專利名稱：一種鴨肝炎抗體的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種鴨肝炎抗體的制備方法。
背景技術：
多流行于冬春季的鴨病毒性肝炎，是一種鴨急性接觸性傳播病。主要以運動失調、 轉圈、兩腳痙攣后踢，頭向后背等神經(jīng)癥狀為特征。病程急促，發(fā)病急，傳播快，常在發(fā)病后 3 4天內死掉。但僅是流行于鴨雛期的一種急性傳染病，故又稱雛鴨病毒性肝炎，尤其1 2周雛鴨最易感，發(fā)病多，其中個體大，強壯的鴨子死亡率高，常在57% 95%左右，是威脅 養(yǎng)鴨業(yè)的一種嚴重的疾病，不容忽視。防治本病的關鍵應是盡早使雛鴨在易感期內獲得保 護力。對種鴨進行免疫接種，通過母源抗體使雛鴨獲得被動保護是一種有效的方法。以往 的做法是用鴨高免血清對雛鴨進行免疫接種。用鴨高免血清或康復血清對雛鴨進行被動免 疫效果雖好，但血清制造手續(xù)繁雜、產量低、成本高，不易滿足生產需要。用鴨病毒性肝炎疫 苗，對雞進行多次免疫，可獲得安全、高效的卵黃抗體。雞易于規(guī)?；曫B(yǎng)，產蛋率高，是大 批量生產卵黃抗體的理想動物。此外，應用異源動物雞制備卵黃抗體，不但減少了同源疫病 傳染的危險，也為研制其他疫病的異源高免卵黃抗體提供了有益的經(jīng)驗。
卵黃抗體是指從免疫禽蛋中提取出的針對特定抗原的抗體，由于卵黃中僅有IgG 類抗體，故稱其為卵黃免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，簡稱為IgY。卵黃抗體 的研究始于19世紀末，1893年，Klemperer發(fā)現(xiàn)了卵黃中富含抗體；1934年Jukes的實驗 證明母雞血清中的抗體可以轉移到卵黃中，從而為雛雞提供被動免疫保護。Patters等的試 驗證實，相對別的血漿蛋白，IgG被選擇性的轉運到卵泡中。1969年，Leslie和Clem將這 種抗體命名為IgY。 卵黃抗體的形成過程是當機體受到外界特異性抗原(尤其是滅活抗原)的剌激 后誘發(fā)一系列的免疫應答反應，激發(fā)B細胞分化成能分泌特異性抗體的漿細胞，分泌大量 的特異性抗體進入血液中。同時在產蛋禽體內，血液中的特異性抗體IgG(所有亞群)由卵 巢IgG受體的介導逐步進入到卵巢濾泡和輸卵管中，并在卵黃中蓄積起來，也正是由于這 種卵黃累積作用，使卵黃中的IgG明顯地高于血清中的含量，而血清中的其他抗體(主要是 IgM， IgA)與輸卵管中的卵白白蛋白一起混入到雞蛋白中。 卵黃抗體在多種環(huán)境中有較高的穩(wěn)定性，在低于75t:條件下，卵黃抗體具有良好
的熱穩(wěn)定性，9(TC處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結合活性，在pH〈 4時，僅有少量卵 黃抗體失去活性。在pH4-12范圍內，卵黃抗體的活性幾乎不受影響，在pH〉 12時，卵黃抗 體迅速失去結合活性。實驗表明，卵黃抗體具有耐受反復凍融的特性，即使經(jīng)過5次凍融， 其抗原結合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個月，4t:保存可達5年以上，活性僅下 降5%左右。由于具有這些穩(wěn)定的理化性質，所以其的開發(fā)應用備受人們所關注。
除上述理化特性外，卵黃抗體還有其他重要的生物學特性。卵黃抗體濃度高于血 清IgG，單個卵黃(約15mL)含200mg左右的卵黃抗體，自卵黃中獲得卵黃抗體較實驗動物 血清方便。且卵黃抗體不與哺乳動物補體、Fc受體結合，也不與葡萄球菌蛋白A(SPA)或鏈球菌蛋白G(SPG)結合，卵黃抗體還不與血清中的類風濕因子(RF)結合，可提高免疫學檢測 的準確性。因而可用卵黃抗體檢測糞便中的病毒，因為糞便中經(jīng)常含有大量SPA，用卵黃抗 體檢測可避免假陽性結果。卵黃抗體是獨特的IgG同種型抗體，同時哺乳動物組織結構較 禽類組織具有高度免疫性，卵黃抗體用于哺乳動物檢測具有明顯的優(yōu)勢，許多高度保守的 抗原，在免疫動物后僅產生極小的免疫原性，卻可用卵黃抗體進行區(qū)分，因此卵黃抗體可用 于獸醫(yī)和人類免疫學的檢測。 楊樹皮類脂(Poplar Bark Lipid,PBL)是從楊樹皮中提取的一種橙黃色脂溶性物 質，富含大量的多糖、有機酸、甾醇、磷脂、甙類及維生素等物質。多糖類具有促胸腺體液反 應、剌激網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)，提高機體特異性免疫反應能力；有機酸具有增強機體免疫功能的作 用，能夠剌激和促進單核吞噬細胞功能，對抗免疫抑制對免疫器官的抑制作用；甙類能夠加 速抗體的產生、促進淋巴細胞轉化和增強網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)功能等作用。這些物質在動物體內 協(xié)調統(tǒng)一，大大提高動物體的免疫機能。 作為楊樹皮的提取物，楊樹皮類脂與大多數(shù)的中草藥一樣，也存在著雙向性，當使 用劑量過大時，不但不能起到正向促進作用，相反免疫器官會出現(xiàn)免疫抑制作用，因此，合 適的劑量是發(fā)揮楊樹皮類脂免疫增強作用的關鍵所在。 禽的免疫器官包括骨髓、法氏囊、胸腺、脾臟、肝臟等器官，這些器官發(fā)育的狀況、 淋巴細胞發(fā)育程度、分化成熟程度將直接影響到制備肝炎抗體水平。適量的楊樹皮類脂對 上述器官發(fā)育均具有明顯的促進作用。由于楊樹皮類脂成分中含有大量的必需氨基酸、維 生素、甾醇等，這些營養(yǎng)物質正是免疫器官發(fā)育過程中不可或缺的組分，通過飼喂適量的楊 樹皮類脂，可以很好的促進各免疫器官的發(fā)育，剌激并促進各淋巴細胞的分裂與增值，提高 分泌抗體的水平，高水平表達的抗體可通過體液循環(huán)到達卵巢，并在卵黃形成階段被收集， 經(jīng)過卵的各個形成過程，最終以卵黃抗體的形式得到保存。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種鹽肝炎抗體的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法，包括以下步驟 1)用楊樹皮類脂飼喂健康產蛋雞，用量為每只雞每天0. 08 0. lg，飼喂20 30 天后，對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進行鴨肝炎滅活疫苗強化免疫，采集雞血清測定抗 DHV中和抗體效價，合格者，收集該雞群產的蛋； 2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗 體。 根據(jù)本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法，其中，對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進
行鴨肝炎滅活疫苗強化免疫的過程為首次免疫每只雞注射O. 5ml弱毒疫苗，14d后進行第
二次免疫，每只雞注射1. 0ml油乳劑滅活苗，21d時進行第3次免疫，每只雞注射1. 0ml油乳
劑滅活苗，28d時進行第四次免疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗。 根據(jù)本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法，其中，在制備卵黃抗體過程中，向所述卵黃
和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達到0. 5-2. 0%。 根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法具體包括以下步驟 1)楊樹皮類脂(購自山東省莒縣林產化工廠)飼喂健康產蛋雞，每只雞每天0. 08 0. lg，每天一次，一個月后對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進行鴨肝炎滅活疫苗強 化免疫， 其中，鴨肝炎滅活疫苗強化免疫方法如下 利用鴨肝炎毒株AVZ111 (購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種SPF雞胚(購自山東省 SPF試驗雞場)，收集60 96h死亡胚胚體、絨毛膜和尿囊液混合搗碎，凍融三次，離心，取 上清液，加O. 1%甲醛滅活，然后與油佐劑(購自杭州煉油廠10號輕質白油)充分乳化制 成油乳劑滅活疫苗，用于經(jīng)楊樹皮類脂飼喂一個月的健康產蛋雞的免疫，首次免疫每只雞 胸部肌肉注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進行第二次免疫，每只雞胸部肌肉注射1. 0ml油乳劑 滅活苗，21d時進行第3次免疫，每只雞肌肉注射1. 0ml油乳劑滅活苗，28d時進行第四次免 疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗；
2)卵黃抗體的制備 第4次免疫后14d，采集雞血清測定抗DHV中和抗體效價(按2008版農業(yè)部獸 用生物制品標準)，合格者，收集該雞群產的蛋，自來水清洗污物后用0. 05%百毒殺浸泡 3-5min，紗布擦干后，再用75%酒精擦一遍，晾干，無菌條件下分離蛋清，把蛋黃倒人消毒好 的組織搗碎機中； 3)按照1 : 4的比例混合卵黃液和無菌生理鹽水，進行勻漿1 2min，在上述混 合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達到0. 5-2. 0%，4-8°〇冷浸過濾，120目紗網(wǎng)第一次 過濾，然后將濾液依次轉入100iim、50iim的微孔濾袋中，壓力過濾，濾液經(jīng)巴氏消毒后加 入萬分之一的硫柳汞，分裝，無菌檢驗合格備用。 通過本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法制備的抗體，與哺乳動物來源的抗體比較具 有取材方便、分離純化方法簡單、產量高，同時具有特異性高、穩(wěn)定性較好的優(yōu)點，同時還具 有產生免疫力時間早注射鴨體后1小時即可產生堅強免疫力，比常規(guī)抗體提前2小時左 右；保存運輸方便無需特殊冷藏設備，0-8t:保存12個月，常溫6個月；應激性小，吸收良 好。在緊急預防與治療方面具有顯著的效果。
具體實施例方式
實施例1鴨肝炎抗體的制備 利用楊樹皮類脂飼喂健康產蛋雞，每只雞每天飼喂0. 08g，每天一次，連續(xù)飼喂一 個月。 利用鴨肝炎毒株AVZ111毒株接種SPF雞胚，收集60 96h死亡胚胚體、絨毛膜和 尿囊液混合搗碎，凍融三次，離心，取上清液，加O. 1%甲醛滅活。然后與油佐劑充分乳化制 成油乳劑滅活疫苗，用于經(jīng)楊樹皮類脂(購自山東省莒縣林產化工廠)飼喂一個月的健康 產蛋雞的免疫。首次免疫每只雞胸部肌肉注射0. 5ml弱毒疫苗，14天后進行第二次免疫， 每只雞胸部肌肉注射1. Oml油乳劑滅活苗，21天時進行第3次免疫，每只雞肌肉注射1. Oml 油乳劑滅活苗，28天時進行第四次免疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗。
第四次免疫后14天，采集雞血清測定抗DHV中和抗體效價(按2008版農業(yè)部獸 用生物制品標準)，合格者，收集該雞群產的蛋，自來水清洗污物后用0.05%百毒殺浸泡 3-5min，紗布擦干后，再用75%酒精擦一遍，晾干。無菌條件下分離蛋清，把卵黃倒入消毒好 的組織搗碎機中，按照l : 4的比例混合卵黃液和無菌生理鹽水，進行勻漿l 2min。在上述混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達到0. 5%。 4-8t:冷浸過濾，120目紗網(wǎng)第一次 過濾，然后將濾液依次轉入100iim、50iim的微孔濾袋中，壓力過濾。濾液經(jīng)巴氏消毒后加 入萬分之一的硫柳汞，分裝，無菌檢驗合格備用(無菌檢驗、安全檢驗根據(jù)2008版農業(yè)部獸 用生物制品質量標準進行)。 經(jīng)測定制備的鴨肝炎抗體的效價為1 : 256以上，其安全性100%、無菌性檢測結 果為陰性。 治療用量對發(fā)病初期的鴨子緊急胸部肌肉注射2. Oml/只。 預防用量對3日齡鴨子胸部肌肉注射1. Oml/只，10天后再次于鴨子胸部肌肉注 射1.0ml/只。
實施例2 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0. lg、向卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅 沙姆188的終濃度為2. 0%外，其余步驟同實施例1。 經(jīng)測定制備的鴨肝炎抗體的效價為1 : 256以上，其安全性100%、無菌性檢測結 果為陰性。 治療用量對發(fā)病初期的鴨子緊急胸部肌肉注射2. Oml/只。 預防用量對3日齡鴨子胸部肌肉注射1. Oml/只，10天后再次于鴨子胸部肌肉注 射1.0ml/只。
實施例3 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0. 09g、向卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊 羅沙姆188的終濃度為1. 5%外，其余步驟同實施例1。 經(jīng)測定制備的鴨肝炎抗體的效價為1 : 256以上，其安全性100%、無菌性檢測結 果為陰性。 治療用量對發(fā)病初期的鴨子緊急胸部肌肉注射2. Oml/只。 預防用量對3日齡鴨子胸部肌肉注射1. Oml/只，10天后再次于鴨子胸部肌肉注
射1.0ml/只。 對比實施例1 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0.05g外，其余步驟同實施例1。
經(jīng)測定制備的鴨肝炎抗體的效價一般在1 : 128。 治療用量需要對發(fā)病初期的鴨緊急胸部肌肉注射3-4. 0. m1/只，7天以后再次注 射3-4. Oml/只。
對比實施例2 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天O. 12g外，其余步驟同實施例2。
經(jīng)測定制備的鴨肝炎抗體的效價一般低于1 : 128。
治療時，即使超過4. Oml/只注射，保護率也較低。
權利要求
一種鴨肝炎抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康產蛋雞，用量為每只雞每天0.08～0.1g，飼喂20～30天后，對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進行鴨肝炎滅活疫苗強化免疫，采集雞血清測定抗DHV中和抗體效價，合格者，收集該雞群產的蛋；2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗體。
2. 根據(jù)權利要求1所述鴨肝炎抗體的制備方法，其特征在于，對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進行鴨肝炎滅活疫苗強化免疫的過程如下首次免疫每只雞注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進行第二次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，21d時進行第3次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，28d時進行第四次免疫，每只雞肌肉注射1ml油乳劑滅活苗。
3. 根據(jù)權利要求1所述鴨肝炎抗體的制備方法，其特征在于，在制備卵黃抗體過程中，向所述卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達到0. 5-2. 0%。
4. 根據(jù)權利要求1所述鴨肝炎抗體的制備方法，其特征在于，卵黃液和無菌生理鹽水以1 : 4混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學領域，具體地，本發(fā)明涉及一種鴨肝炎抗體的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法，包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康產蛋雞，用量為每只雞每天0.08～0.1g，飼喂20～30天后，對飼喂楊樹皮類脂的健康產蛋雞進行鴨肝炎滅活疫苗強化免疫，采集雞血清測定抗DHV中和抗體效價，合格者，收集該雞群產的蛋；2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗體。通過本發(fā)明的鴨肝炎抗體的制備方法制備的抗體，與哺乳動物來源的抗體比較具有取材方便、分離純化方法簡單、產量高，同時具有特異性高、穩(wěn)定性較好的優(yōu)點。
文檔編號C07K16/02GK101704890SQ200910237718
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月13日 優(yōu)先權日2009年11月13日
發(fā)明者丁軍濤, 呂淑榮, 孔義波, 張興曉, 王穎, 郭 東 申請人:煙臺綠葉動物保健品有限公司