸”是指多核苷酸，例如脫氧核糖核酸(DNA)以及適當(dāng)情況下，指核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還包括產(chǎn)生自核苷酸類似物的RNA或DNA的類似物，以及適用于所述實施方案的單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸、EST、染色體、cDNA、mRNA和rRNA。如本文所用的術(shù)語“可操作地連接”表示所選擇的核苷酸序列(例如編碼本文所述的多肽)與啟動子接近以允許所述啟動子調(diào)節(jié)該選擇的核苷酸序列的表達(dá)。此外，按照轉(zhuǎn)錄和翻譯的方向，所述啟動子位于所述選擇的核苷酸序列的上游?！翱刹僮鞯剡B接”表示將核苷酸序列和調(diào)節(jié)序列連接以便當(dāng)合適的分子(例如轉(zhuǎn)錄激活蛋白)與調(diào)節(jié)序列結(jié)合時允許基因表達(dá)。本文所用術(shù)語“或”表示術(shù)語“和/或”并且與術(shù)語“和/或”交換使用，除非上下文明確表示并非如此。如本文所用的“超表達(dá)”表示在細(xì)胞中以高于對應(yīng)野生型細(xì)胞中正常表達(dá)濃度的濃度表達(dá)核酸、多肽或碳?xì)浠衔锘蚴怪槐磉_(dá)。例如，當(dāng)在重組宿主細(xì)胞中多肽以與其在相同種類的非重組宿主細(xì)胞中的濃度相比更高的濃度存在時，所述多肽在所述重組宿主細(xì)胞中能夠“超表達(dá)”。如本文所用的“分配系數(shù)”或“P”定義為化合物在有機(jī)相中的平衡濃度除以在水相中(例如發(fā)酵液)平衡時的濃度。在本文所述的兩相系統(tǒng)的一個實施方案中，生產(chǎn)過程中所述有機(jī)相是由醛或烷形成的。但是，在一些實施例中，可以例如通過提供辛烷層來提供有機(jī)相以便于產(chǎn)物分離。當(dāng)描述兩相系統(tǒng)時，化合物的分配特性可以描述為logP。例如，logP為1的化合物會10:1分配到有機(jī)相。logP為-1的化合物會1:10分配到有機(jī)相。通過選擇合適的發(fā)酵液和有機(jī)相，具有高logP值的醛或烷在發(fā)酵容器中也會分離到有機(jī)相中，即使處于很低的濃度。如本文所用的術(shù)語“純化(purify)”、“純化的(purified)”或“純化(purification)”表示通過例如分離或隔離從分子的環(huán)境中移除或分離所述分子?！盎旧霞兓摹狈肿訛橹辽偌s60％、優(yōu)選地至少約75％以及更優(yōu)選地至少約90％游離于與其相關(guān)的其他組分。如本文所用的這些術(shù)語還指從樣品中去除污染物。例如，污染物的去除可以導(dǎo)致樣品中醛或烷的百分比增加。例如，當(dāng)醛或烷在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時，可以通過去除宿主細(xì)胞蛋白純化醛或烷。純化后，樣品中醛或烷的百分比增加。術(shù)語“純化(purify)”、“純化的(purified)”或“純化(purification)”不需要絕對純。它們是相對的術(shù)語。因此，例如當(dāng)醛或烷在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生時、純化的醛或純化的烷是基本與其他細(xì)胞組分(例如核酸、多肽、脂質(zhì)、碳水化合物或其他碳?xì)浠衔?隔離的醛或烷。在另一實施例中，純化的醛或純化的烷制劑是這樣的制劑，在該制劑中，所述醛或烷基本游離于例如可能存在于后續(xù)發(fā)酵的那些污染物。在一些實施方案中，當(dāng)樣品重量的至少約50％是由醛或烷組成時，所述醛或烷是純化的。在其他實施方案中，當(dāng)樣品重量的至少約60％、70％、80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％或更多是由醛或烷組成時，所述醛或烷是純化的。如本文使用，術(shù)語“重組多肽”是指通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的多肽，其中通常將編碼所表達(dá)的多肽或RNA的DNA插入合適的表達(dá)載體，并且所述表達(dá)載體接下來用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞以產(chǎn)生所述多肽或RNA。如本文所用的術(shù)語“基本相同”(或“基本同源”)是用于指含有足夠數(shù)量的與第二氨基酸或核苷酸序列相同或等同的(例如具有相似側(cè)鏈，例如保守氨基酸取代)氨基酸殘基或核苷酸的第一氨基酸或核苷酸序列，這樣所述第一和第二氨基酸或核苷酸序列具有相似活性。如本文所用的術(shù)語“合酶”表示催化合成過程的酶。如本文所用的術(shù)語合酶包括合酶、合成酶和連接酶。如本文所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)染”表示將核酸(例如通過表達(dá)載體)通過核酸介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移引入到受體細(xì)胞。如本文所用的“轉(zhuǎn)化”是指這樣的過程，在該過程中，細(xì)胞的基因型由于細(xì)胞攝入外源核酸而改變。這可以導(dǎo)致表達(dá)重組形式的RNA或多肽的轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在由轉(zhuǎn)移的基因反義表達(dá)的情況下，天然存在形式的多肽的表達(dá)被破壞。如本文使用，“轉(zhuǎn)運蛋白”是便于一種或多種化合物移入和/或移出細(xì)胞器和/或細(xì)胞的多肽。如本文所用，多肽X的“變體”是指具有多肽X的氨基酸序列的多肽，其中一個或多個氨基酸殘基被改變。所述變體可以具有保守型改變或非保守型改變。使用本領(lǐng)域熟知的計算機(jī)程序，例如LASERGENE軟件(DNASTAR)，可以找到確定哪些氨基酸殘基可以被取代、插入或缺失而不影響生物活性的指導(dǎo)。在用于多核苷酸序列的情況下，術(shù)語“變體”可以包括與基因或其編碼序列的多核苷酸序列相關(guān)的多核苷酸序列。該定義還可以包括，例如“等位基因”變體、“剪接”變體、“物種”變體或“多態(tài)性”變體。剪接變體可以與參考多核苷酸具有顯著的同一性，但是由于在mRNA加工中的可選的外顯子剪接，會通常具有更多或更少的多核苷酸數(shù)。對應(yīng)的多肽可以具有另外的功能結(jié)構(gòu)域或結(jié)構(gòu)域缺失。物種變體是在物種之間彼此不同的多核苷酸序列。得到的多肽通常會具有顯著的相對于彼此的氨基酸同一性。多態(tài)性變體是在給定物種的個體之間特定基因的多核苷酸序列中的變異。如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運另一核酸的核酸分子，所述核酸分子連接到所述另一核酸。一種有用的載體是附加體(即能夠染色體外的復(fù)制的核酸)。有用的載體是能夠自主復(fù)制和/或表達(dá)與其連接的核酸的那些載體。能夠指導(dǎo)基因的表達(dá)的載體在本文被稱為“表達(dá)載體”，所述載體被可操作地連接到所述基因。通常，在重組DNA技術(shù)中有用的表達(dá)載體經(jīng)常是“質(zhì)粒”的形式，所述“質(zhì)粒”通常是指在其載體形式時不與染色體結(jié)合的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。在本說明書中，因為質(zhì)粒是最通常使用的載體形式，所以“質(zhì)?！焙汀拜d體”是交換使用的。但是，還包括發(fā)揮等同功能并隨后至今成為本領(lǐng)域已知的表達(dá)載體的這些其他形式。除非另外限定，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的具有相同的意義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或測試，仍然在下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其他參考資料通過引用全文并入。如有沖突，以包括定義在內(nèi)的本說明書為準(zhǔn)。此外，材料、方法和實施例僅是舉例說明并不意圖限制。根據(jù)下文的詳細(xì)描述和權(quán)利要求，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢會清晰。附圖簡述圖1：上圖是海洋原綠球菌(Prochlorococcusmarinus)CCMP1986細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤；下圖是上圖的7.55分鐘時的峰的質(zhì)量裂解譜(massfragmentationpattern)。圖2：上圖是點狀念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocpunctiforme)PCC73102細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤；下圖是上圖的8.73分鐘時的峰的質(zhì)量裂解譜。圖3：上圖是無類囊體藍(lán)細(xì)菌(Gloeobaceterviolaceus)ATCC29082細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤；下圖是上圖的8.72分鐘時的峰的質(zhì)量裂解譜。圖4：上圖是集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocysticsp.)PCC6803細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤；下圖是上圖的7.36分鐘時的峰的質(zhì)量裂解譜。圖5A是集胞藍(lán)細(xì)菌(Synechocystissp.)PCC6803野生型細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖5B是具有sll0208和sll0209基因缺失的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖6A是大腸桿菌MG1655野生型細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖6B是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcuselongatus)PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖7是表達(dá)藍(lán)絲菌(Cyanothecesp.)ATCC51142cce_1430(YP_001802846)(SEQIDNO:69)的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖8A是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400610(Synpcc7942_1593)(SEQIDNO:1)的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖8B描述圖8A在6.98分鐘時的峰和十五烷的質(zhì)量裂解譜。圖8C描述圖8A在8.12分鐘時的峰和8-十七烯的質(zhì)量裂解譜。圖9是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP00108838)(SEQIDNO:5)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖10是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208(NP442147)(SEQIDNO:3)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖11是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和念珠藍(lán)細(xì)菌(Nostocsp.)PCC7210alr5283(NP489323)(SEQIDNO:7)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖12是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的海濱藍(lán)藻菌(Acaryochlorismarina)MBIC11017AM1_4041(YP_001518340)(SEQIDNO:46)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖13是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌(Thermosynechococcuselongatus)BP-1tll1313(NP_682103)(SEQIDNO:47)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖14是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌(Synechococcussp.)JA-3-3AbCYA_0415(YP_473897)(SEQIDNO:48)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖15是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146(NP926092)(SEQIDNO:15)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖16是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的海洋原綠球菌MIT9313PMT1231(NP895059)(SEQIDNO:49)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖17是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(NP892650)(SEQIDNO:19)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖18是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的海洋原綠球菌NATL2APMN2A_1863(YP_293054)(SEQIDNO:51)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖19表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_09941(ZP_01079772)(SEQIDNO:52)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖20是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和密碼子優(yōu)化的聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_12945(ZP_01080370)(SEQIDNO:53)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖21是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和藍(lán)絲菌ATCC51142cce_0778(YP_001802195)(SEQIDNO:27)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖22是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_0398(YP_002481151)(SEQIDNO:29)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖23是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_2986(YP_002483683)(SEQIDNO:31)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖24A是表達(dá)海洋原綠球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651)(SEQIDNO:71)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖24B是表達(dá)海洋原綠球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651)(SEQIDNO:71)和海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650)(SEQIDNO:19)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖25A是大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖25B是表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340)(SEQIDNO:9)的大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖26A是表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209(NP_442146)(SEQIDNO:67)的大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖26B是表達(dá)集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209(NP_442146)(SEQIDNO:67)和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208(NP_442147)(SEQIDNO:3)的大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖27A是表達(dá)恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)的大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖27B是表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖28是大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏膱D示，所述細(xì)胞單獨表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)或表達(dá)恥垢分枝桿菌菌株MC2155MSMEG_5739(YP_889972)(SEQIDNO:85)與以下的組合：念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7120alr5283(SEQIDNO:7)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)、海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917_12945(SEQIDNO:25)或海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)。圖29A是I型核糖核酸酶還原酶亞基β蛋白RNRβ的三維結(jié)構(gòu)展示。圖29B是海洋原綠球菌MIT9313PMT1231(NP_895059)(SEQIDNO:17)的三維結(jié)構(gòu)的展示。圖29C是海洋原綠球菌MIT9313PMT1231(NP_895059)(SEQIDNO:17)的活性位點三維結(jié)構(gòu)的展示。圖30A是表達(dá)點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖30B是表達(dá)點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)Y123F變體的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖30C是表達(dá)點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)Y126F變體的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖31描述了使用點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)和十八烷醛(A)；Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、十八烷醛、菠菜鐵氧還蛋白還原酶和NADPH(B)；十八烷醛、菠菜鐵氧還蛋白、菠菜鐵氧還蛋白還原酶和NADPH(C)；或Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、菠菜鐵氧還蛋白和菠菜鐵氧還蛋白(D)，體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖32描述了使用點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:6)、NADPH、十八烷醛和(A)菠菜鐵氧還蛋白和菠菜鐵氧還蛋白還原酶；(B)點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02001001(ZP_00111633)(SEQIDNO:90)；(C)Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003530(ZP_00109422)(SEQIDNO:92)；或(D)Npun02003626(ZP_00109192)(SEQIDNO:88)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003123(ZP_00109501)(SEQIDNO:94)，體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖33A是使用十八酰CoA、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)、NADH和Mg2+體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖33B是使用十八酰CoA、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)、NADPH和Mg2+體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖33C是使用十八酰CoA、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和NADPH體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖34A是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和未標(biāo)記的NADPH體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖34B是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和S-(4-2H)NADPH體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖34C是使用十八酰CoA、標(biāo)記的NADPH、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:66)和R-(4-2H)NADPH體外產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖35是由Che-9培養(yǎng)基中的表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的大腸桿菌MG1655ΔfadE細(xì)胞所產(chǎn)生的無細(xì)胞上清中碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖36是由Che-9培養(yǎng)基中的表達(dá)細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838)(SEQIDNO:5)的大腸桿菌MG1655ΔfadE細(xì)胞所產(chǎn)生的無細(xì)胞上清中碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖37是表達(dá)念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7120alr5283(NP_489323)(SEQIDNO:7)和念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7120alr5284(NP_489324)(SEQIDNO:81)的大腸桿菌MG1655細(xì)胞產(chǎn)生的碳?xì)浠衔锏腉C/MS追蹤。圖38是來自宏基因組數(shù)據(jù)庫的細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400610(Synpcc7942_1593)(SEQIDNO:1)的同系物的實例列表。圖39是來自宏基因組數(shù)據(jù)庫的細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942YP_400611(Synpcc7942_1594)(SEQIDNO:65)的同系物的實例列表。圖40是鑒定出可以被表達(dá)、超表達(dá)或減弱以增加特定底物的產(chǎn)生的各種基因的表。詳細(xì)描述本發(fā)明提供了從例如酰基ACP、脂肪酸、?；鵆oA、脂肪醛的底物或脂肪醇底物(例如PCT/US08/058788中所述的，在此通過引用特別并入)產(chǎn)生醛、脂肪醇和碳?xì)浠衔?例如烷、烯和炔)的組合物和方法。此類醛、烷和烯作為生物燃料(例如汽油、柴油、噴氣燃料等的替代品)、特種化學(xué)品(例如潤滑劑、燃料添加劑等)或用于后續(xù)化學(xué)轉(zhuǎn)變(例如，燃料、聚合物、塑料、紡織品、溶劑、粘合劑等)的原料是有用的。本發(fā)明部分地基于參與醛、烷和烯生物合成的基因的鑒定。這些烷和烯生物合成基因包括，例如細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942Synpcc7942_1593(SEQIDNO:1)、集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208(SEQIDNO:3)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)、念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7120alr5283(SEQIDNO:7)、海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)、細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌BP-1tll1313(SEQIDNO:11)、聚球藍(lán)細(xì)菌JA-3-3ACYA_0415(SEQIDNO:13)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、海洋原綠球菌MIT9313PM123(SEQIDNO:17)、狹義的海洋原綠球菌pastoris亞種(Prochlorococcusmarinussubsp.pastorisstr.)CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、狹義的海洋原綠球菌(Prochlorococcusmarinusstr.)NATL2APMN2A_1863(SEQIDNO:21)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_12945(SEQIDNO:25)、藍(lán)絲菌ATCC51142cce_0778(SEQIDNO:27)、藍(lán)絲菌PCC7245Cyan7425DRAFT_1220(SEQIDNO:29)、藍(lán)絲菌PCC7245cce_0778(SEQIDNO:31)、多變魚腥藍(lán)細(xì)菌(Anabaenavariabilis)ATCC29413YP_323043(Ava_2533)(SEQIDNO:33)和細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC6301YP_170760(syc0050_d)(SEQIDNO:35)。其他烷和烯生物合成基因在表1和圖38中列出。醛生物合成基因包括，例如細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942Synpcc7942_1594(SEQIDNO:65)、集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209(SEQIDNO:67)、藍(lán)絲菌ATCC51142cce_1430(SEQIDNO:69)、狹義的海洋原綠球菌pastoris亞種CCMP1986PMM0533(SEQIDNO:71)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421NP_96091(gll3145)(SEQIDNO:73)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102ZP_00108837(Npun02004176)(SEQIDNO:75)、多變魚腥藍(lán)細(xì)菌ATCC29413YP_323044(Ava_2534)(SEQIDNO:77)、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC6301YP_170761(syc0051_d)(SEQIDNO:79)和念珠藍(lán)絲菌PCC7120alr5284(SEQIDNO:81)。其他醛生物合成基因在表1和圖39中列出。使用本文所述的方法，使用一個或多個本文所述的醛、烷和/或烯生物合成基因或多肽或所述基因或多肽的變體，利用宿主細(xì)胞或無細(xì)胞方法，可以制備醛、脂肪醇、烷和烯。表1.藍(lán)細(xì)菌基因組中醛和烷生物合成基因同系物醛、烷和烯生物合成基因和變體本文所述的方法和組合物包括，例如具有SEQIDNO:1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33或35的核苷酸序列的烷或烯生物合成基因及其多核苷酸變體。在一些情況下，所述烷或烯生物合成基因編碼一個或多個本文所述的氨基酸基序。例如，所述烷或烯生物合成基因可以編碼包含SEQIDNO:37、38、39、41、42、43或44的多肽。所述烷或烯生物合成基因還可以包括包含SEQIDNO:40以及SEQIDNO:37、38或39中任一多肽。本文所述的方法和組合物還包括，例如具有SEQIDNO:65、67、69、71、73、75、77、79或81的核苷酸序列的醛生物合成基因及其多核苷酸變體。在一些情況下，所述醛生物合成基因編碼一個或多個本文所述的氨基酸基序。例如，所述醛生物合成基因可以編碼包含SEQIDNO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的多肽。變體可以是天然存在的或體外產(chǎn)生的。特別是，可以使用基因工程技術(shù)產(chǎn)生這些變體，例如定點誘變、隨機(jī)化學(xué)誘變、外切核酸酶III缺失操作和標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)?？蛇x地，可以使用化學(xué)合成或修飾操作產(chǎn)生這些變體、片段、類似物或衍生物。制造變體的方法是本領(lǐng)域熟知的。這些方法包括這樣的操作，在該操作中，修飾獲得自天然分離物的核酸序列以生成編碼多肽的核酸，所述多肽具有增強(qiáng)其在工業(yè)或?qū)嶒炇覒?yīng)用中的價值的特征。在這些操作中，生成并表征了相對于獲得自天然分離物的序列具有一個或多個核苷酸差異的大量變體序列。通常，這些核苷酸差異導(dǎo)致相對于來自天然分離物的核酸所編碼的多肽的氨基酸改變。例如，可以使用易錯PCR(參見，例如Leungetal.,Technique1:11-15,1989；和Caldwelletal.,PCRMethodsApplic.2:28-33,1992)產(chǎn)生變體。在易錯PCR中，在DNA聚合酶的復(fù)制保真度低的條件下進(jìn)行PCR，這樣沿著PCR產(chǎn)物的整個長度獲得了高效點突變。簡單地說，在這些操作中，將待誘變的核酸(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)與PCR引物、反應(yīng)緩沖液、MgCl2、MnCl2、Taq聚合酶和適當(dāng)濃度的dNTPs混合，以實現(xiàn)沿著PCR產(chǎn)物的整個長度的高效點突變。例如，可以使用20fmoles的待誘變的核酸(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)，30pmole的每種PCR引物，包含50mMKCl、10mMTrisHCl(pH8.3)和0.01％明膠的反應(yīng)緩沖液，7mMMgCl2，0.5mMMnCl2，5單位的Taq聚合酶，0.2mMdGTP，0.2mMdATP，1mMdCTP和1mMdTTP進(jìn)行反應(yīng)。PCR可以進(jìn)行30個以下循環(huán)：94℃持續(xù)1分鐘、45℃持續(xù)1分鐘和72℃持續(xù)1分鐘。但是，應(yīng)當(dāng)理解到這些參數(shù)可以視情況變化。然后，將誘變后的核酸克隆到合適的載體中并且評價所述誘變后的核酸編碼的多肽的活性。還可以使用寡核苷酸定向誘變以在任何目的克隆DNA中產(chǎn)生位點特異性突變來產(chǎn)生變體。寡核苷酸誘變描述于，例如Reidhaar-Olsonetal.,Science241:53-57,1988。簡單地說，在這些操作中，合成大量帶有一個或多個待被引入克隆DNA中的突變的雙鏈寡核苷酸并且將其插入待誘變的克隆DNA(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)。重獲含有誘變后的DNA的克隆并且評價其編碼的多肽的活性。產(chǎn)生變體的另一方法是組合PCR(assemblyPCR)。組合PCR涉及來自小DNA片段混合物的PCR產(chǎn)物的組合。大量的不同PCR反應(yīng)在相同小管中平行發(fā)生，伴隨一個反應(yīng)的產(chǎn)物引發(fā)另一反應(yīng)的產(chǎn)物。組合PCR描述于例如美國專利第5,965,408號。生成變體的又一方法是有性PCR誘變。在有性PCR誘變中，作為基于序列同源性的DNA分子隨機(jī)破碎的結(jié)果，體外發(fā)生了不同但高度相關(guān)的DNA序列的DNA分子之間的被迫的同源重組。然后是通過在PCR反應(yīng)中的引物延伸固定交換。有性PCR誘變描述于例如Stemmer,PNAS,USA91:10747-10751,1994。還可以通過體內(nèi)誘變產(chǎn)生變體。在一些實施方案中，核酸序列中的隨機(jī)突變通過在攜帶一個或多個DNA修復(fù)途徑中的突變的例如大腸桿菌菌株的細(xì)菌菌株中增殖所述序列來生成。這些“致突變(mutator)”菌株具有比野生型菌株更高的隨機(jī)突變率。在這些菌株的一個菌株中增殖DNA序列(例如醛或烷生物合成多核苷酸序列)會最終在所述DNA中產(chǎn)生隨機(jī)突變。適用于體內(nèi)誘變的致突變菌株描述于例如PCT公布第WO91/16427號。還可以使用盒誘變產(chǎn)生變體。在盒誘變中，雙鏈DNA分子的小的區(qū)被不同于天然序列的合成的寡核苷酸“盒”替換。該寡核苷酸經(jīng)常含有完全和/或部分隨機(jī)化的天然序列。回歸整體誘變(Recursiveensemblemutagenesis)也可以用于產(chǎn)生變體?；貧w整體誘變是開發(fā)用以產(chǎn)生表型相關(guān)的突變體的多樣性群體的蛋白工程(即蛋白誘變)的運算法則，所述群體成員的氨基酸序列是不同的。該方法使用反饋機(jī)制來控制連續(xù)輪的組合盒誘變?；貧w整體誘變描述于例如Arkinetal.,PNAS,USA89:7811-7815,1992。在一些實施方案中，使用指數(shù)整體誘變(exponentialensemblemutagenesis)產(chǎn)生變體。指數(shù)整體誘變是產(chǎn)生具有高百分比的獨特并且有功能的變體的組合文庫的過程，其中小群殘基被平行隨機(jī)化以鑒定每個改變的位置上導(dǎo)致功能性蛋白的氨基酸。指數(shù)整體誘變描述于例如Delegraveetal.,Biotech.Res.11:1548-1552,1993。隨機(jī)誘變和定點誘變描述于例如Arnold,Curr.Opin.Biotech.4:450-455,1993。在一些實施方案中，如例如美國專利第5,965,408號和第5,939,250號中所述，使用改組操作產(chǎn)生變體，其中許多編碼不同多肽的核酸中的部分融合在一起以產(chǎn)生編碼嵌合多肽的嵌合核酸序列。多核苷酸變體還包括核酸類似物。核酸類似物可以在堿基部分、糖部分或磷酸主鏈進(jìn)行修飾以改善例如核酸的穩(wěn)定性、雜交或溶解性。堿基部分中的修飾包括將脫氧胸苷修飾為脫氧尿苷和將脫氧胞苷修飾為5-甲基-2'-脫氧胞苷或5-溴-2'-脫氧胞苷。糖部分的修飾包括修飾核糖糖的2'羥基以形成2'-O-甲基糖或2'-O-烯丙基糖?？梢孕揎椕撗鹾颂橇姿嶂麈溡援a(chǎn)生嗎啉核酸，其中每個堿基部分連接到六元嗎啉環(huán)，或產(chǎn)生肽核酸，其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈代替并保留4個堿基(參見，例如Summertonetal.,AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7:187-195；和Hyrupetal.,Bioorgan.Med.Chem.(1996)4:5-23.)。此外，脫氧磷酸主鏈可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主鏈、亞磷酰胺、或烷基磷酸三酯主鏈所代替。醛和烷生物合成多肽Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)和Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)在其他藍(lán)細(xì)菌中均有同系物(非限制性實例描述于表1中)。因此，編碼表1中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其變體可以被用作本文所述方法中的醛或烷生物合成多核苷酸。每種表1中列出的藍(lán)細(xì)菌都具有兩個基因的拷貝?；虍a(chǎn)物序列同一性的水平范圍對于Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)而言為61％至73％，對于Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)而言為43％至78％。醛生物合成多肽Synpcc7942_1594(SEQIDNO:66)的其他同系物在圖39中列出，并且編碼圖39中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其變體可以被用作本文所述的方法中的醛生物合成多核苷酸。烷生物合成多肽Synpcc7942_1593(SEQIDNO:2)的其他同系物在圖38中列出，并且編碼圖38中列出的同系物的任何多核苷酸序列或其變體可以被用作本文所述的方法中的烷生物合成多核苷酸。在某些情況下，為了在特定宿主細(xì)胞中表達(dá)，醛、烷和/或烯生物合成基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化。例如為了在大腸桿菌中表達(dá)，可以如例如Grosjeanetal.,Gene18:199-209(1982)中所述，優(yōu)化一個或多個密碼子。醛、烷和烯生物合成多肽和變體本文所述的方法和組合物還包括具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的烷或烯生物合成多肽及其多肽變體。在一些情況下，烷或烯生物合成多肽是包括一個或多個本文所述的氨基酸基序的多肽。例如，所述烷或烯生物合成多肽可以包括SEQIDNO:37、38、39、41、42、43或44的氨基酸序列。所述烷或烯生物合成多肽還可以包括SEQIDNO:40以及SEQIDNO:37、38或39的任何一個的氨基酸序列。本文所述的方法和組合物還包括具有SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的醛生物合成多肽及其多肽變體。在一些情況下，醛生物合成多肽是包括一個或多個本文所述的氨基酸基序的多肽。例如，所述醛生物合成多肽可以包括SEQIDNO:54、55、56、57、58、59、60、61、62、63或64的氨基酸序列。醛、烷和烯生物合成多肽變體可以是其中一個或多個氨基酸殘基被保守或非保守氨基酸殘基(優(yōu)選保守氨基酸殘基)所取代的變體。這些取代的氨基酸殘基可以是或可以不是遺傳密碼所編碼的殘基。保守型取代為由具有相似性質(zhì)的另一氨基酸取代多肽中給定氨基酸的那些取代。典型的保守型取代是以下替換：諸如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的脂肪族氨基酸被另一脂肪族氨基酸替換；絲氨酸被蘇氨酸替換，或反之亦然；諸如天冬氨酸和谷氨酸的酸性殘基被另一酸性殘基替換；諸如天冬酰胺和谷氨酰胺的攜帶酰胺基的殘基被另一攜帶酰胺基的殘基替換；諸如賴氨酸和精氨酸的堿性殘基被另一堿性殘基交換；以及諸如苯丙氨酸和酪氨酸的芳香族殘基被另一芳香族殘基替換。其他多肽變體是那些其中一個或多個氨基酸殘基包括取代基的變體。還有其他多肽變體是那些其中所述多肽與另一化合物結(jié)合的變體，如增加多肽的半衰期的化合物(例如聚乙二醇)。另外的多肽變體是那些其中其他氨基酸被融合到所述多肽的變體，所述其他氨基酸例如前導(dǎo)序列、分泌序列、前蛋白序列或便于所述多肽的純化、富集或穩(wěn)定的序列。在一些情況下，烷或烯生物合成多肽變體與具有SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的多肽保持相同的生物學(xué)功能(例如保持烷或烯生物合成活性)并具有與其基本相同的氨基酸序列。在其他情況下，所述烷或烯生物合成多肽變體與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列具有至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或多于約95％的同源性。在另一實施方案中，所述多肽變體包括片段，所述片段包含SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150個連續(xù)氨基酸。在一些情況下，醛生物合成多肽變體與具有SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的多肽保持相同的生物學(xué)功能(例如保持醛生物合成活性)，并具有與其基本相同的氨基酸序列。在其他情況下，所述醛生物合成多肽變體與SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列具有至少約50％、至少約55％、至少約60％、至少約65％、至少約70％、至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約95％或多于約95％的同源性。在另一實施方案中，所述多肽變體包括片段，所述片段包含SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列的至少約5、10、15、20、25、30、35、40、50、75、100或150個連續(xù)氨基酸。所述多肽變體或其片段可以通過使用本文所述的技術(shù)分離編碼它們的核酸或通超表達(dá)編碼它們的合成的核酸來獲得?？蛇x地，多肽變體或其片段可以通過生物化學(xué)富集或純化操作來獲得。多肽變體或片段的序列可以通過蛋白水解消化、凝膠電泳和/或微測序來確定。然后使用本文所述的任何程序，可以將所述烷或烯生物合成多肽變體或片段的序列與SEQIDNO:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34或36的氨基酸序列進(jìn)行比較。用本文所述的任何程序，可以將所述醛生物合成多肽變體或片段的序列與SEQIDNO:66、68、70、72、74、76、78、80或82的氨基酸序列進(jìn)行比較。使用常規(guī)方法，可以檢測所述多肽變體及其片段的產(chǎn)生醛、產(chǎn)生脂肪醇、產(chǎn)生烷和/或產(chǎn)生烯的活性。例如，在允許所述多肽變體發(fā)揮功能的條件下，可以使所述多肽變體或片段與底物(例如脂肪酸衍生物底物或本文所述的其他底物)接觸?？梢詼y量底物水平的下降或醛、烷或烯水平的升高以分別測定產(chǎn)生醛、產(chǎn)生脂肪醇、產(chǎn)生烷和/或產(chǎn)生烯的活性。抗醛、抗脂肪醇、抗烷和抗烯生物合成多肽抗體本文所述的醛、脂肪醇、烷和烯生物合成多肽還可以用于產(chǎn)生針對醛、脂肪醇、烷和烯生物合成多肽的抗體。這些抗體可以用于，例如利用本領(lǐng)域已知的方法檢測醛、脂肪醇、烷或烯生物合成多肽的表達(dá)。所述抗體可以是，例如多克隆抗體；單克隆抗體或其抗原結(jié)合片段；例如嵌合抗體、重構(gòu)抗體(reshapedantibody)、人源化抗體的修飾的抗體或其片段(例如Fab'、Fab、F(ab')2)；或例如單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體(DAB)、Fv、單鏈Fv(scFv)等的生物合成抗體。制造和使用多克隆和單克隆抗體的方法描述于，例如Harlowetal.,UsingAntibodies:ALaboratoryManual:PortableProtocolI(使用抗體：實驗室指南：操作手冊I).ColdSpringHarborLaboratory(1998年12月1日)。制造修飾的抗體和抗體片段(例如嵌合抗體、改形抗體、人源化抗體或其片段，所述片段例如Fab'、Fab、F(ab')2片段)或生物合成抗體(例如單鏈抗體、單結(jié)構(gòu)域抗體(DABs)、Fv、單鏈Fv(scFv)等)的方法是本領(lǐng)域已知的并且可以見于，例如Zola,MonoclonalAntibodies:PreparationandUseofMonoclonalAntibodiesandEngineeredAntibodyDerivatives(單克隆抗體：單克隆抗體和改造抗體衍生物的制備和使用),施普林格(SpringerVerlag)(2000年12月15；第一版)。底物本文所述的組合物和方法可以用于從合適的底物產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和/或烯。盡管不希望被特定理論約束，還是認(rèn)為本文所述的烷或烯生物合成多肽通過脫羰機(jī)制從底物產(chǎn)生烷或烯。在一些情況下，所述底物是脂肪酸衍生物，例如脂肪醛，并且具有特定分支模式和碳鏈長度的烷可以從例如脂肪醛的具有那些特定特征的脂肪酸衍生物產(chǎn)生。在其他情況下，所述底物是不飽和脂肪酸衍生物，例如不飽和脂肪醛，并且具有特定分支模式和碳鏈長度的烯可以從例如不飽和脂肪醛的具有那些特定特征的不飽和脂肪酸衍生物產(chǎn)生。盡管不希望被特定理論約束，還是認(rèn)為本文所述的醛生物合成多肽通過還原機(jī)制從底物產(chǎn)生醛。在某些情況下，所述底物是?；鵄CP。盡管不希望被特定理論所約束，還是認(rèn)為本文所述的脂肪醇是通過還原機(jī)制從底物產(chǎn)生。在某些情況下，所述底物是脂肪醛。因此，可以修飾導(dǎo)致這些底物的產(chǎn)生的生物合成途徑中的每一個步驟以產(chǎn)生或過量產(chǎn)生目的底物。例如，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)、超表達(dá)或減弱參與脂肪酸生物合成途徑、脂肪醛途徑和脂肪醇途徑的已知基因，以產(chǎn)生所需底物(參見，例如PCT/US08/058788，在此特通過引用并入)。示例性基因在圖40中提供。底物的合成脂肪酸合酶(FAS)是一組催化?；湹钠鹗己脱娱L的多肽(Marrakchietal.,BiochemicalSociety,30:1050-1055,2002)。?；d體蛋白(ACP)以及FAS途徑中的酶控制所產(chǎn)生的脂肪酸衍生物的長度、飽和度和分支。脂肪酸生物合成途徑涉及前體乙酰CoA和丙二酰CoA。該途徑中的步驟由脂肪酸生物合成(fab)和乙酰CoA羧化酶(acc)基因家族的酶催化(參見，例如Heathetal.,Prog.LipidRes.40(6):467-97(2001))?？梢酝ㄟ^重組表達(dá)或超表達(dá)乙酰CoA和/或丙二酰CoA合酶基因改造宿主細(xì)胞以表達(dá)脂肪酸衍生物底物。例如，為了增加乙酰CoA產(chǎn)生，可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)一個或多個以下基因：pdh、panK、aceEF(編碼丙酮酸和2-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物的E1p脫氫酶組分和E2p二氫硫辛酰胺?；D(zhuǎn)移酶組分)、fabH、fabD、fabG、acpP和fabF。這些基因的示例性GenBank登錄號為：pdh(BAB34380、AAC73227、AAC73226)、panK(也稱為coaA、AAC76952)、aceEF(AAC73227、AAC73226)、fabH(AAC74175)、fabD(AAC74176)、fabG(AAC74177)、acpP(AAC74178)、fabF(AAC74179)。此外，可以通過用含有相應(yīng)基因的無效或缺失突變的條件復(fù)制或非復(fù)制質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化或通過取代啟動子或增強(qiáng)子序列，在改造的宿主細(xì)胞中減弱或敲除fadE、gpsA、ldhA、pflb、adhE、pta、poxB、ackA和/或ackB的表達(dá)水平。這些基因的示例性GenBank登錄號為：fadE(AAC73325)、gspA(AAC76632)、ldhA(AAC74462)、pflb(AAC73989)、adhE(AAC74323)、pta(AAC75357)、poxB(AAC73958)、ackA(AAC75356)和ackB(BAB81430)。得到的宿主細(xì)胞當(dāng)在合適的環(huán)境中生長時，會具有增加的乙酰CoA產(chǎn)生水平。丙二酰CoA超表達(dá)可以通過將accABCD(例如登錄號AAC73296、EC6.4.1.2)引入宿主細(xì)胞來實現(xiàn)?？梢酝ㄟ^將編碼脂肪酶(例如，登錄號CAA89087、CAA98876)的DNA序列引入宿主細(xì)胞，在宿主細(xì)胞中進(jìn)一步超表達(dá)脂肪酸。此外，抑制PlsB可以導(dǎo)致長鏈?；鵄CP水平的增加，這會抑制途徑中的早期步驟(例如，accABCD、fabH和fabI)。plsB(例如，登錄號AAC77011)D311E突變可以用于增加可用?；鵆oA的量。此外，可以改造宿主細(xì)胞以超表達(dá)sfa基因(fabA的抑制基因，例如，登錄號AAN79592)，從而增加單不飽和脂肪酸的產(chǎn)生(Rocketal.,J.Bacteriology178:5382-5387,1996)。在一些情況下，可以改造宿主細(xì)胞以表達(dá)、超表達(dá)或減弱硫酯酶的表達(dá)，從而增加脂肪酸底物產(chǎn)生。脂肪酸底物的鏈長度由硫酯酶控制。在一些情況下，可以超表達(dá)tes或fat基因。在其他情況下，C10脂肪酸可以通過減弱使用C18:1-ACP的硫酯酶C18(例如，登錄號AAC73596和P0ADA1)，并表達(dá)使用C10-ACP的硫酯酶C10(例如，登錄號Q39513)來產(chǎn)生。這導(dǎo)致了碳鏈長度為10的脂肪酸的相對同種群體。在其他情況下，C14脂肪酸可以通過減弱產(chǎn)生非C14脂肪酸的內(nèi)源硫酯酶并且表達(dá)使用C14-ACP的硫酯酶(例如，登錄號Q39473)來產(chǎn)生。在一些情況下，C12脂肪酸可以通超表達(dá)使用C12-ACP的硫酯酶(例如，登錄號Q41635)并且減弱產(chǎn)生非C12脂肪酸的硫酯酶來產(chǎn)生。使用本領(lǐng)域已知的方法可以證實乙酰CoA、丙二酰CoA和脂肪酸的過量產(chǎn)生，例如，通過在細(xì)胞裂解后使用放射性操作、HPLC和GC-MS?？梢杂糜诒疚乃龅姆椒ㄖ械牧蝓ッ傅姆窍拗菩詫嵗诒?中列出。表2.硫酯酶*Mayeretal.,BMCPlantBiology7:1-11,2007分支醛、脂肪醇、烷和烯的形成通過使用分支脂肪酸衍生物作為底物，可以產(chǎn)生含有分支點的醛、脂肪醇、烷、烯。例如，雖然大腸桿菌天然產(chǎn)生直鏈脂肪酸衍生物(sFAs)，但是可以通過在大腸桿菌中引入且表達(dá)或超表達(dá)提供分支前體的基因(例如bkd、ilv、icm和fab基因家族)改造大腸桿菌，以產(chǎn)生支鏈脂肪酸衍生物(brFAs)。此外，可以改造宿主細(xì)胞以表達(dá)或超表達(dá)編碼用于brFAs的延長的蛋白的基因(例如ACP、FabF等)，和/或缺失或減弱通常導(dǎo)致sFAs的對應(yīng)宿主細(xì)胞基因。形成brFAs中的第一步驟是通過支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生對應(yīng)α-酮酸。宿主細(xì)胞可以內(nèi)源包括編碼這些酶的基因或這些基因可以被重組引入。例如，大腸桿菌內(nèi)源表達(dá)這樣的酶I1vE(EC2.6.1.42；GenBank登錄YP_026247)。在一些宿主細(xì)胞中，可以不表達(dá)異源支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶。但是，大腸桿菌I1vE或任何其他支鏈氨基酸氨基轉(zhuǎn)移酶(例如，來自乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)的I1vE(GenBank登錄AAF34406)、來自惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)的I1vE(GenBank登錄NP_745648)或來自天藍(lán)色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)的I1vE(GenBank登錄NP629657))，如果不是內(nèi)源的，可以被引入和重組表達(dá)。第二步驟是將α-酮酸氧化脫羧為對應(yīng)的支鏈?；鵆oA。該反應(yīng)可以由支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合物(bkd；EC1.2.4.4.)(Denoyaetal.,J.Bacteriol.177:3504,1995)催化，該復(fù)合物由E1α/β(脫羧酶)、E2(二氫硫辛酸轉(zhuǎn)酰酶)和E3(二氫硫辛酸脫氫酶)亞基組成。這些支鏈α-酮酸脫氫酶復(fù)合物與丙酮酸和α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合物相似。具有brFAs和/或生長在支鏈氨基酸上的任何微生物可以用作分離用于在例如大腸桿菌的宿主細(xì)胞中表達(dá)的bkd基因的來源。此外，大腸桿菌具有E3組分，作為其丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(lpd、EC1.8.1.4、GenBank登錄NP_414658)的一部分。因此，僅表達(dá)E1a/β和E2bkd基因就足夠了。表3列出了來自幾種微生物的、可以在宿主細(xì)胞中重組引入并表達(dá)以提供支鏈?；鵆oA前體的bkd基因的非限制性實例。表3.來自選擇的微生物的Bkd基因在另一實例中，通過丁烯酰CoA還原酶(Ccr、EC1.6.5.5、1.1.1.1)和異丁酰CoA變位酶(大亞基IcmA、EC5.4.99.2；小亞基IcmB、EC5.4.99.2)的共表達(dá)，異丁酰CoA可以在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生，例如在大腸桿菌中(Han和Reynolds,J.Bacteriol.179:5157,1997)。丁烯酰CoA是大腸桿菌和其他微生物中脂肪酸生物合成的中間體。來自所選微生物的ccr和icm基因的非限制性實例在表4中列出。表4.來自選擇的微生物的Ccr和icm基因除bkd基因的表達(dá)外，brFA生物合成的起始利用對支鏈?；鵆oA具有特異性的β-酮脂酰-?；?載體-蛋白合酶III(FabH、EC2.3.1.41)(Lietal.,J.Bacteriol.187:3795-3799,2005)。這些FabH酶的非限制性實例在表5中列出。參與任何含有brFA的微生物的脂肪酸生物合成的fabH基因可以在宿主細(xì)胞中表達(dá)。來自不天然產(chǎn)生brFA的宿主細(xì)胞的Bkd和FabH酶可能不支持brFA產(chǎn)生。因此，可以重組表達(dá)bkd和fabH?？梢詫⒑衎kd和fabH基因的載體插入這樣的宿主細(xì)胞中。同樣，Bkd和FabH產(chǎn)生的內(nèi)源水平可能不足以產(chǎn)生brFA。這種情況下，可以超表達(dá)它們。此外，可以表達(dá)或超表達(dá)脂肪酸生物合成途徑的其他組分，例如酰基載體蛋白(ACPs)和β-酮脂酰-?；?載體-蛋白合酶II(fabF、EC2.3.1.41)(候選者的非限制性實例在表5中列出)。除表達(dá)這些基因外，可以在宿主細(xì)胞中減弱內(nèi)源脂肪酸生物合成途徑中的一些基因(例如，大腸桿菌基因fabH(GenBank登錄號NP_415609)和/或fabF(GenBank登錄號NP_415613))。表5.來自選擇的具有brFAs的微生物的FabH、ACP和fabF基因環(huán)狀醛、脂肪醇、烷和烯的形成通過使用環(huán)狀脂肪酸衍生物作為底物，可以產(chǎn)生環(huán)狀醛、脂肪醇、烷和烯。為了產(chǎn)生環(huán)狀脂肪酸衍生物底物，可以將提供環(huán)狀前體的基因(例如ans、chc和plm基因家族)引入宿主細(xì)胞并使其表達(dá)，以允許從環(huán)狀前體起始脂肪酸生物合成。例如，為了將例如大腸桿菌的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚝铣搔?環(huán)狀脂肪酸衍生物(cyFA)的細(xì)胞，可以在宿主細(xì)胞中引入并表達(dá)提供環(huán)狀前體環(huán)己基羰基CoA(CHC-CoA)的基因(Croppetal.,NatureBiotech.18:980-983,2000)。在大腸桿菌中提供CHC-CoA的基因的非限制性實例包括：來自山丘鏈霉菌(Streptomycescollinus)的安莎三烯(ansatrienin)基因簇的ansJ、ansK、ansL、chcA和ansM(Chenetal.,Eur.J.Biochem.261:98-107,1999)或來自鏈霉菌(Streptomycessp.)HK803的磷內(nèi)酯霉素B(phoslactomycinB)基因簇的plmJ、plmK、plmL、chcA和plmM(Palaniappanetal.,J.Biol.Chem.278:35552-35557,2003)，以及來自山丘鏈霉菌、阿維鏈霉菌(S.avermitilis)或天藍(lán)色鏈霉菌的chcB基因(Pattonetal.,Biochem.39:7595-7604,2000)(參見表6)。然后，可以表達(dá)表5中所列的基因，以允許ω-環(huán)狀脂肪酸的起始和延長?？蛇x地，可以從產(chǎn)生cyFA的微生物中分離同源基因并在宿主細(xì)胞(例如大腸桿菌)中表達(dá)該同源基因。表6.用于合成CHC-CoA的基因表5中列出的基因(fabH、ACP和fabF)允許ω-環(huán)狀脂肪酸衍生物的起始和延長，因為它們具有寬泛的底物特異性。如果任何這些基因與表6中列出的基因的共表達(dá)不產(chǎn)生cyFA，則可以分離(例如通過使用簡并PCR引物或異源DNA序列探針)并共表達(dá)來自產(chǎn)生cyFAs的微生物的fabH、ACP和/或fabF同系物(例如表7中列出的那些)。表7.含有ω-環(huán)狀脂肪酸的微生物的非限制性實例*利用環(huán)庚基羰基-CoA而不是環(huán)己基羰基-CoA作為cyFA生物合成的前體醛、脂肪醇和烯飽和水平通過調(diào)節(jié)脂肪酸衍生物中間體的飽和度，可以控制脂肪酸衍生物的飽和度?？梢员磉_(dá)或超表達(dá)sfa、gns和fab基因家族以控制脂肪酸的飽和。圖40列出了這些基因家族中可以用于本文所述的方法和宿主細(xì)胞的基因的非限制性實例。通過改造宿主細(xì)胞以超表達(dá)fabB或通過使宿主細(xì)胞在低溫生長(例如低于37℃)，可以改造宿主細(xì)胞以產(chǎn)生不飽和脂肪酸。FabB具有對于cis-δ3癸烯酰ACP的偏向性并導(dǎo)致大腸桿菌中不飽和脂肪酸產(chǎn)生。fabB的超表達(dá)導(dǎo)致顯著百分比的不飽和脂肪酸的產(chǎn)生(deMendozaetal.,J.Biol.Chem.258:2098-2101,1983)。基因fabB可以在不是天然具有該基因的宿主細(xì)胞中插入和表達(dá)。然后，這些不飽和脂肪酸衍生物可以在被改造的宿主細(xì)胞中用作產(chǎn)生脂肪酸衍生物，例如脂肪醛、脂肪醇或烯的中間體。在其他情況下，可以缺失脂肪酸生物合成的阻抑物，例如fabR(GenBank登錄NP_418398)，這也可以導(dǎo)致大腸桿菌中不飽和脂肪酸產(chǎn)生的增加(Zhangetal.,J.Biol.Chem.277:15558,2002)?？梢栽谄渌拗骷?xì)胞中進(jìn)行相似的缺失。例如，通過超表達(dá)fabM(反式-2,順式-3-癸烯酰-ACP異構(gòu)酶、GenBank登錄DAA05501)和來自肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)的fabK(反式-2-烯酰-ACP還原酶II，GenBank登錄NP_357969)的受控表達(dá)(Marrakchietal.,J.Biol.Chem.277:44809,2002)，同時缺失大腸桿菌fabI(反式-2-烯酰-ACP還原酶，GenBank登錄NP_415804)，可以實現(xiàn)不飽和脂肪酸衍生物的進(jìn)一步增加。在一些實例中，可以減弱內(nèi)源fabF基因，從而增加所產(chǎn)生的棕櫚油酸酯(C16:1)的百分比。其他底物可以用于在本文所述的方法中產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和烯的其他底物是?；鵄CP、酰基CoA、脂肪醛或脂肪醇，它們描述于例如PCT/US08/058788?？梢员桓淖円栽谒拗骷?xì)胞中表達(dá)或超表達(dá)這些底物的示例性的基因在圖40中列出。其他示例性的基因描述于PCT/US08/058788。宿主細(xì)胞的基因工程以產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和烯如本文所述，可以用各種宿主細(xì)胞產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和/或烯。宿主細(xì)胞可以是任何原核或真核細(xì)胞。例如，本文所述的多肽可以在細(xì)菌細(xì)胞(例如大腸桿菌)、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞(例如中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、VERO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、HeLa細(xì)胞、Cv1細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞、3T3細(xì)胞或PC12細(xì)胞)中表達(dá)。其他示例性的宿主細(xì)胞包括來自以下屬的成員的細(xì)胞：埃希氏菌屬、芽孢桿菌屬、乳酸桿菌屬、紅球菌屬、假單胞菌屬、曲霉屬、木霉屬、脈孢菌屬、鐮刀菌屬、腐質(zhì)霉屬、根毛霉屬、克魯維酵母菌屬、畢赤酵母屬、毛霉菌屬、蝕絲霉屬、青霉屬、平革菌屬、側(cè)耳屬、栓菌屬、金黃孢子菌屬、酵母屬、裂殖酵母屬、耶氏酵母屬或鏈霉菌屬。其他示例性的宿主細(xì)胞可以是遲緩芽孢桿菌細(xì)胞、短芽孢桿菌細(xì)胞、嗜熱脂肪芽孢桿菌細(xì)胞、地衣芽孢桿菌細(xì)胞、嗜堿芽孢桿菌細(xì)胞、凝結(jié)芽孢桿菌細(xì)胞、環(huán)狀芽孢桿菌細(xì)胞、短小芽孢桿菌細(xì)胞、蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞、克勞氏芽孢桿菌細(xì)胞、巨大芽孢桿菌細(xì)胞、枯草芽孢桿菌細(xì)胞、解淀粉芽孢桿菌細(xì)胞、康氏木霉細(xì)胞、綠色木霉細(xì)胞、里氏木霉細(xì)胞、長枝木霉細(xì)胞、泡盛曲霉細(xì)胞、煙曲霉細(xì)胞、臭曲霉細(xì)胞、構(gòu)巢曲霉細(xì)胞、黑曲霉細(xì)胞、米曲霉細(xì)胞、特異腐質(zhì)霉細(xì)胞、棉毛狀腐質(zhì)霉細(xì)胞、米黑根毛霉細(xì)胞、米黑毛酶細(xì)胞、淺青紫鏈霉菌細(xì)胞、鼠灰鏈霉菌細(xì)胞或放線菌細(xì)胞。宿主細(xì)胞的其他非限制性實例是表1中列出的那些。在優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細(xì)胞是大腸桿菌細(xì)胞。在更優(yōu)選的實施方案中，所述宿主細(xì)胞來自大腸桿菌菌株B、C、K或W。其他合適的宿主細(xì)胞對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。本領(lǐng)域熟知的各種方法可以用于遺傳改造宿主細(xì)胞以產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和/或烯。所述方法包括使用載體，優(yōu)選表達(dá)載體，所述載體含有編碼本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或其多肽變體或片段的核酸。如本文所用，術(shù)語“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運另一核酸的核酸分子，所述核酸分子連接到所述另一核酸。一種載體是“質(zhì)?！保鲑|(zhì)粒是指可以連接有另外的DNA節(jié)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種載體是病毒載體，其中另外的DNA節(jié)段可以被連接到病毒基因組中。某些載體能夠在它們被引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點的細(xì)菌載體和附加體哺乳動物載體)。其他載體(例如，非附加體哺乳動物載體)當(dāng)引入到宿主細(xì)胞中時，被整合到宿主細(xì)胞的基因組中，并因此隨同宿主基因組一起復(fù)制。此外，某些載體，例如表達(dá)載體，能夠指導(dǎo)與其可操作地連接的基因的表達(dá)。通常，重組DNA技術(shù)所用的表達(dá)載體經(jīng)常是質(zhì)粒的形式。但是，也可以使用其他形式的表達(dá)載體，例如病毒載體(例如復(fù)制缺陷性逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)。本文所述的重組表達(dá)載體包括以適于宿主細(xì)胞中的核酸表達(dá)的形式的本文所述的核酸。所述重組表達(dá)載體可以包括一個或多個基于將被用于表達(dá)的宿主細(xì)胞所選擇的控制序列。所述控制序列可操作地連接到待表達(dá)的核酸序列。這些控制序列描述于，例如Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)?？刂菩蛄邪ㄔ谠S多類型的宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的組成型表達(dá)的那些控制序列和僅在某些宿主細(xì)胞中指導(dǎo)核苷酸序列的表達(dá)的那些控制序列(例如組織特異性調(diào)節(jié)序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，表達(dá)載體的設(shè)計可以取決于例如待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需蛋白的表達(dá)水平等因素。可以將本文所述的表達(dá)載體引入宿主細(xì)胞，以產(chǎn)生本文所述核酸所編碼的多肽，包括融合多肽。可以設(shè)計重組表達(dá)載體用于在原核或真核細(xì)胞(例如，例如大腸桿菌的細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞(使用桿狀病毒表達(dá)載體)、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞)中表達(dá)醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或變體。適合的宿主細(xì)胞在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)中進(jìn)一步作了詳細(xì)討論。可選地，所述重組表達(dá)載體可以在體外進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯，例如通過使用T7啟動子調(diào)節(jié)序列和T7聚合酶。最經(jīng)常用含有指導(dǎo)融合或非融合多肽表達(dá)的組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體在例如大腸桿菌的原核生物中進(jìn)行多肽的表達(dá)。融合載體將許多氨基酸添加到其中編碼的多肽，通常添加到重組多肽的氨基末端。這些融合載體通常擔(dān)任3個用途：(1)增加重組多肽的表達(dá)；(2)增加重組多肽的可溶性；和(3)通過作為親和純化中的配體，幫助重組多肽的純化。通常，在融合表達(dá)載體中，在融合部分和重組多肽的連接處引入蛋白水解切割位點。這使得在融合多肽純化后，重組多肽能夠從融合部分分離。這些酶的實例及其同源識別序列包括Xa因子、凝血酶和腸激酶。示例性的融合表達(dá)載體包括pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smithetal.,Gene(1988)67:31-40)、pMAL(NewEnglandBiolabs,Beverly,Mass.)和pRITS(Pharmacia,Piscataway,N.J.)，它們分別將谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、麥芽糖E結(jié)合蛋白或蛋白A融合到靶重組多肽。誘導(dǎo)型、非融合大腸桿菌表達(dá)載體的實例包括pTrc(Amannetal.,Gene(1988)69:301-315)和pET11d(Studieretal.,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)60-89)。從pTrc載體表達(dá)靶基因依賴于來自雜合trp-lac融合啟動子的宿主RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄。從pET11d載體表達(dá)靶基因依賴于來自共表達(dá)的病毒RNA聚合酶(T7gn1)所介導(dǎo)的T7gn10-lac融合啟動子的轉(zhuǎn)錄。該病毒聚合酶由來自攜帶T7gn1基因的定居λ原噬菌體的宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)提供，所述T7gn1基因受lacUV5啟動子的轉(zhuǎn)錄控制。使重組多肽表達(dá)最大化的一種策略是，在具有受損的蛋白水解切割所述重組多肽的能力的宿主細(xì)胞中表達(dá)多肽(參見Gottesman,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology(基因表達(dá)技術(shù)：酶學(xué)方法)185,AcademicPress,SanDiego,Calif.(1990)119-128)。另一策略是改變待插入表達(dá)載體中的核酸序列，這樣每個氨基酸的單獨密碼子是所述宿主細(xì)胞優(yōu)選使用的那些密碼子(Wadaetal.,NucleicAcidsRes.(1992)20:2111-2118)。通過標(biāo)準(zhǔn)DNA合成技術(shù)可以進(jìn)行該核酸序列的改變。在另一實施方案中，所述宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。在該實施方案中，表達(dá)載體是酵母表達(dá)載體。用于在釀酒酵母(S.cerevisiae)中表達(dá)的載體的實例包括pYepSec1(Baldarietal.,EMBOJ.(1987)6:229-234)、pMFa(Kurjanetal.,Cell(1982)30:933-943)、pJRY88(Schultzetal.,Gene(1987)54:113-123)、pYES2(InvitrogenCorporation,SanDiego,Calif.)和picZ(InvitrogenCorp,SanDiego,Calif.)?？蛇x地，使用桿狀病毒表達(dá)載體，可以在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)本文所述的多肽?？捎糜谠谂囵B(yǎng)的昆蟲細(xì)胞(例如Sf9細(xì)胞)中表達(dá)蛋白的桿狀病毒載體包括，例如pAc系列(Smithetal.,Mol.CellBiol.(1983)3:2156-2165)和pVL系列(Lucklowetal.,Virology(1989)170:31-39)。在又一實施方案中，使用哺乳動物表達(dá)載體，可以在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)本文所述的核酸。哺乳動物表達(dá)載體的實例包括pCDM8(Seed,Nature(1987)329:840)和pMT2PC(Kaufmanetal.,EMBOJ.(1987)6:187-195)。當(dāng)用于哺乳動物細(xì)胞中時，表達(dá)載體的控制功能可以由病毒調(diào)節(jié)元件提供。例如，通常使用的啟動子來自多瘤病毒、腺病毒2、巨細(xì)胞病毒和猿猴病毒40。對于原核和真核細(xì)胞都合適的其他表達(dá)系統(tǒng)描述于Sambrooketal.,eds.,MolecularCloning:ALaboratoryManual.2nd(分子克?。簩嶒炇謨裕?版),ed.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.,1989的16和17章中。通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)可以將載體引入原核或真核細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指許多領(lǐng)域公認(rèn)的用于將外源核酸(例如DNA)引入宿主細(xì)胞的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染或電穿孔。用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的合適的方法可以見于例如Sambrooketal.(同上)。對于細(xì)菌細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，已知的是，根據(jù)所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)化技術(shù)，僅小部分的細(xì)胞會攝入并復(fù)制所述表達(dá)載體。為了鑒定和選擇這些轉(zhuǎn)化體，可以將編碼選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性)的基因伴隨目的基因引入宿主細(xì)胞中。選擇標(biāo)記包括賦予藥物抗性的那些標(biāo)記，所述藥物諸如氨芐西林、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素。編碼選擇標(biāo)記的核酸可以在與編碼本文所述的多肽相同的載體上被引入宿主細(xì)胞或可以在單獨的載體上被引入?？梢酝ㄟ^藥物選擇鑒定被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，具有并入的選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞會存活，而其他細(xì)胞死亡)。對于哺乳動物細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，已知的是，根據(jù)使用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，僅小部分的細(xì)胞可以將外源DNA整合到其基因組中。為了鑒定和選擇這些整合體，可以將編碼選擇標(biāo)記(例如抗生素抗性)的基因伴隨目的基因引入宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括賦予藥物抗性的那些標(biāo)記，所述藥物諸如G418、潮霉素和甲氨蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸可以在與編碼本文所述的多肽相同的載體上被引入宿主細(xì)胞或可以在單獨的載體上被引入?？梢酝ㄟ^藥物選擇鑒定被引入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(例如，具有并入的選擇標(biāo)記基因的細(xì)胞會存活，而其他細(xì)胞死亡)。在某些方法中，在單一宿主細(xì)胞中共表達(dá)醛生物合成多肽和烷或烯生物合成多肽。在可選的方法中，在單一宿主細(xì)胞中共表達(dá)醛生物合成多肽和醇脫氫酶多肽。轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運蛋白可以將多肽和碳?xì)浠衔?例如醛、烷和/或烯)輸出宿主細(xì)胞。很多轉(zhuǎn)運和外排蛋白用于排出種類廣泛的化合物并且可以被天然修飾，從而對于特定類型的碳?xì)浠衔锞哂羞x擇性。合適的轉(zhuǎn)運蛋白的非限制性實例是ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運蛋白、外排蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白(FATP)。合適的轉(zhuǎn)運蛋白的其他非限制性實例包括來自諸如秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)、擬南芥(Arabidopsisthalania)、真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌(Alkaligeneseutrophus)和紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的生物體的ABC轉(zhuǎn)運蛋白。示例性的可以使用的ABC轉(zhuǎn)運蛋白在圖40中列出(例如CER5、AtMRP5、AmiS2和AtPGP1)。宿主細(xì)胞也可以對于其分泌碳?xì)浠衔锏膬?nèi)源能力進(jìn)行選擇。碳?xì)浠衔锂a(chǎn)生和分泌進(jìn)入宿主細(xì)胞環(huán)境的效率(例如培養(yǎng)基、發(fā)酵液)可以表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)物與細(xì)胞外產(chǎn)物的比值。在一些實施例中，該比值可以為約5:1、4:1、3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4或1:5。發(fā)酵通過使用有益發(fā)酵技術(shù)，可以增強(qiáng)醛、脂肪醇、烷和/或烯的產(chǎn)生和分離。使產(chǎn)量最大化同時降低費用的一種方法是增加被轉(zhuǎn)變?yōu)樘細(xì)浠衔锂a(chǎn)物的碳源的百分比。在正常的細(xì)胞生命周期中，碳被用于細(xì)胞功能，例如產(chǎn)生脂質(zhì)、糖類、蛋白質(zhì)、有機(jī)酸和核酸。降低生長相關(guān)活性所需的碳的量可以增加碳源轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物的效率。這可以通過例如首先使宿主細(xì)胞生長到所需密度(例如，達(dá)到生長對數(shù)期高峰的密度)來實現(xiàn)。在這點上，可以使用復(fù)制檢查點基因(replicationcheckpointgene)阻止細(xì)胞生長。具體而言，群體感應(yīng)機(jī)制(quorumsensingmechanisms)(綜述于Camillietal.,Science311:1113,2006；VenturiFEMSMicrobio.Rev.30:274-291,2006；和Readingetal.,FEMSMicrobiol.Lett.254:1-11,2006)可以用于激活例如p53、p21的檢查點基因或其他檢查點基因?？梢员患せ钜宰柚勾竽c桿菌中細(xì)胞復(fù)制和生長的基因包括umuDC基因。umuDC基因的超表達(dá)阻止從靜止期到指數(shù)性生長的進(jìn)展(Murlietal.,J.ofBact.182:1127,2000)。UmuC是可以對非編碼損傷進(jìn)行跨損傷修復(fù)(translesionsynthesis)的DNA聚合酶，所述非編碼損傷是大部分UV和化學(xué)誘變的機(jī)制基礎(chǔ)。umuDC基因產(chǎn)物參與跨損傷修復(fù)的過程并且還作為DNA序列損傷檢查點。umuDC基因產(chǎn)物包括UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2和UmuD2。同時，產(chǎn)生產(chǎn)物的基因可以被激活，從而在制造醛、烷和/或烯的同時，使對于待使用的復(fù)制和保持途徑的需要最小化。通過umuC和umuD與合適的終產(chǎn)物產(chǎn)生基因的重新合成，可以改造宿主細(xì)胞以在prpBCDE啟動子系統(tǒng)下的pBAD24中表達(dá)來自大腸桿菌的umuC和umuD。輸入碳轉(zhuǎn)變?yōu)槿⒅敬?、烷?或烯的百分比可以是成本動因。該過程的耗費越小，該過程越有效率(即輸入碳轉(zhuǎn)變?yōu)槿?、脂肪醇、烷?或烯的較高的百分比)。對于含氧碳源(例如葡萄糖和其他基于碳水化合物的來源)，氧必須以二氧化碳的形式釋放。對于每2個釋放的氧原子，碳原子也被釋放，這導(dǎo)致約34％(w/w)的最大理論代謝效率(對于脂肪酸來源的產(chǎn)物)。但是，這個數(shù)字對于其他碳?xì)浠衔锂a(chǎn)物和碳源會變化。文獻(xiàn)中的通常效率約低于5％。經(jīng)改造產(chǎn)生醛、烷和/或烯的宿主細(xì)胞可以具有大于約1、3、5、10、15、20、25和30％的效率。在一個實例中，宿主細(xì)胞可以表現(xiàn)出約10％至約25％的效率。在其他實例中，這些宿主細(xì)胞可以表現(xiàn)出約25％至約30％的效率。在其他實例中，宿主細(xì)胞可以表現(xiàn)出大于30％的效率。可以另外改造宿主細(xì)胞以表達(dá)重組纖維小體，例如PCT申請第PCT/US2007/003736號中描述的那些。這些纖維小體可以允許宿主細(xì)胞使用纖維素原料作為碳源。例如，可以另外改造宿主細(xì)胞以表達(dá)轉(zhuǎn)化酶(EC3.2.1.26)，這樣蔗糖可以被用作碳源。相似地，可以使用美國專利第5,000,000號、第5,028,539號、第5,424,202號、第5,482,846號和第5,602,030號中描述的教導(dǎo)改造宿主細(xì)胞，這樣宿主細(xì)胞可以有效地吸收碳并使用纖維素原料作為碳源。在一個實例中，發(fā)酵室可以將正在進(jìn)行連續(xù)還原的發(fā)酵封閉。這種情況下，可以創(chuàng)造穩(wěn)定的還原環(huán)境。通過二氧化碳的釋放(以氣體形式)可以保持電子平衡。提高NAD/H和NADP/H平衡的努力也可以有助于穩(wěn)定電子平衡。通過改造宿主細(xì)胞以表達(dá)NADH:NADPH轉(zhuǎn)氫酶，也可以增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)NADPH的可利用性。一個或多個NADH:NADPH轉(zhuǎn)氫酶的表達(dá)將糖酵解中產(chǎn)生的NADH轉(zhuǎn)變?yōu)镹ADPH，所述NADPH可以增強(qiáng)醛、烷和/或烯的產(chǎn)生。對于小規(guī)模生產(chǎn)，改造的宿主細(xì)胞可以在例如約100mL、500mL、1L、2L、5L或10L的批量中生長；發(fā)酵；并且基于合適的質(zhì)粒中所編碼的特定基因，經(jīng)誘導(dǎo)而表達(dá)所需醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，攜帶pBAD24(具有氨芐西林抗性和醛、脂肪醇、烷或烯合成途徑)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰CoA/丙二酰CoA超表達(dá)系統(tǒng))的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞可以在2L瓶中、37℃下、在補(bǔ)充了75μg/mL氨芐西林和50μg/mL卡那霉素的500mLLB培養(yǎng)基中、以大于200rpm振蕩孵育過夜，直到培養(yǎng)物達(dá)到大于0.8的OD600。當(dāng)達(dá)到大于0.8的OD600時，細(xì)胞可以補(bǔ)充25mM丙酸鈉(pH8.0)以激活用于生產(chǎn)的改造的基因系統(tǒng)，并且通過激活UmuC和UmuD蛋白阻止細(xì)胞增殖。誘導(dǎo)可以在30℃進(jìn)行6小時。孵育后，可以使用GC-MS檢查培養(yǎng)基的醛、脂肪醇、烷和/或烯。對于大規(guī)模生產(chǎn)，改造的宿主細(xì)胞可以在10L、100L、1000L或更大的批量中生長；發(fā)酵；并且基于合適的質(zhì)粒中所編碼的特定基因，經(jīng)誘導(dǎo)而表達(dá)所需醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，攜帶pBAD24(具有氨芐西林抗性和醛、脂肪醇、烷或烯合成途徑)以及pUMVC1(具有卡那霉素抗性和乙酰CoA/丙二酰CoA超表達(dá)系統(tǒng))的大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞可以按照500mL種子培養(yǎng)物(seedculture)對應(yīng)10L發(fā)酵物(5L對應(yīng)100L發(fā)酵物等)在具有50μg/mL卡那霉素和75μg/mL氨芐西林的LB培養(yǎng)基(無甘油)中37℃進(jìn)行孵育并以大于200rpm振蕩，直到培養(yǎng)物達(dá)到大于0.8的OD600(通常16小時)?？梢猿掷m(xù)補(bǔ)充培養(yǎng)基以保持25mM丙酸鈉(pH8.0)，從而激活用于生產(chǎn)的改造的基因系統(tǒng)并且通過激活umuC和umuD蛋白阻止細(xì)胞增殖。培養(yǎng)基可以持續(xù)補(bǔ)充葡萄糖以保持25g/100mL的濃度。第一小時的誘導(dǎo)后，可以每小時移除不多于10％的全部細(xì)胞體積的等分部分并允許其靜置而不搖動以允許醛、烷和/或烯上升至表面并經(jīng)歷自發(fā)的相分離。然后可以收集醛、脂肪醇、烷和/或烯組分，并且將水相返回到反應(yīng)室。可以連續(xù)操作反應(yīng)室。當(dāng)OD600下降至0.6以下時，可以用生長自種子培養(yǎng)物的新批次替換細(xì)胞。使用無細(xì)胞方法產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和烯在本文所述的一些方法中，可以使用本文所述的純化的多肽和本文所述的底物產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和/或烯?？梢愿脑焖拗骷?xì)胞以表達(dá)如本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯生物合成多肽或變體?？梢栽谶m于允許多肽表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。然后，可以使用已知方法產(chǎn)生無細(xì)胞提取物。例如，可以使用去垢劑或通過超聲處理裂解宿主細(xì)胞?？梢允褂靡阎椒兓磉_(dá)的多肽。獲得無細(xì)胞提取物后，可以將本文所述的底物添加到所述無細(xì)胞提取物并保持在允許所述底物轉(zhuǎn)變?yōu)槿?、脂肪醇、烷?或烯的條件下。然后，可以使用已知技術(shù)分離并純化醛、脂肪醇、烷和/或烯。產(chǎn)生后加工在發(fā)酵中產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以從發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。可以使用用于從水性培養(yǎng)基分離醛、脂肪醇、烷和/或烯的任何已知技術(shù)。一個示例性分離過程是兩相(twophase)(兩相(bi-phasic))分離過程。該過程涉及使遺傳改造的宿主細(xì)胞在足以產(chǎn)生醛、脂肪醇、烷和/或烯的條件下發(fā)酵，允許醛、脂肪醇、烷和/或烯收集在有機(jī)相中并從水性發(fā)酵液分離該有機(jī)相。該方法可以在批次和連續(xù)發(fā)酵環(huán)境中實施。兩相分離利用醛、脂肪醇、烷和/或烯的相對不混溶性促進(jìn)分離。不混溶是指化合物相對不溶于水的能力并且由化合物的分配系數(shù)定義。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，通過選擇發(fā)酵液和有機(jī)相，使產(chǎn)生的醛、烷和/或烯具有高logP值，在發(fā)酵容器中醛、烷和/或烯即使處于非常低的濃度也可以分離到有機(jī)相。通過本文所述的方法產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯，在發(fā)酵液以及細(xì)胞質(zhì)中可以是相對不混溶的。因此，醛、脂肪醇、烷和/或烯可以細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外地收集在有機(jī)相中。有機(jī)相中產(chǎn)物的收集可以減輕醛、脂肪醇、烷和/或烯對細(xì)胞功能的影響并可以允許宿主細(xì)胞產(chǎn)生更多產(chǎn)物。本文所述的方法可以導(dǎo)致同種化合物的產(chǎn)生，其中至少約60％、70％、80％、90％或95％的產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯會具有改變少于約6個碳、少于約4個碳或少于約2個碳的碳鏈長度。也可以產(chǎn)生具有相對一致的飽和度的這些化合物。這些化合物可以直接用作燃料、燃料添加劑、特種化學(xué)品、用于生產(chǎn)其他化學(xué)化合物(例如聚合物、表面活性劑、塑料、紡織品、溶劑、粘合劑等)的起始原料或個人護(hù)理產(chǎn)品添加劑。這些化合物也可以用作例如氫化、催化裂解(通過氫化、熱解或兩者)的后續(xù)反應(yīng)的原料以制造其他產(chǎn)品。在一些實施方案中，使用本文所述的方法產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以含有約50％至約90％的碳；或約5％至約25％的氫。在其他實施方案中，使用本文所述的方法產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以含有約65％至約85％的碳；或約10％至約15％的氫。燃料組合物和特種化學(xué)品組合物本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯可以用作或轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂匣蛱胤N化學(xué)品。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，取決于燃料或特種化學(xué)品的既定目的，可以產(chǎn)生和使用不同的醛、脂肪醇、烷和/或烯。例如，分支醛、脂肪醇、烷和/或烯對于意圖在寒冷氣候中使用的汽車燃料是理想的。此外，當(dāng)本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯用作燃料或特種化學(xué)品生產(chǎn)的原料時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，醛、脂肪醇、烷和/或烯原料的特性會影響所產(chǎn)生的燃料或特種化學(xué)品的特性。因此，可以通過生產(chǎn)特定的醛、脂肪醇、烷和/或烯用作原料來選擇燃料或特種化學(xué)品產(chǎn)品的特性。使用本文所述的方法，可以從醛、脂肪醇、烷和/或烯中產(chǎn)生具有所需燃料品質(zhì)的生物燃料。生物學(xué)產(chǎn)生的醛、脂肪醇、烷和/或烯代表生物燃料的新來源，其可以被用作噴氣燃料、柴油或汽油。一些使用醛、脂肪醇、烷和/或烯制造的生物燃料未從可再生資源產(chǎn)生過，并且是新的物質(zhì)組合物。基于雙重碳同位素指紋譜，這些新燃料或特種化學(xué)品可以區(qū)別于來自石化產(chǎn)品的碳的燃料或特種化學(xué)品。此外，可以通過雙重碳同位素指紋譜確定生物來源的碳的具體來源(例如葡萄糖與甘油相比)(參見，例如美國專利第7,169,588號，特別是第4欄第31行至第6欄第8行)。基于14C(fM)和雙重碳同位素指紋譜，醛、脂肪醇、烷和/或烯及相關(guān)的生物燃料、特種化學(xué)品和混合物可以區(qū)別于其來源于石油化學(xué)品的對應(yīng)物。在一些實施例中，生物燃料組合物中的醛、脂肪醇、烷和/或烯的現(xiàn)代碳(fM14C)部分可以為例如至少約1.003、1.010或1.5。在一些實施例中，可以制備生物燃料組合物，其包括δ13C為約-15.4至約-10.9的醛、脂肪醇、烷和/或烯，其中所述醛、脂肪醇、烷和/或烯占據(jù)組合物中至少約85％的生物來源材料(即來自可再生資源，例如生物量、纖維素原料和糖)。區(qū)別這些生物來源的產(chǎn)品的能力對于在商業(yè)中追蹤這些材料是有益的。例如，包含生物來源的和基于石油的碳同位素譜兩者的燃料或特種化學(xué)品可以區(qū)別于僅由基于石油的原料制造的燃料和特種化學(xué)品。因此，本文所述的醛、脂肪醇、烷和/或烯作為生物燃料，可基于其獨特的譜在商業(yè)中進(jìn)行跟蹤或在商業(yè)中進(jìn)行鑒定。此外，可以鑒定出其他競爭材料是生物來源的或來自石油化學(xué)資源。燃料添加劑用于增強(qiáng)燃料或發(fā)動機(jī)的性能。例如，燃料添加劑可以用于改變凍/凝點、濁點、潤滑性、粘性、氧化穩(wěn)定性、點火性能、辛烷水平和/或閃點。在美國，所有的燃料添加劑必須在環(huán)境保護(hù)署(EnvironmentalProtectionAgency)注冊。通過聯(lián)系EPA或通過瀏覽EPA的網(wǎng)站可公開獲取燃料添加劑的名稱和銷售該燃料添加劑的公司。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解到，本文所述的基于醛的和/或基于烷的生物燃料可以與一種或多種燃料添加劑混合以賦予所需品質(zhì)。本文所述的基于醛、脂肪醇、烷和/或烯的生物燃料可以與其他燃料混合，例如各種醇，如乙醇和丁醇，和石油來源的產(chǎn)品，如汽油、柴油或噴氣燃料。在一些實施例中，所述混合物可以包括至少約10％、15％、20％、30％、40％、50％或60％重量的醛、脂肪醇、烷或烯。在其他實例中，可以制備這樣的生物燃料組合物：其包括至少約5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的醛、脂肪醇、烷或烯，所述醛、脂肪醇、烷或烯包括長度為8、10、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22個碳的碳鏈。這類生物燃料組合物可以另外包括至少一種選自以下的添加劑：可以將濁點降低至低于約5℃或0℃的降低濁點添加劑、表面活性劑、微乳化液、至少約5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％的來自甘油三酸酯的柴油燃料、石油來源的汽油或來自石油的柴油燃料。實施例以下實施例進(jìn)一步描述了本發(fā)明，這些實施例并不限制權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍。實施例1.選擇的藍(lán)細(xì)菌中烷生物合成的檢測和驗證選擇七種藍(lán)細(xì)菌用于烷生物合成的驗證和檢測，所述藍(lán)細(xì)菌的全基因組序列可公開獲取：細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942、細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC6301、多變魚腥藍(lán)細(xì)菌ATCC29413、集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102、無類囊體藍(lán)細(xì)菌ATCC29082和海洋原綠球菌CCMP1986。該名單中僅前三個藍(lán)細(xì)菌菌株據(jù)報道含有烷(Hanetal.,J.Am.Chem.Soc.91:5156-5159(1969)；Fehleretal.,Biochem.9:418-422(1970))。菌株在振蕩瓶中100mL合適的培養(yǎng)基(在表8中列出)中在30℃、以約3500lux的光強(qiáng)度光合自養(yǎng)生長3-7天。按照以下提取細(xì)胞用于檢測烷：來自1mL培養(yǎng)體積的細(xì)胞以13,000rpm離心1分鐘，細(xì)胞團(tuán)在甲醇中重懸，渦漩1分鐘并然后超聲處理30分鐘。以13000rpm離心3分鐘后，將上清轉(zhuǎn)移到新的小瓶并通過GC-MS進(jìn)行分析。在30mDP-5毛細(xì)柱(0.25mm內(nèi)徑)或30m高溫DP-5毛細(xì)柱(0.25mm內(nèi)徑)使用以下方法分析樣品。1μL無分流進(jìn)樣(入口溫度保持在300℃)到GC/MS柱后，烘箱保持在100℃持續(xù)3分鐘。以20℃/分鐘的速率將溫度升至320℃。烘箱保持在320℃再持續(xù)5分鐘。運載氣體氦的流速是1.3mL/分鐘。MS四極子從50至550m/z進(jìn)行掃描。產(chǎn)物峰的保留時間和裂解譜與權(quán)威參考進(jìn)行比較以確認(rèn)峰的一致性。七個菌株中，六個主要產(chǎn)生十七烷以及一個產(chǎn)生十五烷(海洋原綠球菌CCMP1986)；這些菌株中的一個除十七烷外還產(chǎn)生甲基-十七烷(多變魚腥藍(lán)細(xì)菌ATCC29413)(參見表8)。因此，證實了三種先前報道的藍(lán)細(xì)菌中的烷生物合成并且在先前不知產(chǎn)生烷的四種藍(lán)細(xì)菌中檢測到烷生物合成：海洋原綠球菌CCMP1986(參見圖1)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102(參見圖2)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌ATCC29082(參見圖3)和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803(參見圖4)。圖1A描述了用甲醇提取的海洋原綠球菌CCMP1986細(xì)胞的GC/MS追蹤。7.55分鐘時的峰與十五烷(Sigma)具有相同的保留時間。在圖1B中，顯示了十五烷峰的質(zhì)量裂解譜。212峰對應(yīng)于十五烷的分子量。圖2A描述了用甲醇提取的點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102細(xì)胞的GC/MS追蹤。8.73分鐘時的峰與十七烷(Sigma)具有相同的保留時間。在圖2B中，顯示了十七烷峰的質(zhì)量裂解譜。240峰對應(yīng)于十七烷的分子量。圖3A描述了用甲醇提取的無類囊體藍(lán)細(xì)菌ATCC29082細(xì)胞的GC/MS追蹤。8.72分鐘時的峰與十七烷(Sigma)具有相同的保留時間。在圖3B中，顯示了十七烷峰的質(zhì)量裂解譜。240峰對應(yīng)于十七烷的分子量。圖4A描述了用甲醇提取的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803細(xì)胞的GC/MS追蹤。7.36分鐘時的峰與十七烷(Sigma)具有相同的保留時間。在圖4B中，顯示了十七烷峰的質(zhì)量裂解譜。240峰對應(yīng)于十七烷的分子量。表8.選擇的藍(lán)細(xì)菌中檢測到的碳?xì)浠衔飳嵤├?.集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803中sll0208和sll0209基因的缺失導(dǎo)致烷生物合成的丟失集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803的編碼推定的脫羰酶(sll0208；NP_442147)(SEQIDNO:3)和生成醛的酶(sll0209；NP_442146)(SEQIDNO:67)的基因按照以下方式缺失。分別使用引物sll0208/9-KO1(CGCGGATCCCTTGATTCTACTGCGGCGAGT)與引物sll0208/9-KO2(CACGCACCTAGGTTCACACTCCCATGGTATAACAGGGGCGTTGGACTCCTGTG)以及引物sll0208/9-KO3(GTTATACCATGGGAGTGTGAACCTAGGTGCGTGGCCGACAGGATAGGG-CGTGT)與引物sll0208/9-KO4(CGCGGATCCAACGCATCCTCACTAGTCGGG)，擴(kuò)增約1kb的上游和下游側(cè)翼DNA。PCR產(chǎn)物用于使用引物sll0208/9-KO1和sll0208/9-KO4的交叉(cross-over)PCR中，以擴(kuò)增約2kb的sll0208/sll0209缺失盒，該缺失盒被克隆到克隆載體pUC19的BamHI位點。然后，使用引物Kan-aph-F(CATGCCATGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTG)和Kan-aph-R(CTAGTCTAGAGCGCTGAGGTCTGCCTCGTGAA)，從質(zhì)粒pRL27(Larsenetal.,Arch.Microbiol.178:193(2002))擴(kuò)增卡那霉素抗性盒(aph、KanR)，然后用NcoI和XbaI切除所述卡那霉素抗性盒并克隆到sll0208/sll0209缺失盒的NcoI和AvrII位點，從而在pUC19中創(chuàng)造了sll0208/sll0209缺失、KanR插入盒。將不在藍(lán)細(xì)菌中復(fù)制的含有盒的載體轉(zhuǎn)化到集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803中(Zangetal.,2007,J.Microbiol.,vol.45,pp.241)，并且在30℃下，在裝備光源的孵育器中，在含有100μg/mL卡那霉素的BG-11瓊脂平皿上選擇轉(zhuǎn)化體(例如通過雙重同源重組的染色體整合體)。將卡那霉素抵抗的菌落再畫線一次并然后利用使用診斷引物的PCR進(jìn)行基因型分析。將確認(rèn)的缺失-插入突變體在裝備光源的振蕩孵育器中的12mL具有50μg/mL卡那霉素的BG11培養(yǎng)基中于30℃培養(yǎng)4天。然后離心1mL的培養(yǎng)基(1分鐘、13,000g)并且用0.1mL甲醇提取細(xì)胞團(tuán)。提取后，將樣品再次離心，并且如實施例1中所述，將上清進(jìn)行GC-MS分析。如圖5中所示，sll0208和sll0209基因缺失的集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803菌株丟失其產(chǎn)生十七烯和十八烯醛的能力。該結(jié)果表明，集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803中的sll0208和sll0209基因和其他藍(lán)細(xì)菌中的直系同源基因(參見表1)負(fù)責(zé)這些生物中烷和脂肪醛生物合成。實施例3.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594的異源表達(dá)大腸桿菌中脂肪醛和脂肪醇的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594(YP_400611；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:65)的基因組DNA，并克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體(“OP80-PCC7942_1594”)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并且使細(xì)胞于37℃在具有1％(w/v)葡萄糖作為碳源并補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.8-1.0時，用1mMIPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，并且使細(xì)胞在37℃再生長18-20小時。用0.5mL乙酸乙酯提取來自0.5mL培養(yǎng)物的細(xì)胞。超聲處理60分鐘后，將樣品以15000rpm離心5分鐘。如實施例1中所述，通過GC-MS分析溶劑層。如圖6所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594的載體所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生以下脂肪醛和脂肪醇：十六烷醛、十八烯醛、十四烯醇、十六烯醇、十六烷醇和十八烯醇。該結(jié)果表明PCC7942orf1594(i)體內(nèi)生成作為脫羰的可能底物的醛，并且(ii)可以還原作為底物的?；鵄CP，?；鵄CP是野生型大腸桿菌細(xì)胞中最充足的活化脂肪酸的形式。因此，該酶被稱為?；鵄CP還原酶。在體內(nèi)，脂肪醛顯然是通過內(nèi)源大腸桿菌醛還原酶活性被進(jìn)一步還原為對應(yīng)的脂肪醇。實施例4.通過藍(lán)絲菌ATCC51142cce_1430的異源表達(dá)大腸桿菌中脂肪醛和脂肪醇的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼藍(lán)絲菌ATCC51142cce_1430(YP_001802846；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:69)的基因組DNA，并克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并且使細(xì)胞于37℃在具有1％(w/v)葡萄糖作為碳源并補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖7所示，用攜帶藍(lán)絲菌ATCC51142cce_1430的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生以下脂肪醛和脂肪醇：十六烷醛、十八烯醛、十四烯醇、十六烯醇、十六烷醇和十八烯醇。該結(jié)果表明ATCC51142cce_1430(i)體內(nèi)生成作為脫羰的可能底物的醛，并且(ii)可以還原作為底物的酰基ACP，?；鵄CP是野生型大腸桿菌細(xì)胞中最充足的活化脂肪酸的形式。因此，該酶也是?；鵄CP還原酶。實施例5.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orfl593的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orfl593(YP_400610；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:1)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖8所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1593的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的PCC7942_1593分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦⒁虼耸腔钚灾救┟擊拭?。實施?.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:5)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖9所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Npun02004178分別將十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭椤⑹逑?、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208(NP_442147；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:3)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖10中所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Npun02004178分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283(NP_489323；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:7)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖11所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的alr5283分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:9)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:46)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖12所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的AM1_4041分別將十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭?、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?0.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌BP-1tll1313的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌BP-1till1313(NP_682103；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:11)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:47)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖13中所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶細(xì)長嗜熱聚球藍(lán)細(xì)菌BP-1till1313的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的till1313分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?1.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和聚球藍(lán)細(xì)菌JA-3-3AbCYA_0415的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼聚球藍(lán)細(xì)菌JA-3-3AbCYA_0415(YP_473897；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:13)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:48)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖14所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶聚球藍(lán)細(xì)菌JA-3-3AbCYA_0415的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Npun02004178分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦⒁虼耸腔钚灾救┟擊拭?。實施?2.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146(NP_926092；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:15)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖15所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的gll3146分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?3.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和海洋原綠球菌MIT9313PMT1231的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼海洋原綠球菌MIT9313PMT1231(NP_895059；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:17)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:49)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MG1655，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖16所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶海洋原綠球菌MIT9313PMT1231的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的PMT1231分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?4.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:19)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖17所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的PMM0532分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦⒁虼耸腔钚灾救┟擊拭?。實施?5.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和海洋原綠球菌NATL2APMN2A_1863的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼海洋原綠球菌NATL2APMN2A_1863(YP_293054；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:21)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:51)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖18所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶海洋原綠球菌NATL2APMN2A_1863的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的PMN2A_1863分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?6.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_09941的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_09941(ZP_01079772；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:23)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:52)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖19所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_09941的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的RS9917_09941分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦?，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?7.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_12945的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生對編碼聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_12945(ZP_01080370；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:25)的基因組DNA進(jìn)行密碼子優(yōu)化，用于在大腸桿菌中表達(dá)(SEQIDNO:53)，合成并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖20所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917RS9917_12945的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的RS9917_12945分別將十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭逋楹褪呦⒁虼耸腔钚灾救┟擊拭?。實施?8.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和藍(lán)絲菌ATCC51142cce_0778的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生合成編碼藍(lán)絲菌ATCC51142cce_0778(YP_001802195；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:27)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化入大腸桿菌MG1655，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖21所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶藍(lán)絲菌ATCC51142cce_0778的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的ATCC51142cce_0778分別將十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭椤⑹逑?、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?9.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_0398的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生合成編碼藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_0398(YP_002481151；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:29)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖22所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_0398的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Cyan7425_0398分別將十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭?、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?0.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_2986的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生合成編碼藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_2986(YP_002483683；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:31)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖23所示，用攜帶細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和攜帶藍(lán)絲菌PCC7425Cyan7425_2986的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了與實施例3相同的脂肪醛和脂肪醇，但還產(chǎn)生了十三烷、十五烯、十五烷和十七烯。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Cyan7425_2986分別將十四烷醛、十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛轉(zhuǎn)變?yōu)槭?、十五烯、十五烷和十七烯，并因此是活性脂肪醛脫羰酶。實施?1.通過海洋原綠球菌CCMP1986PMM0533和海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼海洋原綠球菌CCMP1986PMM0533(NP_892651；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:71)和海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(NP_892650；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:19)的基因組DNA，并分別克隆到載體OP-80的NcoI與EcoRI位點和載體OP-183的NdeI與XhoI位點。將得到的構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化入及共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖24A所示，僅用攜帶海洋原綠球菌CCMP1986PMM0533的載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞不產(chǎn)生了任何脂肪醛或脂肪醇。但是，用攜帶PMM0533和攜帶PMM0532的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了十六烷醇、十五烷和十七烯(圖24B)。該結(jié)果表明當(dāng)PMM0533與例如PMM0532的脫羰酶相互作用時，PMM0533僅提供用于脫羰反應(yīng)的脂肪醛底物。實施例22.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041的異源表達(dá)在產(chǎn)生脂肪酰CoA的大腸桿菌菌株中烷和烯的產(chǎn)生合成編碼海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(YP_001518340；推定的脂肪醛脫羰酶)(SEQIDNO:9)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體與OP80-PCC7942_1594共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD中。在Ptrc啟動子的控制下，該菌株表達(dá)細(xì)胞質(zhì)形式的大腸桿菌硫酯酶、‘TesA和大腸桿菌酰基CoA合成酶、FadD，并因此產(chǎn)生脂肪酰CoAs。使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖25所示，用細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041共轉(zhuǎn)化的這些大腸桿菌細(xì)胞也產(chǎn)生了烷和脂肪醇。該結(jié)果表明細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942_1594能利用?；鵆oA作為底物產(chǎn)生十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛，然后所述十六烯醛、十六烷醛和十八烯醛被海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041分別轉(zhuǎn)變?yōu)槭逑⑹逋楹褪呦?。實施?3.通過集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209和集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208的異源表達(dá)在產(chǎn)生脂肪酰CoA的大腸桿菌菌株中烷和烯的產(chǎn)生合成編碼集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208(NP_442147；推定的脂肪醛脫羰酶)(SEQIDNO:3)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。合成編碼集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209(NP_442146；?；鵄CP還原酶)(SEQIDNO:67)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NcoI與EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA-fadD。在Ptrc啟動子的控制下，該菌株表達(dá)細(xì)胞質(zhì)形式的大腸桿菌硫酯酶、‘TesA和大腸桿菌?；鵆oA合成酶、FadD，并因此產(chǎn)生了脂肪酰CoAs。使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例26中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖26所示，用集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209轉(zhuǎn)化的這些大腸桿菌細(xì)胞不產(chǎn)生任何脂肪醛或脂肪醇。但是，當(dāng)用集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208和sll0209共轉(zhuǎn)化時，它們產(chǎn)生了烷、脂肪醛和脂肪醇。該結(jié)果表明集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0209能利用?；鵆oA作為底物產(chǎn)生例如十四烷醛、十六烷醛和十八烯醛的脂肪醛，但只有與脂肪醛脫羰酶共表達(dá)時。脂肪醛顯然是通過內(nèi)源大腸桿菌醛還原酶活性被進(jìn)一步還原為對應(yīng)的脂肪醇、十四烷醇、十六烷醇和十八烯醇。在本實驗中，十八烯醛被集胞藍(lán)細(xì)菌PCC6803sll0208轉(zhuǎn)變?yōu)槭呦?。實施?4.通過點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178和其一些同系物的異源表達(dá)在產(chǎn)生脂肪醛的大腸桿菌菌株中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；推定的脂肪醛脫羰酶)(SEQIDNO:5)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。擴(kuò)增編碼恥垢分枝桿菌菌株MC2155orfMSMEG_5739(YP_889972，推定的羧酸還原酶)(SEQIDNO:85)的基因組DNA，并克隆到載體OP-180(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。將兩個得到的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA中。在該菌株中，脂肪醛由MSMEG_5739提供，所述MSMEG_5739將游離脂肪酸(通過‘TesA的作用形成)還原為脂肪醛。使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和100μg/mL羧芐青霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞，并且如實施例1中所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖27所示，用攜帶點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178和攜帶恥垢分枝桿菌菌株MC2155MSMEG_5739的載體共轉(zhuǎn)化的這些大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了十三烷、十五烯和十五烷。該結(jié)果表明大腸桿菌中的Npun02004178將羧酸還原酶MSMEG_5739提供的十四烷醛、十六烯醛和十六烷醛還原為十三烷、十五烯和十五烷。如圖28所示，在建立的相同實驗中，以下脂肪醛脫羰酶在大腸桿菌MG1655ΔfadElacZ::Ptrc‘tesA中表達(dá)時，也將MSMEG_5739提供的脂肪醛轉(zhuǎn)變?yōu)閷?yīng)的烷：念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283(SEQIDNO:7)、海洋原綠球菌CCMP1986PMM0532(SEQIDNO:19)、無類囊體藍(lán)細(xì)菌PCC7421gll3146(SEQIDNO:15)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS9917_09941(SEQIDNO:23)、聚球藍(lán)細(xì)菌RS991712945(SEQIDNO:25)和海濱藍(lán)藻菌MBIC11017AM1_4041(SEQIDNO:9)。實施例25：藍(lán)細(xì)菌脂肪醛脫羰酶屬于非血紅素二鐵蛋白類。點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178中保守組氨酸定點誘變?yōu)楸奖彼岵粡U除其催化功能如實施例13中所討論的，來自海洋原綠球菌MIT9313(SEQIDNO:18)的假定的蛋白PMT1231是活性脂肪醛脫羰酶。根據(jù)可以分辨率獲得的PMT1231的三維結(jié)構(gòu)(pdb2OC5A)(參見圖29B)，藍(lán)細(xì)菌脂肪醛脫羰酶與非血紅素二鐵蛋白具有結(jié)構(gòu)相似性，特別是與I型核糖核酸酶還原酶亞基β蛋白RNRβ(StubbeandRiggs-Gelasco,TIBS1998,vol.23.,pp.438)(參見圖29A)。Ia型和Ib型RNRβ含有介導(dǎo)RNRα的催化活性的二高鐵酪氨?；?核糖核苷酸還原為脫氧核糖核苷酸)。在大腸桿菌RNRβ中，該酪氨酸在位置122處，并且緊鄰于一個活性位點的鐵分子。結(jié)構(gòu)比對表明，PMT1231在與RNRbtyr122相同的位置含有苯丙氨酸，這提示藍(lán)細(xì)菌脂肪醛脫羰酶的不同催化機(jī)制。但是，所有脫羰酶的比對表明，在所有序列中兩個酪氨酸殘基都是完全保守的，對于PMT1231，為tyr135和tyr138，tyr135緊鄰一個活性位點的鐵分子(參見圖29C)。為了研究兩個保守酪氨酸殘基之一是否參與藍(lán)細(xì)菌脂肪醛脫羰酶的催化機(jī)制，按照以下，在Npun02004178(tyr123和tyr126)中用苯丙氨酸替換這些殘基。將編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942ORF1594(SEQIDNO:65)的基因組DNA克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。也將編碼點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)的基因組DNA克隆到載體OP-183(pACYC177衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。用后一構(gòu)建體作模板以在脫羰酶蛋白的位置123和126引入突變，分別使用引物gttttgcgatcgcagcatttaacatttacatccccgttgccgacg和gttttgcgatcgcagcatataacattttcatccccgttgccgacg將酪氨酸改變?yōu)楸奖彼帷Ｈ缓髮⒌玫降臉?gòu)建體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中。使細(xì)胞于37℃在補(bǔ)充了1％葡萄糖(w/v)和100μg/mL羧芐青霉素與壯觀霉素的M9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例3培養(yǎng)和提取細(xì)胞。如圖30所示，兩個Npun02004178Tyr至Phe蛋白變體當(dāng)與細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942ORF1594共表達(dá)時，是有活性的并產(chǎn)生了烷。該結(jié)果表明與Ia型和Ib型RNRβ蛋白相反，脂肪醛脫羰酶的催化機(jī)制不涉及酪氨?；嵤├?6：點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178的生物化學(xué)表征將編碼點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(SEQIDNO:5)的基因組DNA克隆到載體pET-15b的NdeI和XhoI位點，受T7啟動子控制。得到的Npun02004178蛋白含有N末端His標(biāo)簽。通過常規(guī)化學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)，用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株(DE3)(Invitrogen)。通過以下進(jìn)行蛋白表達(dá)：首先將大腸桿菌菌株的菌落接種在5mL補(bǔ)充了100mg/L羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，并在37℃振蕩過夜，以產(chǎn)生起始培養(yǎng)物。用該起始培養(yǎng)物接種0.5L補(bǔ)充了100mg/L羧芐青霉素的LB培養(yǎng)基。在37℃振蕩培養(yǎng)物，直到OD600值達(dá)到0.8，并然后添加IPTG至1mM的終濃度。然后，在37℃振蕩培養(yǎng)物約3小時。然后，在4℃將培養(yǎng)物以3700rpm離心20分鐘。然后，將小團(tuán)重懸于10mL含有100mM磷酸鈉緩沖液的、pH7.2的、補(bǔ)充了細(xì)菌蛋白酶逮捕劑(BacterialProteaseArrest)(GBiosciences)的緩沖液中。然后，將細(xì)胞在冰上用12W以1.5秒的超聲然后靜置1.5秒，處理9秒。將該操作5次重復(fù)，每個超聲處理循環(huán)之間間隔1分鐘。在4℃，將無細(xì)胞提取物以10000rpm離心30分鐘。將5mL的Ni-NTA(Qiagen)添加到上清，并將混合物在4℃輕微攪動。使?jié){液通過柱，從裂解液去除樹脂。然后，用30mL含有100mM磷酸鈉緩沖液的、pH7.2的、外加30mM咪唑的緩沖液洗滌樹脂。最后，用10mLpH7.2的、外加250mM咪唑的100mM磷酸鈉緩沖液洗脫蛋白。用200體積pH7.2的、具有20％甘油的100mM磷酸鈉緩沖液透析蛋白溶液。使用Bradford檢測(Biorad)測定蛋白濃度。獲得5.6mg/mL的Npun02004178蛋白。為了合成用于脫羰酶反應(yīng)的十八烷醛，將500mg的十八烷醇(Sigma溶解于25mL二氯甲烷。然后，將200mg的氯鉻酸吡啶(TCIAmerica)添加到溶液中并攪動過夜。在真空下干燥反應(yīng)混合物以去除二氯甲烷。將剩余產(chǎn)物重懸于己烷中并通過Whatman濾紙進(jìn)行過濾。然后，在真空下干燥濾出液，并且重懸于5mL的己烷中，并通過二氧化硅快速色譜進(jìn)行純化。將己烷中的混合物上樣到重力供給柱(gravityfedcolumn)，然后用兩個柱體積的己烷進(jìn)行洗滌。然后，用8:1的己烷和乙酸乙酯的混合物洗脫十八烷醛。收集含有十八烷醛的部分并使用下文所述的GC/MS方法進(jìn)行分析。通過本方法測定的最終產(chǎn)物純度為95％。為了測試Npun02004178蛋白脫羰活性，建立以下酶檢測。在具有以下組分的、pH7.2的、100mM磷酸鈉緩沖液中建立200μL反應(yīng)，所述以下組分為其各自的終濃度：30μM純化的Npun02004178蛋白、200μM十八烷醛、0.11μg/mL菠菜鐵氧還蛋白(Sigma)、0.05單位/mL菠菜鐵氧還蛋白還原酶(Sigma)和1mMNADPH(Sigma)。陰性對照包括沒有Npun02004178的以上反應(yīng)、沒有十八烷醛的以上反應(yīng)和沒有菠菜鐵氧還蛋白、鐵氧還蛋白還原酶和NADPH的以上反應(yīng)。每個反應(yīng)在用100μL乙酸乙酯提取前，在37℃孵育2小時。使用以下參數(shù)通過GC/MS分析樣品：運行時間：13.13分鐘；柱：HP-5-MSPartNo.19091S-433E(長度30米；I.D.：0.25mm窄徑；膜：0.25ìM)；進(jìn)樣：1ìlAgilent6850入口；入口：300C無分流；運載氣體：氦；流速：1.3mL/分鐘；烘烤溫度：75℃保持5分鐘、以40℃/分鐘到達(dá)320、320保持2分鐘；檢測器：Agilent5975BVLMSD；檢測器溫度：330℃；掃描：50-550M/Z。用Sigma的十七烷作為測定化合物保留時間和裂解譜的可信參考。如圖31所示，在Npun02004178的存在下，觀察到十八烷醛體外轉(zhuǎn)變?yōu)槭咄椤Ｍㄟ^Npun02004178的十八烷醛的酶促脫羰依賴于加入菠菜鐵氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋白和NADPH。接下來，確定了藍(lán)細(xì)菌鐵氧還蛋白和鐵氧還蛋白還原酶能否替代體外脂肪醛脫羰酶檢測中的菠菜蛋白。將以下4個基因各自克隆到pET-15b的NdeI和XhoI位點：點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003626(ZP_00109192，沒有n末端別藻藍(lán)蛋白連接物結(jié)構(gòu)域的鐵氧還蛋白氧化還原酶petH)(SEQIDNO:87)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02001001(ZP_00111633、鐵氧還蛋白1)(SEQIDNO:89)、點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003530(ZP_00109422，鐵氧還蛋白2)(SEQIDNO:91)和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02003123(ZP_00109501，鐵氧還蛋白3)(SEQIDNO:93)。如上文所述表達(dá)和純化這4種蛋白。獲得1mg/mL的每種鐵氧還蛋白和4mg/mL的鐵氧還蛋白氧化還原酶。使用較早描述的酶促安排，用藍(lán)細(xì)菌鐵氧還蛋白氧化還原酶進(jìn)行測試三種藍(lán)細(xì)菌鐵氧還蛋白，所述設(shè)置具有以下改動。鐵氧還蛋白還原酶的終濃度為60μg/mL，鐵氧還蛋白為50μg/mL。提取的酶促反應(yīng)是通過GC/MS，使用以下參數(shù)：運行時間：6.33分鐘；柱：J&W122-5711DB-5ht(長度15米；I.D.：0.25mm窄徑；膜：0.10μM)；進(jìn)樣：1μLAgilent6850入口；入口：300℃無分流；運載氣體：氦；流速：1.3mL/分鐘；烘烤溫度：100℃保持0.5分鐘、以30℃/分鐘到達(dá)260、260保持0.5分鐘；檢測器：Agilent5975BVLMSD；檢測器溫度：230℃；掃描：50-550M/Z。如圖32所示，在NADPH和藍(lán)細(xì)菌鐵氧還蛋白氧化還原酶以及三種藍(lán)細(xì)菌鐵氧還蛋白中任一種存在下，觀察到Npun02004178依賴的十八烷醛至十七烷的體外轉(zhuǎn)變。實施例27.細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594的生物化學(xué)表征將編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7492orf1594(SEQIDNO:65)的基因組DNA克隆到載體pET-28b的NcoI和XhoI位點，受T7啟動子控制。得到的PCC7942_orf1594蛋白含有C末端His標(biāo)簽。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株(DE3)(Invitrogen)并且按照實施例22所述表達(dá)和純化PCC7942_orf1594蛋白。蛋白溶液保存在以下緩沖液中：50mM磷酸鈉、pH7.5、100mMNaCl、1mMTHP、10％甘油。使用Bradford檢測(Biorad)測定蛋白濃度。獲得2mg/mL的PCC7942_orf1594蛋白。為了測試PCC7942_orf1594蛋白?；鵄CP或?；鵆oA還原酶活性，建立以下酶檢測。在具有以下組分的、pH7.5的、50mMTris-HCl緩沖液中建立100μL反應(yīng)，所述以下組分為其各自的終濃度：10μM純化的PCC7942_orf1594蛋白、0.01-1mM?；鵆oA或酰基ACP、2mMMgCl2、0.2-2mMNADPH。將反應(yīng)在37℃孵育1小時，并且添加100μL乙酸乙酯(含有5mg/11-十八烷烯作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn))時停止。將樣品渦漩15分鐘并且以最高速離心3分鐘，用于相分離。將80μL的頂層轉(zhuǎn)移到GC玻璃小瓶，并按照實施例26所述通過GC/MS進(jìn)行分析。根據(jù)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，計算所形成的醛的量。如圖33所示，PCC7942_orf1594能夠?qū)⑹送轷oA還原為十八烷醛。還原酶活性需要諸如Mg2+、Mn2+或Fe2+的二價陽離子和作為電子供體的NADPH。NADH不支持還原酶活性。PCC7942_orf1594也能夠?qū)⑹讼oA和十八烯酰-ACP還原為十八烯醛。在2mMNADPH的存在下，還原十八烷酰CoA、十八烯酰CoA和十八烯酰-ACP的Km值分別測定為45±20μM、82±22μM和7.8±2μM。這些結(jié)果表明，PCC7942_orf1594體外還原?；鵆oAs和?；鵄CPs，并且與酰基CoAs相比，該酶顯然對酰基ACPs具有更高的親和力。在用于PCC7942_orf1594的0.5mM十八烷酰CoA的存在下，NADPH的Km值測定為400±80μM。接下來，檢查了由PCC7942_orf1594催化的從NADPH到脂肪醛的立體特異性氫化物轉(zhuǎn)移。按照以下流程制備含氘NADPH。將5mgNADP+和3.6mgD-葡萄糖-1-d添加到2.5mL的50mM磷酸鈉緩沖液(pH7.0)。通過添加5單位的來自用于產(chǎn)生R-(4-2H)NADPH的巨大芽孢桿菌(USB公司)或用于產(chǎn)生S-(4-2H)NADPH的嗜酸熱原體(Thermoplasmaacidophilum)(Sigma)的葡萄糖脫氫酶，起始標(biāo)記的NADPH的酶促產(chǎn)生。將反應(yīng)在37℃孵育15分鐘，使用10KDaMWCOAmiconUltra離心濾器(Millipore)進(jìn)行離心過濾，在干冰上速凍并保存在-80℃。體外檢測反應(yīng)含有50mMTris-HCl(pH7.5)、10μM純化的PCC7942_orf1594蛋白、1mM十八烷酰CoA、2mMMgCl2和50μL含氘NADPH(按照上文所述制備)，總體積100μL。孵育1小時后，如上文所述提取并分析酶促反應(yīng)的產(chǎn)物。通過GC/MS檢測到的得到的脂肪醛為十八烷醛(參見圖34)。因為從NADPH的氫化物轉(zhuǎn)移是立體特異性的，所以合成了R-(4-2H)NADPH和S-(4-2H)NADPH。僅使用S-(4-2H)NADPH，觀察到具有加1的單位質(zhì)量的十八烷醛。脂肪醛被標(biāo)記的事實表明，含重氫的氫已經(jīng)從標(biāo)記的NADPH轉(zhuǎn)移到標(biāo)記的脂肪醛。這表明該酶反應(yīng)使用NADPH，并且由PCC7942_orf1594催化的氫化物轉(zhuǎn)移是立體特異性的。實施例28.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594的異源表達(dá)在大腸桿菌中脂肪醛和脂肪醇的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外產(chǎn)生擴(kuò)增編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594(YP_400611；?；鵄CP還原酶)(SEQIDNO:65)的基因組DNA，并克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655ΔfadE中，并且使細(xì)胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作為碳源的葡萄糖并分別補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和羧芐青霉素的Che-9基本培養(yǎng)基中生長。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到0.8-1.0時，用1mMIPTG誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物并且使細(xì)胞在37℃再生長24-48小時。Che-9基本培養(yǎng)基規(guī)定為：6g/LNa2HPO4、3g/LKH2PO4、0.5g/LNaCl、2g/LNH4Cl、0.25g/LMgSO4×7H2O、11mg/LCaCl2、27mg/LFe3Cl×6H2O、2mg/LZnCl×4H2O、2mg/LNa2MoO4×2H2O、1.9mg/LCuSO4×5H2O、0.5mg/LH3BO3、1mg/L硫胺、200mMBis-Tris(pH7.25)和0.1％(v/v)Triton-X100。當(dāng)培養(yǎng)物的OD600達(dá)到1.0-1.2時，用1mMIPTG誘導(dǎo)所述培養(yǎng)物并且允許細(xì)胞在37℃再生長40小時。如實施例26中所述，用0.5mL乙酸乙酯提取來自0.5mL培養(yǎng)物的細(xì)胞，用于總碳?xì)浠衔锂a(chǎn)生。此外，通過離心(4000g、室溫、10分鐘)分離細(xì)胞和上清，并分別提取。該培養(yǎng)物產(chǎn)生620mg/L脂肪醛(十四烷醛、十七烯醛、十七烷醛和十八烯醛)和1670mg/L脂肪醇(十二烷醇、十四烯醇、十四烷醇、十七烯醇、十七烷醇和十八烯醇)。圖35顯示提取的上清的色譜圖。經(jīng)測定，73％的脂肪醛和脂肪醇在無細(xì)胞上清中。實施例29.通過細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594和點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178的異源表達(dá)在大腸桿菌中烷和烯的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外產(chǎn)生擴(kuò)增基因組DNA編碼細(xì)長聚球藍(lán)細(xì)菌PCC7942orf1594(YP_400611；酰基ACP還原酶)(SEQIDNO:65)，并克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。擴(kuò)增編碼點狀念珠藍(lán)細(xì)菌PCC73102Npun02004178(ZP_00108838；脂肪醛脫羰酶)(SEQIDNO:5)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655ΔfadE中，并且使細(xì)胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作為碳源的葡萄糖并分別補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和羧芐青霉素的Che-9基本培養(yǎng)基中生長。按照實施例28中所述，使細(xì)胞生長、從培養(yǎng)基分離、提取和分析。該培養(yǎng)物產(chǎn)生了323mg/L烷和烯(十三烷、十五烯、十五烷和十七烯)、367mg/L脂肪醛(十四烷醛、十七烯醛、十七烷醛和十八烯醛)和819mg/L脂肪醇(十四烷醇、十七烯醇、十七烷醇和十八烯醇)。圖36表示提取的上清的色譜圖。經(jīng)測定，86％的烷、烯、脂肪醛和脂肪醇在無細(xì)胞上清中。實施例30.通過念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5284和念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283的異源表達(dá)大腸桿菌中烷和烯的產(chǎn)生擴(kuò)增編碼念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5284(NP_489324；推定的生成醛的酶)(SEQIDNO:81)的基因組DNA，并克隆到載體OP-80(pCL1920衍生物)的NcoI和EcoRI位點，受Ptrc啟動子控制。擴(kuò)增編碼念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283(NP_489323；推定的脫羰酶)(SEQIDNO:7)的基因組DNA，并克隆到載體OP-183(pACYC衍生物)的NdeI和XhoI位點，受Ptrc啟動子控制。將得到的構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌MG1655中，并且使細(xì)胞于37℃在15mL具有3％(w/v)作為碳源的葡萄糖并分別補(bǔ)充了100μg/mL壯觀霉素和羧芐青霉素的Che-9基本培養(yǎng)基中生長(如實施例28所述)。按照實施例3所述，提取和分析來自0.5mL培養(yǎng)物的細(xì)胞，并如實施例26所述通過GC-MS進(jìn)行分析。如圖37所示，用攜帶念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5284和攜帶念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5283的載體共轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生了十三烷、十五烯、十五烷、十四烷醇和十六烷醇。該結(jié)果表明念珠藍(lán)細(xì)菌PCC7210alr5284和alr5283的共表達(dá)足以使大腸桿菌產(chǎn)生脂肪醇、烷和烯。其他實施方案應(yīng)當(dāng)理解到，盡管對本發(fā)明結(jié)合其詳細(xì)的描述進(jìn)行了描述，但上文的描述意圖舉例說明而不是限制附加的權(quán)利要求的范圍所界定的本發(fā)明的范圍。其他方面、優(yōu)點和改動在以下權(quán)利要求的范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3