專利名稱：抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有抗體的醫(yī)藥配制品，或單克隆抗體的制備，具體是一種抗人Calnexin蛋 白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1975年，Kohler和Milstein發(fā)現(xiàn)將小鼠骨髓瘤細(xì)胞和綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞進行 融合，形成的雜交細(xì)胞既可產(chǎn)生抗體，又可無限增殖，從而創(chuàng)立了單克隆抗體雜交瘤技術(shù)。
單克隆抗體庫是通過細(xì)胞或細(xì)胞提取物等混合抗原免疫小鼠，得到針對不同蛋白的各種 單克隆抗體的集合。采用此種方法制備單克隆抗體缺點是一次融合制備抗體的工作量大，后 期需要抗原鑒定工作、最初很難預(yù)測產(chǎn)生何種抗體。優(yōu)點是一次制備能夠產(chǎn)生多種蛋白的單 克隆抗體，使得多種蛋白的單抗制備工作一次完成，實現(xiàn)工作程序的高通量；并且由于采用 天然蛋白進行免疫，因此產(chǎn)生的抗體特異性好、質(zhì)量高。
目前，腫瘤研究從癌基因/抑癌基因?qū)W說進入分子表達(dá)譜的新階段，發(fā)現(xiàn)腫瘤過程中不 僅僅是某幾個基因發(fā)生改變，而是涉及多個信號傳導(dǎo)通路的細(xì)胞整體協(xié)同變化，因此利用單 克隆抗體庫技術(shù)可以直接發(fā)現(xiàn)發(fā)生改變的蛋白分子，同時獲得該分子的特異的單克隆抗體， 達(dá)到一舉兩得的目的。
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成和Ca^貯積的主要場所，它能夠參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)量 控制、糖基化修飾、細(xì)胞凋亡、蛋白質(zhì)降解以及鈣離子穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)功能，分子伴侶在 其中發(fā)揮著十分重要的作用。鈣聯(lián)蛋白Calnexin是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的一種跨膜蛋白，它和鈣網(wǎng)蛋白 Calreticulin以及特異分布在睪丸組織中的同源物Calmegin都屬于類凝集素分子伴侶，這類 分子伴侶所構(gòu)成的Calnexin / Calreticulin循環(huán)能夠?qū)Ｒ坏刈R別以N2糖苷鍵連接的糖蛋白， 是真核細(xì)胞蛋白折疊和裝配的重要監(jiān)控機制，同時也能調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca^穩(wěn)態(tài)平衡和 Ca2+信號傳導(dǎo)過程，因此進一步明確該分子在細(xì)胞中的作用機制對于諸多細(xì)胞生命現(xiàn)象的闡 釋及某些腫瘤的形成分子機制具有重要的作用。而在研究中用于檢測該分子的表達(dá)和分布的 重要工具之一即為單克隆抗體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對人Calnexin蛋白在細(xì)胞中的作用機制，對于諸多細(xì)胞生命現(xiàn)象的闡釋及某些 腫瘤的形成機制，為細(xì)胞生物功能研究、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨床檢測，提供了一種通過單克隆抗體庫技術(shù)獲得的抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用。 本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
一種抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，該抗體特異性識別人Calnexin蛋白，并與 Calnexin蛋白具有特異性結(jié)合能力，其是由保藏號為CGMCC No. 3240的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，所述Calnexin單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)DNA序列如 圖5所示，所述Calnexin單克隆抗體的重鏈可變區(qū)DNA序列如圖6所示；
所述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，所述Calnexin單克隆抗體亞型鑒定為IgG2b。
一種抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體得制備方法，其是采用乳腺癌細(xì)胞MCF-7免疫 BALB/c小鼠，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合，利用MCF-7細(xì)胞進行篩選，然后 將得到的陽性克隆構(gòu)建單克隆抗體庫；源自該抗體庫的抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，采 用免疫沉淀和質(zhì)譜的方法鑒定其抗原為Calnexin;將此單抗的雜交瘤細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄 成cDNA，利用抗體可變區(qū)引物進行擴增，得到PCR產(chǎn)物測序鑒定。
一種雜交瘤細(xì)胞，所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞 的保藏號CGMCC No. 3240。
抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體在制備醫(yī)學(xué)檢測制劑中的應(yīng)用
a. 抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測制劑中的應(yīng)用；
b. 所述抗體在制備免疫熒光檢測制劑中的應(yīng)用；
c. 所述抗體在制備免疫印跡反應(yīng)檢測制劑中的應(yīng)用；
d. 所述抗體在制備免疫沉淀檢測制劑中的應(yīng)用。
應(yīng)用該抗體進行多種免疫學(xué)實驗均獲得良好效果，表明該抗體能夠與Calnexin蛋白具有 特異性結(jié)合能力，適用于該分子的免疫組化(IHC)、免疫熒光(IF)、免疫印跡(Western blot)以及免疫沉淀(IP)的檢測。將本發(fā)明應(yīng)用到細(xì)胞生物功能研究、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究和臨 床檢測，為該分子的臨床與基礎(chǔ)研究提供了可靠地檢測工具。
雜交瘤由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；
保藏號為CGMCC No. 3240，保藏日期2009年09月03日，經(jīng)檢測，生物材料存活。


圖l顯示Calnexin Western blot染色； 圖2顯示Calnexin免疫沉淀及質(zhì)譜鑒定； 圖3顯示Calnexin乳腺癌組織免疫組化染色； 圖4顯示Calnexin免疫熒光染色；圖5是Calnexin輕鏈可變區(qū)的DNA序列 圖6是Calnexin重鏈可變區(qū)的DNA序列。
具體實施例方式
一、MCF-7細(xì)胞單克隆抗體庫的制備
(一) 材料方法
1. 實驗材料來源
BALB/c小鼠、MCF-7細(xì)胞及小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)由天津腫瘤醫(yī)院提供。福氏完全佐 劑及福氏不完全佐劑、HAT、 HT條件培養(yǎng)基成分購自Invitrigen公司。DMEM培養(yǎng)基、聚乙二 醇(PEG)、 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone公司。辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠Ig、鄰 苯二胺(OPD) 、 二氨基聯(lián)苯胺(DAB) 、 8-氮鳥嘌呤(8-AG)購自Sigma公司。
2. 動物免疫
取1X107 MCF-7細(xì)胞，離心收集，加入200ul生理鹽水反復(fù)凍融5次，離心棄上清。于沉 淀中加入裂解液(0.05M Tris-HC1 pH=8. 0、 l%Triton X100) 3C)0ul， 4。C離心12， OOOrpm， 取上清作為免疫原。
取7 10周齡BALB/c雌性小鼠4只，將100ul MCF-7細(xì)胞免疫原與等體積弗氏完全佐劑 (Sigma)充分混勻，腹部皮下多點注射。第1次免疫后第15和29天，分別用100ul免疫原與等 體積弗氏不完全佐劑(Sigma)充分混勻后加強免疫，融合前3d由尾靜脈強化免疫注射50ul免 疫原1次。
3. 間接ELISA法檢測血清效價
以MCF-7細(xì)胞免疫原包被酶標(biāo)板，設(shè)空白對照組，37。C包被過夜。用0.25。/。BSA 37。C封閉 l小時。加入梯度系列稀釋的血清，37。C孵育lh， PBS-T洗5次。加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記 的山羊抗鼠Ig， 37。C孵育lh， PBS-T洗5次。0PD底物顯色系統(tǒng)顯色2-3分鐘，測定0D492值。
4. 細(xì)胞融合及單克隆抗體庫構(gòu)建
取經(jīng)加強免疫的BALB/c小鼠l只，放血處死后，無菌條件下取脾，制備脾細(xì)胞懸液。取 2X107個骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)，于37。C水浴中加50。/。PEG (麗4000) 1 ml融合，將融合細(xì)胞 接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，分別采用HAT和HT培養(yǎng)基進行選擇性培養(yǎng)。待雜交瘤細(xì)胞長至培養(yǎng)孔 底面l/3時，用MCF-7免疫原作包被抗原，以ELISA法篩選抗體，選擇抗體分泌陽性孔，采用 甲基纖維素半固體培養(yǎng)基法，將雜交瘤細(xì)胞克隆化，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，取培養(yǎng)上清作抗 體檢測，陽性者凍存。全部陽性克隆之集合即為單克隆抗體庫，留作進一步篩選備用。
(二) 實驗結(jié)果
5小鼠免疫三次后，以MCF-7細(xì)胞免疫原包被板、尾靜脈取血進行效價測定，得其效價為 1:4000。細(xì)胞融合后初篩形成96個陽性克隆，每個克隆均經(jīng)克隆化后凍存。 二、單抗庫的篩選及抗原鑒定
(一)材料方法 1.免疫印跡(Western blot)篩選
MCF-7細(xì)胞免疫原進行SDS-PAGE電泳，然后進行PVDF膜蛋白轉(zhuǎn)印。用單克隆抗體庫中的 雜交瘤培養(yǎng)上清分別進行轉(zhuǎn)印膜的雜交反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影。取陽性克隆復(fù)蘇 ，擴大培養(yǎng)。具體步驟如下
1. 1 MCF-7細(xì)胞免疫原中加入等體積的加樣緩沖液沸水浴5分鐘，進行SDS-PAGE電泳，每 個泳道加樣20ul，電泳條件為恒流20mA /板，約l. 5 2小時。蛋白轉(zhuǎn)印為半干轉(zhuǎn)印，恒流 40mA，約1小時。
1.2將膜置于5%脫脂奶粉中，37。C搖動lh 。
1.3將膜置于單抗培養(yǎng)上清中，4。C搖動2h過夜。TBS-T漂洗3遍，每次5分鐘。 1.4將膜置于羊抗鼠二抗稀釋液中(1:10， 000)中，37。C搖動lh。 TBS-T漂洗3遍，每次 5分鐘。
1. 5 ECL曝光顯影。
2. 陽性雜交瘤腹水單克隆抗體的制備
BALB/c小鼠腹腔注射Pristane0. 5ml /只，l周后腹腔注射生長良好的陽性雜交瘤細(xì)胞 107，10天左右，小鼠腹部脹大至其活力極差時，處死小鼠，抽取其腹水，2000轉(zhuǎn)離心去沉淀 ，收集上清。
3. 免疫沉淀(IP)鑒定抗原
取lul小鼠腹水與10ul蛋白A/G混合，4"C孵育1小時，離心去上清；于沉淀中加入MCF-7 細(xì)胞免疫原lml， 4。C孵育搖動過夜，離心去上清；將沉淀中加入加樣緩沖液20ul，沸水浴 IO分鐘，上樣SDS-PAGE電泳。將沉淀的蛋白條帶切下，進行質(zhì)譜鑒定。
4. Calnexin單抗的免疫學(xué)反應(yīng)
采用已鑒定的Calnexin腹水單抗進行各項免疫學(xué)反應(yīng)測試
4. 1免疫沉淀(具體方法見方法3)
4. 2 Western blot (具體方法見方法l)
4. 3免疫組化(IHC)
1)乳腺癌切片放入67°C溫箱中干烤24小時。
62) 常規(guī)二甲苯脫蠟2次，每次20分鐘，梯度乙醇至水后PBS洗兩次，每次10分鐘。
3) 在3。/。H202中室溫孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。
4) 浸入p^8.0的EDTA抗原修復(fù)液中，用微波行抗原修復(fù)。使抗原修復(fù)液快速升溫至 92-98'C后維持此溫度范圍持續(xù)20分鐘。
5) 冷卻，置于抗原修復(fù)液中自然冷卻，時間不少于20分鐘。
6) PBS液浸泡3次，每次5分鐘。
7) 用正常動物血清50y l封閉10min，傾去多余血清，不洗。
8) 輕甩掉血清，滴加Calnexin腹水單抗稀釋液(1:100)，放入4。C孵育過夜，取出切片 入PBS中浸洗3次，每次5分鐘。
9) 滴加免疫組化染色試劑盒中PV6002 (北京中山)二抗工作液，后放入37'C溫箱中孵育 20分鐘。
10) PBS液浸泡3次，每次5分鐘。
11) 二氨基聯(lián)苯胺(diamminobenzidine， DAB)染色每l ml蒸餾水分別依次加入l滴A， B， C液，混勻后滴加在切片上，鏡下監(jiān)測顯色過程，適時終止反應(yīng)。
12) 蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片。 4.4免疫熒光(IF)
載玻片泡酸，清洗，干烤消毒，備用。取MCF-7細(xì)胞加入少量培養(yǎng)基，混勻，從中吸出 100ul點于載玻片上，置于無菌的平皿中37。C，培養(yǎng)8小時后，各片補充100ul培養(yǎng)基，過夜 。將載玻片從平皿中取出，浸泡于0.9%生理鹽水中，洗凈血清。置于冷甲醇中固定20分鐘 。將玻片置于3% H202溶液中，浸泡15分鐘，去除內(nèi)源性過氧化物酶。每片點l滴正常羊血清 ，37。C溫浴20分鐘。應(yīng)用Calnexin腹水單抗稀釋液(1:100) ， 4。C過夜。PBS漂洗3遍，加 AlexaFluor488標(biāo)記羊抗鼠Ig (分子探針公司)，37'C孵育15分鐘，常規(guī)封片，熒光顯微鏡 觀察。
5.抗體亞型鑒定
以羊抗鼠Ig包被酶標(biāo)板，，37。C包被過夜。用O. 25%BSA 37。C封閉l h。加入Calnexin雜 交瘤培養(yǎng)上清，37。C孵育lh， PBS-T洗5次。分別加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠 IgGl、 IgG2a、 IgG2b、 IgG3、 IgM、 IgA， 37。C孵育lh， PBS-T洗5次。OPD底物顯色系統(tǒng)顯色 5-10 min，測定0D492值。 (二)實驗結(jié)果
1、用單克隆抗體庫中的抗體上清分別進行MCF-7細(xì)胞免疫原轉(zhuǎn)印膜的雜交反應(yīng)，化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯影。能夠發(fā)生western blot反應(yīng)的單抗有30株，選取其中一株陽性克隆細(xì) 胞(如圖l)進行復(fù)蘇，擴大培養(yǎng)，大量制備小鼠腹水。
2、 利用小鼠腹水進行免疫沉淀，沉淀抗原進行質(zhì)譜鑒定為Calnexin (如圖2)，免疫沉 淀顯示改單抗特異性強，無其他非特異蛋白沉淀，質(zhì)譜鑒定結(jié)果單一；與之相吻合， Western blot同樣顯示雜交蛋白信號單一，特異性強(如圖l)，結(jié)果證明該抗體能夠作為 免疫沉淀及western blot的檢測制劑進行應(yīng)用。
3、 Calnexin單克隆抗體的免疫組化染色，可見乳腺癌細(xì)胞明顯著色，定位于胞漿，在 細(xì)胞核周圍濃集，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位一致(如圖3)，并且說明改單抗適用于組織的免疫學(xué)染色 ，結(jié)果證明該抗體能夠作為免疫組化染色的檢測制劑進行應(yīng)用。
4、 Calnexin單克隆抗體的免疫熒光染色顯示胞漿著色，細(xì)胞核周圍濃集，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 定位一致(如圖4)，結(jié)果證明該抗體能夠作為免疫熒光的檢測制劑進行應(yīng)用。
5、 Calnexin單克隆抗體亞型鑒定為IgG2b。 三、Calnexin單克隆抗體可變區(qū)序列的鑒定
(一) 實驗材料
Expression Module (recombinant phage antibody system) 購自PHARMACIA BIOTECH ，M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq DNA聚合酶購自Takara。
(二) 實驗步驟
參見PHARMACIA BIOTECH (27-9401-01)試劑盒說明書
Calnexin單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)一提取總RNA —反轉(zhuǎn)錄成cDNA —用輕鏈、 重鏈引物(試劑盒提供)擴增輕鏈DNA和重鏈DNA。
1、 Calnexin雜交瘤細(xì)胞總RNA的制備1 X 1()7的Calnexin雜交瘤細(xì)胞加入TRIZ0L 1ml 充分裂解。加入0.2ml氯仿，充分混勻15秒，4°C、 12000Xg離心15分鐘。取上層水相置于新 管中，加入O. 5ml異丙醇靜置10分鐘，12000Xg、 4"C離心10分鐘。棄上清，以75%乙醇洗滌
、渦旋，7500Xg、 4。C離心5分鐘，洗滌2次。加入20y 1無RNA酶水，取4. 5 y 1用于檢測RNA 完整性，2y 1用于RNA的濃度和純度測定，其余-7(TC保存，用于cDNA第一鏈合成。
2、 RNA 65。C加熱10分鐘，冰上迅速冷卻，2分鐘內(nèi)開始第一鏈cDNA反應(yīng)。
m麗5y 1，無RNA酶7jU5y 1， Primed First-Strand Mix llyl，DTT Slution ly 1， M-MulV逆轉(zhuǎn)錄酶1 y 1，總體積33 y 1， 37。C孵育l小時。
3、 輕鏈PCR: First-strand reaction 33 yl， Light Primer Mix 2yl，無菌7K64y 1， 總體積99yl。重鏈PCR: First-strand reaction 33 yl， Heavy Primerl 2yl， HeavyPrimer2 2yl，無菌水62yl，總體積99yl。 95。C加熱5分鐘。向每個反應(yīng)中各加入Taq DNA聚合酶2yl，混勻，在0.2ml薄壁管中各分成2管，啟動程序l (30個循環(huán)94'C1分鐘; 55'C2分鐘；72'C2分鐘)。電泳割膠純化，目的條帶轉(zhuǎn)移至微旋柱內(nèi)，置于l. 5ml E卯endorf管中，740Xg離心2分鐘，洗脫物即為純化的輕鏈和重鏈DNA，送奧科公司測序。 (三)實驗結(jié)果 1、編碼Calnexin單抗的輕鏈可變區(qū)DNA序列333bp，序列為
GCTGGAAATAAAACGGA。
2、編碼Calnexin單抗的重鏈可變區(qū)DNA序列347bp，序列為:
GCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCCTCAA。 SEQUENCE LISTING
〈110>天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院
〈120>抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用
〈130> 小鼠
〈160> 1
〈170> Patentln version 3.1
〈210> 1
〈211> 333
〈212> DNA
〈213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220>
〈221> 輕鏈可變區(qū)〈222>(1). (333)
〈223>
〈400> 1
gacattgagctcacccagtctcctgcttccctctggggcagagggcc獄60
atctcatacagggccagc肌aagtgtcagtacatctggctgcaccggaac120
caacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatct180
ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctc肌catccat240
cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgt300
tcggaggggggaccaagctg卿333
〈221> 重鏈可變區(qū)
〈222> (1)..(347)
〈400〉 1
aggtgc肌gctgcaggagtcaggg卿ggcttagtgaagcctggagggtccctgaaactc60
tcctgtgcagcctctggattcgctttcagttgtgttggattcgccagact120
ccgg卿卿ggctggagtgggtcgcatatattagtagcggtggtgattacacctactat180
tg肌gggccgattcaccatccgccctgtat240
agagtctgaagtctgaggacacagccatgtattactgtgc300
gggaccgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctccctc肌34權(quán)利要求
1.一種抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，其特征是該抗體特異性識別人Calnexin蛋白，并與Calnexin蛋白具有特異性結(jié)合能力，其是由保藏號為CGMCCNo.3240的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。
2.如權(quán)利要求l所述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，其特征是所述 Calnexin單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)DNA序列如圖5所示，所述Calnexin單克隆抗體的重鏈可變 區(qū)DNA序列如圖6所示；
3.如權(quán)利要求l所述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，其特征是 Calnexin單克隆抗體亞型鑒定為IgG2b。
4.如權(quán)利要求l所述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體的制備方法，其特征是采用乳腺癌細(xì)胞MCF-7免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合， 利用MCF-7細(xì)胞進行篩選，然后將得到的陽性克隆構(gòu)建單克隆抗體庫；源自該抗體庫的抗人 Calnexin蛋白的單克隆抗體，采用免疫沉淀和質(zhì)譜的方法鑒定其抗原為Calnexin;將此單抗 的雜交瘤細(xì)胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用抗體可變區(qū)引物進行擴增，得到PCR產(chǎn)物測序鑒 定。
5. 一種雜交瘤細(xì)胞，其特征是所述雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗人Calnexin 蛋白的單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞的保藏號CGMCC No. 3240。
6.如權(quán)利要求l所述抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體在制備醫(yī)學(xué)檢 測制劑中的應(yīng)用a. 抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測制劑中的應(yīng)用；b. 所述抗體在制備免疫熒光檢測制劑中的應(yīng)用；c. 所述抗體在制備免疫印跡反應(yīng)檢測制劑中的應(yīng)用；d. 所述抗體在制備免疫沉淀檢測制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用，屬于含有抗體的醫(yī)藥配制品，或單克隆抗體的制備。抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體由保藏號CGMCC No.3240的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生。本發(fā)明采用乳腺癌細(xì)胞MCF-7免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合，利用MCF-7細(xì)胞進行篩選，然后將得到的陽性克隆組成單克隆抗體庫；源自該抗體庫的抗人Calnexin蛋白的單克隆抗體，采用免疫沉淀和質(zhì)譜的方法鑒定其抗原為Calnexin。該抗體與Calnexin蛋白具有特異性結(jié)合能力；同時確定了標(biāo)識該抗體的可變區(qū)序列。本發(fā)明適用于該分子的免疫組化、免疫熒光、免疫印跡以及免疫沉淀的檢測。
文檔編號C07K16/18GK101659702SQ200910308129
公開日2010年3月3日 申請日期2009年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者寧 張, 霖 張, 牛瑞芳, 藝 羅 申請人:天津醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院