專利名稱：雙分枝聚唾液酸活性衍生物的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍 生物及其制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用。所述其它分子特別是蛋白質(zhì)和多肽 等大分子，本發(fā)明還涉及包含所述結(jié)合物的藥物組合物。
背景技術(shù)：
目前，藥物的種類繁多，就其分子量大小來分， 一般可分為兩大類 一類 分子量較低，通常在1000以下，絕大多數(shù)為常用的化學(xué)合成藥物和一些天然 藥物，如氮芥，順鉑，5-氟尿嘧啶，紫杉醇等都屬此列；另一類則分子量較大， 絕大多數(shù)由基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)和多肽藥物。但是無論小分子藥物還是大分 子藥物，都存在著毒性大，溶解性差，半衰期短等缺點(diǎn)。對(duì)蛋白質(zhì)和多肽藥物 還存在免疫原性的問題。
蛋白質(zhì)化學(xué)修飾技術(shù)是近年來快速發(fā)展的新興技術(shù)。利用基因工程方法生 產(chǎn)的多肽、蛋白質(zhì)類藥物在臨床應(yīng)用中往往存在穩(wěn)定性差、活性偏低、體內(nèi)半 衰期短、引起免疫反應(yīng)等問題，通過化學(xué)修飾可以有效改善上述不足之處，同 時(shí)，蛋白質(zhì)化學(xué)修飾也是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究的一個(gè)重要手段。
蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾是指通過以某些物質(zhì)如聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、肝素
等作為修飾劑與蛋白質(zhì)(多肽)的活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，從而達(dá)到改善蛋白質(zhì)性 質(zhì)，如解除異體蛋白質(zhì)免疫原性、毒副作用以及增加活性、提高穩(wěn)定性、延長(zhǎng) 體內(nèi)半衰期的目的。將具有生物相容性的聚合物連結(jié)藥物是解決問題的一個(gè)途
徑。聚唾液酸(Polysialic acid)是唾液酸(Sialic acid)單體以a-2, 8或a -2，9鍵連接的直鏈同聚物，是一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞中糖蛋白的組成部分和少數(shù)幾種細(xì)菌的胞外多糖組分。a -2， 8連接形式的PSA在細(xì)菌多糖中是唯一非免疫原 性的(不引起哺乳動(dòng)物個(gè)體內(nèi)的T細(xì)胞或抗體應(yīng)答)，即使與免疫原性載體蛋白 綴合連接時(shí)也是如此，這可以表現(xiàn)為其作為哺乳動(dòng)物(以及細(xì)菌)聚合物存在。 在廣泛分布于體內(nèi)的細(xì)胞表面神經(jīng)節(jié)苷脂中發(fā)現(xiàn)了較短的聚合物(最高為4)， 并認(rèn)為該較短聚合物可有效地導(dǎo)致并保持對(duì)PSA的免疫耐受性。近些年來己利 用了PSA的生物學(xué)特性，特別是a-2，8連接的均聚PSA的生物學(xué)特性，來改 變蛋白質(zhì)和低分子量藥物分子的藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。包括過氧化氫酶、天冬 酰胺酶和胰島素在內(nèi)的一些治療性蛋白的PSA衍生物，使得循環(huán)半衰期及其穩(wěn) 定性大幅度提高，并使得這些蛋白可用于應(yīng)對(duì)預(yù)存抗體。在很多方面，聚唾液 酸化蛋白質(zhì)改進(jìn)的性質(zhì)與用聚乙二醇(PEG)衍生的蛋白質(zhì)相當(dāng)。例如均提高了 半衰期，并且使蛋白質(zhì)和其在蛋白水解消化中更穩(wěn)定，但采用PSA時(shí)生物活性 的保持力似乎比PEG更強(qiáng)。在采用需要長(zhǎng)期給藥的治療劑時(shí)使用PEG也存在問 題，因?yàn)镻EG只能非常緩慢地生物降解，并且高分子量形式和低分子量形式均 易于在組織中積累。發(fā)現(xiàn)PEG化的蛋白質(zhì)能產(chǎn)生抗PEG的抗體，該抗PEG的抗 體也會(huì)影響綴合物在血液循環(huán)中的停留時(shí)間。盡管PEG作為與治療物綴合連接 的腸胃外給藥聚合物已有一定歷史，但仍需對(duì)其免疫毒理學(xué)、藥理學(xué)和代謝進(jìn) 行更深入的了解。同樣也對(duì)PEG在需要大劑量使用的治療劑中的應(yīng)用(因此最 終導(dǎo)致大劑量的PEG)有所擔(dān)憂，因?yàn)镻EG的積累可產(chǎn)生毒性。聚唾液酸應(yīng)用 于蛋白質(zhì)和多肽類藥物的可降解緩釋劑已取得良好效果。有望成為新一代的藥 物構(gòu)建體而顯著提高多肽、蛋白的藥學(xué)性能。具有重要作用和功能的蛋白質(zhì)類 藥物的聚唾液酸化修飾已經(jīng)在全球的生物制藥領(lǐng)域引起越來越多的關(guān)注英國(guó)
的LipoXen公司臨床試驗(yàn)了聚唾液酸化干擾素，發(fā)現(xiàn)其效果比PEG化的干擾素 的半衰期更長(zhǎng)；另外該公司還正在試驗(yàn)其他藥物如胰島素、天冬酰胺酶和人紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等。
在US05846951和W00187922描述了利用天然的PSA來改進(jìn)蛋白質(zhì)治療劑 的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。描述了依靠聚合物非還原端的化學(xué)衍生來產(chǎn)生蛋白質(zhì)反應(yīng) 活性醛基將多糖連接到治療劑上的方法。在W02005016973中，描述了由末端 唾液酸單元引入巰基反應(yīng)活性基團(tuán)的多糖衍生物。產(chǎn)物可用于蛋白質(zhì)的定位衍 生。在CN 101160326公開了一種新的PSA衍生物，其中還原和/或非還原端的 末端唾液酸被轉(zhuǎn)化為N-羥基琥珀酰亞胺酯(NHS)基因?？梢耘c含有胺基或肼基 團(tuán)的底物反應(yīng)。
盡管已經(jīng)描述的各種將PSA連接到治療藥劑上的方法在理論上是可行的， 但是為使蛋白與PSA非還原端(醛的形式)反應(yīng)生成的綴合物達(dá)到可接受的量， 所要求的反應(yīng)時(shí)間在較高溫度下將不利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。其次，所需的反應(yīng) 物濃度可能難以實(shí)現(xiàn)或不夠經(jīng)濟(jì)。
眾所周知，藥物高分子化后的性能和所用的高分子材料的結(jié)構(gòu)、分子量、 分子量分布以及高分子的構(gòu)型有關(guān)。同一結(jié)構(gòu)，不同分子量的高分子在修飾藥 物后，會(huì)產(chǎn)生不同的性質(zhì)；同一結(jié)構(gòu)，相同分子量，但構(gòu)型不同的高分子在修 飾藥物后，也會(huì)產(chǎn)生很大的差異。目前在對(duì)蛋白質(zhì)或者其它藥物進(jìn)行聚唾液酸 化時(shí)用的都是單鏈聚唾液酸，存在的幾個(gè)問題使得所制備的聚唾液酸與蛋白質(zhì) 或者藥物的結(jié)合物的優(yōu)點(diǎn)難以實(shí)現(xiàn)。其一是PSA的結(jié)合使蛋白質(zhì)或者藥物的結(jié) 合物生物活性降低。另外，在形成結(jié)合物時(shí)PSA可以發(fā)生部分水解斷裂，使結(jié) 合物失去了由結(jié)合PSA帶來的優(yōu)點(diǎn)。在研究中人們發(fā)現(xiàn)，PSA對(duì)生物活性物質(zhì) 的修飾效果與所使用的PSA的分子的分子量及特定的修飾度相關(guān)。 一般來說， 所用的PSA的分子量越大，修飾度越高，PSA-蛋白質(zhì)結(jié)合物的抗原性越小，排 除時(shí)間越長(zhǎng)。為了解決這個(gè)問題，我們合成了雙鏈聚唾液酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種活性的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物及其制 備方法和在藥物中的應(yīng)用。和相同分子量的線型PSA比較，該類型雙鏈PSA的
靜態(tài)粘度小，流體力學(xué)體積大，能對(duì)蛋白質(zhì)藥物等產(chǎn)生更為有效的生理作用。 本發(fā)明提出的活性雙鏈PSA，是由三官能團(tuán)小分子化合物經(jīng)化學(xué)反應(yīng)與PSA 結(jié)合在一起而獲得。該活性的雙鏈PSA可記為(R廠PSA)2-X-F。其中，&為氫或 一種單、雙、寡聚或多聚唾液酸基團(tuán)、 一種蛋白、 一種肽、 一種脂質(zhì)、 一種藥 物、 一種細(xì)胞膜或細(xì)胞壁組分或一種藥物傳遞系統(tǒng)；2代表雙鏈；X連接點(diǎn)， 即為三官能團(tuán)小分子化合物；F表示活性功能基團(tuán)；PSA與三官能團(tuán)小分子化 合物以共價(jià)鍵連接，連接基團(tuán)選自氨基、酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯、酯 基、環(huán)氧基、羧基、羥基、巰基或碳水化合物，或其中幾個(gè)組合之一種；所用 的三官能團(tuán)小分子化合物的結(jié)構(gòu)式為下列之一種
<formula>formula see original document page 9</formula>
這里，n為l-9的整數(shù)，m為0-6的整數(shù)；
例如當(dāng)其中三官能團(tuán)小分子化合物X為H2N(CH2)nCH(NH2)C02H(n為1-9的 整數(shù))，連接基團(tuán)為酰胺基或者氨基甲酸酯時(shí)，其結(jié)構(gòu)式如以下通式<formula>formula see original document page 10</formula>'OSyl
pW——(CH2)n
O
.CH一C一F
R2——-OSyl
IV
其中A為NR3、 NR3NR4、 0或S，其中M口尺4獨(dú)立地選自H、 Ch院基和芳
SylO為一個(gè)唾液酸基團(tuán)；
N為1-9; q為1-100; p為O或l;
W為0、 S或者NH之一；
F為下列功能基團(tuán)之-
o
H, OH， NH2, o-N
o
NO,
O
O
O
OCH廣N
O
K為連接基團(tuán)；
R2為氫或一種單、雙、寡聚或多聚唾液酸基團(tuán)、 一種蛋白、 一種肽、 一種 脂質(zhì)、 一種藥物、 一種細(xì)胞膜或細(xì)胞壁組分或一種藥物傳遞系統(tǒng)；
上述雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物的制備方法如一下先由活性的聚唾 液酸與三官能團(tuán)小分子化合物反應(yīng)，然后再與帶有活性基團(tuán)F的化合物反應(yīng)， 即得到活性的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物。
本發(fā)明中，所述三官能小分子化合物(X)的活性基團(tuán)為羧基和兩個(gè)氨基，或者為羧基各兩個(gè)羥基。具體可以為前述結(jié)構(gòu)式之一種。
單鏈活性PSA的合成方法在本領(lǐng)域中已有描述，例如，在US05846951、W00187922、 WO2005016973和CN 101160326。在本發(fā)明中，這些均被引入作為參考。
雙鏈PSA的制備方法類似，當(dāng)X為賴氨酸(Lysine)，兩鏈PSA為非還原端和還原端衍生的活性CA-NHS類，W為NH， n為4， P為l， F為NHS時(shí)，可按下列反應(yīng)路線來制備活性端基為NHS不同雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(I型)(R2-PSA)2-Lys-NHS,其中所用到的單鏈的活性PSA可根據(jù)上述■5846951、 W00187922、 W02005016973、 CN 101160326等方法來制備。
不同雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(n型)(R2-PSA)廠Lys-NHS。同樣可以用上述方法制備，只要改變加入活性單鏈聚唾液酸的順序即可。
相同雙鏈PSA的制備方法類似，只要將上述雙鏈改為相同的PSA活性衍生物即可得相同雙鏈的PSA活性衍生物。相同雙鏈的PSA活性衍生物也可以通過下列方法制備當(dāng)X為賴氨酸(Lysine),活性PSA為非還原端衍生的CA-NHS類，W為NH， n為4， P為1， F為NHS時(shí)，可按下列反應(yīng)路線來制備活性端基為NHS雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(R廠PSA)2-Lys-NHS.其中所用到的單鏈的活性PSA可根據(jù)上述US05846951、 WO0187922 、 W02005016973和CN101160326等方法來制備。
<formula>formula see original document page 13</formula>
當(dāng)活性PSA為非還原端衍生的CA-DSG， X為賴氨酸(Lysine) ， W為NH， n為4， P為l， F為琥珀酰亞胺時(shí)制備方法如下當(dāng)X為賴氨酸(Lysine)，活性PSA為還原端衍生的CA-NHS類，W為NH,n為4， P為1， F為NHS時(shí)，可按下列反應(yīng)路線來制備活性端基為NHS雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(R2-PSA)2-Lys-NHS.其中所用到的單鏈的活性PSA可根據(jù)上述CN 101160326方法來制備。
當(dāng)X為賴氨酸(Lysine)，活性PSA為還原端衍生的CA-BS3， W為NH， n為4， F為NHS時(shí)，可按下列反應(yīng)路線來制備活性端基為NHS雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(CA) 2-LyS-NHS.其中所用到的單鏈的活性CA-BS3可根據(jù)上述CN 101160326方法來制備。
當(dāng)X為賴氨酸(Lysine),活性PSA為非還原端衍生的CA-CHO， W為NH， n為4， P為0， F為NHS時(shí)，可按下列反應(yīng)路線來制備活性端基為NHS雙鏈結(jié) 構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物(CA)2-Lys-NHS.其中所用到的單鏈的活性CA-CHO可根 據(jù)上述CN 101160326方法來制備。上述路線中是通過N-羥基琥珀酰亞胺酯來活化羧基的，也可以用生成其他 活性酯的方法來對(duì)羧基進(jìn)行活化，如對(duì)硝基苯酚酯等。
顯然，依據(jù)上面的路線，只需在制備過程中根據(jù)需要選用不同的活性PSA， 就可以比較容易地制備出上述I 、 II、 III、 IV式活性的各種長(zhǎng)短、結(jié)合方式不 同的雙鏈PSA。結(jié)合本發(fā)明的公開，這上點(diǎn)對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員來說是 顯而易見的。
本發(fā)明提供的活性雙鏈PSA可用于藥物的制備。上述活性衍生物通過F基 團(tuán)與其它分子形成結(jié)合物。上述雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物可以在溫和的
生理?xiàng)l件與具有自由氨基的分子結(jié)合，如可廣泛用于小分子藥物、蛋白質(zhì)和多 肽藥物的修飾，即通過雙鏈的活性功能基團(tuán)F與小分子藥物、多肽或蛋白質(zhì)藥物等含有伯胺基的生物活性分子。小分子藥物優(yōu)選但不限于苯丁酸氮芥、順 鉑、5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素或甲氨喋呤。所述蛋白質(zhì)藥物優(yōu)選但不限于: 干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素 或超氧化物歧化酶。使用本發(fā)明的高分子材料修飾的藥物，可改進(jìn)藥物的溶解 性、穩(wěn)定性和免疫原性，以延長(zhǎng)藥物的半衰期，提高療效。
除了上述以外，其他分子還可以是具有氨基的氨基酸、糖類、有機(jī)酸、生 物堿、黃酮類、苷類、醌類、路類等藥物分子中具有自由氨基的分子。
本發(fā)明的再一個(gè)方面是提供一種包含上述雙鏈聚唾液酸和藥物學(xué)可接受 的載體或賦形劑的藥物組合物，所述的藥物組合物可為片劑、栓劑、丸劑、軟 和硬明膠膠囊劑、散劑、溶液劑、混懸劑或氣霧劑的劑型。
實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明有以下優(yōu)點(diǎn)其一，由于活性雙鏈PSA的流體力學(xué)體積 大，當(dāng)它與蛋白質(zhì)上的某個(gè)部位結(jié)合后，由于空間位阻的作用，其他部位很難 與另一雙鏈PSA反應(yīng)，從而提高了對(duì)結(jié)合部位的選擇性。而且這樣蛋白質(zhì)類藥 物的生物活性保留值也更高；其二，通過控制雙PSA的分子量可以控制其流體 力學(xué)體積，使其難接近蛋白質(zhì)的活性部位，這樣所得的聚唾液酸結(jié)合物可以保 持較高的生物活性，其三，由于鏈數(shù)的增加將會(huì)比線形PSA更為有效地阻止接 近藥物表面的大分子或者細(xì)胞，從而進(jìn)一步提高結(jié)合物在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)，減少 免疫反應(yīng)的發(fā)生。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在以下的實(shí)施例中進(jìn)一步說明。這些實(shí)施例只是為了說明的目的， 而不是用來限制本發(fā)明的范圍。為了便于說明，在以下的實(shí)施例中，多聚唾液 酸都采用多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA。
實(shí)施例l不同雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA2-Lys-NHS制備將賴氨酸(439mg， 3mmo1)溶于20ml pH值為8. 0-8. 3的水中，然后在2. 5
氨酸CA-DSG (l腿ol)(按CN 101160326方法來制備)，同時(shí)用0. 2mol/L NaOH 來維持體系的pH值在8.3。在室溫?cái)嚢柽^夜后，將反應(yīng)物冷卻到0-C?，F(xiàn)用乙 醚從水中萃取出雜質(zhì)，再用氯仿連續(xù)提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚 中，得到白色沉淀，所得沉淀經(jīng)乙醇兩次重結(jié)晶后，得到CA單取代的賴氨酸 (CA-Lys-C00H)，其末端官能團(tuán)為羧基。
向溶有上述產(chǎn)品(0. 9mmo1)的無水二氯甲烷(30mL)中，加入三乙胺(TEA) 直到pH值達(dá)到8。在三小時(shí)之內(nèi)分批加入還原端活化衍生的單鏈聚唾液酸 CA-BS3 (1. lmmol)至反應(yīng)液中，同時(shí)用TEA維持體系的pH值在8左右。反應(yīng) 物回流72小時(shí)后，濃縮后，過濾，用乙醚沉淀。然后用少量乙醇重結(jié)晶。過 量的單鏈聚唾液酸在pH為9-10的Na2C03緩沖液中攪拌過夜后被水解，溶液被 冷至(TC。用乙醚提取溶液中的雜質(zhì)。再用氯仿連續(xù)提取三次，提取液經(jīng)干燥 濃縮后用無水乙醚沉淀，然后用無水乙醇重結(jié)晶，所得產(chǎn)物用QSES印hadexA50 柱(5X80cm，淋洗液pH=8. 7的硼砂緩沖液)進(jìn)一步純化，得到CA2-Lys-C00H。 在0。C，向溶有上述CA2-Lys-C00H (0.6mrno1)的無水二氯甲烷(20mL)中 加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.6mmo1)和DCC (1.6mmo1)，室溫?cái)嚢柽^夜后，過 濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得到羧基被N-羥基 琥珀酰亞胺活化的CA2-Lys-NHS。
實(shí)施例2非還原端活化衍生的相同雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA2-Lys-NHS制備
將賴氨酸(0.2mrno1)溶于40ml pH值為8.0-8.3的硼酸緩沖液中，然后 向其中加入新制備的非還原端活化衍生的活性單鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA-DSG (0. 6畫1)(按CN 101160326方法來制備)，同時(shí)用0. 2mol/Lr Na0H來維持體系的pH值在8.3。在室溫?cái)嚢柽^夜后，將反應(yīng)物冷卻到0。C?，F(xiàn)用乙醚從水中萃取出雜質(zhì)，再用氯仿連續(xù)提取三次，提取液濃縮后滴加入無水乙醚中，得到白色沉淀，所得沉淀經(jīng)乙醇兩次重結(jié)晶后，得到CA雙取代的賴氨酸(CA2-Lys-COOH)，其末端官能團(tuán)為羧基。
在0。C，向溶有上述CA2-Lys-COOH (0.2mmo1)的無水二氯甲烷(20mL)中加入N-羥基琥珀酰亞胺(0.6mmo1)和DCC (0.6mmo1)，室溫?cái)嚢柽^夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得到羧基被N-羥基琥珀酰亞胺活化的CA廠Lys-NHS。
實(shí)施例3還原端活化衍生的相同雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA2-Lys-NHS制備
將上述實(shí)例2中的非還原端活化衍生的活性單鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA-DSG (按CN 101160326方法來制備)改為等量的還原端活化衍生的活性單鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA-BS3即可。
實(shí)施例4起始為CA-CHO的相同雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸CA2-Lys-NHS制備
用含有2mmo1的賴氨酸的2mL去離子水，溶解摩爾當(dāng)量2-6倍的CA-CHO，并置于50mL容器中，然后加入NaCNBH4 (至濃度為5mg/mL)?；旌衔镌谑覝叵路磻?yīng)2-5天。加入5mL冰凍乙醇，將產(chǎn)物雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸酸沉淀下。用臺(tái)式離心機(jī)4000r/min離心30分鐘來回收沉淀。在2mL去離子重懸沉淀，然后在10mLr的超速離心管中用5mL冰凍乙醇重新沉淀。用30000r/min離心30分鐘來回收沉淀。沉淀再次在2mL去離子水中重懸并凍干，備用。
在0。C，向溶有上述CA廠Lys-COOH (0. 8mmo1)的無水二氯甲垸(20mL)中加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.6腿o1)和DCC (1.6mmo1)，室溫?cái)嚢柽^夜后，過濾，濾液經(jīng)濃縮后用無水乙醚沉淀，再經(jīng)乙酸乙酯重結(jié)晶，得到羧基被N-羥基琥珀酰亞胺活化的CA2-Lys-NHS。實(shí)施例5 CA2-Lys-對(duì)硝基苯酚的制備
將上述實(shí)例l、 2、 3、 4例中的N-羥基琥珀酰亞胺改為等量的對(duì)硝基苯酚即可。
實(shí)施例6雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物CA廠Lys-haFGF的制備
將溶解于PBS緩沖液(10-50mmol，PH7.2)中的人酸性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子與實(shí)例l、 2、 3、 4、 5制備的雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸以摩爾比1:5-l:50混合，放置于4-37°C，反應(yīng)2-72小時(shí)。反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液過S印hedax G-25柱除鹽后，上CL-6B肝素親和層析柱分離，分離條件為CL-6B制備型親和層析柱(20cmX1.5cm)，采用10-50mmol/L， PBS緩沖液平衡柱，lmL/min流速上樣，用10-50mmol/L， PBS緩沖液洗柱至基線平穩(wěn)后，10-50mmol/L, PBS緩沖液+0. 1-1. 2MNaCl緩沖液洗脫，洗脫液流速為lmL/min，收集洗脫峰，SDS-PAGE檢驗(yàn)，得到不同修飾度的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物-haFGF純品。實(shí)施例7雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物CA2-Lys-IFN的制備
取10mg/ml的干擾素硼酸緩沖液，pH二8.5，加入實(shí)例1、 2、 3、 4、 5所制備的雙鏈多聚乙酰神經(jīng)氨酸干粉20-400mg, 4-37。C條件下反應(yīng)2-72小時(shí)，經(jīng)陰離子交換柱純化，可得PSA-IFN樣品。
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權(quán)利要求
1、一種雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物，其特征在于由三官能團(tuán)小分子化合物經(jīng)化學(xué)反應(yīng)與活化的單鏈聚唾液酸任選地通過接頭結(jié)合在一起而形成，可表示為(R2-PSA)2-X-F，其中，R2為氫或一種單、雙、寡聚或多聚唾液酸基團(tuán)、一種蛋白、一種肽、一種脂質(zhì)、一種藥物、一種細(xì)胞膜或細(xì)胞壁組分或一種藥物傳遞系統(tǒng)；2代表雙鏈；X為連接點(diǎn)，即一種三官能團(tuán)小分子化合物；F表示活性功能基團(tuán)，可以與藥物或基體上的氨基形成共價(jià)鍵連接；PSA為聚唾液酸。
2、 權(quán)利要求1所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物，其特征在于活化的單鏈聚唾液酸與三官能團(tuán)小分子化合物以共價(jià)鍵連接，連接基團(tuán)選自胺基、亞胺基、酰胺基、亞酰胺基、氨基甲酸酯、酯基、環(huán)氧基、羧基、羥基、巰基、碳水化合物，或其中幾個(gè)組合之一種。
3、 權(quán)利要求1所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物，其特征在于三官能團(tuán)小分子化合物的活性基團(tuán)為羧基和兩個(gè)氨基或羧基和兩個(gè)羥基，所用的三官能團(tuán)小分子化合物的結(jié)構(gòu)式優(yōu)選自下列之一種<formula>formula see original document page 2</formula>這里，n為l-9的整數(shù)，m為0-6的整數(shù)。
4、權(quán)利要求1所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物，其特征在于當(dāng)三官能團(tuán)小分子化合物為下列結(jié)構(gòu)<formula>formula see original document page 3</formula>其中，n為l-9的整數(shù)，連接基團(tuán)為酰胺基或氨基甲酸酯時(shí)，所述雙鏈聚唾液酸化-PSA)廠X-F具有結(jié)構(gòu)式I、 n、 III或IV其中A為NR3、 NR3NR4、 0或S，其中&和&獨(dú)立地選自H、 Ch院基和芳基;SylO為一個(gè)唾液酸基團(tuán)；n為1-9; q為1-100; p為0或l;W為0、 S或者NH之一；F優(yōu)選下列功能基團(tuán)之一 -H， OH, NH:Ri為連接基團(tuán); <formula>formula see original document page 4</formula>R2為氫或一種單、雙、寡聚或多聚唾液酸基團(tuán)、 一種蛋白、 一種肽、 一種脂質(zhì)、 一種藥物、 一種細(xì)胞膜或細(xì)胞壁組分或一種藥物傳遞系統(tǒng)。
5、 權(quán)利要求4所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物，其中Ri選自亞烷基、亞芳基、亞烷芳基、雜亞芳基、垸基-雜亞芳基，它們中任何一個(gè)都可以由硫代酸酯、酯、胺或酰胺鍵所連接，且其中A為NR3或?yàn)橥ㄟ^服3基團(tuán)連接到分子余下部分的一個(gè)連接基團(tuán)。
6、 一種如權(quán)利要求1所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物的制備方法，其特征在于通過活化的單鏈聚唾液酸與三官能團(tuán)小分子化合物反應(yīng)，然后再與帶有活性基團(tuán)F的化合物反應(yīng)，得到活性的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物。
7、 一種如權(quán)利要求l所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物的應(yīng)用，其特征在于其通過活性功能基團(tuán)F與包括小分子藥物、多肽或蛋白質(zhì)藥物在內(nèi)的含有伯胺基的生物活性分子結(jié)合。
8、 權(quán)利要求7所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述小分子藥物優(yōu)選但不限于苯丁酸氮芥、順鉑、5-氟脲嘧啶、紫杉醇、阿霉素或甲氨喋呤。
9、 權(quán)利要求7所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物的應(yīng)用，其特征在于所述蛋白質(zhì)藥物優(yōu)選但不限于干擾素、白介素、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素或超氧化物歧化酶。
10、 一種藥物組合物，該組合物包含權(quán)利要求1所述的雙鏈結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物與蛋白質(zhì)或多肽的結(jié)合物和治療惰性載體。
全文摘要
本發(fā)明屬高分子材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的雙鏈結(jié)結(jié)構(gòu)的聚唾液酸活性衍生物及其制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用?？蓮V泛用于含氨基的生物功能分子特別是蛋白質(zhì)和多肽等大分子的修飾，用于改進(jìn)藥物的溶解性、穩(wěn)定性和免疫原性，以延長(zhǎng)藥物的半衰期，提高療效。
文檔編號(hào)C08B37/00GK101475647SQ20081016220
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者付小兵, 張衛(wèi)星, 李校堃, 林紹強(qiáng), 廣 梁, 田吉來, 趙應(yīng)征, 趙承光, 閆欣欣 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)學(xué)院