專利名稱：包含磺酰胺基團(tuán)的呫噸染料的制作方法
包含磺酰胺基團(tuán)的咕噸染料交叉參考本申請(qǐng)要求2009年2月3日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/149，603的權(quán)益，該申請(qǐng)通過引用全文納入本文。
背景技術(shù)：
熒光染料廣泛用于生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)診斷。熒光染料優(yōu)于常規(guī)的放射性材料，因?yàn)闊晒馊玖贤ǔ＞哂凶銐虻臋z測(cè)靈敏度、廉價(jià)且低毒。具體地說，具有可區(qū)分顏色范圍的各種熒光團(tuán)使得能平行檢測(cè)多種生物學(xué)靶標(biāo)的多重試驗(yàn)更加實(shí)際。在體外和體內(nèi)描述不同生物學(xué)靶標(biāo)之間在空間和時(shí)間上的關(guān)系常要求能平行顯現(xiàn)多個(gè)靶標(biāo)。此外，產(chǎn)生大量熒光染料為進(jìn)行高通量和自動(dòng)化試驗(yàn)打開了新的通道，因而極大降低了每次試驗(yàn)的單位成本。此外，熒光染料的低毒性便于體外操控，還能更安全地進(jìn)行生物學(xué)活性的體內(nèi)成像。雖然熒光染料有各種優(yōu)點(diǎn)，但常規(guī)染料有許多深遠(yuǎn)的局限性。例如，常規(guī)熒光染料通常易發(fā)生染料間淬滅，已知該現(xiàn)象能減弱染料的亮度。常將給定靶標(biāo)偶聯(lián)于多個(gè)染料分子以便最大程度提高標(biāo)記靶標(biāo)，例如生物分子，如蛋白質(zhì)或DNA的亮度。對(duì)于許多常規(guī)熒光染料，標(biāo)記靶標(biāo)的熒光強(qiáng)度常不與所連接染料分子數(shù)成正比，由于，例如靶標(biāo)所連多個(gè)染料之間的淬滅而弱于預(yù)計(jì)的強(qiáng)度。此類淬滅效應(yīng)部分是因?yàn)樗B染料分子之間的物理相互作用可能形成無熒光的染料二聚體。疏水相互作用可驅(qū)動(dòng)二聚體形成。由于許多傳統(tǒng)熒光染料，例如各種羅丹明染料和花青染料是高度疏水性芳族化合物，這些常用的染料尤其易在標(biāo)記的生物分子上形成二聚體。將磺酸基團(tuán)加入染料顯示能減少二聚體形成。參見，例如美國(guó)專利號(hào) 5，268，486,6, 977，305,6, 130，101 和 Panchuk-Voloshina 等，J. Histochem. Cytochem. 47(9)，1179(1999)。然而，雖然磺化可減少二聚體形成，但也在生物分子中引入負(fù)電荷，因此可能增加破壞標(biāo)記生物分子的生物學(xué)活性的風(fēng)險(xiǎn)。磺化染料(例如，AF488、AlexaFluor 532,Alexa Fluor 546和Alexa Fluor 568) 可用于抗體標(biāo)記或標(biāo)記其它大分子，其中多個(gè)染料分子通常很接近。在一些情況中，如果背景熒光信號(hào)的降低依賴于染料之間的相互作用，染料的電荷可影響標(biāo)記生物分子的活性。 在一些情況中，標(biāo)記的抗體可在某些細(xì)胞染色中產(chǎn)生高背景。為降低背景，可能需要利用帶負(fù)電的聚合物以用作阻斷劑(美國(guó)專利申請(qǐng)2008/0038772)。為最大程度提高熒光信號(hào)，需要在其最大吸收(波長(zhǎng))或附近激發(fā)熒光染料?，F(xiàn)有激發(fā)光源的波長(zhǎng)有限。例如，熒光顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、PCR儀器、DNA測(cè)序儀器和其它熒光生物醫(yī)學(xué)儀器通常利用488nm氬激光。許多常規(guī)染料光穩(wěn)定性差，在強(qiáng)激光下發(fā)生快速光漂白，當(dāng)要長(zhǎng)時(shí)間追蹤熒光信號(hào)時(shí)，已知該現(xiàn)象減弱染料的有效亮度。對(duì)于許多常規(guī)染料， 熒光還對(duì)pH改變敏感。在一些情況中，染料的磺化克服光穩(wěn)定性低和pH敏感的缺點(diǎn)。磺化還增強(qiáng)水溶性和藍(lán)移，即，染料的吸收波長(zhǎng)向接近488nm氬離子激光線(argon ion laser line)的漂移。 然而，多個(gè)磺化基團(tuán)造成染料相對(duì)不溶于非極性有機(jī)溶劑。在某些情況中，涉及相對(duì)非極性底物的標(biāo)記反應(yīng)優(yōu)選非極性有機(jī)溶劑。發(fā)明概述
因此，仍極其需要改進(jìn)的組合物和方法從而能方便和有效地標(biāo)記各種應(yīng)用中的大量分子。本發(fā)明解決了此類需求并提供額外的優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明提供可能具有任何或所有以下特征的熒光化合物。在一方面，利用本發(fā)明熒光化合物制備的標(biāo)記生物分子顯示二聚體形成明顯減少。在其它方面，本發(fā)明的化合物和標(biāo)記生物分子顯示其它所需特性，例如水溶性較高、熒光量子產(chǎn)量提高、光穩(wěn)定性改善、合成相對(duì)簡(jiǎn)單、標(biāo)記偶聯(lián)物的特異性改善。在一些實(shí)施方式中，本文提供式I所示化合物
權(quán)利要求
1.式Ia或Λ所示化合物
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，X是0。
3.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，A是-NR1Rla,B是=N+R4R4a。
4.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，一對(duì)或多對(duì)的R2和I la、R3和R4a、R4和R5、 R5和和&、或&和R1與和它們相連的原子一起形成一個(gè)或多個(gè)稠合的飽和或不飽和環(huán)，該環(huán)任選被至少一個(gè)鹵素、CN、烷基、雜烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基氨基羰基、二烷基氨基羰基、芳基、雜芳基、-L-P032-、-L-S0” -L-Rx、反應(yīng)活性磺酰胺或無反應(yīng)活性磺酰胺取代。
5.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物包含至少一個(gè)式IIa所示的反應(yīng)活性磺酰胺式中R10是H或取代或未取代的C1-C12烷基；或R10和L與和它們相連的氮一起形成飽和或不飽和的環(huán)。
6.如權(quán)利要求5所述的化合物，其特征在于，R10是H、磺基丙基或磺基丁基。
7.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，民是異硫氰酸酯、異氰酸酯、一氯三嗪、二氯三嗪、鹵素-取代的吡啶、鹵素-取代的二嗪、亞磷酰胺、馬來酰亞胺、氮丙啶、磺酰鹵、酰鹵、羥基琥珀酰亞胺酯、羥基磺基琥珀酰亞胺酯、吡咯-2，5-二酮、四氟苯酚酯、亞胺酯、胼、 疊氮基硝基苯基、疊氮化物、炔烴、3- (2-吡啶基二硫代)-丙酰胺、乙二醛或醛。
8.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，民與氨基、巰基或羥基親核試劑形成共價(jià)鍵。
9.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，&、民、1 5和1 9獨(dú)立選自H、鹵
10.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R7是H、取代或未取代的烷基或取代或未取代的芳基。
11.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，R7是被-C02-、羧酰胺、-so”氯、氟或Rx 取代的苯基。
12.如權(quán)利要求1所述的化合物，其特征在于，Rx是活化的羧酸酯基團(tuán)。
13.如權(quán)利要求12所述的化合物，其特征在于，活化的羧酸酯基團(tuán)是N-羥基琥珀酰亞胺酯基團(tuán)。
14.如權(quán)利要求5所述的化合物，其具有式IIIa所示結(jié)構(gòu)Rlla是H、-SO3^或無反應(yīng)活性的磺酰胺。
15.如權(quán)利要求14所述的化合物，其特征在于， R3是H或-SO3-；和L是Qn，其中至少1、2、3或4個(gè)Q是-(CH2CH20)-。
16.如權(quán)利要求5所述的化合物，其具有式IV所示結(jié)構(gòu)式IV
17.如權(quán)利要求5所述的化合物，其具有式V所示結(jié)構(gòu)
18.如權(quán)利要求1所述的化合物，其具有式VI所示結(jié)構(gòu)
19.式VII所示化合物
20.如權(quán)利要求19所述的化合物，其特征在于，Z是選自以下的靶離子的螯合劑Ca2+、 Mg2+、Zn2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Na+、K+、Hg2+、Pb2+、Cd2+ 或 As3+。
21.如權(quán)利要求20所述的化合物，其特征在于，Z是基于BAPTA的Ca2+螯合劑。
22.—種檢測(cè)或定量測(cè)定金屬離子存在與否的方法，包括 a.將樣品與式VII所示化合物溫育
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述改變是所述化合物的吸收或發(fā)射的增加或降低。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述改變是所述化合物的最大吸收或最大發(fā)射波長(zhǎng)的改變。
25.一種制備標(biāo)記生物分子的方法，包括將生物分子與具有式VIIIa或Vinb所示結(jié)構(gòu)的化合物反應(yīng)
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述生物分子是蛋白質(zhì)、多肽、多核苷酸、 碳水化合物、脂質(zhì)、金屬螯合劑或它們的組合。
27.—種試劑盒，其裝有i)權(quán)利要求1或19所述的化合物；ii)緩沖液；iii)純化偶聯(lián)產(chǎn)物的材料或裝置；和 iv)指導(dǎo)所述化合物使用的使用說明書。
28.一種包含標(biāo)記物的生物分子，所述標(biāo)記物具有權(quán)利要求1或19所述化合物的結(jié)構(gòu)， 其中所述化合物的至少一個(gè)反應(yīng)活性部分經(jīng)歷將所述標(biāo)記物連接于所述生物分子的反應(yīng)。
29.如權(quán)利要求觀所述的生物分子，其特征在于，所述生物分子包含多核苷酸或多肽。
30.一種包含標(biāo)記物的免疫球蛋白，所述標(biāo)記物具有權(quán)利要求1或19定義的結(jié)構(gòu)，其中所述結(jié)構(gòu)的至少一個(gè)反應(yīng)活性部分經(jīng)歷將所述標(biāo)記物連接于所述免疫球蛋白的反應(yīng)，其中所述免疫球蛋白是特異性結(jié)合癌細(xì)胞上抗原的抗體。
31.式Ia或Λ所示化合物R2R3R2R3式Ia式H 式中
32.如權(quán)利要求31所述的化合物，其特征在于，所述無反應(yīng)活性磺酰胺的分子量小于約 350。
33.如權(quán)利要求31所述的化合物，其特征在于，所述無反應(yīng)活性磺酰胺部分具有式IIb 所示結(jié)構(gòu)
34.如權(quán)利要求33所述的化合物，其特征在于，Rffl和各自獨(dú)立為H或C1-C12烷基。
35.如權(quán)利要求31所述的化合物，其特征在于，所述無反應(yīng)活性磺酰胺帶正電荷。
36.如權(quán)利要求33所述的化合物，其特征在于，所述化合物具有式Inb所示結(jié)構(gòu)
37. 一種制備標(biāo)記的生物分子的方法，包括將生物分子與權(quán)利要求31所述的化合物反應(yīng)，其中所述化合物包含至少一個(gè)反應(yīng)活性基團(tuán)。
全文摘要
本發(fā)明總體上涉及熒光染料。本發(fā)明提供各種熒光染料和含有這些染料的試劑盒，其適用于標(biāo)記各種生物分子、細(xì)胞和微生物。本發(fā)明還提供利用所述熒光染料進(jìn)行研究和開發(fā)、法醫(yī)鑒定、環(huán)境研究、疾病診斷、預(yù)后和/或治療的各種方法。
文檔編號(hào)C07D405/00GK102300861SQ201080007073
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月3日
發(fā)明者C-Y·程, F·毛, W-Y·里昂 申請(qǐng)人:百奧提姆股份有限公司