用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的人工抗原及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與體外血清學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的人工抗原及試劑盒。本發(fā)明提供的人工抗原，能夠準確、高效、靈敏、特異地檢出待測樣品中存在的EB病毒Rta蛋白抗體與早期抗原EA抗體。采用所述人工抗原制成的試劑盒，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，提高了鼻咽癌診斷的靈敏度和特異性，縮短了檢測時間，使患者能得到及時的治療，減輕痛苦。
【專利說明】用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA 抗體的人工抗原及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)、醫(yī)學(xué)免疫學(xué)與體外血清學(xué)診斷【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種用 于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的人工抗原及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] EB病毒是Epstein和Barr于1964年首次成功地將Burkitt非洲兒童淋巴瘤 細胞通過體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細胞涂片中用電鏡觀察到的皰疹病毒顆粒。該 病毒是多種惡性腫瘤（如鼻咽癌）的病因之一，它主要感染人類口咽部的上皮細胞和B 淋巴細胞。在中國南方鼻咽癌患病人群中大多都檢測到有EB病毒基因組存在。鼻咽癌 (nasopharygeal carcinoma, NPC)是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側(cè)壁的惡性腫瘤，多發(fā)于東南 亞地區(qū)，在我國南方各種惡性腫瘤中占第一位。
[0003] 經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌與EB病毒關(guān)系最為密切，EB病毒被激活感染鼻咽部細 胞，由潛伏期進入裂解復(fù)制狀態(tài)時，導(dǎo)致鼻咽部細胞發(fā)生異常分裂增生造成癌變。鼻咽癌患 者血清中具有針對多種EB病毒抗原的抗體譜，一般通過檢測血清EB病毒抗體來評估患鼻 咽癌的危險度，為鼻咽癌的診斷提供了有效的檢測指標。申請?zhí)枮?00610113403的發(fā)明專 利申請公開了 Rta是EB病毒剛剛進入裂解復(fù)制狀態(tài)時就表達的立即早期基因 BRLF1的編 碼轉(zhuǎn)錄激活蛋白，是EB病毒進入裂解復(fù)制狀態(tài)必需的激活元件而且僅在鼻咽癌發(fā)生時表 達，對診斷鼻咽癌具有極高的特異性?，F(xiàn)在臨床用于診斷鼻咽癌的主要指標為：EB病毒衣 殼抗原（VCA)、早期抗原（EA)，且主要是檢測其IgA抗體，用于鼻咽癌患者的診斷和預(yù)警。經(jīng) 大量臨床實驗證實EB病毒VCA-IgA抗體用于鼻咽癌診斷雖然靈敏度高，但是特異性差，在 健康人群中有很高的檢出率；EB病毒EA-IgA抗體用于鼻咽癌診斷特異性好，但靈敏度差， 鼻咽癌漏檢率較高。而EB病毒Rta-IgA抗體用于鼻咽癌診斷特異性非常好。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對上述領(lǐng)域存在的問題，提供一種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與 EB病毒早期抗原（EA)抗體的人工抗原及試劑盒。
[0005] 本發(fā)明請求保護的技術(shù)方案如下：
[0006] -種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的人工抗原， 其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)為N-R1-R2-C或N-R2-R1-C，其中R1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 示；R2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007] -種含有EB病毒Rta蛋白與早期抗原EA的抗原決定簇的抗原蛋白，包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
[0008] 編碼上述人工抗原的基因。
[0009] 上述人工抗原的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
[0010] 含有任一上述人工抗原的基因的重組質(zhì)粒。
[0011] 所述重組質(zhì)粒，是以表達載體pET32a (+)為骨架載體，以SEQ ID NO: 3所示的基因 為外源基因的重組質(zhì)粒pET32a-Rta-EA。
[0012] -種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的試劑盒，其 特征在于：以上述人工抗原為檢測抗原。
[0013] 所述試劑盒包括酶標板和酶標記的抗人IgA、校準品溶液、陽性對照溶液、陰性對 照溶液、底物顯色液、終止液、樣品稀釋液及濃縮洗滌液，所述人工抗原包被于所述酶標板 的反應(yīng)孔中。
[0014] 所述酶標記的抗人IgA在酶標記中所用的標記酶為辣根過氧化物酶，所述顯色液 由顯色A液和顯色B液組成，顯色A液為過氧化氫或過氧化脲，顯色B液為鄰苯二胺或四甲 基聯(lián)苯胺，終止液為1?2mol/L硫酸或者鹽酸溶液，所述辣根過氧化物酶標記的抗人IgA 的工作稀釋度為1 :5000?1:80000 ;
[0015] 或者所述標記酶為堿性磷酸酯酶，顯色液為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為1? 2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0016] 所述校準品溶液為含人EBV-Rta-EA-IgA陽性血清的pH7. 4磷酸鹽緩沖液，所述陽 性對照溶液為含人EBV-Rta-EA-IgA陽性血清的pH7. 4磷酸鹽緩沖液，所述陰性對照溶液為 含人EBV-Rta-EA-IgA陰性血清的pH7. 4磷酸鹽緩沖液，所述樣品稀釋液為含有0. 3M NaCl 的50mM的磷酸鹽緩沖液，所述濃縮洗滌液為含有0. 02?0. 05 % (v/v) Proclin300和1. 0? 2. 0% (v/v)吐溫-20的pH值為7. 2?8. 5的0· 01?0· 03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
[0017] 任一上述試劑盒的制備方法，包括如下步驟：
[0018] 1)制備酶標板：
[0019] 用包被緩沖液將權(quán)利要求1所述的人工抗原稀釋至l〇〇ng/ml，然后加入到酶標板 孔中，每孔100 μ 1,進行反應(yīng)；所述包被緩沖液為pH值9. 0?9. 6的0. lmol/L的碳酸鹽緩 沖液；
[0020] 甩掉包被液后，拍干，每孔加入200 μ 1的封閉液，反應(yīng)，甩掉封閉液，拍干，保存； 所述封閉液為含有1?10% (m/m)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液；
[0021] 2)配制酶標記的抗人IgA :
[0022] 親和層析純化HRP標記的抗人IgA，純度大于95%，效價不低于1:2000 ;
[0023] 3)配制校準品溶液、陽性對照溶液、陰性對照溶液、底物顯色液、終止液、樣品稀釋 液及濃縮洗滌液。
[0024] 本發(fā)明所述的抗原蛋白為經(jīng)優(yōu)化后的串聯(lián)表達的EB病毒早期抗原EA和Rta蛋 白。具體地，在NCBI網(wǎng)站查找EB病毒EA抗原（Protein Id:CAA24844. l)、Rta蛋白的氨基 酸（Protein Id :CAA24813. 1)序列（GenBank:V01555. 2)，對兩個蛋白所具有的抗原表位進 行分析，選擇抗原表位比較集中且不影響蛋白空間結(jié)構(gòu)的片段，然后對兩個蛋白中選擇保 留的多肽片段的氨基酸序列信息進行連接得到人工抗原的氨基酸序列，如SEQ ID N0:5或 SEQ ID N0:6所示；并對編碼該人工抗原的核苷酸密碼子進行優(yōu)化，根據(jù)優(yōu)化的基因序列進 行人工抗原的基因合成，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
[0025] 利用PCR技術(shù)擴增上述合成的人工基因片段，構(gòu)建至原核表達載體，并在大腸桿 菌中表達該重組蛋白，將純化后的重組蛋白通過ELISA方法檢測EB病毒抗體，用于輔助鼻 咽癌的臨床篩查與診斷。實驗數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的人工抗原蛋白在鼻咽癌的臨床診斷中，對 EB病毒Rta-IgA抗體和EA-IgA抗體的聯(lián)合檢測能夠彌補單獨檢測EA-IgA抗體時靈敏度差 這一缺點，同時增強檢測的特異性，為鼻咽癌的診斷提供了有效的檢測指標。用本發(fā)明的人 工抗原以一定濃度包被酶標板，制成的ELISA檢測試劑盒能夠準確、高效、靈敏、特異地檢 測樣品中存在的EB病毒Rta蛋白與早期抗原（EA)的抗體。在鼻咽癌病人血清樣本和健康 人血清樣本的檢測中，鼻咽癌病人的陽性檢出率，即靈敏度為91. 4% ;健康人群檢測的陰性 率為96. 4%,均高于目前常規(guī)使用的單獨的EA、VCA抗體的檢測，有利于臨床鼻咽癌篩查， 使患者得到及時、恰當?shù)闹委煛?br> [0026] 本發(fā)明提供的人工抗原的制成的試劑盒形式不限于包被酶標板，只要是基于 ELISA原理的檢測載體，只要采用了本發(fā)明的人工抗原，都包括在本發(fā)明請求保護的范圍 內(nèi)。
[0027] 本發(fā)明所用的表達載體不限于特定的表達載體，只要它能與所述抗原蛋白的DNA 片段重組，形成適合蛋白表達的表達質(zhì)粒即可。
[0028] 本發(fā)明還提供一種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原（EA) 抗體的試劑盒，其特征在于包括一個以本發(fā)明的人工抗原作為包被抗原的酶標板。
[0029] 本發(fā)明制備的優(yōu)選試劑盒中，主要試劑采用工作液形式，成本低廉，操作簡便，簡 化了傳統(tǒng)檢測方法的步驟，縮短了檢測時間，同時能實現(xiàn)多樣本處理，提高了檢測效率，使 醫(yī)生能夠迅速了解患者的病情，及時提出合適的治療方案。
[0030] 本發(fā)明的試劑盒采用板式酶標板，能夠適應(yīng)國內(nèi)普及的檢測設(shè)備，并且能保證檢 測的靈敏度高、特異性好、準確度高、穩(wěn)定性好。
[0031] 綜上，本發(fā)明提供的人工抗原，能夠準確、高效、靈敏、特異地檢出待測樣品中存在 的EB病毒Rta蛋白抗體與早期抗原EA抗體。采用所述人工抗原制成的試劑盒，與傳統(tǒng)的 檢測方法相比，提高了鼻咽癌診斷的靈敏度和特異性，縮短了檢測時間，使患者能得到及時 的治療，減輕痛苦。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖lpET32a-Rta_EA重組質(zhì)粒圖譜
[0033] 圖2BCA-100蛋白質(zhì)定量試劑盒標準蛋白曲線

【具體實施方式】
[0034] 提供下述實施例是為了更好地進一步理解本發(fā)明，并不局限于所述最佳實施方 式，不對本發(fā)明的內(nèi)容和保護范圍構(gòu)成限制。任何人在本發(fā)明的啟示下或是將本發(fā)明與其 它現(xiàn)有技術(shù)的特征進行組合而得出的任何與本發(fā)明相同或相近似的產(chǎn)品，均落在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
[0035] 本發(fā)明所用試劑來源及規(guī)格如下：
[0036] 實驗所用載體、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、pMD18-T和pET32a購自TaKaRa公 司；
[0037] 序列合成、引物合成、測序由上海生物工程公司完成；
[0038] 辣根過氧化物酶購于SIGMA，批號為9003-99-0 ;
[0039] 過氧化氫購于SIGMA，批號為7722-84-1 ;
[0040] 過氧化脲購于SIGMA，批號為U1753 ;
[0041] 鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺購于SIGMA，批號為T2885 ;
[0042] 1 一2mol/L硫酸購于北京化工廠，批號為7647-02-0 ;
[0043] 鹽酸溶液購于北京化工廠，批號為7647-01-0 ;
[0044] 1 一2mol/L氫氧化鈉溶液購于北京化工廠，批號為1310-73-2。
[0045] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī) 實驗方法。
[0046] 實施例1 EB病毒Rta蛋白、EA抗原在大腸桿菌中的串聯(lián)表達
[0047] 在NCBI網(wǎng)站查找EB病毒Rta蛋白、EA抗原的氨基酸序列（見序列表SEQ ID N0:7 和 SEQ ID N0:8)，米用 http://www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_ submission, html對其抗原表位進行分析，對其抗原表位進行選擇，獲得優(yōu)化的EB病毒Rta 蛋白片段（Seq ID No :1)和優(yōu)化的EB病毒EA抗原（Seq ID No :2)，并對密碼子進行優(yōu)化。 將優(yōu)化后的Rta、EA抗原基因序列組合并合成，用Primerf. 0引物設(shè)計軟件設(shè)計引物，
[0048] 上游引物 P1 :5，-CCTCGAGATGGCTTCTTCTAACCGT-3，，
[0049] 下游引物 P2 :5，-CTGGATCCTTTGGTTTTGAAACGCAG-3，。
[0050] PI、P2引物中分別含有Xho I、BarmH I酶切位點。
[0051] 利用PCR技術(shù)擴增上述合成基因。
[0052] PCR反應(yīng)體系：
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的人工抗原， 其氨基酸序列的結(jié)構(gòu)為N-R1-R2-C或N-R2-R1-C，其中R1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所 示；R2的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2. -種含有EB病毒Rta蛋白與早期抗原EA的抗原決定簇的抗原蛋白，包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
3. 編碼權(quán)利要求1所述的人工抗原的基因。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示。
5. 含有權(quán)利要求3或4所述的基因的重組質(zhì)粒。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒，是以表達載體pET32a(+)為骨架載體，以SEQ ID N0:3所示的基因為外源基因的重組質(zhì)粒pET32a-Rta-EA。
7. -種用于聯(lián)合檢測EB病毒Rta蛋白抗體與EB病毒早期抗原EA抗體的試劑盒，其特 征在于：以權(quán)利要求1所述的人工抗原為檢測抗原。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，包括酶標板和酶標記的抗人IgA、校準 品溶液、陽性對照溶液、陰性對照溶液、底物顯色液、終止液、樣品稀釋液及濃縮洗滌液，所 述人工抗原包被于所述酶標板的反應(yīng)孔中。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述酶標記的抗人IgA在酶標記中所 用的標記酶為辣根過氧化物酶，所述顯色液由顯色A液和顯色B液組成，顯色A液為過氧化 氫或過氧化脲，顯色B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1?2mol/L硫酸或者鹽酸 溶液，所述辣根過氧化物酶標記的抗人IgA的工作稀釋度為1 :5000?1:80000 ; 或者所述標記酶為堿性磷酸酯酶，顯色液為硝基磷酸鹽緩沖液，終止液為1?2mol/L 氫氧化鈉溶液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，所述校準品溶液為含人EBV-Rta-EA-IgA陽性血清 的pH7. 4磷酸鹽緩沖液，所述陽性對照溶液為含人EBV-Rta-EA-IgA陽性血清的pH7. 4磷酸 鹽緩沖液，所述陰性對照溶液為含人EBV-Rta-EA-IgA陰性血清的pH7. 4磷酸鹽緩沖液，所 述樣品稀釋液為含有〇. 3M NaCl的50mM的磷酸鹽緩沖液，所述濃縮洗滌液為含有0. 02? 0.05%&八)卩1'〇。1111300 和1.0?2.0%&八）吐溫-20的？!1值為7.2?8.5的0.01? 0· 03mol/L的磷酸鹽緩沖液。
11. 權(quán)利要求7?10任一所述的試劑盒的制備方法，包括如下步驟： 1) 制備酶標板： 用包被緩沖液將權(quán)利要求1所述的人工抗原稀釋至l〇〇ng/ml，然后加入到酶標板孔 中，每孔100 μ 1,進行反應(yīng)；所述包被緩沖液為pH值9. 0?9. 6的0. lmol/L的碳酸鹽緩沖 液； 甩掉包被液后，拍干，每孔加入200 μ 1的封閉液，反應(yīng)，甩掉封閉液，拍干，保存；所述 封閉液為含有1?10% (m/m)牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液； 2) 配制酶標記的抗人IgA : 親和層析純化HRP標記的抗人IgA，純度大于95%，效價不低于1:2000 ; 3) 配制校準品溶液、陽性對照溶液、陰性對照溶液、底物顯色液、終止液、樣品稀釋液及 濃縮洗滌液。
【文檔編號】C07K19/00GK104086657SQ201410321862
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月7日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月7日
【發(fā)明者】賈鳳芹 申請人:同昕生物技術(shù)（北京）有限公司