專利名稱：鑒定樣品中的n－末端前bnp的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種方法，該方法用于通過至少兩種抗體來鑒定樣品中的N-末端前BNP(N-terminalem pro BNP)，這些抗體檢測N-末端前BNP的不同表位。該方法用于對健康個體和NYHA I至IV級患者的樣品進(jìn)行區(qū)分或歸類。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到重組N-末端前BNP，該N-末端前BNP作為標(biāo)準(zhǔn)在鑒定N-末端前BNP的方法中的應(yīng)用，用于檢測重組N-末端前BNP的抗體及它們的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
心力衰竭是一種廣泛的現(xiàn)象，特別是在西方世界中。根據(jù)羅氏(Roche)醫(yī)學(xué)字典(1993，Urban & Schwarzenberg)，心力衰竭是在進(jìn)行身體運(yùn)動或甚至在靜息時(shí)心臟產(chǎn)生代謝所需的血流的能力或確保靜脈回流的能力的急性或慢性衰退(退行性或進(jìn)行性衰竭)。因此，該心臟的泵血功能是脆弱的。心力衰竭的起因十分復(fù)雜。除其它原因之外，本文提及心肌的炎癥和衰退變性，冠狀動脈灌注失調(diào)(coronaryperfusion disorder)，冠狀動脈硬化和傷損。這導(dǎo)致了外周血流的改變，呼吸紊亂，腎功能紊亂和電解質(zhì)代謝失調(diào)(水腫)，并且導(dǎo)致骨骼肌系統(tǒng)性能降低。
根據(jù)紐約心臟聯(lián)合會(NYHA)，經(jīng)過在運(yùn)動后的身體測試，心力衰竭被分為以下的NYHA級別I指的是在正常身體運(yùn)動后完全無痛苦，II指的是體力活動輕度受限，III指的是體力活動明顯受限，IV指的是隨著每一次身體活動機(jī)能不足的癥狀均有所增加，該機(jī)能不足的癥狀在靜息時(shí)多數(shù)時(shí)間仍存在。
對于通過糖苷、血管擴(kuò)張劑、ACE抑制劑和/或β-阻斷劑進(jìn)行的對心力衰竭的有效醫(yī)療來說，心力衰竭的精確診斷和在可能的情況下根據(jù)嚴(yán)重程度進(jìn)行分類以及在治療期間進(jìn)行額外的監(jiān)測是最為必要的。
根據(jù)本領(lǐng)域的現(xiàn)狀，一些用于心力衰竭的血清標(biāo)記已經(jīng)過研討，例如ANP(N-末端心房利尿鈉肽激素)和前ANP，CNP(C-利尿鈉肽)，adrenomedulin，神經(jīng)肽Y，endotheline和BNP(腦利尿鈉肽)。ANP和前ANP一般適用于心力衰竭的診斷用標(biāo)記；但它們在血液中不穩(wěn)定或僅有短暫的半壽期，這對診斷測試是一個障礙(Clin.Sci.95(3)(1998)，235-239；Clenland et al.，Heart 75(1996)，410-413)。
BNP是一種經(jīng)常被引用并很有意義的標(biāo)記(腦利尿鈉肽)。BNP最初在豬腦中被鑒定。它是一種心臟激素，在結(jié)構(gòu)和功能上類似于ANP(心鈉素)(Sudoh et al.，Nature 332(1988)，78-81)。人類BNP由32個氨基酸組成，它主要由心室分泌并在人類血漿中進(jìn)行循環(huán)。已知的BNP作為診斷標(biāo)記的應(yīng)用的例子來自EP-A-0 542 255。BNP具有分子內(nèi)的二硫鍵并且作為一種分析物不很穩(wěn)定，這據(jù)估計(jì)是由于BNP作為激素發(fā)揮生理功能，因而必須被迅速分解的原因。。因此，它作為一種診斷標(biāo)記的應(yīng)用僅僅是有限的(Masuta et al.，Clin.Chem.Vol.44 No.6 Supplement A(1998)，130；Tsuji et al.，Clin.Chem.40(1994)，672)。
BNP的前體分子，即前BNP，由108個氨基酸組成，該前體分子中的上述32個C-末端氨基酸被稱為BNP，它產(chǎn)生實(shí)際的激素效應(yīng)。從該前體中釋放的N-末端氨基酸1-76被稱為N-末端前BNP。除BNP(77-108)外N-末端前BNP以及進(jìn)一步裂解的產(chǎn)物(1-76)也在血漿中進(jìn)行循環(huán)(Hunt et al.，Biochem.Biophys.Res.Com.214(1995)，1175-1183)，這樣N-末端前BNP作為心力衰竭的標(biāo)記也是相關(guān)的。是否該前體分子前BNP也在血漿中存在尚未完全明確。然而據(jù)描述(Hunt et al.，Peptides，Vol.18，No.10(1997)，1475-1481)在血漿中可以檢測到較低量的前BNP(1-108)的釋放，但由于N-末端的迅速部分降解，所以缺少一些氨基酸。在該文獻(xiàn)中該分子被稱為高分子量BNP。
WO 93/24531(US 5,786,163)描述了一種鑒定N-末端前BNP的免疫學(xué)方法及該方法所使用的抗體。為獲得這些抗體，本文使用了合成產(chǎn)生的單一一種肽，該肽來自N-末端前BNP的序列。通過肽免疫來進(jìn)行的抗體生產(chǎn)在原則上是可行的，但對完整分子的親和性通常很低而達(dá)不到測試過程所必需的靈敏度。另外，當(dāng)使用該肽時(shí)還有這樣的危險(xiǎn)，所獲得的抗體可以識別該肽的C-末端并且因此只能結(jié)合完整分子的這一片段。根據(jù)這一結(jié)果，這些抗體不能結(jié)合完整的分子或僅在較低的程度上結(jié)合。在WO 93/24531中產(chǎn)生了抗單一一種肽的多克隆抗體，該肽來自N-末端前BNP。據(jù)顯示，所產(chǎn)生的抗體以競爭測試模式同該免疫肽(氨基酸47-64)結(jié)合。然而沒有顯示該抗體可以結(jié)合樣品中作為完整分子的天然N-末端前BNP。另外，在WO 93/24531中所描述的樣品中的三明治測試無法如其所述進(jìn)行，這是因?yàn)闆]有適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)材料以及沒有抗兩種不同表位的抗體。
本領(lǐng)域中的一個更進(jìn)一步的問題是測試的靈敏度。在WO 93/24531中進(jìn)行的競爭性測試中，在標(biāo)記狀態(tài)的肽47-64作為追蹤物同樣品或未標(biāo)記肽標(biāo)準(zhǔn)47-64競爭結(jié)合來自兔血清的多克隆抗體的情況下，溫育48小時(shí)后僅達(dá)到非常溫和的競爭，從該競爭僅僅能產(chǎn)生約250fmol/ml的檢測低限。這無論對于區(qū)分健康個體和患有心力衰竭的患者還是根據(jù)心力衰竭的嚴(yán)重程度對患者樣本進(jìn)行分級都是不夠的。另外，競爭性測試的長溫育時(shí)間也是為自動化實(shí)驗(yàn)室的樣品常規(guī)測試所不能接受的。
Hunt等人(Clinical Endocrinology 47(1997)，287-296)還描述了一種用于N-末端前BNP檢測的競爭性測試。對于該測試，在測試進(jìn)行前必須對血漿樣品進(jìn)行復(fù)雜的抽提；這可能導(dǎo)致被測試物的破壞和測量誤差。所使用的抗血清類似于WO 93/24531通過以合成肽進(jìn)行免疫來產(chǎn)生。Hunt等人通過以N-末端前BNP氨基酸1-13進(jìn)行免疫產(chǎn)生抗血清，并且氨基酸1-21的肽被用作標(biāo)準(zhǔn)。長溫育時(shí)間也是該測試所必需的。溫育24小時(shí)后達(dá)到1.3fmol/ml的檢測低限。
因此，本領(lǐng)域中沒有檢測N-末端前BNP的方法能在短溫育期間對天然N-末端前BNP進(jìn)行可靠靈敏的檢測。
因此，提供一種在樣品中鑒定N-末端前BNP的方法是一個目標(biāo)，該方法盡可能避免上述的本領(lǐng)域的缺點(diǎn)。特別應(yīng)當(dāng)達(dá)到一個高測試靈敏度以對健康個體和NYHAI至IV級患者的樣品進(jìn)行區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
通過一種在樣品中鑒定N-末端前BNP的方法該目標(biāo)已經(jīng)達(dá)到，該方法在權(quán)利要求中被更詳盡地解釋。該方法的特征在于其利用識別N-末端前BNP的不同表位并能同時(shí)與N-末端前BNP結(jié)合的至少兩種抗體，通過三明治方式進(jìn)行，其中對N-末端前BNP的檢測低限低于每ml所述樣品1fmol。
在本發(fā)明的方法中，天然的N-末端前BNP在樣品中被檢測十分重要。這意味著該抗體必須能夠鑒定并且特異性地結(jié)合樣品中的完整的分子和可能產(chǎn)生的未切割前BNP(1-108)，如果可能還結(jié)合樣品中的蛋白部分消化片段。對于該方法，至少兩種不同的抗體被使用，這些抗體結(jié)合該N-末端前BNP的不同表位。該表位可以是線性的或所謂的構(gòu)象表位。在優(yōu)選的情況下這些表位的定位方式允許這兩種抗體同時(shí)結(jié)合并且相去不遠(yuǎn)。
由于本發(fā)明的方法不能區(qū)分N-末端前BNP，前BNP和親本(naheverwandten)肽(裂解產(chǎn)物)，NT-前BNP指的是以下所有在測試過程中被鑒定的肽，特別是已知的N-末端前BNP(1-76)。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“表位”指的是在一個免疫結(jié)合配體，如抗原上的結(jié)合位點(diǎn)，一種抗體對其特異性地結(jié)合。通常一種表位被6-8個氨基酸清晰地定義。根據(jù)本發(fā)明，該結(jié)合配體對應(yīng)于N-末端前BNP或其部分序列?？贵w結(jié)合在表位上，表位構(gòu)成了結(jié)合配體的部分區(qū)域，該表位可以是線性形式或構(gòu)象表位。
通過具有不同的特異性的兩種抗體的方法，對被分析物進(jìn)行一種較快速的鑒定方法是可行的，該方法無需目前本領(lǐng)域的長時(shí)間競爭性測試過程。本發(fā)明的檢測方法可通過均相或多相的測試過程的手段進(jìn)行。在優(yōu)選的情況下使用了多相的測試過程，在特別優(yōu)選的情況下使用了專家所知的三明治過程。
在優(yōu)選的情況下，這樣的確定N-末端前BNP的方法根據(jù)以下步驟進(jìn)行a)將樣品同N-末端前BNP特異性第一抗體相混合，該抗體攜帶有適于同固相結(jié)合的基團(tuán)，通過該基團(tuán)，可以結(jié)合在固相上，或者將樣品同N-末端前BNP特異性第一抗體混合，該抗體已經(jīng)結(jié)合于一種固相b)將該溶液同第二種抗體相混合，該抗體識別NT-前BNP的一種表位并攜帶一種標(biāo)記，該表位不同于第一種抗體所識別的表位c)使該免疫混合物同一種固相相結(jié)合，該固相可以在步驟a)中便已存在
d)將固相同液相分離e)在一種或兩種相內(nèi)檢測標(biāo)記。
在一種定量檢測中，以一定量的N-末端前BNP作為標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行了相同的測量，并且在確定樣品后進(jìn)行了步驟e)，即，將標(biāo)準(zhǔn)物測量值同樣品測量值相比較，隨后進(jìn)行定量化。
術(shù)語“抗體”意指——根據(jù)本發(fā)明——單克隆或多克隆，嵌合或人源化或其它可通過遺傳工程修飾獲得的抗體以及為專家所知的所有片段，例如，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)ab′或Fab片段。只是必須保證對N-末端前BNP有免疫特異結(jié)合能力。
對N-末端前BNP特異的第一抗體可以直接結(jié)合于固相或通過一種特異的結(jié)合系統(tǒng)結(jié)合于固相。該抗體同固相的直接結(jié)合根據(jù)專家所知的方法進(jìn)行，例如通過吸附。如果該結(jié)合為通過一種特異的結(jié)合系統(tǒng)的間接結(jié)合，該第一種抗體為一種偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物由N-末端前BNP的抗體和一種特異性結(jié)合系統(tǒng)的配偶體組成。一種特異性結(jié)合系統(tǒng)在此處指的是兩種可以互相特異性反應(yīng)的配體。該結(jié)合能力可以基于一種免疫反應(yīng)或一種不同的特異反應(yīng)。在優(yōu)選的情況下，生物素和親合素或生物素與鏈親合素的組合被用作特異性結(jié)合系統(tǒng)。進(jìn)一步優(yōu)選的組合為生物素和抗生物素，半抗原和抗半抗原，一種Fc-片段和抗該Fc片段的抗體，或者糖類與外源凝集素。該特異性結(jié)合系統(tǒng)的反應(yīng)配偶體的一種為該偶聯(lián)物的一部分。
在該特異性結(jié)合系統(tǒng)的第一種結(jié)合配偶體的另一種反應(yīng)配偶體為固相的一層。鏈親合素或親合素被優(yōu)選使用。該特異性結(jié)合系統(tǒng)的另一種反應(yīng)配偶體同可溶載體材料的結(jié)合可以根據(jù)專家所知的通常方法來進(jìn)行。在此一種共價(jià)結(jié)合以及一種吸附結(jié)合是適合的。
試管或微滴度板適于作為固相，該微滴度板由聚苯乙烯或類似的合成材料制成，該固相在其內(nèi)表面覆蓋有該特異結(jié)合系統(tǒng)的一種反應(yīng)配偶體。適合并且特別優(yōu)選的進(jìn)一步物質(zhì)為顆粒材料，如乳膠顆粒，磁性顆粒，分子篩材料，玻璃珠，塑料管或其它。多孔層狀載體如紙或纖維素也可以被用作載體。覆蓋有上述特異性結(jié)合系統(tǒng)的相關(guān)結(jié)合配偶體的磁珠被特別地優(yōu)選使用。測試反應(yīng)完成之后，這些微?？梢詮囊合嘀斜环蛛x以用于檢測反應(yīng)過程，分離手段如過濾，離心或在使用磁珠的情況下通過一磁體。
第二種特異性抗體識別N-末端前BNP的一個表型，與第一種抗體所識別表型的相比該表型與之不同。這兩個表型在分子上的距離必須足夠遠(yuǎn)以使N-末端前BNP的兩種抗體可以無保留地同時(shí)結(jié)合；否則不能形成三明治復(fù)合物。
在N-末端前BNP抗體同N-末端前BNP之間的特異結(jié)合反應(yīng)的檢測可以通過不同的方法進(jìn)行。在通常情況下，第二種抗體被標(biāo)記。通常的標(biāo)記為生色原，熒光基團(tuán)，適于化學(xué)或電化學(xué)發(fā)光的物質(zhì)，放射性同位素，半抗原，酶標(biāo)記或能夠形成特異結(jié)合組合的物質(zhì)如生物素/鏈親合素。該免疫復(fù)合物隨即通過該標(biāo)記所發(fā)射的信號來檢測。例如，該第二種抗體可被半抗原洋地黃毒苷所標(biāo)記。該半抗原再同一個洋地黃毒苷特異性抗體相結(jié)合。該洋地黃毒苷特異性抗體本身被一種酶所標(biāo)記，例如過氧化物酶。隨后通過加入該過氧化物酶的一種特異性底物所產(chǎn)生的顏色或消光來進(jìn)行最后的檢測。
專家已知的所有生物液體可以被用作用于鑒定N-末端前BNP的方法過程的樣品。優(yōu)選的樣品為體液如全血，血清，血漿，尿或唾液。使用血清和血漿是特別優(yōu)選的。
除使用在液相中的測試試劑進(jìn)行的所謂的濕測試外，還可使用所有適于檢測抗原、半抗原、肽、蛋白、抗體等等的常見的干測試模式。如在EP-A-0 186 799中所描述，這些干測試或測試條將所有的測試組分合并入一個單一載體--待分析樣品除外。當(dāng)測試條與該液體樣品接觸時(shí)測試反應(yīng)開始。
本發(fā)明的方法的特征在于其對于N-末端前BNP的低檢測限制，該限制低于1fmol/ml(對應(yīng)于1pmol/l)。根據(jù)本發(fā)明的＜1fmol/ml的高靈敏度無需長的溫育期間便可達(dá)到。一次微滴度測試的總時(shí)間低于2小時(shí)，在優(yōu)選的情況下，以諸如電化學(xué)發(fā)光這樣的更靈敏的方法該時(shí)間約為15分鐘。對于該檢測方法，待測濃度所造成的的上限幾乎并不存在。該技術(shù)上限通常是所用的測量手段所造成的。該方法原則上還能檢測非常高濃度的N-末端前BNP。
本發(fā)明的方法的一個進(jìn)一步的優(yōu)點(diǎn)是通過所獲得的測量數(shù)值對患有和未患有心力衰竭的患者樣品的良好分辨力。該檢測手段十分靈敏以至于可以將沒有冠狀動脈疾病的個體同患有程度輕微的或僅僅處于慢性發(fā)病的NYHA I和II級心力衰竭患者進(jìn)行區(qū)分。初期心力衰竭的這樣的早期確定可以影響開始以藥物進(jìn)行一種早期治療的決定，并且因此較容易延長該患者的存活幾率。
本發(fā)明的另一個內(nèi)容是重組產(chǎn)生的N-末端前BNP。N-末端前BNP為N-末端部分，該部分由氨基酸1-76組成并從由108個氨基酸組成的前體分子N-末端前BNP中釋放。N-末端前BNP還包括其本身的一部分，該部分可能由于該分子的切斷反應(yīng)而在血液中出現(xiàn)。
迄今為止本領(lǐng)域沒有已知的重組N-末端前BNP，這是由于氨基酸序列較短導(dǎo)致其生產(chǎn)比較困難。就多于30個氨基酸的較大肽而言，其化學(xué)合成無法作為宿主有機(jī)體的重組生產(chǎn)的替代方法，這是由于所產(chǎn)生的錯誤序列和每個合成循環(huán)中強(qiáng)烈減少的產(chǎn)量的緣故。
然而，對于一種診斷檢測，一種標(biāo)準(zhǔn)物或參比材料經(jīng)常是必需的。如果需要定量化，必須使用一個標(biāo)準(zhǔn)物系列進(jìn)行一個確定的定量校準(zhǔn)。但是，只有在被用作標(biāo)準(zhǔn)物的材料在免疫測試中與該被分析物性能相同或相似的情況下，這樣的校準(zhǔn)才是有用的。該標(biāo)準(zhǔn)物與被分析物具有充分的結(jié)構(gòu)相似性以及特別具有免疫相似性是十分重要的，這樣可使標(biāo)準(zhǔn)物同檢測抗體的結(jié)合類似于樣品中天然分子與檢測抗體的結(jié)合。
用于檢測N-末端前BNP的方法的這種標(biāo)準(zhǔn)并不能由本領(lǐng)域來給出。被描述的只有短的合成肽。根據(jù)本發(fā)明，在遺傳合成的幫助下，現(xiàn)在首次可以產(chǎn)生編碼N-末端前BNP的DNA序列并且可以在E.coli中獲得該N-末端前BNP的重組表達(dá)。實(shí)施例1描述了實(shí)驗(yàn)過程。
因此，本發(fā)明的一個進(jìn)一步的內(nèi)容是重組N-末端前BNP在鑒定樣品中的N-末端前BNP的方法中作為標(biāo)準(zhǔn)物的使用，該檢測通過至少兩種識別N-末端前BNP的不同表位的抗體進(jìn)行。
出于免疫化的原因，本領(lǐng)域只使用了來自N-末端前BNP的合成短肽。肽免疫化的缺點(diǎn)是多數(shù)時(shí)間只能獲得非常低親和力的抗體或者所獲得的抗體只與線性表位反應(yīng)，該缺點(diǎn)還在于樣品中的天然折疊的抗原不能被發(fā)現(xiàn)見實(shí)施例3。
因此，免疫化以制備一種免疫原的抗體并使用之是十分重要的，這種免疫原與待測的分析物有足夠的一致性。只有這樣才能保證，抗體與樣品中的天然分析物有高度的親和力。
因此，本發(fā)明的一個內(nèi)容是重組N-末端前BNP在抗N-末端前BNP抗體的生產(chǎn)中作為免疫原的使用。
本發(fā)明的一個進(jìn)一步的內(nèi)容是抗N-末端前BNP的抗體。該術(shù)語抗體的定義對應(yīng)于關(guān)于測試過程的段落中所給出的定義。在優(yōu)選情況下，本發(fā)明的抗體特異地識別76氨基酸的大N-末端前BNP的N-末端部分，優(yōu)選情況下在氨基酸區(qū)域10-66，特別優(yōu)選的情況下在氨基酸區(qū)域10-50或10-38。當(dāng)甚至在樣品中末端經(jīng)蛋白酶消化的N-末端前BNP仍含有該表位時(shí)，該被抗體識別的表位的定位是有效的。這樣該被分析物的穩(wěn)定性就或多或少地成為次要的。在N-末端前BNP的優(yōu)選區(qū)域中的表位可以是線性形式或構(gòu)象表位。
因此，本發(fā)明的一個優(yōu)選的內(nèi)容為由細(xì)胞系MAK M10.1.1和MAK M13.4.14所產(chǎn)生的單克隆抗體，該細(xì)胞系由DSMZ于1999年1月26日收到并保存，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen，GmbH，Brunschweig，Germany。這兩個細(xì)胞系產(chǎn)生的抗體為IgG型抗體。細(xì)胞系M10.1.1和13.4.14也是本發(fā)明的一個內(nèi)容。
本發(fā)明的一個進(jìn)一步內(nèi)容為與細(xì)胞系M10.1.1和M13.4.14所產(chǎn)生的抗體等效的方式產(chǎn)生，并且適于同N-末端前BNP結(jié)合的抗體。措辭“以等效方式產(chǎn)生的抗體”的意思是該抗體通過以重組N-末端前BNP進(jìn)行免疫化來產(chǎn)生。
本發(fā)明的內(nèi)容還有用于產(chǎn)生特異結(jié)合N-末端前BNP的抗體的方法。
在優(yōu)選情況下，多克隆抗體的產(chǎn)生根據(jù)以下步驟進(jìn)行以重組產(chǎn)生的N-末端前BNP對一種適當(dāng)?shù)纳?，如綿羊進(jìn)行免疫，分離抗體，檢出最具反應(yīng)性的表位并且經(jīng)過適當(dāng)?shù)碾牡拿庖呶綄贵w進(jìn)行純化。該方法在實(shí)施例2中有描述。
在優(yōu)選情況下，單克隆抗體的產(chǎn)生根據(jù)以下步驟進(jìn)行以重組產(chǎn)生的N-末端前BNP對一種適當(dāng)?shù)纳?，如小鼠進(jìn)行免疫化，根據(jù)抗體對不同患者血清庫中的天然N-末端前BNP反應(yīng)性選擇克隆。該方法在實(shí)施例3中有描述。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明在下列實(shí)施例中有更詳細(xì)的描述實(shí)施例1
重組N-末端前BNP(1-76)的生產(chǎn)方法1.重組N-末端前BNP的克隆N-末端前BNP(氨基酸序列1-76)的核苷酸序列通過遺傳合成手段來產(chǎn)生。為獲得該基因在大腸桿菌中的最佳表達(dá)，該序列被適配以在大腸桿菌中最常用的密碼子。用于產(chǎn)生該基因的寡核苷酸序列如下
Pro5‘(SEQ ID NO 1)5‘CCGGATCCCACCCGCTG3‘Prolhum(SEQ ID NO 2)5‘CGGGATCCCACCCGCTGGGTTCCCCGGGTTCCGCTTCCGACCTGGAAACCTCCGGTCTGCAGGAACAGCGTAACCACCT3‘Pro2hum(SEQ ID NO 3).
5‘CGGTTCCAGGGAGGTCTGTTCAACCTGCAGTTCGGACAGTTTACCCTGCAGGTGGTTACGCTGTTCCTGC3‘Pro3hum(SEQ ID NO4).
5‘CAGACCTCCCTGGAACCGCTGCAGGAATCCCCGCGTCCGACCGGTGTTTGGAAATCCCGTGAAGTTGCTAC 3‘Pro4hum(SEQ ID NO 5)5‘CCCAAGCTTAACGCGGAGCACGCAGGGTGTACAGAACCATTTTACGGTGACCACGGATACCTTCGGTAGCAACTTCACGGGATTTCC3‘Pro3‘(SEQ ID NO 6)5‘CCCAAGCTTAACGCGGAGC3‘該基因的產(chǎn)生是通過以這些引物使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))來進(jìn)行的。被擴(kuò)增的基因被克隆入諸如pUC19這樣的適當(dāng)載體并隨后測序。為將該基因克隆入表達(dá)載體pQE8，該基因通過限制性酶切位點(diǎn)BamHI和HindIII從載體pUC19上被切下并且連接入載體pQE8并轉(zhuǎn)化入E.coli M15[pREP4]，該載體pQE8可以表達(dá)具有N-末端組氨酸標(biāo)記的蛋白。
2.N-末端前BNP在E.coli中的表達(dá)為進(jìn)行該基因在E.coli中的表達(dá)，將一個重組E.coli克隆的過夜培養(yǎng)物以1/60轉(zhuǎn)入Luria-Broth(含100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)并且在OD550為1時(shí)以IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷；終濃度1mM)進(jìn)行誘導(dǎo)。誘導(dǎo)后培養(yǎng)物在37℃下繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。隨后對該培養(yǎng)物進(jìn)行離心，收集細(xì)胞沉淀于pH8.0含300mMNaCl的50mM磷酸鈉緩沖液中。經(jīng)超聲裂解該細(xì)胞懸浮物后，將懸浮物進(jìn)行離心并將上清加入Ni-NTA(三乙酸次氮酯)柱。以含300mMNaCl和20mM咪唑的pH8.0 50mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行洗滌后，組氨酸標(biāo)記的N-末端前BNP以pH 8.0含300mMNaCl和300mM咪唑的50mM磷酸鈉緩沖液進(jìn)行洗脫。收集該洗脫流分并以50mM pH8.0的NaCl進(jìn)行透析。透析產(chǎn)物被加至Q-sepharose以分離雜質(zhì)。通過MALDI-TOF確定主要的純化N-末端前BNP。
實(shí)施例2抗N-末端前BNP的多克隆抗體的產(chǎn)生1.免疫化以完全弗氏佐劑中的重組N-末端前BNP(1-76)對綿羊進(jìn)行免疫化。該劑量為0.1mg每只動物。在10個月的期間內(nèi)以4周為間隔重復(fù)進(jìn)行免疫化。在第一次免疫化后6周開始，每一個月取一次血清并且測定其靈敏度和滴度。
2.多克隆抗體從綿羊血清中的純化從以N-末端前BNP免疫化的綿羊的粗制血清開始，脂成分通過以氣溶膠進(jìn)行的去脂過程而除去。隨后以硫酸銨(2M)分離免疫球蛋白。以pH7.0的15mM的KPO4，50mM NaCl對經(jīng)過溶解的沉淀進(jìn)行透析并經(jīng)DEAE sepharose層析。IgG流分，PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(DE)存在于洗脫組分中。
3.用于產(chǎn)生NT-前BNP特異性多克隆抗體的連續(xù)親和層析為純化針對氨基酸1-21，PAK<rec.NT-前BNP>M-IgG(IS，1-21)的NT-前BNP特異性多克隆抗體而使用了C-末端生物素化的肽HPLGSPGSASDLETSGLQEQR-Bi(1-21-Bi，序列號NO 7)。親和基質(zhì)通過向10ml鏈親和素覆層的丙烯酸脂聚合物顆粒加入1mg肽(1-21-Bi)而產(chǎn)生。
以10ml親和基質(zhì)填裝成一根柱子，以50mMKPO4，150mMNaCl，pH7.5(PBS)進(jìn)行平衡。為進(jìn)行連續(xù)親和層析的第一步，將850mg PAK<NT-前-BNP>S-IgG(DE)與柱結(jié)合。保留該洗脫物以用于第二步(見后)。以PBS和20mMKPO4，500mMNaCl，0.1％Triton X-100，0.5％脫氧膽酸鈉，pH7.5對柱進(jìn)行洗滌。與該親和基質(zhì)特異結(jié)合的IgG被ImmunoPureGentle Ag/Ab洗脫緩沖液(Pierce產(chǎn)品號21013)洗脫。以1M丙酸再生該柱并在PBS/NaN3中保存。
通過與上述相同的途徑，肽Bi-ELQVEQTSL(Bi-30-38序列號8)被用于產(chǎn)生一種親和基質(zhì)以用于純化抗氨基酸30-38的NT-前BNP特異免疫球蛋白。從第一次親和純化的洗脫液中收集PAK<rec.NT-前-BNP>M-IgG(IS，30-38)。
4.PAK<NT-前BNP>S-IgG(IS，1-21)的生物素化以生物素化緩沖液(100mM KPO4，70mM NaCl pH8.0)對親和純化的抗體進(jìn)行透析并且隨后該溶液被調(diào)至蛋白濃度1mg/ml。將溶于DMSO的D-生物素基-氨基己酸-N-羥基丁二酰亞胺酯以摩爾比為1∶7.5加至抗體溶液中。通過加入L-細(xì)胞溶素終止該反應(yīng)，通過透析除去多余的標(biāo)記試劑。
5.PAK<NT-前BNP>S-IgG(IS，30-38)的洋地黃毒苷化以洋地黃毒苷緩沖液(100mM KPO4，70mM NaCl pH7.6)對親和純化的抗體進(jìn)行透析，隨后該溶液被調(diào)至蛋白濃度1mg/ml。將溶于DMSO的洋地黃毒苷-3-CME-N-羥基丁二酰亞胺酯以摩爾比為1∶5加至抗體溶液中。通過加入L-細(xì)胞溶素終止該反應(yīng)，通過透析除去多余的標(biāo)記試劑。
實(shí)施例3抗N-末端前BNP(1-76)的單克隆抗體的產(chǎn)生和檢測1. 獲得抗NT-前BNP(1-76)的單克隆抗體以100μg重組N-末端前BNP抗原同弗氏佐劑對8-12周大的Balb/c小鼠給藥以進(jìn)行腹膜內(nèi)免疫化。6周后，以4周為間隔進(jìn)行3次進(jìn)一步的免疫化。最后一次免疫化后一周取血并測定測試動物的血清中的抗體滴度。從陽性反應(yīng)小鼠的脾臟中獲得B-淋巴細(xì)胞并將其同永生的骨髓瘤進(jìn)行融合。該融合根據(jù)Khler和Millstein(Nature 256，1975，p.495-497)的已知方法進(jìn)行。此處構(gòu)建的雜交細(xì)胞原代培養(yǎng)物通過常用途徑進(jìn)行克隆，例如，通過使用可購得的細(xì)胞分選儀或通過“限制性稀釋”。只有這些克隆，在適當(dāng)?shù)臏y試過程中，如酶免分析(ELISA-方法)同重組N-末端前BNP發(fā)生陽性反應(yīng)并且識別患者血清中的天然N-末端前BNP的克隆，接受加工(見第2點(diǎn))。通過這一途徑收集了產(chǎn)生本發(fā)明的單克隆抗體的幾個雜交瘤細(xì)胞系。
為產(chǎn)生腹水，5×106的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)腹膜內(nèi)注射入Bal/c小鼠，該小鼠在此之前已經(jīng)過Pristan處理1至2次。2-3周后在小鼠的腹部內(nèi)獲得腹水。該抗體從該腹水內(nèi)通過常用途徑分離。這些單克隆抗體特異地抗人類N-末端前BNP。此后它們被稱為MAK M10.1.11或MAKM13.4.14。這些抗體均屬于IgG1，κ亞類。
通過這一方法可以分離雜交瘤細(xì)胞系克隆M10.1.11和M13.4.14，它們?nèi)缟纤霰４嬗贒SMZ中。
2.抗前BNP肽和重組NT-前BNP的抗體的檢測測試為在被免疫化的小鼠血清，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)物上清或腹水中鑒定抗NT-前BNP的抗體的存在及其特異性，該克隆根據(jù)下列測試原則進(jìn)行估測a) 對重組N-末端前BNP的反應(yīng)以2.5μg/ml作為抗原的重組NT-前BNP按100μl/孔在室溫下同微滴度板(Nunc，Maxisorb)攪拌結(jié)合1小時(shí)，該重組NT-前BNP處于加樣緩沖液中(Beohringer，0.2M碳酸鈉/重碳酸鈉，pH9.3-9.5，產(chǎn)品序列號No.726 559)。隨后的加樣在PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液，Oxid，Code-BR 14a)和1％Byco C中進(jìn)行30分鐘。隨后以洗滌緩沖液(0.9氯化鈉溶液，0.05％吐溫20)進(jìn)行洗滌?？贵w樣品的溫育以100μl/孔在室溫?cái)嚢柘逻M(jìn)行1小時(shí)。隨后以洗滌溶液進(jìn)行兩次進(jìn)一步的洗滌。隨后，以檢測抗體PAK<M-Fcy>S-Fab-過氧化物酶偶聯(lián)物(Boehringer Mannheim，產(chǎn)品序列號No.1500 686)100mU/ml，100μl/孔在室溫?cái)嚢柘逻M(jìn)行進(jìn)一步的溫育。以洗滌緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步洗滌后，通過通常的途徑(例如，以ABTS，在室溫下進(jìn)行30分鐘，以ELISA酶標(biāo)儀在405nm測出以mE為單位的消光差異)測定該過氧化物酶的活性。
b)對N-末端前BNP肽的反應(yīng)性在該過程中，經(jīng)鏈生物素處理的的微滴度板同作為抗原的序列中1-10，8-18，1-21，16-30，30-38，39-50，50-63或64-76位的NT-前BNP-肽生物素偶聯(lián)物結(jié)合，該偶聯(lián)物以250ng/ml溶于含0.5％Byco C的PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液，Oxid，Code-BR 14a)，結(jié)合以100μl/孔在室溫下攪拌進(jìn)行1小時(shí)。隨后，以洗滌緩沖液(0.9氯化鈉溶液，0.05％吐溫20)進(jìn)行洗滌。該抗體樣品的溫育和檢測反應(yīng)如a)所描述進(jìn)行。根據(jù)同特定的NT-前BNP肽的反應(yīng)性可以確定表位的位置。
c) 對患者樣品中的天然N-末端前BNP的反應(yīng)性以5μg/ml的PAK<人類前BNP>S-IgG(IS，(1-21)或(30-38)S-IgG按100μl/孔在室溫下同微滴度板(Nunc，Maxisorb)攪拌結(jié)合1小時(shí)，該重組NT-前BNP處于加樣緩沖液中(Beohringer，0.2M碳酸鈉/重碳酸鈉，pH9.3-9.5，產(chǎn)品序列號No.726 559)。隨后的加樣在PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液，Oxid，Code-BR 14a)和1％Byco C中進(jìn)行30分鐘。隨后以洗滌緩沖液(0.9氯化鈉溶液，0.05％吐溫20)進(jìn)行洗滌。以100μl/孔在室溫下同稀釋于PBS緩沖液的患者血漿天然抗原在攪拌下進(jìn)行溫育1小時(shí)。隨后以洗滌溶液進(jìn)行兩次進(jìn)一步的洗滌并且以檢測抗體PAK<M-Fcy>S-Fab-過氧化物酶偶聯(lián)物(BoehringerMannheim，序列號No.1500 686)100mU/ml，100μl/孔在室溫?cái)嚢柘逻M(jìn)行進(jìn)一步的溫育。以洗滌緩沖液進(jìn)行進(jìn)一步洗滌后，通過通常的途徑(例如，以ABTS，在室溫下進(jìn)行30分鐘，以ELISA酶標(biāo)儀在405nm測出以mE為單位的消光差異)測定該過氧化物酶的活性。
3.結(jié)果單克隆和多克隆抗體對N-末端前BNP的反應(yīng)模式a)來自以N-末端前BNP進(jìn)行的免疫化的MAKs(c＝5μg/ml)的反應(yīng)性表1

通過以不同的肽進(jìn)行免疫化而獲得的這些單克隆抗體同相對應(yīng)的肽反映強(qiáng)烈。只有2個單克隆抗體被發(fā)現(xiàn)對重組N-末端前BNP的反應(yīng)性，沒有發(fā)生對患者庫中的天然N-末端前BNP的反應(yīng)(見表1)。
b)來自以重組N-末端前BNP進(jìn)行的免疫化的單克隆抗體(MAKs)的反應(yīng)性表2

通過以重組的N-末端前BNP進(jìn)行免疫化而獲得的這些單克隆抗體只同肽零星地進(jìn)行反應(yīng)，但同重組N-末端前BNP或患者庫中的天然N-末端前BNP反應(yīng)強(qiáng)烈。單個單克隆抗體同肽不反應(yīng)表明了其對所謂的構(gòu)象表位的識別(見表2)。
c)來自以重組N-末端前BNP進(jìn)行的免疫化的PAKs的反應(yīng)性表3

所獲得的PAK對肽1-21和30-38表現(xiàn)出最強(qiáng)的反應(yīng)。出于該原因選擇了這些表位并且在這些肽的輔助下對該P(yáng)AK進(jìn)行了正性免疫吸附。以肽1-21免疫吸附的PAK對區(qū)域8-20表現(xiàn)出了最強(qiáng)的反應(yīng)，而以N-末端序列1-10免疫吸附的PAK的反應(yīng)明顯降低。該方法免疫吸附的PAKs同重組N-末端前BNP反應(yīng)十分強(qiáng)烈，而以PAK/PAK三明治模式的PAK同天然樣品反應(yīng)強(qiáng)烈(見表3)。
實(shí)施例4NT-前BNP測定的高靈敏免疫分析通過使用實(shí)施例2和3產(chǎn)生的抗體可以建立一種高靈敏的免疫分析。在一般情況下，應(yīng)用具不同表位識別的兩種抗體是適當(dāng)?shù)摹Ｗ鳛槔用枋隽怂^的三明治-ELISA。
一種經(jīng)鏈親合素覆層的微滴度板(MTP)被用作固相。10μl未處理樣品或校準(zhǔn)物同100μl含兩種表位特異性抗體的緩沖液一起被加入MTP孔，隨即在室溫下溫育1小時(shí)。1μg/ml生物素化的PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(IS，1-21)和0.5μg/ml的洋地黃毒苷化PAK<rec.NT-前BNP>S-IgG(IS，30-38)作為抗體被使用。隨后吸出該溶液并以350μ1洗滌緩沖液洗滌3次。隨后以微量取液器加入100μl偶聯(lián)溶液并在室溫下再溫育1小時(shí)。一種抗地高辛抗體-POD偶聯(lián)物作為偶聯(lián)物被使用，其濃度為100mIU/ml。隨后吸出該偶聯(lián)溶液并以350μl洗滌緩沖液洗滌3次。最后向孔內(nèi)加入ABTS底物溶液在室溫下測量30分鐘。底物反應(yīng)達(dá)到30分鐘后在MTP酶標(biāo)儀中在405nm的波長下以495nm為參照直接測量該微滴度板。
為測定靈敏度而建立了一條校準(zhǔn)曲線并且測定了零標(biāo)準(zhǔn)的精度(n＝21)。人類EDTA血漿被用作校準(zhǔn)物，該校準(zhǔn)物隨即通過在要求濃度下的重組N-末端前BNP而建立。牛血漿被用作零標(biāo)準(zhǔn)。該結(jié)果見表4。
表4

在22.5mU x ml/fmol的校準(zhǔn)曲線梯度和SD5.7mU的基礎(chǔ)上，根據(jù)Kaiser公式給出了較低檢測限制UNG＝3SD零標(biāo)準(zhǔn)/Ek梯度＝3×5.7/22.5＝0.76fmol/ml。
實(shí)施例5N-末端前BNP穩(wěn)定性的測定在實(shí)施例4中所描述的三明治ELISA的幫助下測量了N-末端前BNP的分析物穩(wěn)定性。為此目的，對4名II-III級NYHA患者進(jìn)行取血并加入含EDTA的收集容器在室溫下保存3天。每天取出一個樣品測量其N-末端前BNP含量。用于測定穩(wěn)定性的EDTA血漿中的樣品及參照直接在4-8℃下冰冷并且在15分鐘內(nèi)進(jìn)行離心。在4℃和室溫下保存該EDTA血漿并隨即在24小時(shí)脅迫期間在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測量。
結(jié)果見表5。
表5

這些數(shù)據(jù)證明N-末端前BNP在被測試期間完全穩(wěn)定，因此可以被用作常規(guī)參量。該結(jié)果與文獻(xiàn)不一致(Hunter et al.，ClinicalEndocrinology，47，287(1997))并且證實(shí)了通過以兩種特異抗體進(jìn)行的測試模式的選擇和設(shè)計(jì)可以影響被分析物的穩(wěn)定性的設(shè)想，該特異性抗體的表位并不位于該被分析物的遠(yuǎn)末端。
實(shí)施例6該N-末端前BNP分析的診斷靈敏度的測定在實(shí)施例4中所描述的測試被再次使用以測定診斷靈敏度。為此目的，114個健康個體和235個I到IV級NYHA患者接受了測量。通常地，將健康個體同I級NYHA患者區(qū)分通常特別重要。
通過這一高靈敏度的分析在110個健康個體中測得平均值為6.6fmol/ml，其標(biāo)準(zhǔn)偏差為7.3fmol/ml。測得的最低值為0.2fmol/ml。這清楚地表明＜1.0fmol/ml的靈敏度對于精確檢測參考區(qū)域是必要的。對于這一分布，所測定的上限正常值區(qū)域(97.5％)為26.6fmol/ml。
假定指標(biāo)區(qū)域(Referenzwertbereiches)為0-26.6fmol/ml，233名I到IV級NYHA患者中只有16名所表現(xiàn)的數(shù)值在該正常區(qū)域內(nèi)。這對應(yīng)的臨床靈敏度為93.3％。如果只考慮I級NYHA患者，37名患者中有30名被測為陽性，其對應(yīng)的靈敏度為81.1％。
該結(jié)果證實(shí)通過高靈敏的N-末端前BNP分析，對患有I級NYHA心力衰竭的患者同健康正常的群體進(jìn)行清晰地區(qū)分是可能的。在此之前，本技術(shù)領(lǐng)域的分析(Dagubatti et al.，Cardiovascular Research36(1997)，246)不能達(dá)到這一點(diǎn)。
序列表<110>Roche Diagnostics GmbH<120>鑒定樣品中的N-末端前BNP的方法<130>51810AWO-SZ<140>
<141>
<160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>17<212>DNA<213>大腸桿菌<400>1ccggatccca cccgctg 17<210>2<211>79<212>DNA<213>大腸桿菌<400>2cgggatccca cccgctgggt tccccgggtt ccgcttccga cctggaaacc tccggtctgc60aggaacagcg taaccacct 79<210>3<211>70<212>DNA<213>大腸桿菌<400>3cggttccagg gaggtctgtt caacctgcag ttcggacagt ttaccctgca ggtggttacg60ctgttcctgc 70<210>4<211>71<212>DNA<213>大腸桿菌<400>4cagacctccc tggaaccgct gcaggaatcc ccgcgtccga ccggtgtttg gaaatcccgt60gaagttgcta c 71<210>5<211>87
<212>DNA<213>大腸桿菌<400>5cccaagctta acgcggagca cgcagggtgt acagaaccat tttacggtga ccacggatac60cttcggtagc aacttcacgg gatttcc87<210>6<211>19<212>DNA<213>大腸桿菌<400>6cccaagctta acgcggagc 19
權(quán)利要求
1.鑒定樣品中的N-末端前BNP的方法，其利用識別N-末端前BNP的不同表位并能同時(shí)與N-末端前BNP結(jié)合的至少兩種抗體進(jìn)行，其中所述樣品是尿。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種方法，該方法用于通過至少兩種抗體來鑒定樣品中的N－末端前BNP，這些抗體檢測N－末端前BNP的不同表位。該方法用于對健康個體和NYHA I至IV級患者的樣品進(jìn)行區(qū)分或歸類。本發(fā)明進(jìn)一步涉及到重組N－末端前BNP，該N－末端前BNP作為標(biāo)準(zhǔn)在鑒定N－末端前BNP的方法中的應(yīng)用，用于檢測重組N－末端前BNP的抗體及它們的生產(chǎn)。
文檔編號C07K16/26GK101046478SQ20071010517
公開日2007年10月3日 申請日期2000年1月27日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月29日
發(fā)明者J·卡爾, H·利爾, P·斯塔爾, K·克呂格爾, A·博格亞, A·加盧塞爾 申請人:羅赫診斷器材股份有限公司