專利名稱：：一種抗原-抗體復(fù)合物晶體及其制備方法與抗原表位的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種抗原-抗體復(fù)合物晶體及其制備方法與抗原表位。
背景技術(shù)：
：癌基因HER2/ErbB2屬于ErbB家族四個成員ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2/P185、ErbB3和ErbB4之一，它們都是由一個胞外區(qū)、一個跨膜區(qū)和一個胞內(nèi)的酪氨酸激酶區(qū)三部分組成的膜受體分子，其中胞外區(qū)(ECD)分為四個亞區(qū)結(jié)構(gòu)域，其中I、III亞區(qū)為亮氨酸富含區(qū)，II、IV亞區(qū)為半胱氨酸富含區(qū)(CarpenterG.(1987)Receptorsofepidermalgrowthfactorandotherpolypeptidemitogens.Annu.Rev.Biochem.56:881-914)。各自的配體與對應(yīng)的ErbB受體胞外區(qū)結(jié)合，誘導(dǎo)受體之間同源或異源二聚體的形成，導(dǎo)致胞內(nèi)受體酪氨酸激酶區(qū)活化，進(jìn)而激活胞內(nèi)的信號級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移和發(fā)育等(OlayioyeM.A.,NeveR.M.,Lane,H.A.HynesH.E.(2000)TheErbBsignalingnetwork:receptorheterodimerizationindevelopmentandcancer.TheEMBOJ.19:3159-3167.)。研究表明，ErbB2在受體激活形成二聚體時起中心作用，家族中所有成員都傾向于與ErbB2形成異二聚體；ErbB2異二聚體或同二聚體都會導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)型發(fā)生癌變，而ErbB家族其他成員的同二聚體卻沒有這種功能(OlayioyeM.A.,NeveR.M.,Lane,H.A.HynesH.E.(2000)TheErbBsignalingnetwork:receptorheterodimerizationindevelopmentandcancer.TheEMBOJ.19:3159-3167.)。ErbB2受體的表達(dá)異常與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)紊亂、細(xì)胞癌化以及腫瘤的發(fā)生和惡性發(fā)展緊密相關(guān)(NancyE.H.,HeidiA.,LaneN.(2005)Erbbreceptorsandcancer:thecomplexityoftargetedinhibitorsNat.Rev.Cancer5:341-354.)。研究還發(fā)現(xiàn)，多種上皮細(xì)胞癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、部分胃癌、非小細(xì)胞肺癌和腸癌等病人的腫瘤組織中存在ErbB2基因異常，導(dǎo)致ErbB2蛋白高表達(dá)現(xiàn)象；尤其在乳腺癌和卵巢癌病人中，ErbB2高表達(dá)比例非常高，達(dá)到30%左右；而且，ErbB2過表達(dá)的乳腺癌腫瘤的惡性程度高，遷移性和浸潤性強(qiáng)，對放療和化療藥物不敏感，治療后復(fù)發(fā)的可能性大，因此危害性更大(RossJ.S.,FletcherJ.A.(1999)TheHER2/neuoncogene:prognosticfactor,predictivefactorandtargetfortherapy.Semin.CancerBiol.9:125-138.)。1985年，GreeneM丄研究組發(fā)現(xiàn)，抗ErbB2胞外區(qū)的單克隆抗體能夠下調(diào)ErbB2受體在細(xì)胞表面的表達(dá)水平，從而降低甚至逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的惡性表型，使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)歸正?；?DrebinJ.A.，LinkV.C.,SternD.F.,WeinbergR.A.,Greene,M丄(1985)Down-modulationofanoncogeneproteinproductandreversionofthetransformedphenotypebymonoclonalantibodies.Cell41:695-706.)。這一發(fā)現(xiàn)大大促進(jìn)了抗ErbB2單克隆抗體的抗腫瘤作用的研究，也揭示了抗體在腫瘤治療上應(yīng)用的前景。經(jīng)過十多年的努力，1998年美國FDA批準(zhǔn)了第一個用于腫瘤治療的人源化抗ErbB2的單克隆抗體藥物(Herceptin或者trastuzumab，其鼠源單抗名為4D5)上市，這是腫瘤抗體治療領(lǐng)域的一個重要的里程碑，使抗體類藥物成為腫瘤治療藥物發(fā)展的一個熱點(diǎn)和新方(http:〃www.fda.gov/bbs/topics/NEWS/NEW00655.html)。一方面，Herceptin的抑癌效應(yīng)在臨床應(yīng)用中得到進(jìn)一步證實(shí)，特別是它在對ErbB2高表達(dá)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的治療中展示了獨(dú)特的功效。另一方面，臨床應(yīng)用中也發(fā)現(xiàn)，Herceptin對ErbB2低表達(dá)的癌癥病人存在療效較差的現(xiàn)象(TokudaY.,OhtaM.，SuzukiY.,KubotaM.，TajimaT.(2001)Clinicaldevelopmentoftrastuzumabinbreastcancer.BreastCancer8:93-97.)，據(jù)Genentech公司關(guān)于對Herceptin抗體藥物臨床治療效果的調(diào)査數(shù)據(jù)顯示(http:〃www.gene.com/gene/products/information):單獨(dú)施用該藥物時能夠在7%的病人體內(nèi)引發(fā)心臟功能紊亂，而與紫杉醇或環(huán)磷酰胺類化療藥物共同施用時，心臟毒性發(fā)生率分別升至11%和28%;另夕卜，Herceptin還能引發(fā)某些病人的超敏反應(yīng)、灌注反應(yīng)及肺部異常，需要停止用藥；對Her2高表達(dá)腫瘤(分別為"++"級和"+++"級)病人的治療有效率也僅為14%。這促使人們對抗體的腫瘤抑制機(jī)理展開了更多的研究，并紛紛研制新的針對ErbB2的單克隆抗體，進(jìn)而發(fā)展更好的針對Her2高表達(dá)腫瘤的抗體治療藥物。大量的研究發(fā)現(xiàn)，不同的ErbB2單抗對ErbB2高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞的增殖產(chǎn)生的影響不同，大多數(shù)抗體能抑制腫瘤的生長，但是也有些抗體沒有任何影響，有的甚至起刺激腫瘤細(xì)胞生長的作用，抗體的這種功能差異與其對抗原分子上的具體作用部位即表位(epitope)的識別特性直接相關(guān)(BoyerC.M.,PusztaiL.,WienerJ.R.,XuF丄,DeanG.S，BastB.S.，O，BriantK.C.,Gre畫aldM.,DesombereK.A.,BastR.C.(1999)Relativecytotoxicactivityofimmunotoxinsreactivewithdifferentepitopesontheextracellulardomainofthec-er6b-2(her-2/"ew)geneproductpl85.Int.J.Cancer.82:525-531.)。因此，研究抗體的抗原識別部位或表位，不僅可以揭示抗體的作用機(jī)制，而且對開發(fā)具有治療前景的新的抗體藥物具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。抗體的識別表位可以通過蛋白質(zhì)晶體學(xué)、分子生物學(xué)及計算機(jī)分子模擬等方法進(jìn)行預(yù)測，例如WangJN和HuS等通過分子生物學(xué)或計算機(jī)分子模擬等方法來預(yù)測抗ErbB2抗體的識別表位(WangJN，F(xiàn)engJN,YuaM,XuaM,ShiM,ZhouT，YuaXD.ShenBF,GuoN.(2004)StructuralanalysisoftheepitopesonerbB2interactedwithinhibitoryornon-inhibitormonoclonalantibodies.MolImmunol.40:963—969.S.Hu,Z.Zhu,L.Li,L.Chang,W.F.L，L.Cheng，M.Teng,J.Liu.(2008)Fineepitopemappingandstructuralanalysisofananti-ErbB2antibodyA21:Molecularbasisforanti-tumormechanism.Proteins.70:938-949.)。但是只有蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)可精確地確定抗體所識別的表位，是公認(rèn)的最可信的方法，特別是抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)能顯現(xiàn)出識別表位的立體結(jié)構(gòu)，可為新的靶向藥物設(shè)計提供重要的依據(jù)。ErbB2分子是一個跨膜蛋白，在細(xì)胞中的含量極低，體外表達(dá)很難獲得正確折疊的、有功能的、足夠量的ErbB2膜蛋白進(jìn)行晶體學(xué)實(shí)驗(yàn)，因此盡管人們做了很多努力，至今只有很少幾個抗ErbB2抗體的識別表位是通過解析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)獲得的。其中之一是人源化單抗4D5的Fab段與ErbB2胞外區(qū)復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，它的解析結(jié)果第一次從結(jié)構(gòu)的角度闡明了ErbB2之所以不同于ErbB家族其它成員的功能特性的分子基礎(chǔ)(ChoH.S.,MasonK.,RamyarK.X.,StanleyA.M.，GabelliS.B.,DenneyD.W.,LeahyD丄(2003)StructureoftheextracellularregionofHER2aloneandincomplexwiththeHerceptinFab.Nature421:756-760.)。人源化單抗2C4的Fab段與ErbB2胞外區(qū)的復(fù)合物是第二個獲得解析的晶體結(jié)構(gòu)(FranklinM.C"CareyK.D.,VajdosF.F.,LeahyD.J，VosA.M,SliwkowskiM.X.(2004)InsightsintoErbB2signalingfromthestructureoftheErbB2-pertusumabcomplex.CancerCell5:317-327.)。雖然4D5和2C4都是ErbB2蛋白胞外區(qū)的抗體，且都能抑制ErbB2高表達(dá)腫瘤細(xì)胞生長，但2C4的抑制作用不需要抗體保留完整的Fc片段，即單價的2C4Fab片段同樣可以發(fā)揮抑制作用，而4D5必需依賴于抗體(Fab，)2的二價性；2C4不僅對ErbB2受體高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞有抑制效果，而且在配體存在時對低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞也起抑制效應(yīng)，而4D5只對高表達(dá)ErbB2受體的腫瘤有效。晶體學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，2C4的抗原識別部位是ErbB2胞外區(qū)靠近第II亞區(qū)結(jié)構(gòu)域的部位，而4D5的抗原識別部位是ErbB2胞外區(qū)的第IV亞區(qū)，4D5抗體的結(jié)合干擾了ErbB2與其他ErbB受體形成異二聚體，并阻止了受體胞外區(qū)的近膜部位被間質(zhì)酶水解，從而阻止了受體被激活而導(dǎo)致的細(xì)胞增殖。2C4的結(jié)合可能也干擾了ErbB2與其他ErbB受體形成異二聚體，同時也能阻止受體與其配體的相互作用。這樣就從結(jié)構(gòu)的角度闡明了兩個抗體產(chǎn)生不同抑瘤效應(yīng)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。人源化的2C4(又名Pertuzumab)也將進(jìn)入三期臨床實(shí)驗(yàn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種抗原-抗體復(fù)合物晶體。本發(fā)明所提供的抗原-抗體復(fù)合物晶體，由腫瘤表面抗原pl85/HER2胞外區(qū)部分片段EPI和抗體chA21經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后得到的單鏈抗體scFv組成；所述EPI的氨基酸殘基序列如序列表中序列1所示。所述抗原-抗體復(fù)合物晶體的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)如下分辨率30.0-2.45埃(2.58-2.45埃)；修正用衍射點(diǎn)數(shù)/監(jiān)測用衍射點(diǎn)數(shù)27646/1461;工作R因子/自由R因子20.1/25.7(25.4/34.9);鍵長的最小均方差0.007埃；鍵角的最小均方差1.03度；總的平均溫度因子24.5平方埃；結(jié)構(gòu)中非氫原子的蛋白質(zhì)原子數(shù)6589;結(jié)構(gòu)中水分子數(shù)239;Ramachandran圖最合適區(qū)域89.4%;次合適區(qū)域9.7%;基本可接受區(qū)域0.9%;上述括號內(nèi)標(biāo)注的是最高分辨率殼層的參數(shù)；所述最合適區(qū)域、次合適區(qū)域和基本可接受區(qū)域均指蛋白質(zhì)主鏈各個氨基酸殘基的二面角在Ramachandran圖中的位置；所述工作R因子^^hl|F。bs(h)|-|Fcal(h)I|/Ih|F。bs(h)I，其中F"h)和F^(h)分別表示h衍射點(diǎn)實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)構(gòu)因子和計算的結(jié)構(gòu)因子；所述自由R因子的計算方法與工作R因子一致，但自由R因子是由隨機(jī)挑選出的5%的監(jiān)測用衍射點(diǎn)來計算。本發(fā)明的另一個目的是提供上述抗原-抗體復(fù)合物晶體的制備方法。本發(fā)明所提供的抗原-抗體復(fù)合物晶體的制備方法，是將腫瘤表面抗原pl85/HER2胞外區(qū)部分片段EPI和抗體chA21經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后的片段scFv按照l:(1-1.2)的摩爾比混合，得到抗原-抗體復(fù)合物蛋白；再將所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白和晶體生長緩沖液混合并置于22t條件下，得到抗原-抗體復(fù)合物晶體；所述晶體生長緩沖液的組成為每升晶體生長緩沖液中含有聚乙二醇4000150ml，終濃度為0.1M的3-(l-吡叮并)-l-丙醇磺酸(3-(l-Pyridino)-l-propanesulfonate,CAS編號15471-17-7)和終濃度為0.1MpH6.5的二甲羧酸鈉，其余為水。所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白和所述晶體生長緩沖液混合后，所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白的濃度為3.5mg/ml。上述抗原-抗體復(fù)合物晶體的制備方法中還包括將得到的抗原-抗體復(fù)合物晶體加入到冷凍保護(hù)液中的步驟；所述冷凍保護(hù)液由甘油和所述晶體生長緩沖液組成，所述甘油和所述晶體生長緩沖液的體積比為1:5。對上述得到的抗原-抗體復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，進(jìn)而確定這種有很好臨床應(yīng)用前景的抗體工程藥物候選分子chA21的抗原識別表位，為闡明其作用機(jī)理提供，構(gòu)基礎(chǔ)。采用上述方法制備的抗原-抗體復(fù)合物晶體的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)如下分辨率30.0-2.45埃(2.58-2.45埃)；修正用衍射點(diǎn)數(shù)/監(jiān)測用衍射點(diǎn)數(shù)27646/1461;工作R因子/自由R因子20.1%/25.7%(25.4%/34.9%);鍵長的最小均方差0.007埃；鍵角的最小均方差1.03度；總的平均溫度因子24.5平方埃；結(jié)構(gòu)中非氫原子的蛋白質(zhì)原子數(shù)6589;結(jié)構(gòu)中水分子數(shù)239;Ramachandran圖最合適區(qū)域89.4%;次合適區(qū)域9.7%;基本可接受區(qū)域0.9%;上述括號內(nèi)標(biāo)注的是最高分辨率殼層的參數(shù)；所述最合適區(qū)域、次合適區(qū)域和基本可接受區(qū)域均指蛋白質(zhì)主鏈各個氨基酸殘基的二面角在Ramachandran圖中的位置；所述工作R因子二i;hl|F。bs(h)|-|Fcal(h)II/ZhIF。bs(h)I，其中F。ah)禾口F^(h)分別表示h衍射點(diǎn)實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)構(gòu)因子和計算的結(jié)構(gòu)因子；所述自由R因子的計算方法與工作R因子一致，但自由R因子是由隨機(jī)挑選出的5%的監(jiān)測用衍射點(diǎn)來計算。本發(fā)明的第三個目的是提供和chA21抗體結(jié)合的抗原表位。本發(fā)明所提供的和chA21抗體結(jié)合的抗原表位，由如下氨基酸殘基組成序列1的自氨基末端第102位的Asn、第103位的Asn、第136位的Asn、第141位的Tyr、第143位的Asp、第166位的Arg、第170位的Cys、第171位的His、第172位的Pro和第185位的Glu。本發(fā)明的抗原-抗體復(fù)合物晶體與現(xiàn)有已經(jīng)獲得的有關(guān)pl85/HER2抗原-抗體復(fù)合物晶體相比，具有如下優(yōu)點(diǎn)和特異性首先，單鏈抗體scFv的制備是來源于經(jīng)過大量研究的工程化嵌合抗體chA21，由于chA21是經(jīng)哺乳動物細(xì)胞表達(dá)得到的，其分子構(gòu)象比用大腸桿菌或酵母表達(dá)的分子更接近其親代來源的單抗可變區(qū)的天然結(jié)構(gòu)；其次，pl85/HER2膜抗原的表達(dá)是通過構(gòu)建含有GST的融合基因，使得在原核系統(tǒng)中很難表達(dá)的膜蛋白能夠正確形成可溶的、有活性的融合蛋白GST-EPI，并且方便純化膜蛋白胞外區(qū)EPl和進(jìn)一步制備抗原-抗體復(fù)合物；第三，scFv和EPI片段形成的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)展現(xiàn)的二者的結(jié)合模式與完整的chA21抗體和pl85/HER2分子間的結(jié)合模式一致，沒有造成有用的結(jié)構(gòu)信息的丟失；與此同時，scFv和EPI片段與完整的chA21抗體和pl85/HER2分子相比，前者分子量較小，而且沒有后者分子內(nèi)部各個結(jié)構(gòu)域之間的相對運(yùn)動，因此有利于獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體，進(jìn)而提高解析的晶體結(jié)構(gòu)的質(zhì)量；第四，由于該抗原-抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析，使pl85/HER2抗原的第I亞區(qū)中一段結(jié)構(gòu)不確定的loop區(qū)的結(jié)構(gòu)獲得了確定，是國際上首次獲得的該區(qū)(Leul01至Serlll共11個殘基)的完整空間結(jié)構(gòu)；第五，由于該抗原-抗體復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的解析，確定了嵌和抗體chA21在pl85/HER2膜抗原上的識別表位是在包含p185胞外第I亞區(qū)的大部分和第II亞區(qū)的一部分，這與目前國際上僅有的兩個已經(jīng)解析出復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的類似抗體赫賽汀(4D5)和2C4的識別表位都不相同；研究還表明，嵌和抗體chA21對腫瘤細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化的影響，與4D5和2C4有-充的差異(WangJ.，ShiY.，LiuY.,HuS.，MaJ,LiuJ.,ChenL.(2005)Purificationandcharacterizationofasingle-chainchimericanti-pl85antibodyexpressedbyCHO-GSsystem.ProteinExpres.Purif.41:68-76.)。這表明，chA21識別的表位可能是一個新的抗pl85/HER2抗體藥物的靶點(diǎn)，chA21可能在腫瘤治療方面發(fā)揮獨(dú)特的作用。本發(fā)明是又一個新的抗ErbB2抗體chA21的抗腫瘤作用的表位的晶體結(jié)構(gòu)及表位研究結(jié)果。圖1為SDS-PAGE檢測GST-EPI蛋白的表達(dá)純化情況圖2為SDS-PAGE檢測GST-EPI的酶切情況圖3為SDS-PAGE檢測chA21的酶切情況圖4為SuperdexG75分子篩分離EPI/scFv復(fù)合物和多余的scFv圖5為陰離子交換柱純化EPI/scFv復(fù)合物圖6為SDS-PAGE檢測蛋白復(fù)合物的濃度和純度圖7為EPI/scFv復(fù)合物蛋白樣品的制備流程8為EPI/scFv復(fù)合物晶體的制備流程圖圖9為EPI/scFv復(fù)合物晶體衍射數(shù)據(jù)采集流程圖圖10為EPI/scFv復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)解析流程圖圖11為EPI/scFv復(fù)合物晶體的X射線衍射圖圖12為一個不對稱單位中的兩個chA21抗體scFv片段和兩個ErbB2胞外區(qū)EPI片段圖13為一個不對稱單位中的兩個二聚體復(fù)合物具有一致的相互作用模式圖14為scFv與EPI相互作用的界面整體圖圖15為胞外區(qū)EPI片段a段Asnl02和Asnl03殘基與chA21抗體scFv片段L3、H2和H3CDRloops的氫鍵作用圖16為胞外區(qū)EPI片段b段Asnl36、Tyrl41和Aspl43殘基與chA21抗體scFv片段Ll、H2和H3CDRlo叩s的氫鍵作用圖17為胞外區(qū)EPI片段c段Argl66和Cysl70殘基與chA21抗體scFv片段H2和H3CDRlo叩s的氫鍵作用圖18為胞外區(qū)EPI片段c段Hisl71、Prol72、Glu185殘基與chA21抗體scFv片段L3CDRloop的氫鍵作用圖19為scFv片段的整體結(jié)構(gòu)在結(jié)合EPI前后沒有大的改變圖20為scFv片段在結(jié)合EPI片段后，結(jié)合界面的一些殘基惻鏈發(fā)生了不同程度的構(gòu)象改變圖21為EPI在與scFv片段結(jié)合后，結(jié)合界面的若干殘基表現(xiàn)出顯著的結(jié)構(gòu)變化圖22為解析EPI與scFv片段結(jié)合的復(fù)合物中，loop(殘基LeulOl至Serlll)的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)的氫鍵作用圖23為模擬的一個chA21scFv片段結(jié)合到ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域二聚體中一個亞基的結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、高純度的EPI/scFv復(fù)合物蛋白樣品的制備EPI/scFv復(fù)合物蛋白樣品的具體制備流程如圖7所示。一、抗腫瘤表面抗原pl85/HER2膜蛋白的工程化嵌合抗體scFv-Fc的構(gòu)建和表達(dá)利用反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)分別擴(kuò)增得到由雜交瘤細(xì)胞株A21(專利ZL98116523.0，抗pl85ne^erbB4單克隆抗體雜交瘤其制備方法及腫瘤檢測用途)表達(dá)的抗pl85/HER2單抗的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因，將重鏈和輕鏈可變區(qū)基因通過連接基因(linker)連接起來，構(gòu)成鼠源單鏈抗體基因^Fv;將與人免疫球蛋白IgGl恒定區(qū)的Fc基因連接起來構(gòu)成人鼠嵌合基因wFv-Fc，將^Fv-Fc轉(zhuǎn)染到哺乳動物細(xì)胞CHO中表達(dá)，兩條相同的scFv-Fc肽鏈之間通過三對二硫鍵形成了同二聚體形式的嵌合抗體分子(scFv-Fc)2即chA2K具體方法參見LiangshenCheng.AipingLiu,JiahongYang,YanliuDong,LiangweiLi，JingWang,ChaochenWang,JingLiu.Construction,expressionandcharacterizationoftheengineeredantibodyagainsttumorsurfaceantigen,pl85c-erbB-2.CellResearch,2003(13):35-48.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué))；將重組細(xì)胞經(jīng)過加壓篩選得到穩(wěn)定、高表達(dá)scFv-Fc融合蛋白的細(xì)胞株F12和F6，收集F12的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用ProteinA柱通過三步層析從中分離得到分子量為105KD的(scFv-Fc)2二價嵌合抗體蛋白chA21，它具有與親代單抗A21完全相同的結(jié)合特性(WangJ"ShiY.,LiuY"HuS"MaJ，LiuJ"ChenL.(2005)Purificationandcharacterizationofasingle-chainchimericanti陽pl85antibodyexpressedbyCHO-GSsystem.ProteinExpres.Purif.41:68-76.)。采用MTT比色法，將處于對數(shù)生長期的高表達(dá)pl85/HER2的人卵巢癌細(xì)胞SK0V3以含10^體積百分含量NBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋成5Xl()7個/L，接種于96孔板中，每孔100L，待細(xì)胞完全貼壁(12h)后分為5個亞組分別加入終濃度為0.67、0.2、0.6、1.8和5.4mg/L的采用上述方法制備的chA21100"L，對照組加入等體積的DMEM培養(yǎng)液。每組均設(shè)3個復(fù)孔。分別于培養(yǎng)24、48、72和96h后，每孔加入5g/L的MTT液20uL，繼續(xù)培養(yǎng)4h。小心吸棄各孔上清并加入150uLDMS0，充分振蕩混勻，用酶標(biāo)儀于波長570nm測定吸光度C4)值。結(jié)果表明，加入chA2196h后，各組細(xì)胞增殖的抑制率依次為5.85%、10.92%、16.55%、23.87%及35.33%(r=0.907，尸<0.01);1.8mg/L及5.4mg/L的chA21作用24h，對SK0V3細(xì)胞的增殖有顯著的抑制作用，隨著作用時間的延長，抑制作用增強(qiáng)(r=0.954，尸<0.01)(薛花，吳強(qiáng)，胡向陽，凌曉光，程聯(lián)勝,劉兢劉愛萍;HER-2嵌合抗體chA21對SK0V3細(xì)胞增殖的抑制及誘導(dǎo)其凋亡的作用。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2006年22巻1期)。二、腫瘤表面抗原pl85/HER2胞外區(qū)I、II亞區(qū)基因在GST克隆載體中的表達(dá)采用PCR方法擴(kuò)增得到p185胞外I-II區(qū)基因S22-J2W(簡稱GST-EPI)(李良維，劉兢，程聯(lián)勝。富含二硫鍵的膜蛋白pl85胞外區(qū)的可溶性表達(dá)和性質(zhì)鑒定。生物工程學(xué)報，2005.9,(21):590-596.)，將上述擴(kuò)增得到的GST-EPI用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切后連接到經(jīng)同樣酶切的pGEX-4T-l載體(購自Amersham公司)上，再將該重組載體轉(zhuǎn)染到OrigamiB感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)篩選鑒定，最終得到表達(dá)可溶的、有活性的pl85抗原I-II區(qū)片段的重組菌株，將該重組菌命名為OrigamiB'。將重組菌OrigamiB紫種到含有100ug/mL氨芐青霉素、100ug/mL卡那霉素和100ug/mL四環(huán)素的LB培養(yǎng)基中，37。C搖床培養(yǎng)至菌液OD值達(dá)到0.6左右；在9L培養(yǎng)基中加入lmL100mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，16°C220rpm搖床培養(yǎng)20—24h;離心收集菌體，用70mLPBS重懸菌體，超聲波破碎，再次離心收集裂解液上清；GST柱進(jìn)行純化，具體的洗脫步驟如下上清液通過已用IO個柱體積PBS(pH7.2-7.4)平衡過的Glutathione-agarose親和柱，再用50個柱體積的平衡液(含1%體積百分含量TritonX-100)清洗柱子，洗掉雜蛋白；然后用PBS洗掉TritonX-100;最后用洗脫液(含pH9.5、終濃度為50mMTris-HCl和終濃度為10mM還原型谷胱甘肽)洗脫目的蛋白并收集。10XSDS-PAGE檢測GST-EPI蛋白的表達(dá)與純化情況，結(jié)果如圖1所示。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，1為PBST洗柱流出液，2為PBS洗柱流出液，3為洗脫流出液。結(jié)果表明，得到了45KD左右的GST-EPI蛋白。三、EPl/scFv復(fù)合物蛋白樣品的制備將上述步驟一表達(dá)并純化的嵌合抗體分子chA21用木瓜蛋白酶酶切后，通過ProteinA柱層析分離純化獲得scFv片段;將上述步驟二表達(dá)并純化的GST—EPI用凝血酶(購自Novagen公司)酶切后用GST柱層析除去酶切掉的GST片段，得到EPI，EPI的氨基酸殘基序列如序列表中序列1所示。SDS-PAGE檢測GST-EPI的酶切情況如圖2所示，SDS-PAGE檢測chA21的酶切情況如圖3所示。從圖2可以看出，GST一EPI經(jīng)凝血酶(購自Novagen公司)完全酶切后得到了GST禾BEPI，從圖3可以看出，chA21經(jīng)木瓜蛋白酶完全酶切后得到了Fc片段和scFv。將純化的EPI與scFv按照摩爾比為1:11.2的比例混合，4。C反應(yīng)過夜，15000rpm離心去除沉淀，獲得含有EPI/scFv復(fù)合物蛋白的溶液。將上述含有EPI/scFv復(fù)合物蛋白的溶液通過SuperdexG75分子篩收集第一峰，將溶液中的EPI/scFv復(fù)合物和多余的scFv分離，結(jié)果如圖4所示，從圖4可以看出，EPI/scFv復(fù)合物溶液經(jīng)SuperdexG75分子篩純化得到兩個峰，其中峰l是EPl/scFv復(fù)合物，峰2是多余的scFv。再將經(jīng)SuperdexG75分子篩純化后的溶液用陰離子交換柱層析，得到高純度的EPI/scFv復(fù)合物蛋白，結(jié)果如圖5所示。從圖5可以看出，經(jīng)分子篩收集的峰1再經(jīng)過陰離子交換柱純化后僅有一個單一的蛋白峰。BCA法檢測上述經(jīng)陰離子交換柱純化后的蛋白復(fù)合物的濃度，10%SDS-PAGE檢測蛋白復(fù)合物的濃度和純度，結(jié)果如圖6所示。其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，l為經(jīng)SuperdexG75分子篩和陰離子交換柱純化后，復(fù)合物蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果，2為經(jīng)SuperdexG75分子篩純化后，復(fù)合物蛋白的SDS-PAGE檢測結(jié)果，3為上述scFv片段的SDS-PAGE檢測結(jié)果。結(jié)果表明，經(jīng)Superdex(375分子篩和陰離子交換柱純化后，EPI/scFv復(fù)合物中雜蛋白的相對含量有所降低，蛋白的純度達(dá)到晶體生長的要求；再經(jīng)過離心濃縮，EPl/scFv復(fù)合物蛋白的濃度為22mg/ml，達(dá)到了晶體生長的濃度要求。實(shí)施例2、EPl/scFv復(fù)合物晶體的生長生長復(fù)合物晶體時，首先要制備好適合晶體生長的蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品。生長晶體的過程包括晶體生長起始條件的篩選、晶體的優(yōu)化和晶體質(zhì)量的鑒定。EPI/scFv復(fù)合物晶體的具體生長流程如圖8所示。EPI/scFv復(fù)合物晶體的數(shù)據(jù)收集與數(shù)據(jù)處理流程如圖9所示。冷凍條件下收集晶體數(shù)據(jù)較常溫條件下收集的數(shù)據(jù)一般情況下具有很多優(yōu)勢，是現(xiàn)在首選的方法。此步驟的難點(diǎn)在于尋找適合晶體及其生長條件的冷凍保護(hù)液配方。在收集完整的數(shù)據(jù)之前，要對初步的X射線衍射畫面進(jìn)行分析，獲得空間群、晶胞參數(shù)、晶體鑲嵌度等初步參數(shù)，設(shè)計數(shù)據(jù)收集方案。采集完整的數(shù)據(jù)后，通過數(shù)據(jù)處理，獲得最后的數(shù)據(jù)文件，用于后續(xù)結(jié)構(gòu)解析。EPI/scFv復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)解析流程如圖10所示。解析晶體結(jié)構(gòu)是后續(xù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析獲得有用信息的基礎(chǔ)。結(jié)構(gòu)解析分為兩部，首先要解析相位問題，本實(shí)施例中，運(yùn)用分子置換法解析相位；其次，要根據(jù)解析的起始相位，精細(xì)修正結(jié)構(gòu)，獲得最終的優(yōu)質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。一、EPl/scFv復(fù)合物晶體起始生長條件的篩選1、將上述實(shí)施例1制備的EPI/scFv蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品用0"C預(yù)冷的蛋白儲存緩沖液(2mMTrispH8.0，20mMNaCl)分別稀釋成5mg/ml和10mg/ml。2、將上述步驟1稀釋好的EPI/scFv蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品15000xg4。C離心10分鐘，吸取上清。3、在標(biāo)準(zhǔn)的坐滴氣相擴(kuò)散法48孔晶體生長板的結(jié)晶緩沖液(又稱母液)池中分別加入100^1各種結(jié)晶緩沖液。4、吸取lpl上述步驟2離心處理好的上清液，滴加到上述步驟3的48孔晶體生長板的晶體生長平臺上，并移取各對應(yīng)孔的結(jié)晶緩沖液池中的結(jié)晶緩沖液lpl與晶體生長平臺上的蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品混合成一個液滴。在晶體板上貼上透明膠帶將各孔密封成獨(dú)立的小腔。5、使用多塊48孔晶體生長板和各種結(jié)晶緩沖液，重復(fù)上述步驟3和步驟4。6、將各塊完成晶體生長操作的48孔晶體生長板分別置于4"和22匸存放，靜待蛋白質(zhì)復(fù)合物和結(jié)晶緩沖液的混合液滴與結(jié)晶緩沖液池中的結(jié)晶緩沖液通過氣相擴(kuò)散達(dá)到平衡。7、上述步驟6的晶體生長板靜置平衡48小時后，取出各晶體生長板，置于光學(xué)顯微鏡下觀察各孔的晶體生長平臺上蛋白質(zhì)復(fù)合物和結(jié)晶緩沖液的混合液滴中晶體的生長狀況，詳細(xì)記錄各個液滴的狀況，如液滴澄清、有輕微沉淀、有嚴(yán)重沉淀、分相、有微小晶體、有針狀晶體、有片狀晶體、有塊狀單晶等等。8、在晶體生長板靜置平衡的一段時期內(nèi)，每間隔48小時，按照上述步驟7的方法，重復(fù)觀察晶體的生長狀況。9、IO天后，發(fā)現(xiàn)若干孔有不同質(zhì)量的晶體出現(xiàn)，分析記錄的各孔蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體的生長情況，挑選出晶體生長狀況較好的孔，挑選時優(yōu)先級順序?yàn)閴K狀單晶優(yōu)于片狀晶體，片狀晶體優(yōu)于針狀晶體，針狀晶體優(yōu)于微小晶體。10、將上述步驟9挑選出的晶體生長狀況較好的孔的結(jié)晶緩沖液作為蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體生長的起始緩沖液，對應(yīng)的晶體生長溫度和蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品的濃度作為蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體生長的起始溫度和濃度條件。結(jié)果表明，篩選出適合EPl/scFv復(fù)合物晶體生長的起始條件。其中，適合晶體生長的結(jié)晶緩沖液如下緩沖液l:每升緩沖液1中含有200ml聚乙二醇4000，終濃度為0.2M的醋酸氨和終濃度為0.1MpH5.O的醋酸鈉，其余為水；緩沖液2:每升緩沖液2中含有200ml聚乙二醇4000，終濃度為0.15M的硫酸氨和終濃度為0.1MpH7.0的HEPES,其余為水；緩沖液3:每升緩沖液3中含有150ml聚乙二醇4000和終濃度為0.1MpH6.0的二甲羧酸鈉，其余為水。適合晶體生長的溫度為22°C，適合晶體生長的蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品的濃度為5—10mg/ml。二、EPI/scFv復(fù)合物晶體生長條件的優(yōu)化1、以上述步驟一篩選得到的適合復(fù)合物晶體生長的條件(溫度為22。C、蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品濃度為5mg/ml)作為起始條件，調(diào)整結(jié)晶緩沖液的組成，如調(diào)整沉淀劑的濃度和種類、緩沖液的pH值、鹽離子的濃度和種類、小分子添加劑的濃度和種類等等。將調(diào)整過的結(jié)晶緩沖液作為晶體生長優(yōu)化的結(jié)晶緩沖液，生長蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體。晶體生長的步驟如上述步驟一的1、2、3和4。如果調(diào)整過的結(jié)晶緩沖液的條件不足48個，則只生長相應(yīng)孔的晶體；如果超過48個，則重復(fù)步驟一的3和4，直至完成所有條件的晶體生長。2、調(diào)整蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品的濃度和晶體生長的溫度，重復(fù)上述步驟l。3、以上述步驟一篩選的其它條件為起始條件，重復(fù)上述步驟1和2。4、按照上述步驟一中7和8描述的方法，觀察晶體生長條件優(yōu)化的結(jié)果。如果觀察到一孔或若干孔有外表光滑無缺陷、尺寸較大(如長寬高三維均大于100pm)的高質(zhì)量單晶，則進(jìn)入步驟5;如果沒觀察到足夠好的復(fù)合物晶體，則以挑選出的最好的一個或者幾個條件作為下一輪晶體優(yōu)化的起始條件，重復(fù)步驟l、2、3和4。5、將獲得的高質(zhì)量單晶置于X射線單晶衍射儀上檢測，鑒定該蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體的衍射質(zhì)量(如單晶性、分辨率和晶體鑲嵌度等)。結(jié)果得到優(yōu)化后的EPI/scFv復(fù)合物晶體的生長條件。其中，適合晶體生長的結(jié)晶緩沖液的組成為每升晶體生長緩沖液中含有聚乙二醇4000150ml，終濃度為0.1M的3-(l-P比叮并)-l-丙醇磺酸和終濃度為0.1MpH6.5的二甲羧酸鈉，其余為水。適合晶體生長的溫度為22°C，適合晶體生長的蛋白質(zhì)復(fù)合物樣品的濃度為7mg/ml。三、EPl/scFv復(fù)合物晶體衍射質(zhì)量的鑒定1、按照上述步驟二篩選得到的結(jié)晶緩沖液的組成配制結(jié)晶緩沖液，在其中加入甘油，使甘油與緩沖液的體積比為1:5，將得到的混合液作為冷凍保護(hù)液。2、用刀片劃開選定孔的密封透明膠帶，將晶體板置于顯微鏡下。用生物大分子X射線單晶衍射儀配套的晶體樣品環(huán)，將蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體從液滴中挑出，然后置于冷凍保護(hù)液液滴中浸泡25秒中。用晶體樣品環(huán)將蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體從冷凍保護(hù)液中撈出后，迅速裝到晶體衍射儀上。蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體用IOOK的冷凍氮?dú)庋杆倮鋬觥?、將晶體調(diào)整到合適位置，打開X射線光閘，將晶體曝光一定時間(20秒到20分鐘不等)，收集衍射畫面。4、分析衍射畫面，判斷晶體衍射的質(zhì)量(單晶性、分辨率、晶體鑲嵌度和晶胞參數(shù)等)。5、將衍射質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體迅速置入液氮罐中儲存?zhèn)溆谩Ｋ?、EPI/scFv復(fù)合物晶體衍射數(shù)據(jù)收集與數(shù)據(jù)處理(一)復(fù)合物晶體X射線衍射數(shù)據(jù)的收集1、將上述步驟三中挑選出的衍射質(zhì)量最好的晶體重新安裝到北京同步輻射(BeijingSynchrotronDiffractionFacility)3WlA線站的生物大分子X射線單晶衍射儀上，并將晶體保溫在IOOK的冷凍氮?dú)饬髦小?、調(diào)整晶體位置至X射線光斑中心，并根據(jù)晶體大小調(diào)整X射線光斑大小(將衍射儀第一道閘口調(diào)整為0.4mmx0.4mm，第二道調(diào)整為0.3mmx0.3mm)。3、以小角回擺的數(shù)據(jù)收集方式，e角每轉(zhuǎn)i度采集一張衍射畫面，每張衍射畫面曝光30秒鐘，直到采集足夠數(shù)量的衍射畫面(本套數(shù)據(jù)共采集99張衍射畫面)。4、待全套畫面采集完成后，將蛋白質(zhì)晶體再重新置于液氮罐中儲存。(二)復(fù)合物晶體X射線衍射數(shù)據(jù)的處理1、運(yùn)用晶體衍射數(shù)據(jù)處理軟件對整套衍射畫面上的衍射點(diǎn)進(jìn)行指標(biāo)化處理，并確定蛋白質(zhì)復(fù)合物晶體所屬的空間群和晶胞參數(shù)。2、對各個衍射點(diǎn)的強(qiáng)度進(jìn)行積分。3、將分散到連續(xù)幾張畫面上的同一個點(diǎn)的強(qiáng)度合并在一起。4、將衍射數(shù)據(jù)收集中重復(fù)收到的衍射點(diǎn)的多個強(qiáng)度數(shù)值進(jìn)行歸一化處理，并根據(jù)晶體具有的對稱性，將對稱等效的各個衍射點(diǎn)歸一化處理。5、計算評價晶體衍射數(shù)據(jù)質(zhì)量的各項(xiàng)統(tǒng)計參數(shù)，并隨機(jī)挑選出5%的衍射點(diǎn)，這些點(diǎn)將不用作后續(xù)的結(jié)構(gòu)修正，而是用作評價結(jié)構(gòu)修正的可信度。結(jié)果表明，收集到一套分辨率為2.45埃的完整的衍射數(shù)據(jù)，為后續(xù)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析提供了基礎(chǔ)。衍射數(shù)據(jù)的收集和處理的各項(xiàng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表1所示。表1衍射數(shù)據(jù)的收集和處理的統(tǒng)計參數(shù)列表衍射分辨率(埃)30.0-2.45(2.58-2.45)X射線波長(埃)l細(xì)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>注括號內(nèi)標(biāo)注的是最高分辨率殼層的參數(shù)。數(shù)據(jù)合并的R因子4勺計算公式為數(shù)據(jù)合并的R因子二i:hi:kiihk-〈h沖2hSk〈ih、其中，ihk是第h個衍射點(diǎn)第k次重復(fù)收集時的衍射強(qiáng)度，〈Ih〉是第h個衍射點(diǎn)重復(fù)收集多次后的平均值。五、EPl/scFv復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)解析(一)解決起始相位問題1、選取ProteinDataBank數(shù)據(jù)庫中2GJJ的A鏈和2A91的A鏈的第1-193位氨基酸殘基作為模型。2、在上述EPI/scFv復(fù)合物晶體晶胞的一個不對稱單元中，運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)的分子置換方法尋找兩個chA21抗體的scFv片段分子和兩個人源ErbB2胞外區(qū)EPI片段抗原分子。(二)結(jié)構(gòu)的精細(xì)修正1、根據(jù)分子置換的解，生成起始的電子密度圖(2Fo-Fc和Fo-Fc)。2、在coot程序中，根據(jù)電子密度圖，將結(jié)構(gòu)中蛋白質(zhì)分子的各個氨基酸殘基修正到更合適的位置。3、手動修正完蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)構(gòu)后，使用refmac5程序，自動修正原子位置和溫度因子。4、根據(jù)修正后的結(jié)構(gòu)，重新生成電子密度圖。重復(fù)步驟2和3多個周期，直到最終獲得高質(zhì)量的結(jié)構(gòu)模型。(三)結(jié)構(gòu)模型的分析1、運(yùn)用晶體結(jié)構(gòu)圖形軟件繪制chA21抗體scFv片段與人源ErbB2胞外區(qū)EPI片段復(fù)合物晶體(即EPI/scFv復(fù)合物晶體)的晶體結(jié)構(gòu)圖。2、分析chA21抗體scFv片段與人源ErbB2胞外區(qū)EPI片段結(jié)合面的相互作用。3、將ProteinDataBank數(shù)據(jù)庫中報道的ErbB2胞外區(qū)EPI片段結(jié)構(gòu)(未結(jié)合抗體)、chA21抗體scFv片段結(jié)構(gòu)(未結(jié)合抗原)與上述EPl/scFv復(fù)合物晶體中的相應(yīng)片段疊合，比較抗原、抗體片段結(jié)合前后各自結(jié)構(gòu)的變化情況。4、將EPI/scFv復(fù)合物晶體中EPI片段疊合到整個的ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域(ProteinDdataBank編號2A91)上，觀察chA21抗體在整個ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域上的結(jié)合位置，并與其它報道的抗體(如Herceptin和pertuzumab)的結(jié)合位置進(jìn)行比較。通過上述實(shí)驗(yàn)得出以下實(shí)驗(yàn)結(jié)論結(jié)論1、解析了EPI/scFv復(fù)合物晶體的高質(zhì)量晶體結(jié)構(gòu)，各項(xiàng)統(tǒng)計數(shù)據(jù)如表2所示。表2EPI/scFv復(fù)合物晶體的結(jié)構(gòu)修正和模型質(zhì)量統(tǒng)計參數(shù)列表<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注括號內(nèi)標(biāo)注的是最高分辨率殼層的參數(shù)。'工作R因子二i:hl|F。bs(h)i-|Fcal(h)IIIF。bs(h)|，其中F。bs(h)和F^(h)分別表示h衍射點(diǎn)實(shí)驗(yàn)觀察到的和計算的結(jié)構(gòu)因子。2自由R因子的計算方法與工作R因子一致，但自由R因子是由隨機(jī)挑選出的5%的監(jiān)測用衍射點(diǎn)來計算。結(jié)論2、一個不對稱單位中包含兩個chA21抗體scFv片段和兩個ErbB2胞外區(qū)EPI片段，具體如圖12和圖13所示。圖12為一個不對稱單位中包含兩個ErbB2胞外區(qū)EPI片段(A鏈和B鏈)和兩個chA21抗體scFv片段(C鏈和D鏈)。其中，A鏈與C鏈相互作用，形成一個二聚體復(fù)合物，而與B鏈和D鏈不存在特異性的相互作用。同樣B鏈和D鏈相互作用，形成另外一個二聚體復(fù)合物。圖13為一個不對稱單位中的兩個二聚體復(fù)合物(A+C鏈與B+D鏈)具有一致的相互作用模式。將兩個二聚體的Cot原子疊合，最小均方差為0.702埃(405C(x個原子參與疊合)。其中灰色的為A+C鏈二聚體復(fù)合物，黑色的為B+D鏈二聚體復(fù)合物。圖13的上半部分為chA21抗體scFv片段，下半部分為EPI片段。由于AC二聚體與BD二聚體表現(xiàn)出的抗原-抗體結(jié)合模式一致，所以只分析A鏈與C鏈間的相互作用即可。結(jié)論3、A21與EPI的相互作用，具體作用情況如圖14-18所示。圖14為chA21抗體scFv片段與EPl片段的結(jié)合界面的整體示意圖。圖中，黑色繩分別為6個CDRloop，灰色繩為EPI片段上參與作用的3段不連續(xù)的序列，按從氨基端到羧基端的順序分別標(biāo)記為a、b和c。scFv與EPI片段的其余部分用連接各個殘基Ca原子的折線顯示。圖15為胞外區(qū)EPI片段a段Asnl02和Asnl03殘基與chA21抗體scFv片段L3、H2和H3CDRloops的氫鍵相互作用。圖片上部的灰色結(jié)構(gòu)為EPI片段，下部的黑色結(jié)構(gòu)為scFv片段。兩個蛋白質(zhì)中參與形成氫鍵的殘基用球棍模型顯示，其中灰色示C原子(scFv的Ca原子用黑色顯示)，深灰色示O、N原子。氫鍵用灰色虛線顯示。圖16為胞外區(qū)EPI片段b段Asnl36、Tyrl41和Aspl43殘基與chA21抗體scFv片段Ll、H2和H3CDRloops的氫鍵相互作用。圖片上部的灰色結(jié)構(gòu)為EPI片段，下部的黑色結(jié)構(gòu)為scFv片段。兩個蛋白質(zhì)中參與形成氫鍵的殘基用球棍模型顯示，其中灰色示C原子(scFv的Ca原子用黑色顯示)，深灰色示O、N原子。氫鍵用灰色虛線顯示。'圖17為胞外區(qū)EPI片段c段Argl66和Cysl70殘基與chA21抗體scFv片段H2和H3CDRloops的氫鍵相互作用。圖片上部的灰色結(jié)構(gòu)為EPI片段，下部的黑色結(jié)構(gòu)為scFv片段。兩個蛋白質(zhì)中參與形成氫鍵的殘基用球棍模型顯示，其中灰色示C原子(scFv的Ca原子用黑色顯示)，深灰色示O、N原子。氫鍵用灰色虛線顯示。圖18為胞外區(qū)EPI片段c段Hisl71、Prol72、Glu185殘基與chA21抗體scFv片段L3CDRloop的相互作用。圖片上部的灰色結(jié)構(gòu)為EPI片段，下部的黑色結(jié)構(gòu)為scFv片段。兩個蛋白質(zhì)中參與形成氫鍵的殘基用球棍,莫型顯示，其中灰色示C原子(scFv的Ca原子用黑色顯示)，深灰色示O、N原子。氫鍵用灰色虛線顯示。chA21抗體scFv片段與ErbB2胞外區(qū)EPI片段的氫鍵相互作用情況如表3所示，范德華相互作用如表4所示。表3scFv片段與EPI片段的氫鍵相互作用表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>括號中數(shù)值顯示該CDRloop或該殘基參與形成的范德華相互作用的數(shù)目。結(jié)論4、scFv片段的整體結(jié)構(gòu)在與EPI結(jié)合前后很相近，但與EPI結(jié)合后，結(jié)合面的若干殘基側(cè)鏈呈現(xiàn)出新的構(gòu)象。具體如圖19和圖20所示。圖19為scFv片段的整體結(jié)構(gòu)在結(jié)合前后沒有大的改變。結(jié)合前的抗體用淺灰色表示，結(jié)合EPI片段后的scFv片段用黑色表示。其中，未結(jié)合EPI的抗體結(jié)構(gòu)為2GJJ(ProteinDataBank編號)的A鏈。圖20為scFv片段在結(jié)合EPI片段后，結(jié)合界面的一些殘基側(cè)鏈發(fā)生了不同程度的構(gòu)象改變。其中，最為明顯的是scFv上Tyrl89側(cè)鏈的構(gòu)象變化。EPI片段用綠色表示，結(jié)合前的抗體C原子用淺灰色表示，結(jié)合EPI片段后的scFv片段C原子用黑色表示。其中，未結(jié)合EPI的抗體結(jié)構(gòu)為2GJJ(ProteinDataBank編號)的A鏈。結(jié)論5:EPI在與scFv片段結(jié)合后，結(jié)合界面的若干殘基表現(xiàn)出顯著的結(jié)構(gòu)變化，具體如圖21和圖22所示。圖21為EPI在與scFv片段結(jié)合后，結(jié)合界面的若干殘基表現(xiàn)出顯著的結(jié)構(gòu)變化。其中結(jié)構(gòu)變化最顯著的是虛線圈出的lo叩區(qū)(由LeulOl到Serlll共ll個氨基酸構(gòu)成)。圖21的復(fù)合物結(jié)構(gòu)為EPI的結(jié)構(gòu)(黑色)和兩個未結(jié)合抗原的EPI的代表性結(jié)構(gòu)(ProteinDataBank編號1N8Z為淺灰色，2A91為灰色)。圖22為解析EPI與scFv片段結(jié)合的復(fù)合物。第一次獲得了EPI該loop的完整的確定結(jié)構(gòu)，該loop的Asnl02和Asnl03與scFv片段間的相互作用，以及該段lo叩內(nèi)部殘基間和該loop與EPI分子內(nèi)部其它殘基間廣泛存在的氫鍵相互作用穩(wěn)定了該loop結(jié)構(gòu)。圖中EPI與scFv的主體均顯示為淺灰色的卡通結(jié)構(gòu)。EPI的loop(Leul01到Serlll),以及seFv、EPI中與該loop形成氫鍵的殘基顯示為棍棒模型，其C原子用淺灰色顯示，N、O原子用深灰色顯示)。穩(wěn)定該loop結(jié)構(gòu)的氫鍵用虛線標(biāo)出，其中scFv片段和EPl分子間氫鍵虛線為灰色，EPI分子內(nèi)氫鍵顯示為黑色。穩(wěn)定EPI的loop(Asnl02到Serlll)結(jié)構(gòu)的主要?dú)滏I如表5所示。表5穩(wěn)定EPI的loop結(jié)構(gòu)的主要?dú)滏I<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>結(jié)論6:chA21scFv片段的結(jié)合在ErbB2二聚化結(jié)合面的背面，不能直接干擾ErbB2的二聚化過程，說明A21抗體應(yīng)該存在一種新的機(jī)制來抑制ErbB2受體。具體如圖23所示。圖23為模擬的一個chA21scFv片段結(jié)合到ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域二聚體中一個亞基的結(jié)構(gòu)示意圖。模擬結(jié)果顯示，chA21scFv片段的結(jié)合在ErbB2二聚化結(jié)合面的背面，不能直接干擾ErbB2的二聚化過程。ErbB2胞外結(jié)構(gòu)域二聚體的兩個亞基分別用淺灰色和灰色的分子表面圖顯示，chA21scFv片段用黑色的卡通飄帶圖顯示。序列表<160>1<210>1<211>192<212>PRT<213〉人工序列<220><223><400〉1ThrGinValCysThrGlyThrAspMetLysLeuArgLeuProAlaSer151015ProGluThrHisLeuAspMetLeuArgHisLeuTyrGinGlyCysGin202530ValValGinGlyAsnLeuGluLeuThrTyrLeuProThrAsnAlaSer354045LeuSerPheLeuGinAspHeGinGluValGinGlyTyrValLeuHe505560AlaHisAsnGinValArgGinValProLeuGinArgLeuArglieVal65707580ArgGlyThrGinLeuPheGluAspAsnTyrAlaLeuAlaValLeuAsp859095AsnGlyAspProLeuAsnAsnThrThrProValThrGlyAlaSerPro100105110GlyGlyLeuArgGluLeuGinLeuArgSerLeuThrGlulieLeuLys115120125GlyGlyValLeulieGinArgAsnProGinLeuCysTyrGinAspThr130135140lieLeuTrpLysAspliePheHisLysAsnAsnGinLeuAlaLeuThr145150155160LeulieAspThrAsnArgSerArgAlaCysHisProCysSerProMet165170175CysLysGlySerArgCysTrpGlyGluSerSerGluAspCysGinSer180185190權(quán)利要求1、一種抗原和chA21抗體復(fù)合物晶體，由腫瘤表面抗原p185/HER2胞外區(qū)部分片段EPI和抗體chA21經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后得到的單鏈抗體scFv組成；所述EPI的氨基酸殘基序列如序列表中序列1所示。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原-抗體復(fù)合物晶體，其特征在于所述抗原-抗體復(fù)合物晶體的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)如下分辨率30.0-2.45埃；最高分辨率殼層的分辨率2.58-2.45埃；修正用衍射點(diǎn)數(shù)/監(jiān)測用衍射點(diǎn)數(shù)27646/1461;工作R因子/自由R因子20.1%/25.7%;最高分辨率殼層的工作R因子/自由R因子25.4%/34.9%;鍵長的最小均方差0.007埃；鍵角的最小均方差1.03度；總的平均溫度因子24.5平方埃；結(jié)構(gòu)中非氫原子的蛋白質(zhì)原子數(shù)6589;結(jié)構(gòu)中水分子數(shù)239;Ramachandran圖最合適區(qū)域89.4%;次合適區(qū)域9.7%;基本可接受區(qū)域0.9%;所述最合適區(qū)域、次合適區(qū)域和基本可接受區(qū)域均指蛋白質(zhì)主鏈各個氨基酸殘基的二面角在Ramachandran圖中的位置；所述工作R因子二i:hl|F。bs(h)|-|Fcal(h)II《hIF。bs(h)I，其中F。bs(h)和F』(h)分別表示h衍射點(diǎn)實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)構(gòu)因子和計算的結(jié)構(gòu)因子；所述自由R因子的計算方法與工作R因子一致，但自由R因子是由隨機(jī)挑選出的5%的監(jiān)測用衍射點(diǎn)來計算。3、一種制備權(quán)利要求l或2所述抗原-抗體復(fù)合物晶體的方法，是將腫瘤表面抗原pl85/HER2胞外區(qū)部分片段EPI和抗體chA21經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后的片段scFv按照l:(1-1.2)的摩爾比混合，得到抗原-抗體復(fù)合物蛋白；再將所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白和晶體生長緩沖液混合并置于22。C條件下，得到抗原-抗體復(fù)合物晶體；所述晶體生長緩沖液的組成為每升晶體生長緩沖液中含有聚乙二醇4000150ml，終濃度為0.1M的3-(l-吡叮并)-l-丙醇磺酸和終濃度為0.1MpH6.5的二甲羧酸鈉，其余為水。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白和所述晶體生長緩沖液混合后，所述抗原-抗體復(fù)合物蛋白的濃度為3.5mg/ml。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述方法還包括將得到的抗原-抗體復(fù)合物晶體加入到冷凍保護(hù)液中的步驟；所述冷凍保護(hù)液由甘油和所述晶體生長緩沖液組成，所述甘油和所述晶體生長緩沖液的體積比為1:5。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述抗原-抗體復(fù)合物晶體的晶體結(jié)構(gòu)參數(shù)如下分辨率30.0-2.45埃；最高分辨率殼層的分辨率2.58-2.45埃；修正用衍射點(diǎn)數(shù)/監(jiān)測用衍射點(diǎn)數(shù)27646/1461;工作R因子/自由R因子20.1%/25.7%;最高分辨率殼層的工作R因子/自由R因子25.4%/34.9%;鍵長的最小均方差0.007埃；鍵角的最小均方差1.03度；總的平均溫度因子24.5平方埃；結(jié)構(gòu)中非氫原子的蛋白質(zhì)原子數(shù)6589;結(jié)構(gòu)中水分子數(shù)239;Ramachandran圖最合適區(qū)域89.4%;次合適區(qū)域9.7%;基本可接受區(qū)域0.9%;所述最合適區(qū)域、次合適區(qū)域和基本可接受區(qū)域均指蛋白質(zhì)主鏈各個氨基酸殘基的二面角在Ramachandran圖中的位置；所述工作R因子二i:hl|F。bs(h)|-|Fcal(h)I|/Ih|F。bs(h)I，其中F。ah)和F^(h)分別表示h衍射點(diǎn)實(shí)驗(yàn)觀察到的結(jié)構(gòu)因子和計算的結(jié)構(gòu)因子；所述自由R因子的計算方法與工作R因子一致，但自由R因子是由隨機(jī)挑選出的5%的監(jiān)測用衍射點(diǎn)來計算。7、和chA21抗體結(jié)合的抗原表位，由如下氨基酸殘基組成序列1的自氨基末端第102位的Asn、第103位的Asn、第136位的Asn、第141位的Tyr、第143位的Asp、第166位的Arg、第170位的Cys、第171位的His、第172位的Pro和第185位的Glu。全文摘要本發(fā)明公開了一種抗原-抗體復(fù)合物晶體及其制備方法與抗原表位。本發(fā)明的抗原和chA21抗體復(fù)合物晶體，由腫瘤表面抗原p185/HER2胞外區(qū)部分片段EPI和抗體chA21經(jīng)木瓜蛋白酶酶切后得到的單鏈抗體scFv組成；所述EPI的氨基酸殘基序列如序列表中序列1所示。chA21識別的表位可能是一個新的抗p185/HER2抗體藥物的靶點(diǎn)，chA21可能在腫瘤治療方面發(fā)揮獨(dú)特的作用。本發(fā)明是又一個新的抗ErbB2抗體chA21的抗腫瘤作用的表位的晶體結(jié)構(gòu)及表位研究結(jié)果。文檔編號C07K19/00GK101418047SQ20081022745公開日2009年4月29日申請日期2008年11月25日優(yōu)先權(quán)日2008年11月25日發(fā)明者兢劉,洋劉,周暉皓,朱娟娟,滕脈坤,程聯(lián)勝,肖衛(wèi)華,魏海明申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)