專利名稱：編碼白細胞介素-12的重組火雞皰疹病毒的制作方法
編碼白細胞介素-12的重組火雞皰疹病毒本發(fā)明涉及在HVT基因組中含有異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒(HVT)。重組HVT例如是從EP431668已知的。HVT是公知的馬立克氏病病毒(MDV)并且廣 泛用于安全疫苗中，用于有效控制家禽中的馬立克氏病(MD)。重組HVT，其也是公知的并且 用于對抗馬立克氏病，例如，通過引入編碼一個或多個所述其他病原體的抗原的異源基因 給予了另外提供對抗其他病原體的保護的可能性。此外，重組HVT可以是包含來自另一個 馬立克氏病病毒血清型的基因的HVT。這樣的重組HVT例如在US 5，965，138中有描述，并 且也稱為重組嵌合病毒或新的禽皰疹病毒。從現(xiàn)有技術(shù)，已知多種方法來獲得含有引入到HVT基因組中的異源核酸序列的重 組HVT載體。例如，在US 5,965, 138 (‘ 138專利)中，公開了將外源DNA引入到唯一的長 病毒區(qū)域的非必需區(qū)域中，該長病毒區(qū)域是火雞皰疹病毒中天然存在的基因組的一部分。 迄今為止，通常的一般知識是將異源核酸與功能性啟動子，例如，HVT中天然存在的啟動子 或異源啟動子可操作地連接，使得異源DNA在宿主中得到真正的表達。這樣的方法從上述 的，138專利是已知的，但也可以例如從以下文獻中獲知Sondermeijer等(在Vaccine， 1993; 11 (3) :349-58) ,Djeraba 等(在 Journal of Virology，2002 年 2 月，ρ· 1062-1070) 和Mohr 等(在 international Journal of Medical Microbiology 298，2008，115—125)。 在歐洲專利431668中，描述了異源核酸序列可以源自任何病原體，優(yōu)選禽病原體，在插入 HVT基因組后，其可以用于誘發(fā)對抗由該病原體引起的疾病或障礙的免疫力。這樣的病 原體例如可以是傳染性支氣管炎病毒(IBV)、新城雞瘟病毒(NDV)、傳染性法氏囊病病毒 (IBDV)、雞貧血因子(CAA)、Reo病毒、禽逆轉(zhuǎn)錄病毒、禽腺病毒、火雞鼻氣管炎病毒、艾美蟲 屬種、沙門氏菌屬種、大腸桿菌、雞毒霉形體(Mycoplasma gallisepticum)和滑液囊支原體 (Mycoplasma synoviae)、鼻氣管鳥桿菌(Ornithobacterium rhinotracheale)、彎曲桿菌 (Campylobacter)等。然而，已知重組HVT具有缺點。對于每種疫苗，接著對抗馬立克氏病的保護，必需 提供對抗另一種疾病或障礙的保護，因此一個疫苗必須插入誘發(fā)其他疾病或障礙的病原體 的異源核酸序列(從現(xiàn)在開始，術(shù)語“障礙”也將用于涵蓋“疾病”)。這從經(jīng)濟學(xué)的觀點看 是沒有吸引力的，并且還降低了在疫苗中使用重組HVT的安全性。本發(fā)明的目的是克服或至少減輕上述的缺點。為此，已經(jīng)設(shè)計了根據(jù)序言的重組 HVT，其中異源核酸編碼IL-12蛋白，將其用于制造保護禽類對抗馬立克氏病病毒并降低其 對微生物感染的敏感性的藥物。令申請人驚訝的是通過給藥編碼IL-12的HVT載體可以降低禽類對微生物感染 的敏感性(即，馬立克氏病病毒感染以外的感染，對馬立克氏病病毒HVT自身已經(jīng)提供了 保護)，而不需要給藥源自相應(yīng)微生物的抗原。實際上，通常從文獻中獲知IL-12在對抗 微生物(即，如細菌、病毒或寄生物的微生物)感染的免疫應(yīng)答中起作用。還知道缺乏 IL-12(即，不能產(chǎn)生IL-12)的哺乳動物在接受病原體時具有不太有效的免疫應(yīng)答，并且通 過直接給予外源IL-12可以使其達到正常水平。然而，現(xiàn)在顯示出在健康的禽類中(即，不 是IL-12缺乏的)，可以使得禽類對任何微生物的感染不太敏感，而不需要同時(或無論如3何，在實際感染野生型微生物發(fā)生之前)必須給予源自該微生物的抗原，即使在沒有同樣 給予IL-12時，而是給予通過HVT載體表達的DNA形式。這可以獲得非常方便和廉價的降 低禽類對馬立克氏病病毒以外的微生物感染的敏感性的方法(注意到表達的IL-12也可以 增強對抗馬立克氏病的保護)。此外，該藥物是非常安全的，因為它不需要含有除HVT自身 以外的任何其他的抗原材料，因此可以完全防止不同抗原組合的不利相互干擾的風(fēng)險。然 而，如果希望，該藥物可以含有其他抗原材料。當(dāng)希望獲得對抗多種MDV的最佳保護時，這 種附加材料例如可以是源自其他馬立克氏病病毒(MDV)的材料，乃至源自非-MDV微生物。白細胞介素-12 (縮寫為IL-12或IL12)是公知的細胞因子，即通過在1型T-輔 助細胞和細胞毒性淋巴細胞的產(chǎn)生中具有免疫調(diào)節(jié)功能的抗原呈遞細胞產(chǎn)生的(Blood， Vol. 84，No 12，1994年12月15日；pp4008_2027)。IL-12是具有雜二聚結(jié)構(gòu)的細胞因子，具 有約70kD的分子量。通過大約40kD和35kD的兩條連接的鏈形成。在不同的物種中，各種 IL-12之間的同源性百分比可以低至例如20-40% (例如，將哺乳動物IL-12與禽IL-12比 較時)，而同時保持細胞因子的功能性(Degen等；The Journal of Immunology, 2004,172 4371-4380)。在本專利意義上的保護意思是誘導(dǎo)有助于預(yù)防、緩解或治療由微生物感染引起的 疾病或障礙的免疫應(yīng)答，作為給藥一種或多種源自該微生物的抗原(含有一種或多種源自 該微生物的抗原的組合物)的結(jié)果，如減毒或殺滅的微生物和/或其亞基，或任何其他物 質(zhì)，如微生物的代謝產(chǎn)物。在本專利意義上的降低對微生物感染的敏感性意思是患有該微 生物感染時，使動物顯示出較少的臨床體征和/或顯示出降低的微生物定殖和/或顯示出 降低的定殖影響，例如，降低的損傷。含有源自微生物的抗原的組合物通常被稱為對抗該微生物的疫苗，S卩，如果抗原 以免疫有效量存在(即，能夠刺激目標(biāo)動物的免疫系統(tǒng)足以至少降低用野生型微生物激發(fā) 的負面作用)。通常將抗原結(jié)合藥物學(xué)上可接受的載體，如含有水的液體，任選包含免疫刺 激劑(佐劑)，在給藥于動物時，免疫刺激劑提供了對抗相應(yīng)微生物的保護。一般而言，可以使用本領(lǐng)域已知的方法來制造藥物，這些方法基本上包括將活性 化合物(或含有活性化合物的組合物)與藥物學(xué)上可接受的載體混合，例如，液體載體，如 (任選緩沖的)水，或固體載體，如通常用于獲得凍干疫苗或片劑、栓劑或膠囊的那些。根據(jù) 例如打算的用途、所需的特性或藥物的給藥方式，任選地加入其他物質(zhì)，如佐劑、穩(wěn)定劑、防 腐劑、潤濕劑、粘度調(diào)節(jié)劑、填充劑或其他成分。對于口服和非腸道給藥，許多合適的形式是 本領(lǐng)域已知的。對于非腸道給藥，特別使用液體制劑(含有溶解的、乳化的或懸浮的抗原)， 但固體制劑也是已知的，如植入物或媒介物形式，如用于將抗原懸浮于液體中的固體載體。 對于所用藥物的非腸道給藥和合適的(物理)形式已經(jīng)知道了數(shù)百年。注意到從W02004/003017獲知了 IL-12可以增大微生物誘發(fā)的免疫應(yīng)答或接種疫 苗誘發(fā)的免疫應(yīng)答，基于細胞和體液免疫。然而，根據(jù)IL-12在對抗病原體的疫苗中的用 途，仍然必須添加源自病原體的抗原(致免疫材料)，疫苗提供了對抗該病原體的保護。該 參考文獻仍然沒有記載關(guān)于這樣使用IL-12來降低對病原體感染的敏感性(即，沒有另外 結(jié)合給藥源自該病原體的抗原)，更不用說使用編碼IL-12的載體病毒。還注意至IJKincy-Cain 等(Infection and Immunity, 1996 年 4 月，ppl437_1440) 已經(jīng)公開了外源(即，不是由主體動物自身產(chǎn)生的)白細胞介素-12可以增大用都柏林沙4門氏菌(Salmonella dublin) 口服激發(fā)的小鼠中的保護性免疫應(yīng)答。然而，該參考文獻教 導(dǎo)了應(yīng)當(dāng)通過使用皮下植入的滲透泵來直接給藥IL-12。清楚的是這是可靠的，但在經(jīng)濟 上是沒有吸引力的提供外源IL-12的方式。注意到該參考文獻仍然沒有記載在禽類中的作 用。公知哺乳動物和禽類免疫系統(tǒng)有著實質(zhì)性的不同，并且不能合理地預(yù)期在哺乳動物中 獲得的免疫效果也可以在禽類物種中獲得。此外，Kincy-Cain仍然沒有記載間接提供外源 IL-12的選擇，特別是通過載體，更別說是火雞的皰疹病毒?；贙incy-Cain的公開內(nèi)容， 不能合理地預(yù)測或預(yù)期使用編碼IL-12的HVT，特別是在健康(即，沒有IL-12缺乏)的禽 類中使用時，可以降低這些禽類對微生物感染的敏感性。在一個實施方案中，微生物感染是細菌或病毒感染。顯示出本發(fā)明特別適用于降 低對這些感染的敏感性，特別是沙門氏菌和禽流感感染。在另一個實施方案中，白細胞介素-12是禽白細胞介素。盡管可以使用非禽白 細胞介素-12(已知白細胞介素-12是通過其功能性來限定的事實)，但認為禽白細胞介 素-12的使用降低了對抗IL-12的自體免疫應(yīng)答的風(fēng)險，并提供了最佳的引發(fā)結(jié)果。在再另一個實施方案中，禽類是雞，并且白細胞介素是雞白細胞介素。在不同的實施方案中，藥物是用于卵內(nèi)(in-ovo)給藥或給藥于一日齡(孵化那 天)動物。這些給藥類型具有如下優(yōu)點從孵化那刻起，可以預(yù)期提高的對抗馬立克氏病的 保護(如與未接種疫苗的動物相比)和降低的對其他微生物敏感性。尤其是對童子雞(除 MD-疫苗以外，其通常在其生命過程中將不接受任何其他疫苗接種，通常為6至8周)，這種 孵化后降低的對其他病原體感染的敏感性在經(jīng)濟上是非常有吸引力的。本發(fā)明還涉及含有引入到HVT基因組中的異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒 (HVT)，異源核酸編碼白細胞介素-12，用于提供保護禽類對抗馬立克氏病病毒和降低對微 生物感染的敏感性的藥物中。還涉及含有引入HVT基因組中的異源核酸序列的重組火雞皰 疹病毒(HVT)的用途，該異源核酸編碼白細胞介素-12，用于保護禽類對抗馬立克氏病病毒 和降低對微生物感染的敏感性。本發(fā)明已經(jīng)顯示出適用于獲得降低的對感染并定殖目標(biāo)動物的方式非常不同的 微生物感染的敏感性。特別地，對于細菌，特別是腸桿菌科沙門氏菌，以及病毒，特別是呼吸 道禽流感病毒，已經(jīng)明確地將有利的作用具體化。因為這些微生物的感染、定殖方式以及引 發(fā)免疫應(yīng)答的方式真正地完全不相關(guān)。因此，可以合理地預(yù)期本發(fā)明適用于任何微生物，特 別是術(shù)語腸桿菌科的任何細菌，特別是沙門氏菌，或任何病毒，特別是任何呼吸道病毒，特 別是任何流感病毒，或任何其他微生物，如屬于立克次氏體的微生物?，F(xiàn)在將使用以下非限 制性實施例來更詳細地解釋本發(fā)明。材料和方法重組雞IL-12(recChIL_12)的表達和純化產(chǎn)生了單鏈IL-12 p40-p35雜二聚體分子(對于氨基酸序列，參見Degen等，The Journal of Immunology，2004，172 :4371-4380)，其中 p40 鏈通過框內(nèi)(G4S)3_ 連接物與 P35鏈連接；該分子在Degen等中被稱為ChFlexi-IL_12。使用EP 0431668中所述的方法， 在HVT中表達該單鏈構(gòu)建體。制造HVT-IL-12病毒和含有該病毒的藥物使用EP 04；31668 中所述的方法，使用從 Degen 等(The Journal of Immunology,2004，172 =4371-4380)已知的IL-12DNA，制得具有插入的雞IL-12的HVT。將重組病毒以 30. 000pfu/ml懸浮于磷酸鹽緩沖鹽水(也稱為“PBS”或簡單地稱為“鹽水”)連接，以構(gòu)成 藥物。RecChIL-12的體外牛物活件通過雞脾細胞的ChIFN-Y合成的增殖和誘導(dǎo)將雞初級脾細胞以100 μ 1中0. 5 X IO6細胞/孔的密度接種于96-孔平板中，重復(fù) 三份，并用所示量的recChIL-12或熱滅活的recChIL_12 (100°C下，10分鐘)培養(yǎng)。加入蛋 白質(zhì)后四十八小時，在18-20小時[甲基-3H]-胸苷(在25 μ 1/孔下18. 5kBq)吸收后測定 細胞的增殖。使用LKB β計數(shù)器(LKB Instruments，Gaithersburg，MD)計算結(jié)合的放射 性。ChIL-12激活的脾細胞也顯示出增加的ChIFN- γ產(chǎn)生(參見，Degen等；The Journal of Immunology,2004，172 :4371-4380)。HVT-Ch IL-12 牛物活件與通過空HVT載體病毒感染的細胞和模擬感染的細胞的上清液相比時， HVT-ChIL-12感染的細胞的上清液顯示出明顯的ChIL-12生物活性的跡象，如通過增加的 新鮮分離的脾細胞的增殖所測量的。表汰HVT的細胞因子的給予將一(1)日齡的雌性非IL-12缺乏SPF小雞QO只動物/組)在腿部肌肉中肌內(nèi) 注射0. Iml如上所述的藥物。給予對照動物含有作為空對照載體的HVT-PBl的磷酸鹽緩沖 鹽水(劑量為3000pfu/動物)，或只給予鹽水。值得注意的是替代小雞的肌內(nèi)注射，還可以 使用卵內(nèi)給藥，因為已知如下事實公知可以通過卵內(nèi)給藥成功地獲得用HVT對抗馬立克 氏病的疫苗接種。沙門氏菌感染和抵抗力測定在激發(fā)感染前一天，通過常規(guī)程序從凍干儲備制劑將腸炎沙門氏菌(SE)(腸炎沙 門氏菌subsp. enterica serovar Entertidis)株在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上新鮮培養(yǎng)過夜。 在無菌肉提取物肉湯中制備激發(fā)接種物并在細胞計數(shù)后適當(dāng)稀釋。通過綿羊血瓊脂上的 菌落計數(shù)來證實接種物的活細胞濃度。在7日齡時(注射HVT構(gòu)建體后6天)，通過管飼 0. 5ml (含有IO6Cfu沙門氏菌/ml)來口服感染動物。對于對沙門氏菌感染的抵抗力的分析，在感染后3、7、11和15天時獲取泄殖腔擦 拭物。此外，在第15天時，將動物犧牲，用于監(jiān)控沙門氏菌在肝臟、脾臟和盲腸內(nèi)含物中的 定殖。通過如下所述的取樣來確定實體器官(肝臟和脾臟)中的定殖(cfu定量)。用熱的刮鏟將肝臟、脾臟和盲腸的表面局部消毒。使用棉簽將盲腸和泄殖腔取 樣。將該棉簽直接接種于+60 μ g/ml萘啶酸(BGAm+nal)改良的亮綠瓊脂上，并在37°C下 16-24小時富集后，再次接種于9ml含有60 μ g/ml萘啶酸的緩沖蛋白胨水(BPW+nal)中。 使用無菌一次性接種環(huán)，將肝臟和脾臟接種于BGAm+nal上。將器官浸泡在沸水中，加入9ml BPW+nal，在胃托中碾碎，并在37°C下16- 小時富集后在BGAm+nal上培養(yǎng)。將泄殖腔擦拭 物直接接種于BGAm上并在37°C下16- 小時富集后再次接種于9ml BPW+nal中。在37°C 下16- 小時接種后，對所有BGAm平板篩選懷疑是腸炎沙門氏菌的菌落(紅色菌落)的存 在。用D1-抗血清(Difco Laboratories，Detroit，MI，抗_01、9和12)使懷疑的菌落凝集。 以以下方式對激發(fā)菌株的重新分離半定量評分直接接種后每個平板的SE菌落的數(shù)量
> 100 = 6,11-100 = 5,1-10 = 4。富集后每個平板的SE菌落的數(shù)量> 100 = 3，11-100 = 2，1-10 = 1。禽流感感染和抵抗力測定使用常規(guī)程序在蛋中生產(chǎn)禽流感A亞型H9N2病毒(分離物A/雞/阿拉伯聯(lián)合酋 長國/99)。將含有病毒懸浮液的水相在0. OlM磷酸鹽緩沖鹽水中稀釋并用作激發(fā)材料。在 14日齡(HVT構(gòu)建體注射后13天)時，通過噴霧途徑用10E8. 8 EID50/ml H9N2病毒激發(fā)禽 類。對于噴霧激發(fā)，將IOml H9N2病毒(10E8. 8 EID50/ml)與等體積的鹽水混合，并將所得 到的20ml病毒懸浮液噴入隔離器中(隔離器容積0. 79cm3)，使用帶有壓縮器的噴槍(1. 5 大氣壓；平均液滴大小50 μ m)，使用封閉式空氣環(huán)流。在10分鐘后將空氣環(huán)流重新打開。對于對禽流感的抵抗力的分析，監(jiān)控禽類的臨床呼吸體征并在激發(fā)后7天時進行 評分。患有嚴重(明顯)呼吸困難的禽類評分為陽性，其他評分為陰性。MM表汰細胞因子的重組HVT的體外牛物活件在每只動物實驗前，使用IL-12活性標(biāo)記之一，將所有批次的HVT-ChIL-12在體外 測試生物活性；即，新鮮分離的脾細胞的增殖，如對于哺乳動物報道的和最近對于雞報道的 (Degen 等；The Journal of Immunology, 2004，172 :4371-4380)。孵化后對沙門氏菌感染的抵抗力將HVT-ChIL-12降低對感染的敏感性的作用與空對照載體HVT-PBl相比較。對于 每個組，測定沙門氏菌感染的動力學(xué)，如通過在感染后幾個時間點的泄殖腔擦拭物中發(fā)現(xiàn) 的cfu水平所反映的。如

圖1中所示，與空HVT載體(PBl)或鹽水組引起的應(yīng)答相比較時， HVT-ChIL-12給予了明顯(P < 0. 05)降低的定殖(大約10-100倍)。圖2顯示了 HVT-ChIL-12明顯(P < 0. 05)降低了肝臟(圖2A)和盲腸扁桃體(圖 2B)中的定殖。孵化后對禽流感感染的抵抗力將HVT-ChIL-12降低對感染的敏感性的作用與空對照載體HVT-PBl相比較。如圖 3中所示的，與空HVT載體(PBl)或鹽水組引起的應(yīng)答相比較時，通過給藥HVT-ChIL-12明 顯降低了激發(fā)后的臨床呼吸體征。附圖描述圖1. HVT-ChIL-12在腸炎沙門氏菌感染過程中對泄殖腔擦拭物評分的影響。將感 染后不同時間點的泄殖腔擦拭物中的cfu計數(shù)表示為平均士SD。圖2. HVT-ChIL-12在腸炎沙門氏菌感染過程中對定殖的影響。顯示了感染后15 天時肝臟(A)和盲腸(B)的定殖水平。圖3. HVT-ChIL-12在禽流感感染過程中對臨床體征的影響。顯示了第7天時的陽 性臨床呼吸體征。Mrk這些觀察在一起顯示了 IL-12通過HVT表達時作為安全的源自宿主的禽類對微生 物感染敏感性的降低劑。該數(shù)據(jù)使得清楚HVT表達的IL-12可以用作抗生素預(yù)防性使用 的替代品或用作對抗感染的疫苗接種的替代品?？傮w而言，使用新的構(gòu)建體，可以制得明顯7降低禽類對微生物感染的敏感性的藥物，通常在發(fā)生這些微生物實際感染之前不需要給藥 相應(yīng)微生物的抗原。因為新的構(gòu)建體是基于HVT，其固有地提供了對抗馬立克氏病的保護。 如果除了一般的對微生物感染的敏感性的降低，新構(gòu)建體使用的目的是保護對抗馬立克氏 病，藥物可以另外包含來自其他血清型MDV的抗原，如活減毒的血清型1MDV，以提供較好的 對抗MD的保護。如從US 5，965，138所知的，這些來自其他血清型MDV的抗原也可形成重 組HVT自身的一部分。
權(quán)利要求
1.含有編碼白細胞介素-12的異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒(HVT)用于制造保護 禽類對抗馬立克氏病病毒和降低其對微生物感染的敏感性的藥物的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其特征在于所述微生物感染是細菌或病毒感染。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的用途，其特征在于所述細菌感染是沙門氏菌感染，而所述病毒感 染是禽流感感染。
4.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的用途，其特征在于所述白細胞介素-12是禽白細胞介ο
5.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的用途，其特征在于所述禽類是雞并且所述白細胞介素是 雞白細胞介素。
6.根據(jù)之前任一項權(quán)利要求的用途，其特征在于所述藥物是用于卵內(nèi)給藥或給藥于一 日齡動物的。
7.含有編碼白細胞介素-12的異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒(HVT)，用于保護禽 類對抗馬立克氏病病毒和降低其對微生物感染的敏感性的藥物中。
8.含有編碼白細胞介素-12的異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒(HVT)用于降低禽類 對微生物感染的敏感性的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有編碼白細胞介素-12的異源核酸序列的重組火雞皰疹病毒(HVT)用于制造保護禽類對抗馬立克氏病病毒和降低其對微生物感染的敏感性的藥物的用途。
文檔編號C07K14/54GK102056941SQ200980120773
公開日2011年5月11日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日
發(fā)明者V·E·J·C·希恩斯, W·G·J·德根 申請人:英特威國際有限公司