專(zhuān)利名稱(chēng)：糖胺聚糖的分離和鑒定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合至具有肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的糖胺聚糖的分離和鑒定，以及分離的所述糖胺聚糖在組織的生長(zhǎng)和/或發(fā)育中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖胺聚糖(GAG)是負(fù)責(zé)實(shí)施和調(diào)節(jié)大量的基本細(xì)胞功能的復(fù)雜的碳水化合物大分子。GAG與數(shù)百種已知的肝素結(jié)合生長(zhǎng)和粘附因子一起調(diào)節(jié)或介導(dǎo)許多信號(hào)系統(tǒng)。認(rèn)為生長(zhǎng)因子與GAG結(jié)合，以各種不同的作用，如通過(guò)保護(hù)其免受蛋白質(zhì)降解而增長(zhǎng)其半壽命，在細(xì)胞表面調(diào)節(jié)這些細(xì)胞因子的定位，介導(dǎo)分子相互作用和穩(wěn)定配體-受體復(fù)合物，來(lái)調(diào)節(jié)它們的各種活性。已經(jīng)鑒定的肝素結(jié)合生長(zhǎng)因子數(shù)目一直在增加，已經(jīng)增加至已知的數(shù)百種了，其中大多數(shù)都是通過(guò)肝素親合色譜進(jìn)行純化的。它們包括大量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF) 家族，PDGF和多效生長(zhǎng)因子以此至細(xì)胞因子的TGF-β超家族。該后者細(xì)胞因子的家族涵蓋了骨誘導(dǎo)的骨形態(tài)形成蛋白質(zhì)(BMP)子家族，因此因?yàn)槠湔T導(dǎo)異位骨形成的能力而得名。GAG和生長(zhǎng)因子的相互作用的性質(zhì)和效應(yīng)仍不清楚。盡管FGF2和在肝素中發(fā)現(xiàn)的特殊糖化物序列之間的相互作用已經(jīng)證實(shí)是高親合性的，但是這一般仍然不清楚其它生長(zhǎng)因子和乙酰肝素(heparan)之間的關(guān)聯(lián)是否涉及蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子上的氨基酸序列抗原決定基和GAG中嵌埋的糖化物序列之間的高親合性或特異性結(jié)合相互作用，或這種關(guān)聯(lián)是否由GAG和蛋白質(zhì)生長(zhǎng)因子之間的較低親合力、非特異性相互作用介導(dǎo)。如果GAG和駐留于、或分泌到、胞外基質(zhì)中的蛋白質(zhì)之間的相互作用是特異性的， 則結(jié)合配對(duì)體需要進(jìn)行鑒定才能弄清楚這些相互作用并理解如何可以使用或調(diào)節(jié)這些相互作用而提供新的治療。因此，產(chǎn)生的關(guān)鍵問(wèn)題是，是否存在嵌埋于GAG分子鏈中的與生長(zhǎng)因子多肽骨架中的主要氨基酸序列匹配的糖化物序列，而以絕對(duì)的，或至少相對(duì)的特異性控制其結(jié)合以及生物活性。

發(fā)明內(nèi)容
我們已經(jīng)發(fā)明了一種回答這個(gè)問(wèn)題的方法，其涉及富集顯示結(jié)合至具有肝素結(jié)合域的特殊多肽的糖胺聚糖分子。然后分離的GAG混合物和/或分子能夠被識(shí)別并對(duì)其調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化和組織表達(dá)含肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的能力進(jìn)行測(cè)試。對(duì)于第一次，這能受控分析特定GAG糖化物序列對(duì)細(xì)胞和組織具體的生長(zhǎng)和分化的影響，體外和體內(nèi)均可。因此，本發(fā)明的第一方面提供了一種分離能夠結(jié)合至具有肝素/乙酰肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供一種具有附著至支持物的多肽分子的固體支持物，其中所述多肽含有肝素結(jié)合域；
(ii)將所述多肽分子與含糖胺聚糖的混合物接觸而使之可以形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)從所述混合物的剩余物中分離多肽_糖胺聚糖復(fù)合物；(iv)從所述多肽_糖胺聚糖復(fù)合物中解離糖胺聚糖；(ν)收集所述解離的糖胺聚糖。本發(fā)明另一方面，分離的糖胺聚糖通過(guò)其調(diào)節(jié)細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)或分化的能力而進(jìn)行鑒定。本發(fā)明提供了一種鑒定能夠刺刺激或抑制細(xì)胞和/或組織生長(zhǎng)和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供一種具有附著至支持物的多肽分子的固體支持物，其中所述多肽含有肝素結(jié)合域；(ii)將所述多肽分子與含糖胺聚糖的混合物接觸而使之可以形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)從所述混合物的剩余物中分離多肽_糖胺聚糖復(fù)合物；(iv)從所述多肽_糖胺聚糖復(fù)合物解離糖胺聚糖；(ν)收集所述解離的糖胺聚糖；(vi)將所述收集的糖胺聚糖加入細(xì)胞或組織中，其中存在含所述肝素結(jié)合域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；(vii)測(cè)定以下一種或多種細(xì)胞增殖，細(xì)胞分化，一個(gè)或多個(gè)蛋白質(zhì)標(biāo)記物的表達(dá)。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，含GAG的混合物可以包含合成的糖胺聚糖。然而，在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用了獲自細(xì)胞或組織的GAG。例如，該混合物可以包含胞外基質(zhì)，其中這種胞外基質(zhì)材料通過(guò)原位活體組織刮片(即，直接從由獲得的人或動(dòng)物身體中的組織中獲得)或通過(guò)對(duì)已經(jīng)從人或動(dòng)物的身體提取的組織(活的或死的)進(jìn)行刮片而獲得。另外， 胞外基質(zhì)物質(zhì)可以獲自培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的細(xì)胞。胞外基質(zhì)物質(zhì)可以獲自結(jié)締組織或結(jié)締組織細(xì)胞，例如骨骼、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或肌腱。GAG組分可以從組織或細(xì)胞樣品提取或通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)對(duì)于技術(shù)人員眾所周知的系列常規(guī)分離步驟(例如，陰離子交換色譜)提取。GAG混合物可以包含不同類(lèi)型的糖胺聚糖的混合物，其可以包括硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素和硫酸乙酰肝素。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，與固體支持物接觸的GAG混合物富含這些類(lèi)型的糖胺聚糖中的一種，最優(yōu)選硫酸乙酰肝素。富含硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素或硫酸葡聚糖的GAG部分可以通過(guò)對(duì)GAG混合物實(shí)施柱色譜分離而獲得，例如弱、中或強(qiáng)陰離子交換色譜，以及強(qiáng)高壓液相色譜(SAX-HPLC)以選擇合適的部分。收集的GAG可以進(jìn)行進(jìn)一步分析而鑒別GAG，例如測(cè)定GAG的組成或序列，或測(cè)定 GAG的結(jié)構(gòu)特性。GAG結(jié)構(gòu)典型地是高度復(fù)雜的，而考慮到當(dāng)前可以利用的分析技術(shù)，在大多數(shù)情況下不可能精確檢測(cè)GAG的序列結(jié)構(gòu)。然而，所收集的GAG分子可以進(jìn)行部分或完全糖化物消化(例如，通過(guò)亞硝酸的化學(xué)消化或采用裂解酶如肝素酶III的酶消化)而產(chǎn)生都屬于GAG的特性和診斷特征的糖化物片斷。具體而言，消化產(chǎn)生二糖(或四糖)可以用于測(cè)定所獲得的每一二糖的百分?jǐn)?shù)，二糖可能提供GAG特征二糖“指紋”。
GAG的硫酸化形式也能夠進(jìn)行檢測(cè)而用于確定GAG結(jié)構(gòu)。例如，對(duì)于硫酸乙酰肝素，在氨基糖和C2、C3和C6位置的硫酸化形式可以用于表征硫酸乙酰肝素。二糖的分析，四糖的分析和硫酸化的分析能夠結(jié)合其它分析技術(shù)如每一種都提供 GAG的獨(dú)特光譜的HPLC、質(zhì)譜和NMR進(jìn)行使用。這些技術(shù)組合起來(lái)可以提供GAG的明確結(jié)構(gòu)表征。GAG和肝素結(jié)合域之間高親合力的結(jié)合相互作用表明，GAG將含有有助于高親合力結(jié)合的相互作用的特異性糖化物序列。其它步驟可以包括確定參與結(jié)合相互作用的GAG 的完整或部分糖化物序列，或GAG的關(guān)鍵部分。在一個(gè)實(shí)施方式中，GAG-多肽復(fù)合物可以采用裂解糖胺聚糖鏈的試劑，例如裂解酶進(jìn)行處理。裂解酶處理可以切開(kāi)并未參與與多肽的結(jié)合相互作用的結(jié)合GAG部分。參與與多肽結(jié)合相互作用的GAG部分可以免受裂解酶作用。在除去裂解酶之后，例如，在沖洗步驟之后，保持結(jié)合至多肽的GAG分子代表多肽的特異性結(jié)合配體(“GAG配體”)。由于較短的GAG分子的較低復(fù)雜性，GAG配體的解離和收集之后，能夠期望進(jìn)行GAG配體的較高程度的結(jié)構(gòu)表征。例如，任何糖化物序列(即，包含于GAG配體中單糖的主要(線性)序列)、硫酸化方式、二糖和/或四糖消化分析、NMR譜圖、質(zhì)譜圖和HPLC譜圖的組合可以提供GAG配體的高水平結(jié)構(gòu)表征。在本發(fā)明的一方面，提供的GAG具有BMP2的高結(jié)合親合性。更優(yōu)選GAG是硫酸乙酰肝素(HS)。HS從通過(guò)以下本發(fā)明的方法獲自成骨細(xì)胞的胞外基質(zhì)的GAG混合物分離出來(lái)，其中包含BMP2的肝素結(jié)合域(SEQ ID NO :1)的多肽連接至固體支持物而可以形成 GAG-多肽復(fù)合物。GAG組分從GAG-多肽復(fù)合物解離導(dǎo)致分離出本文中稱(chēng)之為“HS/BMP2” 的獨(dú)特HS。因此，本發(fā)明一方面提供了 HS/BMP2。HS/BMP2可以以獨(dú)立的或純化的形式提供。 在另一方面提供了包含HS/BMP2的培養(yǎng)基。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種包含HS/BMP2的藥物組合物或藥物，可選地與藥用載體、佐劑或稀釋劑組合。在一些實(shí)施方式中，藥物組合物或藥物可以進(jìn)一步包含BMP2 蛋白質(zhì)。提供的包含HS/BMP2的藥物組合物或藥物用于預(yù)防或治療損傷或疾病。本發(fā)明也提供了 HS/BMP2在預(yù)防或治療損傷或疾病的藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用。在本發(fā)明的其他方面，提供了在其需要這種治療的患者中預(yù)防或治療損傷或疾病的方法，所述方法包括給予患者治療有效量的HS/BMP2。給予的HS/BMP2可以配制于合適的藥物組合物或藥物中并可以進(jìn)一步包含藥用載體、佐劑或稀釋劑?？蛇x地，這種藥物組合物或藥物也可以包含BMP2蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一方面提供了促進(jìn)或抑制骨生成(骨骼細(xì)胞和/或骨骼組織的形成)的方法，包括給予骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞HS/BMP2。本發(fā)明另一方面提供了促進(jìn)或抑制軟骨組織的形成(軟骨發(fā)生)的方法，包括給予軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞HS/BMP2。刺激或抑制骨生成或軟骨組織的形成的方法可以通過(guò)將骨骼或軟骨前體或干細(xì)胞與HS/BMP2接觸，可選地，在外加的BMP2蛋白質(zhì)的存在下而體外實(shí)施。前體細(xì)胞或干細(xì)胞可以是間充質(zhì)干細(xì)胞。在組織形成受促進(jìn)時(shí)，可以收集形成的組織而用于移植入人體或動(dòng)物患者中。
因此，本發(fā)明一方面，提供了其中所述結(jié)締組織通過(guò)在HS/BMP2(即，外源HS/ BMP2)的存在下，可選地在BMP2(即，外源BMP2)的存在下體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞而獲得的結(jié)締組織。這種結(jié)締組織可以是骨骼、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或肌腱。采用HS/BMP2預(yù)防或治療疾病可以涉及到組織，尤其是結(jié)締組織如骨骼、軟骨、肌肉、脂肪、韌帶或肌腱的修復(fù)、再生或替代。在具有這些組織中的一種受損的患者中，給予受損的位置HS/BMP2可以用于刺激該位置的組織生長(zhǎng)、增殖和/或分化。例如，刺激給藥位置處存在或附近的間充質(zhì)干細(xì)胞， 優(yōu)選在該位置也存在BMP2時(shí)，可以導(dǎo)致間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和分化成合適的結(jié)締組織，由此提供受損組織的替代/再生和損傷治療?？商鎿Q地，可以收集由接觸HS/BMP2的間充質(zhì)干細(xì)胞體外培養(yǎng)獲得的結(jié)締組織并移植于在損傷或疾病位置而替代受損或惡化的組織。受損或惡化的組織可選地首先從損傷或疾病位置切除。另一方面，可以提供一種包含干細(xì)胞，優(yōu)選間充質(zhì)干細(xì)胞，和HS/BMP2的藥物組合物。在損傷、疾病或惡化的位置給藥，例如注射該組合物提供了該位置處的組織再生。因此，HS/BMP2適用于通過(guò)向需要治療的患者直接施用HS/BMP2，可選地組合BMP2 和/或干細(xì)胞而實(shí)施的體內(nèi)傷口愈合，包括組織修復(fù)、再生和/或代替(例如疤痕組織或斷裂骨骼的愈合)。HS/BMP2也適用于體外產(chǎn)生適用于植入需要組織修復(fù)、再生和/或代替的患者的組織。優(yōu)選實(shí)施方式的說(shuō)明本發(fā)明涉及GAG，尤其涉及富集包含結(jié)合至對(duì)應(yīng)于結(jié)合肝素/乙酰肝素)的蛋白質(zhì)的肝素結(jié)合域的多肽(“肝素結(jié)合因子”)的一種或多種GAG的化合物的混合物的方法。 這種富集導(dǎo)致GAG分離，無(wú)論是作為含不同GAG的混合物或結(jié)構(gòu)或功能上相同(或基本相同)的GAG的種群。富集的混合物優(yōu)選對(duì)肝素結(jié)合因子具有調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明也涉及富含一種或多種對(duì)肝素/乙酰肝素結(jié)合因子具有調(diào)節(jié)作用的GAG的化合物的混合物，以及使用這種混合物的方法。本發(fā)明也涉及增強(qiáng)(例如，激動(dòng))BMP_2活性和由此刺激干細(xì)胞增殖和骨骼形成能力的GAG分子。正如本文中所用術(shù)語(yǔ)“富集”、“濃縮”、“富含”等都是描述一種處理(或狀態(tài))，其中混合物的相對(duì)組成被(或已經(jīng))按照這種方式改變以使該混合物中的一種或多種成分的分?jǐn)?shù)升高，而同時(shí)該混合物中的一種或多種不同的成分的分?jǐn)?shù)降低。通過(guò)富集而分離的GAG可以是純的，即基本上僅僅含有一種類(lèi)型的GAG，或可以仍然是一種不同類(lèi)型的GAG的混合物，該混合物相對(duì)于起始混合物具有較高比例的結(jié)合于肝素結(jié)合域的特殊GAG。通過(guò)本發(fā)明鑒定的GAG優(yōu)選是當(dāng)與其中表達(dá)或包含含肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織接觸時(shí)表現(xiàn)出功能效應(yīng)的GAG。這種功能效應(yīng)可以是調(diào)節(jié)或強(qiáng)化效應(yīng)。這種功能效應(yīng)可以是促進(jìn)(刺激)或抑制某些類(lèi)型的細(xì)胞增殖或從一種細(xì)胞類(lèi)型向另一種分化，或一種或多種蛋白質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)。例如，GAG可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，即細(xì)胞數(shù)量增加，或促進(jìn)干細(xì)胞向特異化細(xì)胞類(lèi)型的分化(例如，結(jié)締組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞)，促進(jìn)或抑制指示細(xì)胞的多能性或分化狀態(tài)的蛋白質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)(例如，這些標(biāo)記如堿性磷酸酶活性，檢測(cè)RUNX2、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(osterix)、膠原I，II，IV，VII，X、骨橋蛋白質(zhì)、骨鈣素、BSPII, S0X9、聚集蛋白聚糖、ALBP, CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白質(zhì)-α (C/EBP α )、脂肪細(xì)胞脂質(zhì)結(jié)合蛋白質(zhì)(ALBP)、堿性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白2、(BSPII)、膠原2al (Coll2a)和 S0X9)。正如本文中所用術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)效應(yīng)”應(yīng)該理解為是指第一種物質(zhì)對(duì)第二種物質(zhì)具有的效應(yīng)，其中第二種物質(zhì)在另一過(guò)程或多個(gè)過(guò)程中的正常功能通過(guò)第一種物質(zhì)的存在而改變。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，調(diào)節(jié)效應(yīng)可以是激動(dòng)性的或拮抗性的。調(diào)節(jié)效應(yīng)可以是強(qiáng)化效應(yīng)。術(shù)語(yǔ)“強(qiáng)化效應(yīng)”應(yīng)該理解為是指提高效能的效應(yīng)。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，術(shù)語(yǔ)“強(qiáng)化效應(yīng)”是指第一種物質(zhì)對(duì)第二種物質(zhì)所具有的效應(yīng)， 其效應(yīng)提高了第二種物質(zhì)在另一過(guò)程或多個(gè)過(guò)程中的效能。在本發(fā)明其他的優(yōu)選實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)應(yīng)該理解為是指分離的GAG對(duì)肝素結(jié)合因子的效應(yīng)，其中所述效應(yīng)提高了所述肝素結(jié)合因子的效能。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是肝素結(jié)合因子的生物利用度提高。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是BMP2的生物利用度提高。測(cè)定肝素結(jié)合因子生物利用度提高的方法是通過(guò)檢測(cè)肝素結(jié)合因子局部濃度的升高。在本發(fā)明另一實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是保護(hù)肝素結(jié)合因子不受降解作用。在本發(fā)明尤其優(yōu)選的實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是保護(hù)BMP-2不受降解作用。檢測(cè)肝素結(jié)合因子降解減少的一種方法是通過(guò)測(cè)定肝素結(jié)合因子的半衰期提高。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是將肝素結(jié)合因子與細(xì)胞受體隔絕。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，強(qiáng)化效應(yīng)是穩(wěn)定配體-受體的相互作用。強(qiáng)化效應(yīng)(例如，生長(zhǎng)或分化的調(diào)節(jié))可以通過(guò)使用合適的分析法進(jìn)行檢測(cè)。例如，HS對(duì)BMP-2的穩(wěn)定性所具有的效應(yīng)可以通過(guò)ELISA進(jìn)行檢測(cè)。HS對(duì)BMP-2活性所具有的效應(yīng)可以測(cè)定SMAD1、5或8中的一種或多種的活化/表達(dá)，或測(cè)定一種或多種成骨標(biāo)記基因如Runx2、堿性磷酸酶、成骨相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(osterix)、骨鈣素和BSPl的表達(dá)，或使用染色如茜素紅和馮庫(kù)薩(von Kossa)染色而測(cè)定礦化作用的水平。正如本文中所用“接觸”的過(guò)程涉及使兩種或多種分開(kāi)的物質(zhì)物理上彼此靠近。 “接觸”過(guò)程涉及使兩種或多種分開(kāi)的物質(zhì)靠近一段時(shí)間，而在某些條件下，足以容許那些兩種或多種離散存在物中的部分在分子水平上相互作用。優(yōu)選地，正如本文中所用，“接觸” 的過(guò)程涉及使含有一種或多種GAG的化合物的混合物與對(duì)應(yīng)于肝素結(jié)合因子的肝素結(jié)合域的多肽彼此附近?！敖佑|”的過(guò)程的實(shí)例包括混合、溶解、膨脹、沖洗。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，GAG混合物和多肽的“接觸”足以形成復(fù)合物，該復(fù)合物可以是表現(xiàn)出相互之間的高親合性的GAG和多肽之間的共價(jià)鍵，但優(yōu)選是非共價(jià)鍵。這種多肽可以包含具有肝素結(jié)合域的所選蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)或接近全長(zhǎng)的一級(jí)氨基酸序列。由于在較長(zhǎng)的多肽中可能出現(xiàn)的折疊導(dǎo)致掩蔽肝素結(jié)合域與GAG混合物接觸，因此這種多肽優(yōu)選是短的。優(yōu)選地，這種多肽具有包含肝素結(jié)合域并且可選地在肽的 N-和C-端中一端或兩端包含一種或多種氨基酸的氨基酸序列。這些附加的肽使連接子 (linker)或連接分子(attachment molecule)能夠加入到這些多肽中，而這對(duì)將多肽連接至固體支持物是必需的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，除了肝素結(jié)合域中氨基酸的數(shù)量之外，多肽含有1 20個(gè)，更優(yōu)選1 10個(gè)，更加優(yōu)選1 5個(gè)附加氨基酸。在一些實(shí)施方式中，肝素結(jié)合域的氨基酸序列占多肽氨基酸的至少80%，更優(yōu)選至少90%，更加優(yōu)選至少95%。為了將多肽附著到固體支持物的表面上，優(yōu)選對(duì)這些多肽進(jìn)行改性以包含分子標(biāo)簽，而固體支持物表面經(jīng)過(guò)改性而引入具有對(duì)該分子標(biāo)簽具有高親合力的對(duì)應(yīng)分子探針， 即分子標(biāo)簽和探針形成結(jié)合對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，這種標(biāo)簽和/或探針選自以下任意之一抗體、細(xì)胞受體、配體、生物素、這些結(jié)構(gòu)的任何片段或衍生物、前述的任何組合、或能夠設(shè)計(jì)或構(gòu)造探針而與之結(jié)合或另外通過(guò)特異性聯(lián)合的任何其它結(jié)構(gòu)。適于作為標(biāo)簽和探針使用的優(yōu)選結(jié)合對(duì)是生物素和抗生物素蛋白。這種多肽優(yōu)選衍生自感興趣的蛋白質(zhì)。對(duì)于“衍生自”是指多肽因?yàn)槠浜懈信d趣蛋白質(zhì)中存在的肝素結(jié)合域的氨基酸序列而被選擇、挑選或制備。在一些實(shí)施方式中，肝素結(jié)合域的氨基酸序列可以由感興趣的蛋白質(zhì)中所顯示出的序列進(jìn)行改變，例如，為了研究肝素結(jié)合域序列中的變化對(duì)GAG結(jié)合的影響，。感興趣的蛋白質(zhì)可以是任何結(jié)合肝素的蛋白質(zhì)，而因此具有肝素結(jié)合域。優(yōu)選的蛋白質(zhì)包括那些表達(dá)于胞外基質(zhì)中，尤其是在結(jié)締組織的胞外基質(zhì)(例如，骨骼、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、脂肪)中的蛋白質(zhì)。優(yōu)選蛋白質(zhì)及其肝素結(jié)合域列于下表
權(quán)利要求
1.一種分離能夠結(jié)合至具有肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的糖胺聚糖的方法，所述方法包括 (i)提供具有附著至支持物的多肽分子的固體支持物，其中所述多肽含有肝素結(jié)合域；( )將所述多肽分子與含糖胺聚糖的混合物接觸，以使容許形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物從其余混合物分離出來(lái)；(iv)從所述多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離糖胺聚糖； (ν)收集解離的所述糖胺聚糖。
2.一種鑒定能夠刺激或抑制細(xì)胞和/或組織的生長(zhǎng)和/或分化的糖胺聚糖的方法，所述方法包括(i)提供一種具有附著至支持物的多肽分子的固體支持物，其中所述多肽含有肝素結(jié)合域；( )將所述多肽分子與含糖胺聚糖的混合物接觸，以使容許形成多肽-糖胺聚糖復(fù)合物；(iii)將多肽-糖胺聚糖復(fù)合物從其余混合物分離出來(lái)；(iv)從所述多肽-糖胺聚糖復(fù)合物解離糖胺聚糖； (ν)收集解離的所述糖胺聚糖；(vi)將收集的所述糖胺聚糖加入其中存在含所述肝素結(jié)合域的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的細(xì)胞或組織中；(vii)測(cè)定以下一種或多種細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、一種或多種蛋白質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述含糖胺聚糖的混合物含有胞外基質(zhì)材料。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述胞外基質(zhì)材料來(lái)源于結(jié)締組織或結(jié)締組織細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含糖胺聚糖的混合物含有硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述含糖胺聚糖的混合物富含硫酸葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸乙酰肝素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將收集的所述糖胺聚糖進(jìn)行進(jìn)一步分析以便確定GAG的結(jié)構(gòu)特性。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述糖胺聚糖_多肽復(fù)合物與裂解酶接觸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述多肽是，或包含SEQID NO. 1-13或17中的一種。
10.硫酸乙酰肝素HS/BMP2。
11.包含HS/BMP2的培養(yǎng)基。
12.—種包含HS/BMP2的藥物組合物或藥物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物組合物或藥物，進(jìn)一步含有藥用載體、佐劑或稀釋劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的藥物組合物或藥物，進(jìn)一步含有BMP2蛋白質(zhì)。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)所述的藥物組合物或藥物，用于預(yù)防或治療損傷或疾病。
16.HS/BMP2在制備用于預(yù)防或治療損傷或疾病的藥物中的用途。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的藥物組合物或用途，其中所述預(yù)防或治療選自結(jié)締組織的修復(fù)、再生或替換和傷口愈合。
18.一種預(yù)防或治療需要其治療的患者中的損傷或疾病的方法，所述方法包括給予所述患者有效量的HS/BMP2。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中給予的所述HS/BMP2被配制成藥物組合物或藥物。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述藥物組合物或藥物進(jìn)一步包含BMP2蛋白質(zhì)。
21.一種促進(jìn)或抑制骨生成的方法，包括給予骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞HS/BMP2。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞在體外與HS/BMP2 接觸。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞在體內(nèi)與HS/BMP2 接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求21至23中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述骨前體細(xì)胞或骨干細(xì)胞與 BMP2接觸，同時(shí)與HS/BMP2接觸。
25.一種促進(jìn)或抑制軟骨組織的形成的方法，包括給予軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞 HS/BMP2。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞在體外與HS/ BMP2接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞在體內(nèi)與HS/ BMP2接觸。
28.根據(jù)權(quán)利要求25至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述軟骨前體細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞與BMP2接觸，同時(shí)與HS/BMP2接觸。
29.一種在需要其治療的人類(lèi)或動(dòng)物患者中修復(fù)、替換或再生結(jié)締組織的方法，所述方法包括(i)培養(yǎng)與HS/BMP2體外接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞一段足夠長(zhǎng)的時(shí)間使所述細(xì)胞形成結(jié)締組織；( )收集所述結(jié)締組織；(iii)將所述結(jié)締組織植入所述患者體內(nèi)損傷或疾病處而修復(fù)、替換或再生所述患者的結(jié)締組織。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括將所述間充質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)基中與外源 BMP2接觸。
31.在HS/BMP2的存在下通過(guò)體外培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞而獲得的結(jié)締組織。
32.根據(jù)權(quán)利要求31要求的所述結(jié)締組織，其中在外源BMP2的存在下，以及可選地在 BMP2的存在下培養(yǎng)所述間充質(zhì)細(xì)胞。
33.一種包含干細(xì)胞和HS/BMP2的藥物組合物。
34.根據(jù)權(quán)利要求32所述的藥物組合物，其中所述干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求33或34所述的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)一步包含BMP2。
36.根據(jù)權(quán)利要求33至35中任一項(xiàng)所述的藥物組合物，用于治療損傷或疾病。
37.一種在需要其治療的患者中治療損傷或疾病的方法，包括給予所述患者包含干細(xì)胞和HS/BMP2的藥物組合物。
38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括給予所述患者BMP2。
40.HS/BMP2在體外結(jié)締組織的生長(zhǎng)中的用途。
41.一種體外生長(zhǎng)結(jié)締組織的方法，包括培養(yǎng)與外源填加HS/BMP2接觸的間充質(zhì)干細(xì)胞。
42.一種包含浸透了 HS/BMP2的固體或半固體基質(zhì)材料的生物植入物。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的生物植入物，進(jìn)一步浸透了BMP2。
44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的生物植入物，進(jìn)一步浸透了間充質(zhì)干細(xì)胞。
45.一種試劑盒，包含預(yù)定量的對(duì)具有肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)具有高親合性的糖胺聚糖和預(yù)定量的所述蛋白質(zhì)。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的試劑盒，其中所述糖胺聚糖是HS/BMP2，所述蛋白質(zhì)是 BMP2。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了能夠結(jié)合至具有肝素結(jié)合域的蛋白質(zhì)的糖胺聚糖的分離和鑒定，以及分離的所述糖胺聚糖在組織的生長(zhǎng)和/或發(fā)育中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C07K14/51GK102209781SQ200980144772
公開(kāi)日2011年10月5日 申請(qǐng)日期2009年2月19日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者克里斯蒂安·多姆布勞斯基, 維克托·努爾科姆比, 西蒙·麥肯齊·庫(kù)爾 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局