專(zhuān)利名稱(chēng)：一種同時(shí)制備單環(huán)刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及糖胺聚糖和抗菌肽的制備，尤其是涉及一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。
背景技術(shù)：
單環(huán)刺縊俗名海腸、海腸子，屬于縊蟲(chóng)動(dòng)物門(mén)、縊綱、無(wú)管縊目、刺縊科。體粗大，長(zhǎng)約100-300mm，寬約25_27mm，體表滿布大小不等的粒狀突起，吻圓錐形；腹剛毛I(xiàn)對(duì)，粗大； 肛門(mén)周?chē)幸蝗?-13條褐色尾剛毛，是我國(guó)北方沿海泥沙岸潮間帶下區(qū)及潮下帶淺水區(qū)底棲生物的常見(jiàn)種。目前對(duì)單環(huán)刺縊研究集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、胚胎發(fā)育、生活史、人工育苗技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)成分分析及血栓溶解酶等，對(duì)于單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的開(kāi)發(fā)應(yīng)用尚未見(jiàn)報(bào)道。糖胺聚糖是海洋生物中含量較豐富的物質(zhì)，是由重復(fù)的二糖單位構(gòu)成的長(zhǎng)鏈多糖，具有明顯的抗凝血、抗腫瘤、抗病毒和提高機(jī)體免疫力的作用；抗菌肽是動(dòng)物免疫防御系統(tǒng)在誘導(dǎo)條件下產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)抗外源性病原體致病作用的防御性肽類(lèi)活性物質(zhì)，廣泛存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)，分子質(zhì)量一般在4ku左右，抗菌肽是生物體內(nèi)的內(nèi)源性抗生素，是生物體先天性免疫體系的重要組成部分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以單環(huán)刺縊為原材料，同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，在43°C _47°C水浴條件下酶解4-6h,酶解液煮沸滅酶后,5000r-8000r/min離心10min-15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將所述相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3-1/4，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. 0， 離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為3% -5%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70% -80%，于 4°C條件下靜置 20-28 小時(shí)，5000r_8000r/min 離心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌2-4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為1% -3%,加到陰離子交換柱中，先用PH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液濃縮至洗脫液體積的1/2-1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的 1/3-1/4 ；
④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2-1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2-1/3，濃縮液上樣于S印hadexG-25凝膠過(guò)濾柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。最好的是步驟(2)中枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質(zhì)量的0. 8% -1%。陰離子交換柱的填料優(yōu)選DEAE-52纖維素或Q-Sepharose Fast Flow。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是I.本發(fā)明的方法反應(yīng)條件溫和、制備過(guò)程綠色環(huán)保節(jié)能，一種原料同時(shí)制備兩種活性物質(zhì)，產(chǎn)品附加值高；2.本發(fā)明的方法采用單環(huán)刺縊為原料，制備的糖胺聚糖和抗菌肽純度高；3.本方法在制備糖胺聚糖和抗菌肽的同時(shí)還可大量回收蛋白質(zhì)，有利于單環(huán)刺縊的綜合利用，所制備的糖胺聚糖具有明顯的抗凝血(AT、PT和APTT三項(xiàng)指標(biāo)均顯著高于空白對(duì)照組)、清除自由基(對(duì)于羥自由基和超氧陰離子自由基的清除能力顯著高于空白對(duì)照組)的效果，制備的抗菌肽對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有明顯的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽還可為海珍動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)提供優(yōu)良的免疫增強(qiáng)劑和新型抗菌藥物。


圖I為單環(huán)刺縊糖胺聚糖對(duì)白兔TT實(shí)驗(yàn)的影響。圖2為單環(huán)刺縊糖胺聚糖對(duì)白兔PT實(shí)驗(yàn)的影響。圖3為單環(huán)刺縊糖胺聚糖對(duì)白兔APTT實(shí)驗(yàn)的影響。圖4為抗囷妝抑囷圈測(cè)定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的， 不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本實(shí)施例所采用的提取客體是選自渤海廣泛分布的縊蟲(chóng)動(dòng)物-單環(huán)刺縊。實(shí)施例I一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括以下步驟(I)原料處理將單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質(zhì)量的I %，在45°C水浴條件下酶解5h，酶解液煮沸滅酶后，6000r/min離心IOmin,得上清液； (3)超濾將上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的1/3，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. O，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為4%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 80%,于4°C條件下靜置24小時(shí)，6000r/min離心IOmin,移去上清液,沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌3次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為2%，加到填料為DEAE-52纖維素的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用 0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強(qiáng))濃縮至洗脫液體積的1/3、 透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3,上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. O乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過(guò)濾柱,0. 2mol/L pH = 7. O 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過(guò)檢驗(yàn)，制備的糖胺聚糖純度達(dá)94. 6%，得率為是原料重的0. 32%;抗菌肽純度達(dá)92. 1%，得率為是原料重的0. 08%。實(shí)施例2一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質(zhì)量的0. 8%，在43°C水浴條件下酶解6h，酶解液煮沸滅酶后，8000r/min離心IOmin,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將所述相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. O，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為3%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 75%，于4°C條件下靜置24小時(shí)，7000r/min離心13min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌3次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為1%，加到填料為DEAE-52纖維素的陰離子交換柱中，先用pH = 5. O乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強(qiáng))濃縮至洗脫液體積的1/3、 透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；
(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2，上樣于S印hadexG-100凝膠過(guò)濾柱，用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過(guò)濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過(guò)檢驗(yàn)，制備的糖胺聚糖純度達(dá)92. 8%，得率為是原料重的0. 28%;抗菌肽純度達(dá)92. 5%，得率為是原料重的0. 07%。實(shí)施例3一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(I)原料處理將原料單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質(zhì)量的0. 9%，在45°C水浴條件下酶解5h，酶解液煮沸滅酶后，5000r/min離心15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將所述相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. 0，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為4%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 80%，于4°C條件下靜置20小時(shí)，5000r/min離心15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌2次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為2%，加到填料為Q-Sepharose Fast Flow的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 3乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強(qiáng))濃縮至洗脫液體積的1/2、透析、再濃縮至透析后液體積的1/3 ；④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S^hadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/5，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3,上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過(guò)濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過(guò)檢驗(yàn)，制備的糖胺聚糖純度達(dá)94. 8%，得率為是原料重的0. 31%;抗菌肽純度達(dá)91. 8%，得率為是原料重的0. 059%。實(shí)施例4一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟
(1)原料處理將原料單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，枯草桿菌中性蛋白酶的添加量是勻漿液質(zhì)量的1%，在47°C水浴條件下酶解4h，酶解液煮沸滅酶后，6000r/min離心 13min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將所述相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. 0，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. 0，離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為5%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70%，于4°C條件下靜置28小時(shí)，8000r/min離心lOmin，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為3%，加到填料為Q-Sepharose Fast Flow的陰離子交換柱中，先用pH = 5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液(抗凝血活性較強(qiáng))濃縮至洗脫液體積的1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的1/4 ；④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于S印hadexG-100凝膠過(guò)濾柱，進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/3,濃縮液上樣于SephadexG-25凝膠過(guò)濾柱,0. 2mol/L pH = 7. 0 乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。通過(guò)檢驗(yàn)，制備的糖胺聚糖純度達(dá)94. 3%，得率為是原料重的0. 29%;抗菌肽純度達(dá)93. 4%，得率為是原料重的0. 071 %。實(shí)施例5單環(huán)刺縊糖胺聚糖抗凝血I材料與方法I. I實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用新西蘭白兔，糖胺聚糖(GAG)來(lái)自單環(huán)刺縊(實(shí)施例I制備)。實(shí)驗(yàn)儀器=LG-PABER型凝血因子分析儀。I. 2實(shí)驗(yàn)方法采用體外實(shí)驗(yàn)法。(I)凝血酶原時(shí)間(PT)和凝血酶時(shí)間(TT)的測(cè)定新西蘭白兔，戊巴比妥鈉麻醉，心臟取血，3. 8%枸櫞酸鈉抗凝(I 9)，混勻后以 3000r/min,離心15min,取上清,分離出貧血小板血衆(zhòng)(PPP),取PPP 100 U I,加入糖胺聚糖 10 u I,預(yù)溫5min后加入預(yù)溫15min的PT和TT試劑,用血小板聚集凝血因子分析儀測(cè)定凝固時(shí)間。(2)活化的部分凝血活酶時(shí)間(APTT)的測(cè)定
上面的方法分離出貧血小板血漿(PPP)，取PPP lOOiU，加入IOiU糖胺聚糖和 IOOu I APTT試劑，預(yù)溫5min后加入預(yù)溫15min的CaC12100 yl，用血小板聚集凝血因子分析儀測(cè)定凝固時(shí)間。2結(jié)果與分析實(shí)驗(yàn)設(shè)生理鹽水為空白對(duì)照，0. 005mg/ml和0. 01mg/ml的肝素鈉做陽(yáng)性對(duì)照， 糖胺聚糖設(shè)置以肝素的最大濃度為起始濃度，0. 01mg/ml、0. 2mg/ml、0. 4mg/ml、0. 6mg/ml、
0.8mg /ml五個(gè)濃度組,進(jìn)行體外抗凝血試驗(yàn),結(jié)果見(jiàn)圖1、2、3，從三個(gè)圖看出，單環(huán)刺婦糖胺聚糖能明顯延長(zhǎng)PT和APTT，作用稍弱于肝素，對(duì)于TT也有一定的的延長(zhǎng)作用。實(shí)施例6單環(huán)刺縊抗菌肽的抗菌活性I實(shí)驗(yàn)方法采用牛津杯法。副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌的濃度為2. 3 X 106CfU/ml，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的濃度為I. 2X106cfu/ml,向每個(gè)牛津杯中加入200 U I抗菌肽(實(shí)施例 I制備)，以青霉素做陽(yáng)性對(duì)照，滅菌水做陰性對(duì)照，4°C靜置24h后轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌37°C培養(yǎng)24h，副溶血弧菌和嗜水氣單胞菌30°C培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈直徑，并根據(jù)其直徑大小判斷抑菌活性的強(qiáng)弱。2實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果見(jiàn)圖4，從圖4看出，抗菌肽對(duì)副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有明顯的抑菌活性，其中對(duì)副溶血弧菌抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)嗜水氣單胞菌次之，對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性最弱。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征是包括如下步驟(1)原料處理將原料單環(huán)刺縊洗凈后，勻漿，制成勻漿液；(2)酶解向所述勻漿液中加入枯草桿菌中性蛋白酶，在43°C_47°C水浴條件下酶解 4_6h,酶解液煮沸滅酶后,5000r-8000r/min離心10min-15min,得上清液；(3)超濾將所述上清液通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)的中空纖維濾膜超濾分離，得到相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以下和相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的兩種組分的液體； (4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)將所述相對(duì)分子質(zhì)量I萬(wàn)以上的組分的液體濃縮至該液體體積的 1/3-1/4，先用HCl水溶液調(diào)pH至2. O，離心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液調(diào)pH至7. 0， 離心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最終質(zhì)量濃度為3% -5%，離心除去蛋白質(zhì)沉淀；②醇沉、洗滌將步驟①獲得的上清液在攪拌下加入乙醇，使乙醇的體積濃度為 70% -80%，于 4°C條件下靜置 20-28 小時(shí)，5000r-8000r/min 離心 10min_15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和無(wú)水乙醇洗滌2-4次，得粗提糖胺聚糖；③陰離子交換柱層析將粗提糖胺聚糖溶于蒸餾水中，使其質(zhì)量濃度為1%_3%，力口到陰離子交換柱中，先用pH = 5. 0-5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液洗脫，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脫，洗脫液濃縮至洗脫液體積的1/2-1/4、透析、再濃縮至透析后液體積的 1/3-1/4 ；④凝膠過(guò)濾層析將步驟③獲得的濃縮液上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,進(jìn)一步分離純化，收集的流出液濃縮至流出液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備將所述相對(duì)分子量I萬(wàn)以下組分的液體濃縮至該液體體積的 1/2-1/4,上樣于SephadexG-IOO凝膠過(guò)濾柱,用0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫,洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/2-1/3，濃縮液上樣于S印hadexG-25凝膠過(guò)濾柱，0. 2mol/L pH = 7. 0乙酸鈉水溶液洗脫，洗脫液濃縮至該洗脫液體積的1/4-1/6，濃縮液冷凍干燥得抗菌肽純品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述步驟(2)中枯草桿菌中性蛋白酶的添加量為所述勻漿液質(zhì)量的0.8%-1%。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的一種同時(shí)制備單環(huán)刺縊糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述陰離子交換柱的填料為DEAE-52纖維素或Q-Sepharose Fast Flow。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種同時(shí)制備單環(huán)刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步驟(1)原料處理將原料單環(huán)刺螠制成勻漿液；(2)酶解；(3)超濾；(4)糖胺聚糖的制備①除蛋白質(zhì)；②醇沉、洗滌；③陰離子交換柱層析；④凝膠過(guò)濾層析得高純糖胺聚糖；(5)抗菌肽制備。本發(fā)明的方法反應(yīng)條件溫和、制備過(guò)程綠色環(huán)保節(jié)能，產(chǎn)品附加值高；制備的糖胺聚糖和抗菌肽純度高；可大量回收蛋白質(zhì)，有利于單環(huán)刺螠的綜合利用，所制備的糖胺聚糖具有明顯的抗凝血、清除自由基的效果，制備的抗菌肽對(duì)于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、嗜水氣單胞菌等具有明顯的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽還可為海珍動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)提供優(yōu)良的免疫增強(qiáng)劑和新型抗菌藥物。
文檔編號(hào)C07K1/16GK102618614SQ20121010962
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉萍, 崔青曼, 袁春營(yíng), 韓旭 申請(qǐng)人:天津高蜚生物科技發(fā)展有限公司