專利名稱：異麥芽低聚糖硫酸酯(imos)的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及異麥芽低聚糖磺化產(chǎn)物的生產(chǎn)，廣義上屬于糖類衍生物的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
異麥芽低聚糖硫酸酯(1MOS)是一種新型的生物科技產(chǎn)品。它除具有其他多糖硫酸酯的生物學(xué)特征外，由于它的分子量較低，有可能直接進(jìn)入病變細(xì)胞發(fā)揮特殊的藥理作用，因而在許多疾病，如愛滋病、瘋牛病、骨關(guān)節(jié)炎的防治研究中受到極大的重視。近年來(lái)又報(bào)導(dǎo)，一種分子量1000～1500的異麥芽低聚糖所合成的硫酸酯具有特異地結(jié)合人體血液中致動(dòng)脈粥樣硬化脂蛋白(LDL)的功能，這將為人類防治高脂血癥和冠心病提供另一新的途徑。遺憾的是這類產(chǎn)品目前尚處在研發(fā)的初級(jí)階段，價(jià)格昂貴，且乏供應(yīng)，主要原因是其制備過(guò)程涉及生物合成和化學(xué)合成，其中有不少問題尚待研究解決。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明的目的是提供一種科學(xué)而又實(shí)用的制備方法，能用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的IMOS，以滿足國(guó)際市場(chǎng)的迫切需求。
本發(fā)明的依據(jù)是根據(jù)右旋糖酐生物合成過(guò)程中的受體機(jī)理，右旋糖酐蔗糖酶能以麥芽糖為受體，將蔗糖分子中的葡萄糖部分轉(zhuǎn)移到麥芽糖分子上，從而使其碳鏈不斷延伸而生成異麥芽低聚糖。通過(guò)控制合成過(guò)程，可以獲得不同分子量的產(chǎn)品，再經(jīng)過(guò)沉淀、超濾等技術(shù)，除去雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品的純化。使用硼氫化鈉，在改良的操作條件下，使產(chǎn)品高效和充分氫化。最后用吡啶(或甲酰胺)為溶劑，通過(guò)合理控制氯磺酸用量及操作過(guò)程，可合成不同含硫量的優(yōu)質(zhì)IMOS。
本發(fā)明的內(nèi)容是包括異麥芽低聚糖的生物合成及其氫化和磺化三個(gè)方面。
1、異麥芽低聚糖的生物合成(1)基質(zhì)液的配制甲液30％蔗糖溶液即于300克純蔗糖中，加入500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再用蒸餾水加至總?cè)莘e1000毫升。
乙液10％麥芽糖溶液即稱取純度99％麥芽糖100克，加500毫升蒸餾水，攪拌使溶，再加蒸餾水至總?cè)莘e1000毫升。
丙液0.2M乙酸鈉-鈣離子緩沖溶液即稱取16.4克無(wú)水乙酸鈉和5.0克無(wú)水氯化鈣，溶解于900毫升蒸餾水中，用30％冰乙酸調(diào)節(jié)pH至5.2～5.4，再用蒸餾水加至總?cè)莘e1000毫升。
將上述甲、乙、丙三種溶液按1∶0.5∶0.2比例進(jìn)行混合。(適當(dāng)改變上述比例，可制得不同分子量產(chǎn)品，詳見實(shí)施例)(2)酶反應(yīng)按上述基質(zhì)液容積，每毫升加入12單位純化右旋糖酐蔗糖酶，混合后將pH調(diào)至5.2～5.4，維持溫度在25～27℃，并不斷攪拌(50轉(zhuǎn)/分)24～48小時(shí)至反應(yīng)完成(可用高壓液相和粘度監(jiān)測(cè))。然后升溫至80-85℃半小時(shí)以終止反應(yīng)。
(3)分離與純化過(guò)濾將上述酶反應(yīng)液，于溫度60～70℃時(shí)，加入0.5％糖用活性炭，輕微攪拌30分鐘后，經(jīng)板框壓過(guò)濾?；?qū)⒚阜磻?yīng)液直接經(jīng)陶瓷膜系統(tǒng)處理以除去不溶性高分子物質(zhì)。
沉淀過(guò)濾后的液體用等體積98％以上的異丙醇或乙醇沉淀，沉淀物再用1/4上述有機(jī)溶劑洗滌一次。然后將沉淀物溶解于10倍原體積的蒸餾水中。
超濾將上述溶液轉(zhuǎn)移至膜孔為800～1000的超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行循環(huán)超濾，并用高壓液相進(jìn)行監(jiān)測(cè)，直至出現(xiàn)單峰。純度在98％以上，即可進(jìn)行下一步化學(xué)反應(yīng)。
2、異麥芽低聚糖的氫化反應(yīng)(1)10％硼氫化鈉堿性溶液的制備每10克硼氫化鈉溶解于100毫升30％氫氧化鈉溶液中。(臨用前配制)(2)氫化反應(yīng)先將上述純化的異麥芽低聚糖配制成25％濃度的水溶液。按4％異麥芽糖量，緩慢滴加10％硼氫化鈉堿性溶液。反應(yīng)宜在25～30℃溫度下進(jìn)行，攪拌速度應(yīng)控制在10～20轉(zhuǎn)/分，間隙進(jìn)行，4小時(shí)后，當(dāng)產(chǎn)生的氫氣小泡消失時(shí)，可用6N鹽酸緩慢滴加至pH2～3時(shí)，再繼續(xù)攪拌4小時(shí)，測(cè)定反應(yīng)物中還原糖含量，若低于0.1％，則可停止反應(yīng)，將溶液pH調(diào)至5～7。
(3)純化氫化異麥芽低聚糖溶液可通過(guò)超濾膜系統(tǒng)、離子交換或有機(jī)溶劑(異丙醇或乙醇)沉淀等方法進(jìn)行純化。最后噴霧干燥成粉，也可用有機(jī)溶劑脫水后真空干燥。
3、異麥芽低聚糖的磺化反應(yīng)基本步驟如下(1)將一定容量(如1000毫升)的吡啶置于干燥潔凈的2000毫升圓底三口燒瓶中，置冰水溶液使內(nèi)溫降至10℃以下。
(2)在慢速(50轉(zhuǎn)/分)攪拌下，緩慢滴加氯磺酸(滴加量取決于產(chǎn)品所需含硫量，可自0.6至1.25吡啶容積)。滴加過(guò)程中溫度應(yīng)控制在15℃以下。
(3)滴加完畢后立即升溫至50′℃，加快攪拌機(jī)轉(zhuǎn)速至80轉(zhuǎn)/分，使冷凝的固含物充分溶解。
(4)在攪拌條件下，逐漸加入1/10吡啶量(W/V)的氫化異麥芽低聚糖。
(5)待全部溶解后，繼續(xù)升溫至70～75℃，并維持此溫度范圍，持續(xù)攪拌(50轉(zhuǎn)/分)反應(yīng)4小時(shí)。然后將溫度降至50′℃以下。
(6)于反應(yīng)物中加入200毫升蒸餾水，攪拌混勻后，用40％NaOH溶液調(diào)pH至3～4，然后加入1倍體積99％甲醇沉淀，靜置30分鐘后，吸去上清液，沉淀，再用1/4體積99％甲醇洗滌一次。
(7)重復(fù)上述方法，再用甲醇沉淀洗滌2～3次，直到游離硫和氯含量低于100ppm。
(8)將溶液pH調(diào)至6.8～7.2，并加入0.5％磷酸緩沖液，最后噴霧干燥。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比，具有的優(yōu)點(diǎn)科學(xué)性與實(shí)用性的結(jié)合。
1、從異麥芽低聚糖的生物合成看目前國(guó)內(nèi)外普遍采用葡萄糖苷酶方法，其產(chǎn)物多為5個(gè)葡萄糖以下的低分子聚合物，伴葡萄糖等副產(chǎn)品，故僅能用于食品營(yíng)養(yǎng)方面。本發(fā)明則根據(jù)右旋糖酐酶一受體合成機(jī)理，采用科學(xué)的配方和合成過(guò)程，以及先進(jìn)的分離純化技術(shù)，獲得5～10個(gè)葡萄糖(即分子量為1000～1800)的超高純異麥芽低聚糖，是若干重要藥物的最佳載體。
2、從氫化技術(shù)看以往一般采用硼氫化鈉直接加于右旋糖酐溶液中，這種方法不僅原料用量明顯增加，而且操作不便。本發(fā)明先將硼氫化鈉溶解于堿性溶液中，然后再緩慢滴加于異麥芽低聚糖溶液中，使反應(yīng)溫和、充分、利用率高，操作也比較方便，而且硼氫化鈉用量約節(jié)省一半。
3、磺化方面本發(fā)明提供了如何對(duì)分子量較低的糖類合成具有不同含硫量和純度較高的磺化產(chǎn)品。
具體實(shí)施例方式以下本發(fā)明的具體實(shí)施例實(shí)施例1(1)稱取150克純蔗糖加于有刻度的1000毫升三角瓶中，加少量蒸餾水?dāng)嚢枋谷?，再加蒸餾水至500毫升刻度。
(2)稱取25克純度為99％的麥芽糖，溶于250毫升蒸餾水中，攪拌使溶，然后倒于上述蔗糖溶液中，混合。
(3)加入100ml0.22M乙酸鈉鈣離子溶液(內(nèi)含1.64克無(wú)水乙酸鈉和0.5克無(wú)水氯化鈣)。
(4)將上述溶液混勻后，用30％冰乙酸調(diào)pH至5.2～5.4。
(5) 按每毫升溶液12單位計(jì)算，加入足夠的右旋糖酐蔗糖酶，攪拌均勻后，再調(diào)pH在5.2～5.4范圍，維持溫度在25～27℃，連續(xù)攪拌24～48小時(shí)，至反應(yīng)完成后，即可升溫至80-85℃半小時(shí)，以終止反應(yīng)。
(6)乘熱加入0.5％糖用活性炭，輕度攪拌半小時(shí)后，布氏漏斗過(guò)濾，溶液再經(jīng)0.45微米超濾膜除碳。
(7)于濾液中加入1000毫升99％異丙醇沉淀，靜置半小時(shí)后除去上清液，沉淀，再用250毫升99％異丙醇洗滌一次。
(8)將沉淀物溶解于4000毫升蒸餾水中，然后經(jīng)超濾膜系統(tǒng)循環(huán)除去小分子物質(zhì)，最后濃縮至500毫升左右。
(9)于上述溶液中，緩慢滴加30毫升10％硼氫化鈉堿性溶液。在25～30℃溶液中反應(yīng)4小時(shí)，待氣泡消失后，逐漸滴加6N鹽酸至pH 2～3時(shí)再攪拌4小時(shí)，然后加1倍體積的99％異丙醇沉淀、洗滌，沉淀物溶解于1000毫升蒸餾水，再經(jīng)復(fù)合離子交換樹脂柱(或超濾系統(tǒng))除去鹽類，最后用有機(jī)溶劑脫水，真空干燥，磨粉。
(10)磺化反應(yīng)吡啶法將500毫升吡啶倒入1000毫升圓底三口燒瓶中，置冰水溶液中，使瓶?jī)?nèi)吡啶溫度降至10℃以下，開始滴加50毫升氯磺酸，并維持溫度在15℃以下，待滴加完畢后逐漸升溫至50℃，加入上述氫化異麥芽糖干粉50克。然后升溫至70～75℃反應(yīng)4小時(shí)，即可停止，并降溫至50℃以下，然后加50毫升蒸餾水，調(diào)pH至3，再用99％甲醇沉淀、洗滌，并重復(fù)3次至沉淀物的游離硫和氯離子含量降至標(biāo)準(zhǔn)范圍(低于100ppm)即可干燥制粉。
本例異麥芽低聚糖分子量為1000～1300，含硫量18.0～19.0％。
實(shí)施例2(1)異麥芽低聚糖的制備(10L)稱取1.5公斤純蔗糖和0.3公斤純度為99％的麥芽糖，置15升的玻璃反應(yīng)器中，加蒸餾水5升，攪拌使溶，再加入新鮮配制的1升0.2M乙酸鈉---鈣離子溶液(內(nèi)含乙酸鈉16.4克，氯化鈣5.0克)，充分混合后，用30％冰乙酸調(diào)pH至5.2～5.4，然后加入100,000單位右旋糖酐蔗糖酶，再加蒸餾水至總?cè)莘e10升，攪拌混勻后調(diào)pH至5.2～5.4。于25～27℃溫度下，攪拌24～48小時(shí)，反應(yīng)完成后即可升溫滅酶過(guò)濾純化(步驟同實(shí)施例1)。
本例純化異麥芽低聚糖產(chǎn)量為750克。
(2)氫化反應(yīng)將純化異麥芽低聚糖配制成25％濃度溶液，緩慢滴加入300毫升10％硼氫化鈉堿性溶液(即30克硼氫化鈉溶解于300毫升30％NaOH溶液中，臨用前配制)。輕度間隙攪拌，使氫化反應(yīng)溫和進(jìn)行，約4小時(shí)，使氫氣完全耗盡，即可用6N鹽酸，將pH調(diào)至2～3，此時(shí)仍有氫氣發(fā)生，故再攪拌4小時(shí)，使氫化反應(yīng)充分完成，然后按實(shí)施例1的步驟進(jìn)行純化，最后噴霧干燥。
(3)磺化反應(yīng)(甲酰胺法)將5升甲酰胺加于10升玻璃反應(yīng)器中，將內(nèi)溫降至15℃以下，在攪拌(50轉(zhuǎn)/分)條件下，緩慢和小心地滴加300毫升氯磺酸，過(guò)程中應(yīng)維持溫度在20℃以下，滴加完畢后即可升溫至50℃，使固體物質(zhì)完全溶解后即可逐步加入500克干燥的氫化異麥芽低聚糖。然后將溫度升高至70～75℃并維持?jǐn)嚢?小時(shí)。反應(yīng)完成后，立即降溫至50℃以下，加入蒸餾水，攪拌后調(diào)pH至3～4，然后加入99％異丙醇6升，攪拌15分鐘后靜置30分鐘，吸去上清液，回收。沉淀再用1升99％異丙醇洗滌一次。同樣方法重復(fù)2～3次，直至游離硫和氯含量低于標(biāo)準(zhǔn)范圍，即可將pH調(diào)至6.5～7.5，并加入0.5％磷酸緩沖液，最后噴霧干燥。
本例制得的異麥芽低聚糖分子量為1300～1800，含硫量為12％。
權(quán)利要求
異麥芽低聚糖硫酸酯(IMOS)的制備方法，其特征如下1、異麥芽低聚糖的生物合成(1)酶反應(yīng)基質(zhì)液的制備甲液30％蔗糖溶液；乙液10％麥芽糖溶液；丙液0.2M內(nèi)含氯化鈣0.5％乙酸鈉一鈣離子溶液；將甲液、乙液和丙液按1∶0.5∶0.2比例混合，然后用30％冰乙酸調(diào)pH至5.2～5.4；(2)酶反應(yīng)根據(jù)上述基質(zhì)液容積，按每毫升10～12單位計(jì)算，加入適量的純化右旋糖酐蔗糖酶，攪拌混勻后，調(diào)節(jié)pH在5.2～5.4之間，維持溫度在25～27℃，并持續(xù)攪拌(50轉(zhuǎn)/分)24～48小時(shí)，至高壓液相檢測(cè)酶反應(yīng)完成后，即可升溫至80℃約半小時(shí)以終止酶反應(yīng)；(3)分離與純化于上述酶反應(yīng)液中加入0.5％糖用活性炭，攪拌(50轉(zhuǎn)/分)，并維持溫度在60-70℃半小時(shí)，然后經(jīng)板框壓過(guò)濾或?qū)⒚阜磻?yīng)液直接經(jīng)陶瓷膜系統(tǒng)過(guò)濾以除去大分子雜質(zhì)；過(guò)濾后的液體再用1倍容積的99％異丙醇(或乙醇)沉淀，沉淀物再用1/4體積異丙醇洗滌一次；最后將沉淀物溶解于10倍容積的純水中，經(jīng)超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行純化，除去鹽類和其他低分子物質(zhì)。當(dāng)高壓液相檢測(cè)呈現(xiàn)單峰，純度在98％以上時(shí)，即可用于下一步的化學(xué)反應(yīng)；
2.異麥芽低聚的氫化反應(yīng)將上述純化的異麥芽低聚糖配制成濃度25％的水溶液，然后加入4％(W/V)的硼氫化鈉堿性溶液，在25～30℃條件下，間隙攪拌(10～20轉(zhuǎn)/分)4小時(shí)，待產(chǎn)生的氫氣小泡完全消失之后，用6N鹽酸緩慢滴加至pH2～3，繼續(xù)攪拌4小時(shí)，測(cè)定還原糖低于0.1％時(shí)，即可用異丙醇沉淀，離子交換或超過(guò)濾方法除去雜質(zhì)；最后將純化的氫化異麥芽低聚糖真空濃縮干燥或噴霧干燥成粉；硼氫化鈉堿性溶液的配方每10克硼氫化鈉溶解于100毫升30％氫氧化鈉溶液中，臨用前配制。
3.磺化反應(yīng)將1容積的吡啶(或甲酰胺)倒入干燥密封的玻璃或搪瓷反應(yīng)器中，將溫度降至10℃以下，然后緩慢滴加0.6～1.25容積的氯磺酸(滴加量取決于所需含硫量，從10％～20％)，滴加期間應(yīng)維持溫度在15℃以下，并不斷攪拌。待滴加完畢后即可升溫至50℃，然后按每升吡啶加入100克氫化異麥芽低聚糖，并逐漸升溫至70～75℃，維持反應(yīng)4小時(shí)，即可降溫至50℃以下，逐漸加酸中和，并用甲醇沉淀洗滌至游離硫和氯離子濃度低于100ppm，最后加入0.5％磷酸，調(diào)pH至6.5～7.5，噴霧干燥。
全文摘要
異麥芽低聚糖硫酸酯(1MOS)，作為一種新型的高科技產(chǎn)品，由于與許多危害人類和動(dòng)物健康的嚴(yán)重疾病的防治有關(guān)，已引起國(guó)際范圍的極大關(guān)注。其制備方法包括第一、合成特定分子量的異麥芽低聚糖。第二、異麥芽低聚糖的氫化。第三、氫化異麥芽低聚糖的磺化。最后噴霧干燥。
文檔編號(hào)C08B37/00GK1651447SQ20051000214
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2005年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2005年1月14日
發(fā)明者莊漢忠 申請(qǐng)人:莊茅