專利名稱：：?jiǎn)误w7-乙氧基靈芝酸o及單體靈芝酸t(yī)分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種有機(jī)物提純
技術(shù)領(lǐng)域：
的方法，具體是一種單體7-乙氧基靈芝酸0及單體靈芝酸T分離純化方法。
背景技術(shù)：
：靈芝作為一種名貴藥材，在中國(guó)及東南亞地區(qū)有著悠久的藥用歷史。現(xiàn)代醫(yī)藥研究表明，靈芝酸是靈芝重要的活性成分之一，具有抗癌，抗HIV病毒，抗炎癥反應(yīng)等藥理功能(Acta.Pharmacol.Sin.，25(11)，13871395，2004所示。以往的研究大多是用靈芝抽提物(也即靈芝酸混合物)來研究其抗癌活性，故難以真正闡明靈芝酸的藥理作用機(jī)制。近五年來，隨著生物技術(shù)相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展，國(guó)際上有幾個(gè)研究小組開始陸續(xù)使用單體靈芝酸來完成MTT等抗腫瘤活性篩選實(shí)驗(yàn)，并對(duì)其相關(guān)的抗癌機(jī)制進(jìn)行了報(bào)道，如靈芝酸D和X等(Molecule&CellProteomics，7(5)，949961，2007;LifeSciences77(3)，pp.252265所示?，F(xiàn)有技術(shù)表明，靈芝酸T和Me具有顯著的抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的功效(LifeScience,80(3)，205211，2006;ProcessChemistry,44(8)，928933，2009;CN200510026378.X)。這些研究工作顯示了靈芝酸將作為一種極具潛力的輔助抗癌藥物。然而，現(xiàn)行低產(chǎn)率的分離技術(shù)極難滿足相關(guān)實(shí)驗(yàn)和開發(fā)對(duì)單體靈芝酸的大量需求，因此單體靈芝酸制備工藝的開發(fā)將成為今后相關(guān)藥理研究和藥物開發(fā)過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道過大量制備單體靈芝酸的方法及工藝。現(xiàn)階段對(duì)于單體靈芝酸的制備分離僅限于毫克級(jí)水平，主要用于結(jié)構(gòu)分析及體外活性篩選。這些研究中所用各種單體靈芝酸純品均是從幾公斤甚至幾十公斤的靈芝干細(xì)胞中，經(jīng)提取、粗分離、及貴重精密儀器如制備液相色譜儀，精制分離得到的(Agric.Biol.Chem.，51(4)，11491153，1987;Chem.Pharm.Bull.，50(6)，837840，2002)。這些分離純化的方法雖可以得到少量的單體靈芝酸，然而操作流程繁瑣復(fù)雜(大多需要5步以上的分離步驟)，回收率低，設(shè)備成本投入巨大，故難以成為一種單體靈芝酸的大量制備工藝。隨著近年來對(duì)于單體靈芝酸體內(nèi)藥理實(shí)驗(yàn)和藥品商業(yè)開發(fā)的不斷深入，對(duì)于單體靈芝酸的需求量迅速擴(kuò)大，市場(chǎng)前景廣闊，所以急需一種快速、低成本、高純度、易于工業(yè)化的分離純化技術(shù)來滿足市場(chǎng)對(duì)其的需求。常壓硅膠柱層析是一種傳統(tǒng)的吸附色譜，主要基于由物質(zhì)的不同極性所造成吸附能力差異來進(jìn)行分離純化。在化合物的制備方面，相比于制備液相，制備薄層色譜，制備高速逆流色譜技術(shù)，常壓硅膠柱層析具有操作簡(jiǎn)單，成本低廉，易于擴(kuò)大化，相關(guān)的工業(yè)化應(yīng)用成熟等優(yōu)點(diǎn)，目前，常壓硅膠柱層析在工業(yè)界廣泛應(yīng)用于化合物制備方面，如化工產(chǎn)品的分離純化，天然產(chǎn)物的初步分離等。結(jié)晶是一種歷史悠久的分離技術(shù)，是利用溶質(zhì)之間溶解度的差別進(jìn)行分離純化的一種擴(kuò)散分離操作，具有成本低，產(chǎn)品成固態(tài)，易于商品化等優(yōu)點(diǎn)，所以常作為化工，生物制品的最后一步分離純化工藝，是氨基酸，有機(jī)酸和抗生素生產(chǎn)過程中重要的分離純化手段。目前，冷結(jié)晶，真空和蒸發(fā)結(jié)晶是結(jié)晶工藝的主要方式，相比而言，由于真空和蒸發(fā)結(jié)晶容易在濃縮的過程中富集雜質(zhì)，并且較高的處理溫度也對(duì)生物產(chǎn)品的穩(wěn)定不利。因此，冷結(jié)晶技術(shù)作為大規(guī)模單體靈芝酸分離純化的最后一道工藝可能十分合適。酸催化工藝已廣泛用于各個(gè)化工行業(yè)，如生物質(zhì)的酸化水解，檸檬酸合成，樹脂聚合等多個(gè)行業(yè)。具有技術(shù)成熟，配套設(shè)備完善，工藝簡(jiǎn)單，易于操作等優(yōu)點(diǎn)，是一項(xiàng)符合大規(guī)模，工業(yè)化生產(chǎn)要求的工藝技術(shù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種單體7-乙氧基靈芝酸0及單體靈芝酸T分離純化方法，采用常壓硅膠柱層析和冷結(jié)晶法對(duì)靈芝干細(xì)胞的提取液進(jìn)行分離純化，得到的7-乙氧基靈芝酸0精制品，另外通過酸解工藝，可以獲得具有優(yōu)良抗癌活性的單體靈芝酸T。從而保證了在低成本和高純度的情況下滿足對(duì)于單體靈芝酸大量制備的需求，并亦能滿足對(duì)于該工藝未來工業(yè)化的預(yù)期要求。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明涉及單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，包括以下步驟第一步、使用有機(jī)溶劑對(duì)靈芝干菌體進(jìn)行超聲波輔助抽提，制成干菌體提取液。所述的有機(jī)溶劑為氯仿、乙酸乙酯或乙醇中的一種或其組合；所述的靈芝干菌體是指液體發(fā)酵得到的靈芝細(xì)胞經(jīng)烘干處理后得到干燥菌絲體；所述的靈芝細(xì)胞的獲得方式如下67軍軍直衛(wèi)生所發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.75的菌株;上海吳淞中學(xué)發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.110的菌株;日本京大發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.533的菌株；中國(guó)貴州發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.616的菌株；中科院微生物研究所發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.644的菌株；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院發(fā)現(xiàn)的，在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏，保藏號(hào)為CGMCCNO.5.653的菌株。所述的超聲波輔助抽提是指采用有機(jī)溶劑對(duì)靈芝干菌體為l:l至l:300的質(zhì)量比進(jìn)行配比后置于超聲清洗儀中進(jìn)行抽提，工作功率為40160W，設(shè)置環(huán)境溫度為56(TC，抽提時(shí)間為580min，抽提15次。第二步、將干菌體提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理濃縮至浸膏狀，然后將其溶解于乙醚中，用常壓硅膠層析色譜采取濕法上樣進(jìn)行分離純化處理，制成干菌體分離液，再通過TLC薄層層析法檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分。所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理是指采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，設(shè)置環(huán)境溫度為5(TC以下進(jìn)行濃縮蒸發(fā)。所述的常壓硅膠層析色譜的填充材料為50至400目的硅膠；設(shè)置柱徑比為l:2至1:50;流動(dòng)相為乙醚，配以小于等于40%的石油醚或己烷作為極性調(diào)節(jié)劑；所述的采取濕法上樣是指設(shè)置上樣量小于等于柱體積的20%;設(shè)置流速為全流速的20%100%的范圍內(nèi)；柱溫小于等于5(TC，同時(shí)使用自動(dòng)餾分收集器收集流出液，單管收集時(shí)間小于等于30min;所述的TLC薄層層析法是指將吸附劑均勻地鋪在硅膠板上形成薄層后，將干菌體分離液點(diǎn)滴在薄層上，然后用展開劑展開，使混合物得以分離，然后檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成。對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分，獲得純化后的單體靈芝酸O;所述的吸附劑為硅膠；所述的硅膠板為254nm熒光薄層硅膠板；所述的展開劑的組分及體積比為甲苯乙酸乙酯乙酸=13:4:0.4。第三步、合并TLC檢測(cè)中含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干得到固體粗產(chǎn)品，向固體粗產(chǎn)品中加入有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品溶液，向粗產(chǎn)品溶液中加入7-乙氧基靈芝酸0碎晶后置于結(jié)晶器中進(jìn)行結(jié)晶處理，制成粗提純晶體，將粗提純晶體二次結(jié)晶處理后可得到95%以上純度的單體7-乙氧基靈芝酸0。所述的粗產(chǎn)品溶液的濃度為5200mg/mL，其中的溶劑為乙醇、乙酸乙酯或乙醚。所述的結(jié)晶處理是指設(shè)置結(jié)晶器的環(huán)境溫度為-2(T2(rc，結(jié)晶時(shí)間為r2天。所述的二次結(jié)晶處理是指將粗提純晶體溶解于乙醇、乙酸乙酯或乙醚中稀釋至濃度小于粗產(chǎn)品溶液的濃度，然后進(jìn)行結(jié)晶處理，反復(fù)進(jìn)行上述稀釋結(jié)晶操作兩次，制成單體7-乙氧基靈芝酸0。本發(fā)明還涉及單體靈芝酸T的分離純化方法，包括以下步驟步驟一、使用有機(jī)溶劑對(duì)靈芝干菌體進(jìn)行超聲波輔助抽提，制成干菌體提取液；步驟二、將干菌體提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理濃縮至浸膏狀，然后將其溶解于乙醚中，用常壓硅膠層析色譜采取濕法上樣進(jìn)行分離純化處理，制成干菌體分離液，再通過TLC薄層層析法檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分。步驟三、合并TLC檢測(cè)中含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，得到固體粗產(chǎn)品，向固體粗產(chǎn)品中加入有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品溶液，向粗產(chǎn)品溶液中加入7-乙氧基靈芝酸0碎晶后置于結(jié)晶器中進(jìn)行結(jié)晶處理，制成提純晶體。步驟四、過濾提純晶體后得到靈芝酸晶體，同時(shí)將過濾后的母液回流至結(jié)晶器中循環(huán)使用；使用反向液相色譜分析靈芝酸晶體的晶體純度，當(dāng)晶體純度大于80%則繼續(xù)操作步驟五，否則稀釋粗產(chǎn)品溶液的濃度后重復(fù)步驟三的操作。所述的反向液相色譜的填充材料為反相硅膠C18，粒徑5ym，柱長(zhǎng)150mm;流動(dòng)相為90。/。的HPLC級(jí)的甲醇，柱溫為25。C，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。步驟五、使用甲醇溶液溶解靈芝酸晶體，并向甲醇溶液中添加鹽酸，然后置于酸解反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行酸解處理獲得單體靈芝酸粗液，最后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后結(jié)晶制得單體靈芝酸T所述的酸解靈芝酸的方法為采用向7-乙氧基靈芝酸0的甲醇水溶液中加入0.005%至P/。的lmol/L的鹽酸來催化生成靈芝酸T。其中甲醇的含水量控制在050%之間，反應(yīng)物的濃度不超過300mg/mL，反應(yīng)溫度為108(TC，反應(yīng)時(shí)間為O.28小時(shí)。本發(fā)明能直接得到純度超過98%的靈芝酸1單體或95%以上純度的7-乙氧基靈芝酸0單體，整合三項(xiàng)常規(guī)分離制備技術(shù)，不依靠任何精密分析制備儀器，低成本地得到大量高純度的單體靈芝酸。使用單根300mL柱體積的硅膠層析柱，最大產(chǎn)率可達(dá)到l.5克/天/200克硅膠，具有其他現(xiàn)存單體靈芝酸分離工藝無(wú)法與其相比的規(guī)模和價(jià)格優(yōu)勢(shì)，易于操作，方便推廣，可為今后單體靈芝酸相關(guān)的藥物開發(fā)和生產(chǎn)奠定穩(wěn)固的基礎(chǔ)。圖1為實(shí)施例1中靈芝酸粗提液的高效液相分析色譜圖。圖2為實(shí)施例1中經(jīng)硅膠柱層析后的7-乙氧基靈芝酸O粗品的高效液相分析色譜圖。圖3為實(shí)施例l中經(jīng)結(jié)晶得到的7-乙氧基靈芝酸0的高效液相分析色譜圖。圖4為實(shí)施例1靈芝酸T精制品的高效液相分析色譜圖。圖5為實(shí)施例2中經(jīng)結(jié)晶得到的7-乙氧基靈芝酸0的高效液相分析色譜圖。圖6為實(shí)施例4靈芝酸T精制品的高效液相分析色譜圖。圖7為實(shí)施例5靈芝酸粗提液的高效液相分析色譜圖。圖8為實(shí)施例5中經(jīng)硅膠柱層析后的7-乙氧基靈芝酸0粗品的高效液相分析色譜圖。圖9為實(shí)施例8靈芝酸粗提液的高效液相分析色譜圖。圖10為實(shí)施例8中經(jīng)硅膠柱層析后的7-乙氧基靈芝酸O粗品的高效液相分析色譜圖。具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例l1.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L氯仿，超聲提取30分鐘，提取5次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)7.3g，高效液相色譜分析如圖l)。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于25mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含10%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.lg，高效液相色譜分析如圖2所示。3.加入50mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶兩天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體1.6g，純度為87.4%，高效液相色譜分析如圖3所示。4:加入100mL甲醇溶解所得固體，并加入lmLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)0.5小時(shí)，停止反應(yīng)后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮該溶液至60mL，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體1.0g，純度為98.1%，高效液相色譜分析如圖4所示。此實(shí)施例說明這套整合三項(xiàng)傳統(tǒng)技術(shù)的新型靈芝酸分離工藝具有優(yōu)秀的實(shí)用性，實(shí)踐效果達(dá)到預(yù)期中低成本，高純度分離純化靈芝酸的要求。實(shí)施例21.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L氯仿，超聲提取30分鐘，提取3次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)7.2g，高效液相色譜分析如圖l所示)。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于25mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含10%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.lg。3.加入200mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶三天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.55g，純度為96.6%，高效液相色譜分析如圖5所示。4:加入6mL甲醇溶解所得固體，并加入0.01mLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)l小時(shí)，停止反應(yīng)后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體O.42g，純度為98.5%。對(duì)比實(shí)施例l，本實(shí)施例表明在7-乙氧基靈芝酸0的結(jié)晶過程中，濃度降低有利于結(jié)晶純度的提高，但回收率會(huì)有一定下降。實(shí)施例31.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L氯仿，超聲提取30分鐘，提取2次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)7.0g，高效液相色譜分析如圖l所示。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于25mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含10%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.0g。3.加入30mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體2.2g，純度為70.6%。4.加入70mL乙醚溶解上步所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶兩天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.74g，純度為91.6%。5.加入25mL甲醇溶解所得固體，并加入O.lmLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)l小時(shí)，停止反應(yīng)后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體O.35g，純度為98.2%。對(duì)比實(shí)施例l，本實(shí)施例表明在7-乙氧基靈芝酸0的結(jié)晶過程中，濃度升高不利于得到高純度的結(jié)晶體，需要重復(fù)結(jié)晶來提高結(jié)晶純度。實(shí)施例41.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L氯仿，超聲提取30分鐘，提取2次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)7.0g。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于25mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含10%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為4.5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.0g。3.加入100mL乙醚溶解所得固體后，置于4。C的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.35g，純度為92.6%。4.加入50mL70%甲醇溶解所得固體，并加入O.lmLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)0.4小時(shí)，停止反應(yīng)后，置于4'C的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體0.26g，純度為98.8%，高效液相色譜分析如圖6所示。對(duì)比實(shí)施例l，本實(shí)施例表明在酸催化反應(yīng)中，在溶劑中添加水可以進(jìn)一步提高該反應(yīng)的速率，并且靈芝酸T在含水的甲醇中結(jié)晶比純甲醇中更容易。實(shí)施例51.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入4L乙酸乙酯，超聲提取15分鐘，提取5次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)8.9g，高效液相色譜分析如圖7所示。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于15mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含30%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為3.5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.5g，高效液相色譜分析如圖8所示。3.加入100mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體1.0g，純度為87.6%。4:加入100mL90%甲醇溶解所得固體，并加入5mllmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)8小時(shí)，停止反應(yīng)后，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮該溶液至40mL，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體O.52g，純度為98.7%。實(shí)施例61.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入4L乙酸乙酯，超聲提取15分鐘，提取5次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)8.9g。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于15mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含30%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為2.8mL/min(80%流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體4.0g3.加入100mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體1.3g，純度為80.6%。4:加入250mL50%甲醇溶解所得固體，并加入O.5mLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)l小時(shí)，停止反應(yīng)后置于4'C的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體O.12g，純度為98.2%。對(duì)比實(shí)施例5，本實(shí)施例表明在常壓色譜中，低流速不利于物質(zhì)的分離，可能是由于譜帶的展寬所造成的。實(shí)施例71.稱取100g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入4L乙酸乙酯，超聲提取15分鐘，提取5次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)8.9g。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于15mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充200g干硅膠，粒徑200300目，柱徑比l:10，以含30%石油醚的乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為300mL，流速為3.5mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體3.5g3.加入200mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.6g，純度為94.5%。4.加入8mL甲醇溶解所得固體，并加入0.05mLlmol/L的鹽酸水溶液，置于6(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)l小時(shí)，停止反應(yīng)后置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體O.12g，純度為98.2%。以上三個(gè)實(shí)施例表明使用乙酸乙酯提取，會(huì)提取出更多的雜質(zhì)，這對(duì)色譜分離不太有利，因此乙酸乙酯不是首選的提取溶劑，但考慮到毒性小的特點(diǎn)，比之氯仿，仍有其優(yōu)勢(shì)。實(shí)施例81.稱取20g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L乙醇，超聲提取60分鐘，提取2次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)2.4g，高效液相色譜分析如圖9所示。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于20mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充60g干硅膠，粒徑100目，柱徑比l:30，以乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為100mL，流速為2mL/min(全流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體1.0g，高效液相色譜分析如圖IO)。3.加入100mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.lg，純度為82.5%。4.加入3mL甲醇溶解所得固體，并加入O.5mllmol/L的鹽酸水溶液，置于4(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)4小時(shí)，停止反應(yīng)后置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體50mg，純度為95.2%，重復(fù)結(jié)晶一次，得到靈芝酸T晶體20mg，純度98.7%。對(duì)比實(shí)施例l，本實(shí)施例表明使用乙醇提取，會(huì)提取出更多的雜質(zhì)，這對(duì)色譜分離有一些不利的影響，但由于乙醇具有不錯(cuò)的環(huán)境友好性，在這個(gè)體系內(nèi)，乙醇是一種具有潛力，待開發(fā)的提取溶劑。實(shí)施例91.稱取20g從靈芝菌絲體發(fā)酵得到的干細(xì)胞粉，加入2L乙醇，超聲提取60分鐘，提取2次，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到浸膏狀物質(zhì)2.4g。2.將上述浸膏狀物質(zhì)溶于20mL乙醚中，通過事前填充平衡好的常壓硅膠柱進(jìn)行純化分離，填充60g干硅膠，粒徑100目，柱徑比l:30，以乙醚作為流動(dòng)洗脫，柱體積約為100mL，流速為lmL/min(50%流速)，通過自動(dòng)收集器收集各流分。各并相應(yīng)組分，并蒸發(fā)至干，得到固體1.2g。3.加入20mL乙醚溶解所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶一天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體0.3g，純度為64.5%。4.加入3mL乙醚溶解上步所得固體后，置于-2(TC的結(jié)晶器中結(jié)晶兩天，過濾，吹干后，得到7-乙氧基靈芝酸0晶體50mg，純度為85.6%。加入3mL50%甲醇溶解所得固體，并加入O.51lmol/L的鹽酸水溶液，置于4(TC的酸解反應(yīng)器中反應(yīng)1小時(shí)，停止反應(yīng)后置于4'C的結(jié)晶器中結(jié)晶6小時(shí)，過濾，吹干，得到靈芝酸T晶體10mg，純度為97.8%。綜合實(shí)施例，相比200300目的硅膠，IOO目的在分離能力方面表現(xiàn)較差，分離后的粗產(chǎn)品純度低，因此，相對(duì)顆粒度小的硅膠在這個(gè)體系的分離中具有更好的特性。在條件允許的情況下，可盡量選擇顆粒度小的硅膠作為填料。為了確認(rèn)所得產(chǎn)物，對(duì)上述晶體粉末進(jìn)行了高分辨率質(zhì)譜和核磁共振鑒定，質(zhì)譜數(shù)據(jù)與標(biāo)準(zhǔn)品一致，NMR數(shù)據(jù)請(qǐng)見下表，和文獻(xiàn)中的數(shù)據(jù)一致(J.Nat.Prod.52(3)，595605，1989所示。7-乙氧基靈芝酸0和靈芝酸T的13C-NMR數(shù)據(jù)表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>權(quán)利要求1.一種單體7-乙氧基靈芝酸O的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟第一步、使用有機(jī)溶劑對(duì)靈芝干菌體進(jìn)行超聲波輔助抽提，制成干菌體提取液；第二步、將干菌體提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理濃縮至浸膏狀，然后將其溶解于乙醚中，用常壓硅膠層析色譜采取濕法上樣進(jìn)行分離純化處理，制成干菌體分離液，再通過TLC薄層層析法檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸O條帶的組分；第三步、合并TLC檢測(cè)中含有7-乙氧基靈芝酸O條帶的組分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，得到固體粗產(chǎn)品，向固體粗產(chǎn)品中加入有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品溶液，向粗產(chǎn)品溶液中加入7-乙氧基靈芝酸O碎晶后置于結(jié)晶器中進(jìn)行結(jié)晶處理，制成粗提純晶體，將粗提純晶體經(jīng)二次結(jié)晶處理后得到單體7-乙氧基靈芝酸O。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的靈芝干菌體是指液體發(fā)酵得到的靈芝細(xì)胞經(jīng)烘干處理后得到干燥菌絲體。3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理是指采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，設(shè)置環(huán)境溫度為5(TC以下進(jìn)行濃縮蒸發(fā)。4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的常壓硅膠層析色譜的填充材料為50至400目的硅膠；設(shè)置柱徑比為1:2至1:50;流動(dòng)相為乙醚，配以小于等于40%的石油醚或己烷作為極性調(diào)節(jié)劑。5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的TLC薄層層析法是指將吸附劑均勻地鋪在硅膠板上形成薄層后，將干菌體分離液點(diǎn)滴在薄層上，然后用展開劑展開，使混合物得以分離，然后檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成，對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)品，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分，獲得純化后的單體靈芝酸0。6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的展開劑的組分及體積比為甲苯乙酸乙酯乙酸=13:4:0.4。7根據(jù)權(quán)利要求l所述的單體7-乙氧基靈芝酸0的分離純化方法，其特征是，所述的粗產(chǎn)品溶液的濃度為5200mg/mL。8一種單體靈芝酸T的分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟步驟一、使用有機(jī)溶劑對(duì)靈芝干菌體進(jìn)行超聲波輔助抽提，制成干菌體提取液；步驟二、將干菌體提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理濃縮至浸膏狀，然后將其溶解于乙醚中，用常壓硅膠層析色譜采取濕法上樣進(jìn)行分離純化處理，制成干菌體分離液，再通過TLC薄層層析法檢測(cè)干菌體分離液的靈芝酸組成，篩選出含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分；步驟三、合并TLC檢測(cè)中含有7-乙氧基靈芝酸0條帶的組分，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，得到固體粗產(chǎn)品，向固體粗產(chǎn)品中加入有機(jī)溶劑得到粗產(chǎn)品溶液，向粗產(chǎn)品溶液中加入7-乙氧基靈芝酸0碎晶后置于結(jié)晶器中進(jìn)行結(jié)晶處理，制成提純晶體；步驟四、過濾提純晶體后得到靈芝酸晶體，同時(shí)將過濾后的母液回流至結(jié)晶器中循環(huán)使用；使用反向液相色譜分析靈芝酸晶體的晶體純度，當(dāng)晶體純度大于80%則繼續(xù)操作步驟五，否則稀釋粗產(chǎn)品溶液的濃度后重復(fù)步驟三的操作；步驟五、使用甲醇溶液溶解靈芝酸晶體，并向甲醇溶液中添加鹽酸，然后置于酸解反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行酸解處理獲得單體靈芝酸粗液，最后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后結(jié)晶制得單體靈芝酸T9根據(jù)權(quán)利要求8所述的單體靈芝酸T的分離純化方法，其特征是，所述的反向液相色譜的填充材料為反相硅膠C18，粒徑5ym，柱長(zhǎng)150mm;流動(dòng)相為90%的HPLC級(jí)的甲醇，柱溫為25。C，流速lmL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為225nm。10根據(jù)權(quán)利要求8所述的單體靈芝酸T的分離純化方法，其特征在于所述步驟五，采用向7-乙氧基靈芝酸0的甲醇水溶液中加入0.005。/。至P/。的lmol/L的鹽酸來催化生成靈芝酸T。其中甲醇的含水量控制在050%之間，反應(yīng)物的濃度不超過300mg/mL，反應(yīng)溫度為108(TC，反應(yīng)時(shí)間為O.28小時(shí)。全文摘要一種有機(jī)物提純
技術(shù)領(lǐng)域：
的單體7-乙氧基靈芝酸O及其單體靈芝酸T的分離純化方法，包括制備干菌體提取液，篩選含有7-乙氧基靈芝酸O條帶的組分，結(jié)晶處理，制成提純晶體；使用反向液相色譜分析靈芝酸晶體的晶體純度；使用甲醇溶液溶解靈芝酸晶體，并向甲醇溶液中添加鹽酸，然后置于酸解反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行酸解處理獲得單體靈芝酸粗液，最后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)處理后結(jié)晶制得單體靈芝酸T。本發(fā)明能直接得到純度超過98％的靈芝酸T單體或95％以上純度的7-乙氧基靈芝酸O單體，易于操作，方便推廣，可為今后單體靈芝酸相關(guān)的藥物開發(fā)和生產(chǎn)奠定穩(wěn)固的基礎(chǔ)。文檔編號(hào)C07J9/00GK101671383SQ20091030843公開日2010年3月17日申請(qǐng)日期2009年10月19日優(yōu)先權(quán)日2009年10月19日發(fā)明者李英波,王家樂,鐘建江申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)