專利名稱：一種雞法氏囊抗體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種雞法氏囊抗體的制備方法。
背景技術(shù)：
卵黃抗體是指從免疫禽蛋中提取出的針對(duì)特定抗原的抗體，由于卵黃中僅有IgG 類抗體，故稱其為卵黃免疫球蛋白IgG(egg yolkimmunoglobulins)，簡(jiǎn)稱為IgY。卵黃抗體 的研究始于19世紀(jì)末，1893年Klemperer發(fā)現(xiàn)了卵黃中富含抗體；1934年Jukes的實(shí)驗(yàn)證 明母雞血清中的抗體可以轉(zhuǎn)移到卵黃中，從而為雛雞提供被動(dòng)免疫保護(hù)。Patters等的試驗(yàn) 證實(shí)，相對(duì)別的血漿蛋白，IgG被選擇性的轉(zhuǎn)運(yùn)到卵泡中。1969年，Leslie和Clem將這種 抗體命名為IgY。 卵黃抗體的形成過程是當(dāng)機(jī)體受到外界特異性抗原(尤其是滅活抗原)的剌激 后誘發(fā)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，激發(fā)B細(xì)胞分化成能分泌特異性抗體的漿細(xì)胞，分泌大量 的特異性抗體進(jìn)入血液中。同時(shí)在產(chǎn)蛋禽體內(nèi)，血液中的特異性抗體IgG(所有亞群)由卵 巢IgG受體的介導(dǎo)逐步進(jìn)入到卵巢濾泡和輸卵管中，并在卵黃中蓄積起來，也正是由于這 種卵黃累積作用，使卵黃中的IgG明顯地高于血清中的含量，而血清中的其他抗體(主要是 IgM， IgA)與輸卵管中的卵白白蛋白一起混入到雞蛋白中。 卵黃抗體在多種環(huán)境中有較高的穩(wěn)定性，在低于75t:條件下，卵黃抗體具有良好
的熱穩(wěn)定性，9(TC處理15min后，大部分卵黃抗體喪失結(jié)合活性，在pH〈 4時(shí)，僅有少量卵 黃抗體失去活性。在pH4-12范圍內(nèi)，卵黃抗體的活性幾乎不受影響，在pH〉 12時(shí)，卵黃抗 體迅速失去結(jié)合活性。實(shí)驗(yàn)表明，卵黃抗體具有耐受反復(fù)凍融的特性，即使經(jīng)過5次凍融， 其抗原結(jié)合活性幾乎不受影響。在室溫下可保存6個(gè)月，fC保存可達(dá)5年以上，活性僅下 降5%左右。由于具有這些穩(wěn)定的理化性質(zhì)，所以其開發(fā)應(yīng)用備受人們所關(guān)注。
除上述理化特性外，卵黃抗體還有其他重要的生物學(xué)特性。卵黃抗體濃度高于血 清IgG，單個(gè)卵黃(約15mL)含200mg左右的卵黃抗體，自卵黃中獲得卵黃抗體較實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 血清方便。且卵黃抗體不與哺乳動(dòng)物補(bǔ)體、Fc受體結(jié)合，也不與葡萄球菌蛋白A(SPA)或鏈 球菌蛋白G(SPG)結(jié)合，卵黃抗體還不與血清中的類風(fēng)濕因子(RF)結(jié)合，可提高免疫學(xué)檢測(cè) 的準(zhǔn)確性。因而可用卵黃抗體檢測(cè)糞便中的病毒，因?yàn)榧S便中經(jīng)常含有大量SPA，用卵黃抗 體檢測(cè)可避免假陽性結(jié)果。卵黃抗體是獨(dú)特的IgG同種型抗體，同時(shí)哺乳動(dòng)物組織結(jié)構(gòu)較 禽類組織具有高度免疫性，卵黃抗體用于哺乳動(dòng)物檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，許多高度保守的 抗原，在步入動(dòng)物中僅產(chǎn)生極小的免疫原性，卻可用卵黃抗體進(jìn)行區(qū)分，因此卵黃抗體可用 于獸醫(yī)和人類免疫學(xué)的檢測(cè)。 楊樹皮類脂(Poplar Bark Lipid,PBL)是從楊樹皮中提取的一種橙黃色脂溶性物 質(zhì)，富含大量的多糖、有機(jī)酸、甾醇、磷脂、甙類及維生素等物質(zhì)。多糖類具有促胸腺體液反 應(yīng)、剌激網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，提高機(jī)體特異性免疫反應(yīng)能力；有機(jī)酸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作 用，能夠剌激和促進(jìn)單核吞噬細(xì)胞功能，對(duì)抗免疫抑制對(duì)免疫器官的抑制作用；甙類能夠加 速抗體的產(chǎn)生、促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增強(qiáng)網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)功能等作用。這些物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)協(xié)調(diào)統(tǒng)一，大大提高動(dòng)物體的免疫機(jī)能。 作為楊樹皮的提取物，楊樹皮類脂與大多數(shù)的中草藥一樣，也存在著雙向性，當(dāng)使用劑量過大時(shí)，不但不能起到正向促進(jìn)作用，相反免疫器官會(huì)出現(xiàn)免疫抑制作用，因此，合適的劑量是發(fā)揮楊樹皮類脂免疫增強(qiáng)作用的關(guān)鍵所在。 法氏囊作為最重要的禽的中樞免疫器官，其發(fā)育的狀況、淋巴細(xì)胞發(fā)育程度、分化成熟程度將直接影響到制備法氏囊抗體水平。適量的楊樹皮類脂對(duì)法氏囊發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用。由于楊樹皮類脂成分中含有大量的必需氨基酸、維生素、甾醇等，這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)正是免疫器官發(fā)育過程中不可或缺的組分，通過飼喂適量的楊樹皮類脂，可以很好的促進(jìn)法氏囊等免疫器官的發(fā)育，剌激并促進(jìn)各淋巴細(xì)胞的分裂與增值，使法氏囊淋巴組織與淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的生物學(xué)活性，從而整體提高法氏囊產(chǎn)生免疫應(yīng)答，分泌抗體的水平，高水平表達(dá)的抗體可通過體液循環(huán)到達(dá)卵巢，并在卵黃形成階段被收集，經(jīng)過卵的各個(gè)形成過程，最終以卵黃抗體的形式得到保存。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種雞法氏囊抗體的制備方法。
根據(jù)本發(fā)明的雞法氏囊抗體的制備方法，包括以下步驟 1)用楊樹皮類脂飼喂健康產(chǎn)蛋雞，用量為每只雞每天0. 08 0. lg，飼喂20 30天后，對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫，采集雞血清測(cè)定抗DHV中和抗體效價(jià)，合格者，收集該雞群產(chǎn)的蛋； 2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗體。 根據(jù)本發(fā)明的雞法氏囊抗體的制備方法，其中，對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞
進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫的過程為首次免疫每只雞注射O. 5ml弱毒疫苗，14d后進(jìn)行
第二次免疫，每只雞注射1. 0ml油乳劑滅活苗，21d時(shí)進(jìn)行第3次免疫，每只雞注射1. 0ml油
乳劑滅活苗，28d時(shí)進(jìn)行第四次免疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗。 根據(jù)本發(fā)明的雞法氏囊抗體的制備方法，其中，在制備卵黃抗體過程中，向所述卵
黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達(dá)到0. 5-2. 0%。 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明的雞法氏囊抗體的制備方法具體包括以下步
驟 1)楊樹皮類脂(購(gòu)自山東省莒縣林產(chǎn)化工廠)飼喂健康產(chǎn)蛋雞，每只雞每天0. 08 0. lg，每天一次，一個(gè)月后對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫， 其中，法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫方法如下 利用法氏囊B87毒株(購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)接種SPF雞胚(購(gòu)自山東省SPF試驗(yàn)雞場(chǎng))，收集60 96h死亡胚胚體、絨毛膜和尿囊液混合搗碎，凍融三次，離心，取上清液，加0. 1%甲醛滅活，然后與油佐劑(購(gòu)自杭州煉油廠10號(hào)輕質(zhì)白油)充分乳化制成油乳劑滅活疫苗，用于經(jīng)楊樹皮類脂飼喂一個(gè)月的健康產(chǎn)蛋雞的免疫，首次免疫每只雞胸部肌肉注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進(jìn)行第二次免疫，每只雞胸部肌肉注射1. 0ml油乳劑滅活苗，21d時(shí)進(jìn)行第3次免疫，每只雞肌肉注射1. 0ml油乳劑滅活苗，28d時(shí)進(jìn)行第四次免疫，每只雞肌肉注射1ml油乳劑滅活苗；
2)卵黃抗體的制備 第4次免疫后14d，采集雞血清測(cè)定抗DHV中和抗體效價(jià)(按2008版農(nóng)業(yè)部獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn))，合格者，收集該雞群產(chǎn)的蛋，自來水清洗污物后用0. 05%百毒殺浸泡3-5min，紗布擦干后，再用75%酒精擦一遍，晾干，無菌條件下分離蛋清，把蛋黃倒人消毒好的組織搗碎機(jī)中； 3)按照1 : 4的比例混合卵黃液和無菌生理鹽水，進(jìn)行勻漿1 2min，在上述混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達(dá)到0. 5-2. 0%，4-8°〇冷浸過濾，120目紗網(wǎng)第一次過濾，然后將濾液依次轉(zhuǎn)入100iim、50iim的微孔濾袋中，壓力過濾，濾液經(jīng)巴氏消毒后加入萬分之一的硫柳汞，分裝，無菌檢驗(yàn)合格備用。 本發(fā)明提供了一種新型抗雞傳染性法氏囊病的精致抗體制備方法，利用楊樹皮類脂的免疫增強(qiáng)功能先提高蛋雞中樞免疫器官的成熟程度，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，通過機(jī)體對(duì)疫苗注射產(chǎn)生的特殊免疫應(yīng)答使注射過楊樹皮類脂的蛋雞所產(chǎn)的雞蛋中含有高滴度的抗雞傳染性法氏囊病的抗體。通過本發(fā)明的方法不僅具有制作簡(jiǎn)單方便，性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，其產(chǎn)生的傳染性法氏囊抗體效價(jià)可比常規(guī)方法制得的卵黃抗體提高2倍以上，在緊急預(yù)防與治療雞傳染性法氏囊病方面具有顯著的效果。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1雞傳染性法氏囊抗體的制備 利用楊樹皮類脂飼喂健康產(chǎn)蛋雞，每只雞每天飼喂0. 08g。 利用法氏囊B87毒株接種SPF雞胚，收集60 96h死亡胚胚體、絨毛膜和尿囊液混合搗碎，凍融三次，離心，取上清液，加O. 1%甲醛滅活。然后與油佐劑充分乳化制成油乳劑滅活疫苗，用于經(jīng)楊樹皮類脂(購(gòu)自山東省莒縣林產(chǎn)化工廠)飼喂一個(gè)月的健康產(chǎn)蛋雞的免疫。首次免疫每只雞胸部肌肉注射O. 5ml弱毒疫苗，14天后進(jìn)行第二次免疫，每只雞胸部肌肉注射1. Oml油乳劑滅活苗，21天時(shí)進(jìn)行第3次免疫，每只雞肌肉注射1. Oml油乳劑滅活苗，28天時(shí)進(jìn)行第四次免疫，每只雞肌肉注射lml油乳劑滅活苗。 第四次免疫后14天，采集雞血清測(cè)定抗DHV中和抗體效價(jià)(按2008版農(nóng)業(yè)部獸用生物制品標(biāo)準(zhǔn))，合格者，收集該雞群產(chǎn)的蛋，自來水清洗污物后用0.05%百毒殺浸泡3-5min，紗布擦干后，再用75%酒精擦一遍，晾干。無菌條件下分離蛋清，把卵黃倒入消毒好的組織搗碎機(jī)中，按照l : 4的比例混合卵黃液和無菌生理鹽水，進(jìn)行勻漿l 2min。在上述混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達(dá)到0. 5%。 4-8t:冷浸過濾，120目紗網(wǎng)第一次過濾，然后將濾液依次轉(zhuǎn)入100iim、50iim的微孔濾袋中，壓力過濾。濾液經(jīng)巴氏消毒后加入萬分之一的硫柳汞，分裝，無菌檢驗(yàn)合格備用(無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)根據(jù)2008版農(nóng)業(yè)部獸用生物制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行)。 經(jīng)測(cè)定制備的雞法氏囊卵黃抗體的效價(jià)不低于1 : 256，其安全性為100%、無菌性檢測(cè)結(jié)果為陰性 治療用量對(duì)發(fā)病初期的雞緊急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2. Oml/只。
實(shí)施例2
5
除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0. lg、向卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188的終濃度為2. 0%外，其余步驟同實(shí)施例1。 經(jīng)測(cè)定制備的雞法氏囊卵黃抗體的效價(jià)不低于1 : 256，其安全性、無菌性檢測(cè)結(jié)果陰性為 治療用量對(duì)發(fā)病初期的雞緊急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2. 0m1/只。
實(shí)施例3 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0. 09g、向卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188的終濃度為1. 5%外，其余步驟同實(shí)施例1。 經(jīng)測(cè)定制備的雞法氏囊卵黃抗體的效價(jià)不低于1 : 256，其安全性100%、無菌性檢測(cè)結(jié)果為陰性。 治療用量對(duì)發(fā)病初期的雞緊急胸部肌肉注射2.0ml/只，7天以后再次注射2. Oml/只。 對(duì)比實(shí)施例1 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天0.05g外，其余步驟同實(shí)施例1。
經(jīng)測(cè)定制備的雞法氏囊卵黃抗體的效價(jià)一般在1 : 128. 治療用量需要對(duì)發(fā)病初期的雞緊急胸部肌肉注射3-4. 0. m1/只，7天以后再次注射3-4. Oml/只。
對(duì)比實(shí)施例2 除楊樹皮類脂飼喂量為每只雞每天O. 12g外，其余步驟同實(shí)施例2。
經(jīng)測(cè)定制備的雞法氏囊卵黃抗體的效價(jià)低于1 : 128，
治療時(shí)，即使超過4. Oml/只注射，保護(hù)率也較低。
權(quán)利要求
一種雞法氏囊抗體的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康產(chǎn)蛋雞，用量為每只雞每天0.08～0.1g，飼喂20～30天后，對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫，采集雞血清測(cè)定抗DHV中和抗體效價(jià)，合格者，收集該雞群產(chǎn)的蛋；2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雞法氏囊抗體的制備方法，其特征在于，對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫的過程如下首次免疫每只雞注射0. 5ml弱毒疫苗，14d后進(jìn)行第二次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，21d時(shí)進(jìn)行第3次免疫，每只雞注射1. Oml油乳劑滅活苗，28d時(shí)進(jìn)行第四次免疫，每只雞肌肉注射1ml油乳劑滅活苗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雞法氏囊抗體的制備方法，其特征在于，在制備卵黃抗體過程中，向所述卵黃和生理鹽水的混合液中添加泊羅沙姆188，使其終濃度達(dá)到0. 5-2. 0%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雞法氏囊抗體的制備方法，其特征在于，卵黃液和無菌生理鹽水以1 : 4混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種雞法氏囊抗體的制備方法。根據(jù)本發(fā)明的雞法氏囊抗體的制備方法，包括以下步驟1)用楊樹皮類脂飼喂健康產(chǎn)蛋雞，用量為每只雞每天0.08～0.1g，飼喂20～30天后，對(duì)飼喂楊樹皮類脂的健康產(chǎn)蛋雞進(jìn)行法氏囊滅活疫苗強(qiáng)化免疫，采集雞血清測(cè)定抗DHV中和抗體效價(jià)，合格者，收集該雞群產(chǎn)的蛋；2)無菌條件下分離蛋清，搗碎蛋黃，將卵黃液和無菌生理鹽水混勻，制備卵黃抗體。通過本發(fā)明的方法不僅具有制作簡(jiǎn)單方便，性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)，其產(chǎn)生的傳染性法氏囊抗體效價(jià)可比常規(guī)方法制得的卵黃抗體提高2倍以上，在緊急預(yù)防與治療雞傳染性法氏囊病方面具有顯著的效果。
文檔編號(hào)C07K16/10GK101704889SQ20091023771
公開日2010年5月12日 申請(qǐng)日期2009年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月13日
發(fā)明者丁軍濤, 呂淑榮, 孔義波, 張興曉, 王穎, 郭 東 申請(qǐng)人:煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司