專(zhuān)利名稱：：一種提取聚唾液酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：種提取聚唾液酸的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：唾液酸是一類(lèi)神經(jīng)氨酸的衍生物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是一個(gè)含有9個(gè)碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖，系統(tǒng)命名為5-氨基-3,5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖。根據(jù)5號(hào)碳位上不同的連接基團(tuán)構(gòu)成了不同的唾液酸衍生物，最主要的兩種唾液酸為5-乙酰氨基-3，5-二脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(NANA，Neu5Ac，N—乙酰神經(jīng)氨酸)和3-脫氧-D-甘油-D-半乳壬酮糖(KDN)，其余的唾液酸均是由這兩種衍生而成。其中，N—乙酰神經(jīng)氨酸在脊椎動(dòng)物體內(nèi)更為常見(jiàn)，如魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)、鳥(niǎo)類(lèi)等動(dòng)物。哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍存在唾液酸，相對(duì)而言在腦脊液和粘液中最多。嬰兒在幼年期唾液酸含量較高，對(duì)其身體發(fā)育具有重要意義。聚唾液酸(Polysialicacid，Colominicacid)是唾液酸以a-2，8和/或a-2，9酮苷鍵連接的線性同聚物，是少數(shù)幾種細(xì)菌的胞外多糖組分。1957年Barry和Goebel首先在Esc/^n'c/w'aco//K-235和K-l中發(fā)現(xiàn)該聚合物，以后又陸續(xù)在7Ve&sen'G附/"/"g"/cfcB,5"a/mowe〃a她cra048,C"raZflcter戶ew"(i"05中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。a-2，8酮苷鍵連接的聚唾液酸末端相鄰的兩個(gè)單體形成內(nèi)酯(甲單體的羧基和乙單體的9號(hào)碳位上的羥基脫水縮合形成)，對(duì)聚唾液酸的穩(wěn)定起到一定的作用，這也是大多數(shù)的聚唾液酸以a-2，8酮苷鍵連接的主要原因之一。<formula>complexformulaseeoriginaldocumentpage3</formula>聚唾液酸是無(wú)色的，易溶于水，在水溶液中很穩(wěn)定，4t:時(shí)貯藏?cái)?shù)月不發(fā)生變化。如果溶液中含有非常微量的有機(jī)酸或者pH大于10，其穩(wěn)定性就受到很大的影響。游離的唾液酸能有效地抑制感冒病毒和其他病原微生物入侵紅細(xì)胞。唾液酸的類(lèi)似物Zanamivir(N-乙?；?2，3-二脫氧-4-胍基唾液酸)和Tamiflu(oseltamivirphosphate)的抗流感機(jī)理一樣，可以抑制流感病毒上唾液酸酶唾液酸的一般結(jié)構(gòu)的活性，己經(jīng)被美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)為治療禽流感的特效藥。唾液酸衍生物SialylLewiSx作為重要的抗粘附藥物，可有效阻止白細(xì)胞過(guò)量聚集，治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克等疾病。同時(shí)，唾液酸是一種止咳祛痰劑，對(duì)于中心和外周神經(jīng)性疾病以及脫髓鞘病均有療效。如唾液酸膽固醇可以治療老年癡呆癥。此外，唾液酸在腦中的含量很高，可能作為神經(jīng)傳導(dǎo)質(zhì)，參與離子外流和神經(jīng)興奮。單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷酯對(duì)于治療腦缺血、帕金森癥和神經(jīng)創(chuàng)傷有一定功能。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，唾液酸還具有免疫抑制作用。以唾液酸為先導(dǎo)進(jìn)行生物活性物質(zhì)的探索已經(jīng)成為新藥研究的一個(gè)新領(lǐng)域。聚唾液酸可以作為一些藥物的緩釋劑，也可以用于固定酶以用于診斷，或?qū)σ恍┧幬锂a(chǎn)品進(jìn)行化學(xué)修飾。聚唾液酸可以用作治療一些疾病的疫苗而避免其它細(xì)胞組分如脂多糖或蛋白質(zhì)引起的副作用。近年來(lái)，生物可降解聚合物在藥物傳遞系統(tǒng)研究領(lǐng)域越來(lái)越受矚目，部分聚合物已應(yīng)用于各種劑型。目前比較成功用于多肽與蛋白質(zhì)類(lèi)藥物傳遞系統(tǒng)的是聚乙二醇(PEG);但是，PEG是人工合成、在體內(nèi)不可降解的，容易在膀胱積累，而且還可能產(chǎn)生抗PEG的抗體。在尋找替代PEG的可降解聚合物中，a-2，8連接的聚唾液酸(PSA)是目前發(fā)現(xiàn)最好的多肽與蛋白類(lèi)藥物的控釋劑。英國(guó)的LipoXen公司臨床試驗(yàn)了聚唾液酸化干擾素、胰島素、天冬酰胺酶和人紅細(xì)胞生長(zhǎng)素等，發(fā)現(xiàn)其效果比PEG化的效果好、半衰期更長(zhǎng)；其中主要應(yīng)用分子量約為7000Da15000Da、a-2，8連接的聚唾液酸。隨著基因工程與蛋白質(zhì)工程在醫(yī)藥領(lǐng)域的快速發(fā)展，未來(lái)越來(lái)越多的藥物將是各種蛋白質(zhì)和多肽類(lèi)藥物，因此聚唾液酸作為醫(yī)藥中間體在未來(lái)將會(huì)有巨大的市場(chǎng)潛力。而且目前世界上還沒(méi)有任何公司能夠進(jìn)行聚唾液酸的規(guī)模化生產(chǎn)，因此開(kāi)發(fā)高純度聚唾液酸分離純化的技術(shù)具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種提取聚唾液酸的方法，以提高聚唾液酸的純度，達(dá)到化妝品和醫(yī)藥生產(chǎn)的要求，使其競(jìng)爭(zhēng)力更強(qiáng)。本發(fā)明的技術(shù)方案一種提取聚唾液酸的方法，以一株大腸桿菌(^C^enW2^co//)K235-JYlI-74的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除菌體，上清液加入適量氯化鈉和乙醇溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用板框過(guò)濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨絡(luò)合沉淀并解離后，再用適量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，通過(guò)層析柱進(jìn)行分級(jí)純化，收集洗脫液經(jīng)過(guò)透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品；各步驟工藝條件為(1)過(guò)濾發(fā)酵液中加入1020g/L的80200目的珍珠巖助濾劑，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除菌體，過(guò)濾方式選擇110目工業(yè)濾布；(2)沉淀過(guò)濾去除菌體后的清液加入氯化鈉，使氯化鈉質(zhì)量濃度達(dá)2%~5%，溶解后再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度的乙醇洗滌24次；(3)溶解、過(guò)濾聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，加入1020g/L的80200目的珍珠巖助濾劑，通過(guò)板框過(guò)濾或者硅藻土過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，通過(guò)過(guò)濾去除部分變性蛋白質(zhì)；(4)酶處理過(guò)濾去除部分變性蛋白后的濾液加入堿性蛋白酶進(jìn)行處理，其工藝為堿性蛋白酶活力25萬(wàn)U/mL，pH7~8，加量為10mL/kg聚唾液酸，3070'C酶解37小時(shí)；(5)絡(luò)合沉淀酶處理過(guò)的聚唾液酸溶液加入過(guò)量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行絡(luò)合沉淀，氯代十六垸基吡啶或十六垸基三甲基溴化銨加量為13g/g聚唾液酸，溫度為1015°C;(6)解離經(jīng)過(guò)絡(luò)合得到的聚唾液酸沉淀加入24倍量0.50.8M的氯化鈉溶液，406(TC水浴解離38小時(shí)；(7)乙醇沉淀解離后的溶液再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度的乙醇洗滌24次；(8)溶解、柱層析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超純水溶解后進(jìn)行層析分離，其工藝為層析柱填料為DEAE-纖維素或者葡聚糖凝膠，層析柱用0.010.05M磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫液為0.020.08M氯化鈉溶液，洗脫速度為l5mL/min,分別收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析層析收集得到的分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分別用截留分子量為7000Da、1200014000Da透析膜進(jìn)行透析4872小時(shí)；(10)冷凍干燥兩種透析液體分別經(jīng)過(guò)冷凍干燥得到兩種規(guī)格的聚唾液酸產(chǎn)品。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提出一種有效的聚唾液酸分離純化方法。發(fā)酵液用過(guò)量乙醇使聚唾液酸和蛋白質(zhì)同時(shí)沉淀下來(lái)，沉淀溶解后用板框過(guò)濾使得變性的蛋白質(zhì)更容易去除，有利于后續(xù)提取純化。堿性蛋白酶添加到聚唾液酸溶液中可以降解剩余的蛋白質(zhì)，而氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨能夠與聚唾液酸專(zhuān)一性絡(luò)合形成沉淀，有利于把聚唾液酸和其他一些大分子、小分子物質(zhì)分離開(kāi)。聚唾液酸進(jìn)一步通過(guò)層析分離，可以收集不同分子量范圍的聚唾液酸，利用透析可以去除一些小分子物質(zhì)，經(jīng)過(guò)冷凍干燥后，聚唾液酸的純度達(dá)到97%以上。圖l聚唾液酸的提取流程示意圖。生物材料樣品說(shuō)明大腸桿菌(&c/^/c/'aco//)K235-JYlI-74江南大學(xué)生物工程學(xué)院生化工程實(shí)驗(yàn)室保藏和提供，該菌株已在《無(wú)錫輕工大學(xué)學(xué)報(bào)》2002，21(5)，456459公開(kāi)。根據(jù)專(zhuān)利審査的有關(guān)規(guī)定，申請(qǐng)人保證該菌種從申請(qǐng)日起20年內(nèi)向公眾發(fā)放。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1.聚唾液酸發(fā)酵液的制備菌株大腸桿菌(^c/^WcWaco/OK235-JYlI-74。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)山梨醇20，氯化銨2.0，磷酸氫二鉀1.5，MgSO40.9,胰蛋白胨1.5，pH7.8。利用30L發(fā)酵培養(yǎng)基，在50LB.Braum機(jī)械攪拌罐上采用pH控制方法進(jìn)行發(fā)酵，接種量4%，滅菌前加入少量聚氧乙烯聚氧丙烯甘油醚(泡敵)以控制發(fā)酵過(guò)程中的泡沫，發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速300500rpm，通風(fēng)量為30L/min，表壓0.05Mpa，發(fā)酵溫度37°C。調(diào)節(jié)pH值的氨水是濃氨水，鹽酸濃度3M。菌體生長(zhǎng)階段的pH自然下降到6.4,然后用氨水和鹽酸把pH值控制在6.4左右，直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵過(guò)程中，間隔一定時(shí)間取樣測(cè)定山梨醇濃度，發(fā)酵至第12h開(kāi)始補(bǔ)加山梨醇。根據(jù)底物濃度的變化，估計(jì)菌體對(duì)底物的消耗速率，調(diào)整控制補(bǔ)料液流加速率，使碳源濃度控制在5g/L到20g/L之間。發(fā)酵培養(yǎng)60小時(shí)下罐，測(cè)定聚唾液酸產(chǎn)量達(dá)到3.5g/L。實(shí)施例2.聚唾液酸的提取取5L發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除菌體，所得過(guò)濾清液加入100-250g氯化鈉(NaCl)并攪拌使其溶解，含氯化鈉的清液再加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度乙醇洗滌24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于適量的去離子水中，所得渾濁液體經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除部分蛋白質(zhì)，得到的濾液調(diào)節(jié)pH78并加入約50mL堿性蛋白酶(酶活25萬(wàn)U/mL)，在307(TC恒溫水浴條件下處理37小時(shí)，再加入過(guò)量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行絡(luò)合，隔夜靜置后，傾析或者離心收集沉淀，沉淀加入0.50.8M的氯化鈉溶液進(jìn)行解離，4060"C水浴解離38小時(shí)，解離得到清液加入24倍體積的95%質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75%質(zhì)量濃度乙醇洗滌24次，然后聚唾液酸沉淀再溶解于適量的超純水中，得到澄清液體，該溶液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入平衡好的層析柱，用0.020.08M氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，洗脫速度為15mL/min，分別收集分子量700015000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸，分別用截留分子量為7000Da或1200014000Da透析膜進(jìn)行透析4872小時(shí)，最后透析液體經(jīng)過(guò)冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品，純度達(dá)到97%以上。表1聚唾液酸提取純化的收率〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1、一種提取聚唾液酸的方法，其特征是以一株大腸桿菌(Escherichiacoli)K235-JYII-74的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除菌體，上清液加入氯化鈉和乙醇溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用板框過(guò)濾或者硅藻土過(guò)濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨絡(luò)合沉淀并解離后，再用乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，通過(guò)層析柱進(jìn)行分級(jí)純化，收集洗脫液經(jīng)過(guò)透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品；各步驟工藝條件為(1)過(guò)濾發(fā)酵液中加入10～20g/L的80～200目的珍珠巖助濾劑，發(fā)酵液經(jīng)過(guò)板框過(guò)濾去除菌體，過(guò)濾方式選擇110目工業(yè)濾布；(2)沉淀過(guò)濾去除菌體后的清液加入氯化鈉，使氯化鈉質(zhì)量濃度達(dá)2％～5％，溶解后再加入2～4倍體積的95％質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75％質(zhì)量濃度的乙醇洗滌2～4次；(3)溶解、過(guò)濾聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，加入10～20g/L的80～200目的珍珠巖助濾劑，通過(guò)板框過(guò)濾或者硅藻土過(guò)濾機(jī)進(jìn)行過(guò)濾，通過(guò)過(guò)濾去除部分變性蛋白質(zhì)；(4)酶處理過(guò)濾去除部分變性蛋白后的濾液加入堿性蛋白酶進(jìn)行處理，其工藝為堿性蛋白酶活力2～5萬(wàn)U/mL，pH7～8，加量為10mL/kg聚唾液酸，30～70℃酶解3～7小時(shí)；(5)絡(luò)合沉淀酶處理過(guò)的聚唾液酸溶液加入過(guò)量的氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行絡(luò)合沉淀，氯代十六烷基吡啶或十六烷基三甲基溴化銨加量為1～3g/g聚唾液酸，溫度為10～15℃；(6)解離經(jīng)過(guò)絡(luò)合得到的聚唾液酸沉淀加入2～4倍量0.5～0.8M的氯化鈉溶液，40～60℃水浴解離3～8小時(shí)；(7)乙醇沉淀解離后的溶液再加入2～4倍體積的95％質(zhì)量濃度的乙醇，沉淀出聚唾液酸，并隔夜靜置，通過(guò)傾析或者離心獲得聚唾液酸沉淀，再用少量75％質(zhì)量濃度的乙醇洗滌2～4次；(8)溶解、柱層析乙醇沉淀出的聚唾液酸用超純水溶解后進(jìn)行層析分離，其工藝為層析柱填料為DEAE-纖維素或者葡聚糖凝膠，層析柱用0.01～0.05M磷酸鹽緩沖液進(jìn)行平衡，洗脫液為0.02～0.08M氯化鈉溶液，洗脫速度為1～5mL/min，分別收集分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸；(9)透析層析收集得到的分子量7000～15000Da的聚唾液酸和分子量大于15000Da的聚唾液酸分別用截留分子量為7000Da、12000～14000Da透析膜進(jìn)行透析48～72小時(shí)；(10)冷凍干燥兩種透析液體分別經(jīng)冷凍干燥得到兩種規(guī)格的聚唾液酸產(chǎn)品。全文摘要一種提取聚唾液酸的方法，屬于生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明以一株產(chǎn)聚唾液酸大腸桿菌的發(fā)酵液為原料，經(jīng)過(guò)過(guò)濾去除菌體，上清液加入適量氯化鈉和乙醇等溶劑沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用去離子水溶解，再用過(guò)濾去除變性蛋白質(zhì)，濾液經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶處理、氯代十六烷基吡啶(CPC)或十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)絡(luò)合沉淀并解離后，再用過(guò)量乙醇沉淀出聚唾液酸，聚唾液酸沉淀用超純水溶解，用層析柱進(jìn)行分級(jí)純化，收集洗脫液經(jīng)過(guò)透析，冷凍干燥得聚唾液酸產(chǎn)品。本發(fā)明提出一種有效的聚唾液酸分離純化方法，得到97％以上純度的聚唾液酸產(chǎn)品，以用做藥品和化妝品的原料。文檔編號(hào)C08B37/00GK101195661SQ20071019136公開(kāi)日2008年6月11日申請(qǐng)日期2007年12月19日優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日發(fā)明者吳劍榮,莉朱,詹曉北,鄭志永申請(qǐng)人:江南大學(xué)