一組pcr鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組PCR鑒別引物，該組引物由三條引物組成，其核苷酸序列分別如序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。本發(fā)明還提供以前述引物組鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟：1)提取待鑒定樣品的基因組DNA；2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述引物組對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。在354bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為白及，在519bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。本發(fā)明提供的方法能快速、準(zhǔn)確鑒定白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，又能同步鑒別黃花白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，并能實(shí)現(xiàn)與其他植物的鑒別。
【專利說明】-組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、 黃花白及的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 中藥白及具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于咳血吐血、外傷出血、瘡瘍腫毒、 皮膚皸裂的治療。歷版中國(guó)藥典收載均為蘭科白及屬植物白及Bletilla striata Rchb. f.，同時(shí)，白及作為珍稀瀕危植物，野生資源匱乏，而栽培資源尚難以滿足市場(chǎng)需求，使藥 材價(jià)格逐年上漲。但由于該物種的分布具有地域性，一些地區(qū)性的中藥材標(biāo)準(zhǔn)以黃花白及 B.ochracea Schltr.植物作為白及的替代藥用品種（《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》 (2003年版），《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（2010年版）），但作為地區(qū)性品種其資源使用受到一定 局限。發(fā)明人在對(duì)白及藥材市場(chǎng)進(jìn)行實(shí)地走訪和調(diào)查發(fā)現(xiàn)，以黃花白及的塊莖冠以正品白 及藥材出售的現(xiàn)象極為普遍，而且以同屬、同科植物塊莖作為白及藥材混淆使用的現(xiàn)象也 屢見不鮮。
[0003] 由于白及和黃花白及在非花期植物形態(tài)很難準(zhǔn)確分辨，而且這2種物種的塊莖在 表觀性狀、組織構(gòu)造、理化成分上也極為相似，當(dāng)塊莖被加工為飲片、粉末時(shí)鑒別難度就更 大，既便是有豐富鑒定學(xué)知識(shí)和鑒別經(jīng)驗(yàn)者也會(huì)籌措難定。白及B. striata Rchb. f.是國(guó)家 藥典明確規(guī)定的中藥白及品種，黃花白及的經(jīng)濟(jì)、藥用價(jià)值與白及尚有一定差距。目前，運(yùn) 用DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)白及屬植物進(jìn)行鑒定上，有學(xué)者運(yùn)用過SCAR分子標(biāo)記方法對(duì)黃花白 及 B. ochracea Schltr.與白及 B. striata Rchb. f.、小白及 B. formosana Schltr.和云南 獨(dú)蒜蘭（又名獨(dú)葉白藍(lán)）Pleione yunnnanensis(Rolfe)Rolfe進(jìn)行鑒定區(qū)別（趙爽，黃春 球，楊耀文，等.黃花白及的SCAR分子標(biāo)記轉(zhuǎn)化研究.中草藥，2012,43 (10): 2036-2039)， 也有學(xué)者采用SRAP標(biāo)記技術(shù)，擬探索建立一個(gè)分析白及物種遺傳多樣性的實(shí)驗(yàn)體系（蔣 瑞彬，徐旭棟，藍(lán)小明，等.野生白及SRAP-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013， 31 (2) :353-355)，但以白及B. striata Rchb. f.為研究對(duì)象，將之與黃花白及和其他植物進(jìn) 行鑒別的分子標(biāo)記鑒定技術(shù)的報(bào)道尚未見到。本發(fā)明提供的一組PCR鑒別引物及以之鑒 別白及、黃花白及的方法，只需在一個(gè)擴(kuò)增體系內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，即能快速、準(zhǔn)確鑒定 白及的原植物、飲片藥材和粉末藥材，又能同步鑒別黃花白及的原植物、飲片藥材和粉末藥 材，并能實(shí)現(xiàn)白及和黃花白及與其他植物的鑒別。在提交本發(fā)明申請(qǐng)之前，尚無任何公開 或報(bào)道過本專利申請(qǐng)中所提及的PCR鑒別引物組及同步鑒別白及、黃花白及的分子鑒定方 法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一在于提供一組PCR鑒別引物。
[0005] 本發(fā)明的另外一個(gè)目的在于提供上述鑒別引物組在白及、黃花白及鑒定中的應(yīng) 用。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一組PCR鑒別引物，其核苷酸 序列分別如序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。
[0007] 前述的PCR鑒別引物組在白及、黃花白及鑒別中的應(yīng)用。
[0008] 包括前述引物的試劑盒。
[0009] -組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟：1)提取待鑒 定樣品的基因組DNA ;2)以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述引物組對(duì)其進(jìn)行PCR 擴(kuò)增；3)對(duì)步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。在354bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品 鑒定為白及，在519bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均 未檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。
[0010] 具體的說，所述的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，優(yōu)選的， 所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，包括Taq酶PCR預(yù)混液6?8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 2 ?5pmol，模板 DNA 20 ?160ng，CldH2O 補(bǔ)足 25 μ L。所述的 PCR 反 應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性1?5min，25?40個(gè)循環(huán)（95°C變性1?20s、52?68°C退火延伸 1 ?30s)。
[0011] 更優(yōu)選的，所述的PCR反應(yīng)體系為25 μ L，包括Taq酶PCR預(yù)混液7 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 各 4pmol，模板 DNA 40ng，CldH2O 補(bǔ)足 25 μ L。所述的 PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性lmin，30個(gè)循環(huán)（95°C變性2s、66°C退火延伸5s)。
[0012] 一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法，所述的步驟3)，其特征在于 對(duì)步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，在354bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為白 及，在519bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測(cè)出 條帶的待鑒定樣品鑒定為其他植物材料。
[0013] 發(fā)明人進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)選本發(fā)明提供的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白 及、黃花白及的方法的PCR擴(kuò)增條件等，證明本發(fā)明鑒定方法的有效性。具體技術(shù)方案如 下：
[0014] 一、引物設(shè)計(jì)
[0015] 在 NCBI (National Center for Biotechnology Information，NCBI，美國(guó)國(guó)立生 物技術(shù)信息中心）下載到白及與其近緣物種的核糖體基因序列和葉綠體基因序列，共246 條。另選用通用引物對(duì)白及與其近緣物種進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，成功獲取50條rDNA-ITS序列 和15條psbA-trnH序列。運(yùn)用ClustalX 2. 1軟件對(duì)以上序列進(jìn)行排序、比對(duì)、分析，找出白 及、黃花白及的特異性位點(diǎn)，針對(duì)此位點(diǎn)設(shè)計(jì)一組特異性鑒別白及和黃花白及的PCR引物， 該組引物由3條引物組成，其核酸序列分別如下：
[0016] SEQ ID NO. 1 :5'一GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3'
[0017] SEQ ID NO. 2 :5'一TTGGCACGGAGCGACACG-3'
[0018] SEQ ID NO. 3 :5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
[0019] 二、PCR擴(kuò)增條件優(yōu)選
[0020] 根據(jù)前述的鑒別引物組和擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值、長(zhǎng)度設(shè)置PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系與擴(kuò)增程 序，以白及、黃花白及和其近緣種（小白及、華白及）的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其 具體如下：
[0021] PCR 的反應(yīng)體系為 25 μ L，包括Taq酶PCR預(yù)混液8 μ L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、 SEQ ID NO. 3 各 3pmol，模板 DNA 20ng，ddH20 補(bǔ)足 25 μ L。
[0022] 所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性lmin，35個(gè)循環(huán)（95°C變性20s，62°C退火延伸 30s)。
[0023] a.前述的一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及方法的PCR擴(kuò)增程序優(yōu)選 如下：
[0024] i退火延伸溫度：考察了 48°〇、521：、561：、601：、641：、681：的退火延伸溫度。結(jié) 果顯示，52°C?68°C白及和黃花白及的擴(kuò)增產(chǎn)物分別在354bp、519bp擴(kuò)增出目的條帶， 條帶亮度隨溫度的升高而增強(qiáng)，近緣種均未檢測(cè)出條帶。為保證退火延伸的有效進(jìn)行，本 發(fā)明選擇退火延伸溫度為66°C。圖1為退火延伸溫度優(yōu)選的電泳檢測(cè)圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0025] ii退火延伸時(shí)間：基于上述退火延伸溫度的特征，考察ls、2s、5s、10s、20s、30s的 退火延伸時(shí)間。結(jié)果顯示，各退火延伸時(shí)間下，白及、黃花白及均能有效擴(kuò)增，條帶亮度隨著 時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，5s?30s條帶亮度無明顯差異。為節(jié)約時(shí)間，本發(fā)明優(yōu)選退火延伸時(shí)間 為5s。圖2為退火延伸時(shí)間優(yōu)選的電泳檢測(cè)圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花 白及、小白及、華白及）。
[0026] iii變性時(shí)間：基于上述ii，考察變性時(shí)間為lS、2S、5 S、l〇S、15s、2〇S。結(jié)果顯示， 各變性時(shí)間下，白及、黃花白及均能有效擴(kuò)增，尤其是2s?IOs時(shí)條帶亮度最強(qiáng)。為節(jié)約 擴(kuò)增時(shí)間，本發(fā)明選擇變性時(shí)間為2s。圖3為變性時(shí)間優(yōu)選的電泳檢測(cè)圖譜（M :D2000DNA Marker ;1?4 :白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0027] iv變性-退火延伸的循環(huán)次數(shù)（η):根據(jù)上述iii的特征，考察25、28、30、32、35、40 次變性-退火延伸循環(huán)次數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響。結(jié)果顯示，各個(gè)循環(huán)次數(shù)條件下，白及、黃花 白及樣品均能擴(kuò)增，目的條帶明亮清晰，尤其是在30次循環(huán)時(shí)的電泳條帶亮度最均一。因 此，本發(fā)明優(yōu)選變性-退火延伸的循環(huán)次數(shù)為30次。圖4為變性-退火延伸循環(huán)次數(shù)優(yōu)選 的電泳檢測(cè)圖譜（M:D2000DNA Marker ;1?4:白及、黃花白及、小白及、華白及）。
[0028] V基于上述iv，一組PCR鑒別引物及以其鑒別白及、黃花白及的方法PCR擴(kuò)增程序 最終優(yōu)選為：
[0029]

【權(quán)利要求】
1. 一組PCR鑒別引物，其核苷酸序列為： SEQ ID NO. 1 ：5'-GCCCAGAACAGCCATCCAAGT-3' SEQ ID NO. 2 ：5'-TTGGCACGGAGCGACACG-3' SEQ ID N0.3:5，一GCCGAGCAAGAAACAACGC-3，
2. 以權(quán)利要求1所述PCR引物組鑒別白及、黃花白及的方法，包括如下步驟： 1) 提取待鑒定樣品的基因組DNA ; 2) 以步驟1)提取的基因組DNA為模板，使用前述的鑒別引物組對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增； 3) 對(duì)步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，步驟2)所述的PCR 反應(yīng)體系為 25 ii L，包括 Taq 酶 PCR 預(yù)混液 6 ?8 ii L，SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3各2pmol?5pmol，模板DNA20ng?160ng，ddH20補(bǔ)足25 y L。所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)?95°C預(yù)變性lmin?5min，25?40個(gè)循環(huán)（95°C變性Is?20s、52°C?68°C退火延伸Is? 30s)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)體系 為 25iiL，包括 Taq 酶 PCR 預(yù)混液 7iiL，SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3 各 4pmol， 模板DNA 40ng，ddH20補(bǔ)足25ii L。所述的PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性lmin，30個(gè)循環(huán)（95°C 變性2s、66°C退火延伸5s)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述鑒別白及、黃花白及的方法，其特征在于，步驟3)對(duì)步驟2)的 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，在354bp處檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為白及，在519bp處 檢測(cè)出條帶的待鑒定樣品鑒定為黃花白及，在354bp和519bp處均未檢測(cè)出條帶的待鑒定 樣品鑒定為其他植物材料。
6. 權(quán)利要求2?5任一項(xiàng)所述PCR擴(kuò)增方法在白及、黃花白及鑒別中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104388569SQ201410733438
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年12月4日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月4日
【發(fā)明者】周濤, 趙丹, 黃璐琦, 袁媛, 肖承鴻, 江維克 申請(qǐng)人:貴陽中醫(yī)學(xué)院, 中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所