專利名稱：血栓的形成和/或穩(wěn)定化的預(yù)防的制作方法
血栓的形成和/或穩(wěn)定化的預(yù)防
在最一般的方面，本發(fā)明的主題是三維動脈或靜脈血栓的形成和/ 或穩(wěn)定化的預(yù)防。
具體地，本發(fā)明涉及至少一種抗體和/或一種抑制劑用于抑制凝血
因子XII活性和防止血栓的形成和/或穩(wěn)定化和血栓生長的用途。本發(fā) 明還涉及藥物制劑以及凝血因子XII作為抗血栓形成的靶標(biāo)的用途。
血管壁損傷引發(fā)血小板的突然粘著和聚集，接著是血漿凝固系統(tǒng) 的激活和含有血纖蛋白的血栓的形成，血栓使損傷部位閉塞。這些事 件對于限制創(chuàng)傷后失血是關(guān)鍵的，但是也可以閉塞患病的血管，導(dǎo)致 重要器官的局部缺血和梗死。以瀑布或級聯(lián)的方式，血液凝固通過一 系列反應(yīng)進(jìn)行，所述反應(yīng)涉及通過有限蛋白水解來激活酶原，最終爆 發(fā)式地產(chǎn)生凝血酶，其將血漿血纖蛋白原轉(zhuǎn)化成血纖蛋白并有效地激 活血小板。反過來，粘著膠原或血纖蛋白的血小板又通過在它們的外
表面暴露促凝血的磷脂酰絲氨酸(PS)(其擴(kuò)大凝血蛋白酶復(fù)合體的
裝配和活化)以及通過血小板受體和凝血因子之間的直接相互作用以
幾個數(shù)量級的程度促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生。
存在兩種凝血的會聚途徑，它們通過血管系統(tǒng)的外源性(血管壁) 或者內(nèi)源性(血源性的)組分引發(fā)。"外源性"途徑由血漿凝血因子
VII (FVII)和膜內(nèi)在蛋白質(zhì)組織因子(TF)的復(fù)合體啟動，TF是在 血管的腔表面不存在但是在內(nèi)皮下層強(qiáng)烈表達(dá)的必需的凝血輔因子。 在循環(huán)微泡中表達(dá)的TF也可以通過維持在活化的血小板的表面上的 凝血酶產(chǎn)生而促進(jìn)血栓擴(kuò)大。
當(dāng)凝血因子XII (FXII， Hageman因子)在涉及高分子量激肽原和 血漿激肽釋放酶的反應(yīng)中接觸帶負(fù)電荷的表面時，啟動了 "內(nèi)源性" 或接觸活化途徑。FXII可以被內(nèi)皮下基質(zhì)的大分子組分例如糖胺聚糖 和膠原、疏苷脂、核苷酸和其他可溶的聚陰離子或者非生理材料例如
玻璃或聚合物活化。最有效的接觸活化劑之一是高呤土，并且該反應(yīng)
物作為主要臨床凝固試驗(yàn)((活化的)部分促凝血酶原激酶時間(PTT， aPTT))的機(jī)理基礎(chǔ)。在由血小板所擴(kuò)大的反應(yīng)中，活化的FXII然后 激活FXI，反過來，F(xiàn)XIa又激活凝血因子IX。盡管它高效誘導(dǎo)體外血 液凝固，但是FXII引發(fā)的內(nèi)源性凝血途徑的(病理)生理重要性受到 如下事實(shí)的質(zhì)疑FXII以及高分子量激肽原和血漿激肽釋放酶的遺傳 缺陷與出血并發(fā)癥無關(guān)。觀察到缺少外源性途徑組分如TF、 FVII或凝 血因子IX的人和小鼠患有嚴(yán)重的出血，與該觀察一起導(dǎo)致了當(dāng)前的假 說血纖蛋白形成在體內(nèi)僅由外源性級聯(lián)啟動(Mackman，N. (2004). Role of tissue factor in hemostasis， thrombosis, and vascular development. Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 24， 1015-1022)。 像所有生理機(jī)制一樣，凝血級聯(lián)可以變得不適當(dāng)?shù)乇患せ?，并?dǎo) 致在血管內(nèi)形成止血塞。從而，血管可以變成被閉塞，并且血液向遠(yuǎn) 端器官的供應(yīng)受到限制，該過程已知為血栓栓塞并且與高死亡率相關(guān)。 此外，由于凝血級聯(lián)的活化和假體表面的包被(這通常損害了它的功 能)，與血液接觸的假體裝置的使用受到嚴(yán)重限制。此類假體裝置的 實(shí)例是血液透析器、心肺分流回路、血管支架和留置導(dǎo)管。對于使用 此類裝置的情況，用抗凝劑如肝素來防止血纖蛋白沉積在表面上。然 而， 一些患者不耐受肝素，其可以導(dǎo)致肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥(HIT )， 導(dǎo)致血小板聚集和威脅生命的血栓形成。此外，臨床中使用的所有抗 凝劑的內(nèi)在風(fēng)險也與嚴(yán)重出血的風(fēng)險增加有關(guān)。因此，存在對新型抗 凝劑的需要，所述抗凝劑不與這樣的并發(fā)癥有關(guān)，并且可以用于受影 響的患者或者作為預(yù)防血栓形成的優(yōu)異的治療概念而沒有增加的出血 傾向。
所以顯然仍然需要用于治療或預(yù)防血栓形成和類似病癥的改良的 藥療法。因此，本發(fā)明的一個目的是滿足這種需求。50多年以來，已 知凝血因子XII的缺陷不與自發(fā)或損傷相關(guān)的出血并發(fā)癥增加有關(guān)聯(lián) (Ratnoff， 0. D. & Colopy， J. E. (1955) A familial hemorrhagic trait associated with a deficiency of a clot-promoting fraction
of plasma. J Clin Invest 34， 602-13 )。實(shí)際上，盡管存在病理 性aPTT (專注于凝血的內(nèi)源性途徑的臨床凝固試驗(yàn))，但是FXII缺 陷的人甚至在大手術(shù)操作中并沒有異常出血(Colman， R. W. Hemostasis and Thrombosis. Basic principles & clinical practice (eds. Colman R. W., Hirsch. J. ， Mader V. J. ， Clowes A. W. ， & George J.) 103-122 Lippincott Wi 11 iams & Wilkins， Philadelphia, 2001 )。相反地，F(xiàn)XII的缺陷與靜脈血栓形成的風(fēng)險增加有關(guān)(Kuhli， C. ， Scharrer， I., Koch， F. ， 0hrloff， C. & Hattenbach， L. 0. (2004) Factor XII deficiency: a thrombophilic risk factor for retinal vein occlusion. Am. J. Ophthalmol. 137, 459-464; Halbmayer, W. M.， Mannhalter， C. ， Feichtinger， C. ， Rubi， K. & Fischer, M. (1993) Factor XII (Hageman factor) deficiency: a risk factor for development of thromboembolism.Incidence of factor XII deficiency in patients after recurrent venous or arterial thromboembolism and myocardialinfarction.Wien. Med. Wochenschr. 143， 43-50 )。支持該觀點(diǎn)的研究和病例報告涉及FXII 缺陷的指示病例John Hageman先生，它死于肺栓塞。FXII缺陷與促 血栓形成的風(fēng)險增加有關(guān)這一假說受到幾個病例報告的最近的重新評 估的挑戰(zhàn)，所述的重新評估將FXII缺陷與血栓形成聯(lián)系起來 (Girolami， A" Randi， M丄，Gavasso， S. ， Lombardi， A.M. & Spiezia， F. (2004) The Occasional Venous Thromboses Seen in Patients with Severe (Homozygous) FXII Deficiency are Probably Due to Associated Risk Factors: A Study of Prevalence in 21 Patients and Review of the Literature. J. Thromb. Thrombolysis 17， 139-143 )。在大多數(shù)情況下，作者鑒定了與凝血因子FXII缺陷 相組合的相伴的先天性或獲得性促血栓形成風(fēng)險因子，其甚至可以不 依賴于FXII而造成血栓形成事件。使用經(jīng)詳細(xì)表征的患者(Koster， T.， Rosendaal， F丄，Briet， E. & Vandenbroucke， J. P. (1994) John Hageman's factor anddeep—vein thrombosis: Leiden
thrombophilia Study. Br. J. Haematol. 87， 422-424 )和FXII缺 陷型家族(Zeerleder， S.等人 (1999) Reevaluation of the incidence of thromboembolic complications in congenital factor XII deficiency-a study on 73 subjects from 14 Swiss families. Thromb. Haemost. 82， 1240-1246 )所進(jìn)行的最大的流行病學(xué)研究表 明，F(xiàn)XII缺陷和任何促血栓形成或抗血栓形成的風(fēng)險之間沒有相關(guān) 性。
令人驚奇地并且與本領(lǐng)域技術(shù)人員通常認(rèn)為的相反，本申請人已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，凝血因子XII所驅(qū)動的內(nèi)源性凝血途徑對于體內(nèi)動脈血栓形 成是必要的，但是對于正常的組織特異性止血不是必需的。出乎意料 地，這些結(jié)果改變了體內(nèi)血液凝固僅僅由外源性途徑介導(dǎo)這種長期存 在的觀念，并將凝血因子XII置于病理性血栓形成過程中的中心位置。
因此，本發(fā)明的第 一個主題是至少一種抗體和/或至少一種抑制劑 用于抑制凝血因子XII和防止三維動脈或靜脈血栓的形成和/或穩(wěn)定 化的用途。因此，抗-FXII抗體或者抑制劑可以以抑制FXII的激活和 /或干擾關(guān)鍵性地參與FXII激活的FXII分子的其他部分而發(fā)揮功能。
與內(nèi)源性途徑不是止血所需這一事實(shí)一起，這將凝血因子XII確 立為有效的抗血栓形成治療的有希望的新靶標(biāo)。此外，這些結(jié)果對于 開發(fā)抗-FXII試劑以控制其他與接觸系統(tǒng)相連的(病理)機(jī)制如炎癥、 補(bǔ)體激活、纖維蛋白溶解、血管發(fā)生和激肽形成也是重要的。
因此，本發(fā)明還提供了此類抗體和/或抑制劑在治療或者預(yù)防與動 脈的血栓形成相關(guān)的狀況或病癥即中風(fēng)或心肌梗死、炎癥、補(bǔ)體激活、 纖維蛋白溶解、血管發(fā)生和/或與病理性激肽形成有關(guān)的疾病如低滲休 克、水腫(包括遺傳性血管性水腫)、細(xì)菌感染、關(guān)節(jié)炎、胰腺炎或 關(guān)節(jié)痛風(fēng)中的用途。
具體地，根據(jù)本發(fā)明，提供了至少一種抗-FXII抗體(例如，像 Fl抗體(MoAbFl， Ravon等人，Blood. 1995 Dec 1; 86 (11): 4134-43 " 和/或至少一種蛋白酶抑制劑用于抑制FXII-驅(qū)動的血栓形成的用途。
特別優(yōu)選的是例如選自下列的蛋白酶抑制劑ATIII抑制劑、血
管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑、Cl抑制劑、抑酶肽、ot-l蛋白酶抑制劑、抗 蛋白酶([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨基曱?；?-L-Arg-L-Val-Arginal ) 、 Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸鹽 (Z-Pro-Pro-aldehyde-dimethyl acetate) 、 DX88 ( Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139， USA;在Williams A. and Baird LG.， Transfus Apheresis Sci. 2003 Dec: 29 (3): 255-8中 所引用)、亮抑蛋白酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如 Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制劑、牛胰腺胰蛋白酶抑制劑的突 變體、大腸桿菌素、YAP (刺黃蓋鰈(yellowfin sole)抗凝蛋白)和 *瓜(Cuci/r6/"邊a;ri鵬)胰蛋白酶抑制劑-n包括夢瓜同效抑制劑)。
因此，本發(fā)明提供了本文描述的此類抗體和/或抑制劑在醫(yī)學(xué)中的 用途；和此類抗體和/或抑制劑在制備藥物中的用途。
因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包含至少一種抗體和/或一 種抑制劑的藥物制劑，其適于抑制凝血因子XII，并且防止三維動脈 或靜脈血栓的形成和/或穩(wěn)定化。
具體地，用于所述藥物制劑的所述抗體是抗-FXII抗體(例如， 像Fl抗體(MoAb Fl， Ravon等人，Blood. 1995 Dec 1; 86(11): 4134-43 )),并且所述抑制劑是蛋白酶抑制劑，例如但不限于ATIII 抑制劑、血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑、Cl抑制劑、抑酶肽、oc-l蛋白酶 抑制劑、抗蛋白酶([(S)-l-羧基-2-苯乙基]-氨基甲酰基 -L-Arg-L-Val-Arginal) 、 Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸鹽、DX88(Dyax Inc., 300 Technology Square, Cambridge, MA 02139， USA; 在 Williams A. and Baird LG.， Transfus Apheresis Sci. 2003 Dec: 29 (3):255-8中所引用)、亮抑蛋白酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例 如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白酶抑制劑、牛胰腺胰蛋白酶抑制劑 的突變體、大腸桿菌素、YAP(刺黃蓋鰈抗凝蛋白)和夢瓜胰蛋白酶抑 制劑-V (包括勞瓜同效抑制劑)。
所述抗體還可以是保留了抑制活性的抗體片段或模擬物，例如， 在美國專利6, 613, 890 (特別是第4到8欄)中公開的淀粉狀蛋白前
體蛋白的Kun i t z蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)域的類似物。其他合適的抑制劑可 以是Harahiko Isawa等人在The Journal of Biological Chemistry, Vol. 277， No. 31 (August 2， pp. 27651-27658， 2002)中公開的 Hamadarin。合適的玉米胰蛋白酶抑制劑及其制備方法公開于 Zhi-Yuan Chen等人，Applied and Environmental Microbiology, March 1999， p. 1320-1324和其中所引用的參考文獻(xiàn)19中。所有引 用的參考文獻(xiàn)都將其完整內(nèi)容引入本申請中作為參考。最后但同樣重 要的是，例如通過使用FXII或FXIIa抑制作為進(jìn)行選擇的基礎(chǔ)的測定 法而分離的小分子以及在上文或下文中描述它們的各自用途都是本發(fā) 明的一部分?？梢曰贔XII的晶體結(jié)構(gòu)來設(shè)計這些小分子FXIIa抑制 劑。因此， 一些FXII結(jié)構(gòu)域或者輕鏈可以在表達(dá)系統(tǒng)如大腸桿菌(f. co//)、酵母或者哺乳動物細(xì)胞中重組表達(dá)。然后使用對于FXII底物 FXI所描述的標(biāo)準(zhǔn)方法(Jin L，等人(2005) Crystal structures of the FXIa catalytic domain in complex with ecotin mutants reveal substrate-like interactions. J Biol Chem. 280 (6):4704-12 )來 純化和結(jié)晶該蛋白質(zhì)。備選地，可以包括小分子絲氨酸蛋白酶抑制劑 以穩(wěn)FXII結(jié)構(gòu)。包含蛋白質(zhì)乾的小分子抑制劑(其可以例如在這些靶 蛋白質(zhì)的晶體的指導(dǎo)下進(jìn)行設(shè)計)的此類制劑是本領(lǐng)域公知的，并且 包括可以例如全身地如腸胃外或口服或者局部地施用于患者的藥物制 劑。
如本文使用的，術(shù)語"腸胃外的"包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動 脈內(nèi)和氣管內(nèi)注射，滴注，噴霧施用，和輸注技術(shù)。腸胃外制劑優(yōu)選 地根據(jù)已知的程序以快速濃注的形式或恒量輸注的形式靜脈內(nèi)施用， 或者皮下施用。公知用于腸胃外使用的優(yōu)選的液體栽體包括無菌水、 鹽水、葡萄糖水溶液、糖溶液、乙醇、二醇和油。
用于口服施用的片劑和膠嚢劑可以含有常規(guī)賦形劑，例如粘合劑、 填充劑、潤滑劑和濕潤劑等等?？诜后w制劑可以為水性或油性的混 懸劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑、酏劑等等的形式，并且可以作為在用 時用水或其他合適的載體重構(gòu)的干燥產(chǎn)品存在。此類液體制劑可以含
有常規(guī)的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水性載體和防腐劑。
適于局部應(yīng)用的制劑可以為水性或油性的混懸劑、溶液劑、乳劑、
凝膠劑或者優(yōu)選地乳濁型軟骨劑(emulsion ointment)的形式。用于 噴霧應(yīng)用的制劑可以為可噴霧的液體或者干燥粉劑的形式。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，通過由至少一種抗體和/或一種抑制劑抑 制凝血因子XII并因而防止血管中三維血栓的形成和/或穩(wěn)定化，提供 了凝血因子XII作為抗血栓形成的把標(biāo)的用途。
當(dāng)結(jié)合下述附圖進(jìn)行閱讀時，從下面的所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和它們的結(jié) 果的詳細(xì)描述，本發(fā)明的性質(zhì)、益處和其他特征會變得顯而易見。
用凝血因子XII缺陷型小鼠來分析內(nèi)源性凝血級聯(lián)在止血和血栓 形成中的功能?；铙w熒光顯微術(shù)和超聲波流量測量揭示了在血管系統(tǒng) 的不同的動脈分枝中三維血栓的形成和穩(wěn)定化之中的嚴(yán)重缺陷。用人 凝血因子XII重構(gòu)突變型小鼠，在體外恢復(fù)了內(nèi)源性凝血途徑和在體
內(nèi)恢復(fù)了動脈血栓形成。在機(jī)制上，內(nèi)源性途徑的促凝血活性關(guān)鍵性 地由活化的血小板促進(jìn)。這些結(jié)果將FXII誘導(dǎo)的內(nèi)源性血液凝固級聯(lián) 置于動脈血栓形成過程中的中心位置，其連接血漿凝固與血小板聚集。 圖l描述了 FXII缺陷型小鼠的凝血分析(A)野生型(n=12) 和FXII-Z- (n-ll)小鼠的尾部出血時間。每個符號代表一個個體。 (B) FXII-/-和wt小鼠的外周血細(xì)胞計數(shù)(千/jil)和總體凝血參數(shù)。 縮寫為白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、活化的部分促凝血酶原激酶時間(aPTT) 和凝血酶原時間(PT)。值以每種基因型的10只小鼠的平均值土SD 給出。(CM吏用特異抗體通過Western印跡法在0. 3 jil的wt和FXII-/-血漿中探測的接觸系統(tǒng)蛋白FXII、血漿激肽釋放酶(PK)和高分子量 激肽原(HK)。在左邊給出分子量標(biāo)準(zhǔn)。(D)在用高嶺土 (深色柱) 或者膠原(淺色柱)激活后，在來自C57BL/6和129sv wt、 FXII-/-、 011丫-/-和整聯(lián)蛋白o(hù)c2缺陷型小鼠的無血小板(上圖)和富含血小 板(下圖)的血漿中測定的再鉀化凝血時間。在補(bǔ)充有50 jig/ml抗 體的C57BL/6血漿中分析JON/A的影響。給出了來自6次實(shí)驗(yàn)的平均 值土STD。
圖2。 ( A )在靜脈內(nèi)注射膠原(0. 8 mg/kg )和腎上腺素(60 jig/kg ) 后觀察到血栓栓塞性死亡。所有野生型小鼠在5分鐘內(nèi)死亡。在攻擊 后30分鐘仍活著的動物被認(rèn)為是存活者。(B)在輸注膠原/腎上腺素 后2分鐘，在對照(n-19) 、 FXII-/- (n = 14)和FcR y-/- (n - 5)小鼠中的血小板計數(shù)。(C)用膠原(10 ng/ml)或ADP (5 pM) 刺激來自野生型和FXII-/-小鼠的肝素化的富含血小板的血漿，并用 標(biāo)準(zhǔn)aggregometer記錄光透射。顯示的結(jié)果是每組6只小鼠的代表。 (D)在膠原/腎上腺素注射后2分鐘，來自所示小鼠肺的蘇木精/伊紅 染色的切片。以20倍放大率計數(shù)每個視野的血栓。柱代表來自100 個視野的平均值土SDT,
圖3描述了在缺少凝血因子XII的小鼠體內(nèi)缺陷的血栓形成。在 用20% FeCl3誘導(dǎo)損傷的情況下，監(jiān)視腸系膜小動脈上的體內(nèi)血栓形 成。(A)在所有小鼠品系中于損傷后5分鐘檢測單個血小板粘附，在 野生型小鼠中于損傷后7到8分鐘觀察到第一個血栓，而在FXII-/-中于損傷后14到35分鐘出現(xiàn)第一個血栓，和在FXI-/-中于損傷后5 到35分鐘出現(xiàn)第一個血栓。(B)在野生型小鼠中在100%的腸系膜 動脈中觀察到血栓形成，但是僅在50 %的FXII-Z-小鼠和44. 4%的 FXI-/-小鼠中觀察到血栓形成。(C)在野生型小鼠中形成的血栓在損 傷后平均25分鐘的時間閉塞了血管，而在FXII和FXI缺陷型小鼠中 形成的血栓不導(dǎo)致閉塞。每個符號代表單個所監(jiān)視的小動脈。(D) — 個實(shí)驗(yàn)的代表性照片。
圖4。在動脈閉塞模型中分析野生型(n=10) 、 FXII-/- (n=10) 和FXI"7- (n-ll)。通過用鑷子進(jìn)行一次用力的壓迫在主動脈中誘 導(dǎo)血栓形成。用血管周圍超聲波流量探測器監(jiān)視血液流量直到完全閉 塞。在40分鐘后停止實(shí)驗(yàn)。每個符號代表一個個體。(B)通過結(jié)扎 來誘導(dǎo)頸動脈中的機(jī)械性損傷。在取出絲狀血栓后，以nm卩測量野生 型(n- 10)和FXII-/- (n= 10)中的面積。(C)顯微照片顯示損 傷后2分鐘的代表性圖像。
圖5描述了 FXII缺陷型動物中血栓形成的缺陷，其通過人FXII
而得到恢復(fù)。(A)在野生型小鼠以及注射了人FXII的FXII-/-小鼠 中，在100。/。的腸系膜動脈中觀察到當(dāng)進(jìn)行FeCl3誘導(dǎo)的損傷時的血栓 形成。(B)在野生型小鼠中，在損傷后平均25分鐘內(nèi)，所形成的血 栓閉塞了血管，和在注射了人FXII的？乂11-/-小鼠中，在損傷后22. 7 分鐘內(nèi)，所形成的血栓閉塞了血管。每個符號代表一個個體。(C)顯 示了代表性照片。(D) FXII-/-小鼠接受2 mg/kg hFXII-/-，并通過 用鑷子進(jìn)行一次用力的壓迫在主動脈中誘導(dǎo)血栓形成。用血管周圍超 聲波流量探測器監(jiān)視血液流量直到完全閉塞。在40分鐘后停止實(shí)驗(yàn)。 每個符號代表一個個體。
圖6描述了抗-FXII抗體在小鼠體內(nèi)抑制血栓形成。野生型小鼠 經(jīng)靜脈內(nèi)接受2 mg/kg抗-FXII抗體或者非免疫IgG。 15分鐘后，在 用20°yi FeCl3誘導(dǎo)損傷的情況下，監(jiān)視腸系膜小動脈上的體內(nèi)血栓形 成。(A)在兩個組中于損傷后5分鐘檢測單個血小板粘附。7到8分 鐘后，在經(jīng)對照IgG處理的小鼠中觀察到第一個血栓，而在經(jīng)抗-FXII 處理的小鼠中，在損傷后12到32分鐘出現(xiàn)第一個血栓。(B)在對照 小鼠中在100%的腸系膜動脈中觀察到血栓形成，但是僅在60%的經(jīng) 抗-FXII處理的小鼠中觀察到血栓形成。(C)顯示了到達(dá)完全閉塞的 時間。每個符號代表一個個體。
圖7描述了動脈血栓形成的經(jīng)修正的模型。最初，在血管損傷部 位，血栓形成主要是由于在內(nèi)皮下基質(zhì)中的組織因子(TF)的暴露。 與FVII復(fù)合的TF起始外源性凝血途徑。在損傷部位，經(jīng)FXI驅(qū)動內(nèi) 源性途徑的FXII對于凝血酶(FII)產(chǎn)生的貢獻(xiàn)是微小的，并且對于 正常的止血可以忽略不計。因此，具有FXII缺陷的個體不遭受出血。 所產(chǎn)生的凝血酶通過形成血纖蛋白和激活血小板來起始血塊形成。血 栓生長的擴(kuò)大在正在生長的血栓中暴露的表面上，由FXII誘導(dǎo)的內(nèi) 源性途徑關(guān)鍵性地促進(jìn)凝血酶產(chǎn)生。活化的FXII通過FXI產(chǎn)生另外的 血纖蛋白。因此，F(xiàn)XII以及FXI缺陷嚴(yán)重地?fù)p害血栓形成。
在本發(fā)明中，使用缺少凝血因子XII的小鼠，通過基于活體顯微 鏡術(shù)和流量測量的動脈血栓形成模型評估了凝血的內(nèi)源性途徑對體內(nèi)
病理性血栓形成的潛在貢獻(xiàn)。盡管在突變型動物中，損傷部位處血小 板的最初粘附?jīng)]有改變，但是隨后的三維血栓的形成和穩(wěn)定化有嚴(yán)重 缺陷。該缺陷在脈管系統(tǒng)的不同分枝中觀察到，并且可以通過外源的
人凝血因子XII而完全恢復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)在經(jīng)修正的血栓形成模型中將 由凝血因子XII驅(qū)動的內(nèi)源性凝血途徑確立為初級和次級止血之間的
主要連接。
為了分析FXII對于體內(nèi)凝血的功能，產(chǎn)生了 FXII缺陷型小鼠。 FXII-/-小鼠是健康的，在表型上與它們的野生型同窩小鼠不可區(qū)分， 并且是能繁殖的。詳細(xì)的組織學(xué)和止血學(xué)(hemostasiological )分析
沒有顯示出對于在Fxn-/-小鼠中增加的血栓形成或者出血的聯(lián)系，
盡管在眶后采集的血漿中具有延長的aPTT( 68 ± 17秒)和再鉀化時間 (412土78秒)(wt: 23 ± 4和210 ± 31秒)(Pauer， H. U.等人(2004). Targeted deletion of murine coagulation factor XII gene-a model for contact phase activation in vivo. Thromb. Haemost. 92， 503-508 )。類似于FXII缺陷的人，F(xiàn)XII-/-小鼠沒有增加的出血傾向，
明的(分別為369. 5 ±201. 7和355. 9 ±176. 1秒，每組n-12,

圖1A)。 突變型小鼠的外周血細(xì)胞計數(shù)與野生型對照沒有不同。值得注意的是， 乂11-/-小鼠的凝血酶原時間(PT)類似于野生型(8.9±1.3對9.1 土1.3秒)，表明FXII缺陷不影響通過外源性凝血系統(tǒng)的血纖蛋白形 成(圖1B)。為了評估人和小鼠之間FXII促凝血活性中的可能差異， 用鼠類野生型血漿重構(gòu)了 FXII缺陷的人(FXII < 1%)或者反之亦然， 并測定了混合物的PTT。在任一情況中，血塊形成都變得正常，這支 持了在人和小鼠中FXII對于凝血的功能是相當(dāng)?shù)倪@一觀點(diǎn)。
在人中，類似于FXII缺陷，接觸系統(tǒng)蛋白質(zhì)血漿激肽釋放酶(PK) 和高分子量激肽原(HK)的缺陷不導(dǎo)致出血風(fēng)險增加，盡管aPTT延長。 為了證實(shí)在FXII-/-小鼠中aPTT延長不是由于接觸相蛋白的額外缺陷 引起的，我們分析了 FXII-/-和wt血漿中的PK和HK。 Western印跡 表明，在突變型和野生型小鼠中HK和PK水平是相等的(圖1C)。在
功能上，在暴露于膠原或高嶺土的FXII-/-血漿中，HK加工和凝血酶 形成與野生型相比受到嚴(yán)重?fù)p害。
血液凝固和血小板激活是互補(bǔ)的并且相互依賴的過程。血小板與 幾種凝血因子相互作用并促進(jìn)這些凝血因子的激活，中心凝血產(chǎn)物凝
血酶是有效的血小板激活劑。因此，接著更詳細(xì)地檢查了血小板和 FXII對血塊形成的貢獻(xiàn)。為此，我們使用高嶺土或膠原誘導(dǎo)凝血，高 嶺土通常激活FXII但是對于血小板沒有直接影響，膠原激活FXII和 血小板，其中它與許多受體，最重要地oc2P1整聯(lián)蛋白和GPVI相互 作用。在血小板存在而不是不存在時，對于野生型血漿中的血塊形成， 膠原優(yōu)于高嶺土 (圖1D).相反地，在含有激活缺陷型？^1 -/-血小 板的血漿中，高嶺土和膠原的相對效力類似于PFP，并且用來自整聯(lián) 蛋白cx2-/-小鼠的PRP看到相似的效果。在正在凝固的血漿中也有效 地引發(fā)了血小板促凝血活性，并且血纖蛋白(原)受體otIIbP 3已經(jīng)顯 示出在該過程中起關(guān)鍵作用，盡管潛在的機(jī)制還沒有完全理解.與這 些報導(dǎo)相一致，阻斷抗體J0N/A的ot lib P 3功能極大地抑制了凝血時 間的依賴血小板的縮短(圖1D)。這些結(jié)果一起證明，促凝血狀態(tài)下 的血小板可以促進(jìn)FXII誘導(dǎo)的血塊形成。
為了測試膠原誘導(dǎo)的FXII激活是否在體內(nèi)具有功能后果，將野生 型和FXII-/-小鼠進(jìn)行致死性肺血栓栓塞模型測試，該模型通過輸注 膠原(0.8 mg/kg體重)和腎上腺素(60 jig/kg體重)的混合物而誘 導(dǎo)。所有對照小鼠U9/19)在5分鐘內(nèi)死于廣泛的肺血栓形成和心臟 停搏，其伴隨著攻擊后2分鐘時循環(huán)的血小板計數(shù)減少>95% (圖 2A，B)。在這些實(shí)驗(yàn)條件下，35.7%(5/14)的FXII-/-小鼠存活下來， 雖然它們的外周血小板計數(shù)與在野生型對照中類似地減少，這提示所 觀察到的保護(hù)不是基于血小板激活缺陷。通過體外研究證實(shí)了該假設(shè)， 所述研究表明FXII-/-血小板表達(dá)正常水平的主要表面糖蛋白，包括 膠原受體，并且表明通過典型的激動劑如凝血酶、腺苷二磷酸(ADP)， 或者GPVI-特異性激動劑，膠原相關(guān)的肽可正常地激活細(xì)胞(如通過 整聯(lián)蛋白o(hù)tIIbP 3和P-選擇蛋白表達(dá)的激活而測量的)。與此相一致，
FXII-/-血小板顯示出對膠原、ADP (圖2C) 、 PMA或凝血酶的未改變 的聚集應(yīng)答。
在一組平行的實(shí)驗(yàn)中，用膠原/腎上腺素攻擊FcRy-Z-小鼠。這 些小鼠受到完全保護(hù)而免于死亡，并且攻擊后2分鐘血小板計數(shù)僅適 度地減少，這證實(shí)在該模型中致死性嚴(yán)格地需要血小板激活。這些數(shù) 據(jù)進(jìn)一步得到來自不同組的小鼠的肺切片的組織學(xué)分析的支持。盡管 在野生型小鼠中大多數(shù)血管被閉塞，但是這在？乂11-/-小鼠(存活者 和非存活者)中顯著減少。與以前的報導(dǎo)一致，在來自FcRy-/-小鼠 的肺中幾乎沒有發(fā)現(xiàn)血栓(圖2D)。這些結(jié)果提示，在體內(nèi)膠原引發(fā) 了血小板激活和依賴FXII的內(nèi)源性凝血途徑，其在該模型中起協(xié)同作 用以形成閉塞性肺血栓。
病理性血栓形成通常由脈管系統(tǒng)的動脈分枝中粥樣硬化斑塊的龜 裂或者突然破裂而起始，所述粥樣硬化斑塊的龜裂或者突然破裂在內(nèi) 皮下層的表面上導(dǎo)致非生理強(qiáng)烈的血小板激活和促凝血活性。為了測 試FXII在這些過程中的作用，使用不同的動脈損傷模型，在野生型和 FXI 1-/-小鼠中研究了血栓形成。在第 一種模型中，在腸系膜小動脈(直 徑60 - 100 nm)中誘導(dǎo)了氧化損傷，并通過體內(nèi)熒光顯微術(shù)檢查了血 栓形成。野生型和FXII-/-小鼠接受相同基因型的經(jīng)熒光標(biāo)記的血小 板(lx108)，并通過局部施加用20%氯化鐵(FeCl3)飽和的濾紙1 分鐘來誘導(dǎo)損傷，氯化鐵引起自由基的形成，從而導(dǎo)致內(nèi)皮的破壞。 血小板與受損的血管壁的相互作用快速開始，并且在損傷后5分鐘， 在兩個組的+鼠中牢固粘附的血小板的數(shù)目是相似的(圖3A)。然而， 盡管在野生型小鼠中，粘附的血小板不斷從循環(huán)系統(tǒng)中募集額外的血 小板，導(dǎo)致形成聚集體，但是該過程在突變型小鼠中是嚴(yán)重缺陷的。 在100%的對照血管(17/17)中，在損傷后10分鐘已經(jīng)形成了直徑 >20 fim的穩(wěn)定的血栓，其隨著時間不斷生長并最后在40分鐘的觀察 期內(nèi)在94. 1% ( 16/17)的血管中導(dǎo)致完全閉塞(平均閉塞時間25. 6 士8.9分鐘)(圖3)。形成鮮明對比的是，在突變型小鼠中，在50% (7/14)的血管中完全不存在所出現(xiàn)的微聚集體或血栓的形成。在其
余的50% (7/14)的血管中，形成了血栓，然而其始終是不穩(wěn)定的并 且從血管壁上迅速脫落。沒有一個血管中直徑>20 jim的血栓在損傷部 位保持附著超過1分鐘。因此，在觀察期(40分鐘)內(nèi)，F(xiàn)XII-/-小 鼠中沒有血管閉塞。該出乎意料的結(jié)果證明FXII是FeCl廠損傷的小動 脈中富含血小板的血栓的產(chǎn)生和穩(wěn)定化所需的，并且提示FXII誘導(dǎo)的 凝血途徑實(shí)質(zhì)上有助于所觀察到的血栓形成應(yīng)答。當(dāng)在相同的才莫型中 分析FXI缺陷型小鼠時，證實(shí)了該假設(shè)。因?yàn)镕XI是在"內(nèi)源性"級 聯(lián)中FXII的主要的底物，所以在那些小鼠中肯定會預(yù)期出現(xiàn)血栓形成 的類似缺陷。實(shí)際上，非常類似于？乂11-/-小鼠，在損傷后前3分鐘 內(nèi)可以檢測到損傷部位處幾乎正常的血小板粘附，而在55.6% (5/9) 的血管中血栓的形成被完全抑制。在其余的血管中，形成的微聚集體 和血栓是不穩(wěn)定的，并且連續(xù)地被栓塞(圖3)。結(jié)果，在觀察期(40 分鐘)內(nèi)沒有血管被閉塞。該數(shù)據(jù)顯示，在FeCl廣誘導(dǎo)的頸動脈閉塞 模型中，F(xiàn)XI缺陷型小鼠受到保護(hù)。
已知FeCl3-誘導(dǎo)的動脈血栓形成依賴于血小板和凝血酶產(chǎn)生，但 是還不清楚該類型的損傷如何地類似于在患病血管(例如，當(dāng)動脈粥樣 硬化斑塊破裂時)中產(chǎn)生的血栓生成環(huán)境。因此，為了排除大量FeCl3-誘導(dǎo)的氧化損傷產(chǎn)生可以人工有利于FXII依賴性接觸相激活的非生 理?xiàng)l件這種可能性，在另一種成熟的動脈血栓形成模型中評估了 FXII 的功能，在所述另一種成熟的動脈血栓形成模型中在主動脈中機(jī)械性 地誘導(dǎo)損傷并用超聲波流量探測器監(jiān)視血液流量。在血液流量于損傷 后立即暫時增加后，在所有經(jīng)測試的小鼠中，血流量在幾分鐘內(nèi)不斷 減小。在所有經(jīng)測試的野生型小鼠(10/10)中，這種減小在損傷后 1. 6到11. l分鐘內(nèi)導(dǎo)致血管的完全和不可逆的閉塞(平均閉塞時間5. 3 ±3. O分鐘，圖4A)。在？義11-/-小鼠中發(fā)現(xiàn)了不同的圖像，其中穩(wěn) 定的血栓形成是嚴(yán)重缺陷的。盡管在所有動物中，在損傷后前幾分鐘 內(nèi)觀察到血液流量的逐漸減少，但是僅在10只小鼠的4只中發(fā)生閉塞。 此外，那些小鼠中的閉塞性血栓在所有情況下都是不穩(wěn)定的并且快速 栓塞，從而在閉塞后10秒到115秒內(nèi)再次建立血流。再次打開的血管
沒有再次閉塞。因此，所有？乂11-/-小鼠在觀察期(40分鐘)結(jié)束時 都顯示出通過受損血管的基本上正常的流速。用FXI-Z-小鼠得到了非 常相似的結(jié)果，其中11只中的9只不能在觀察期(30分鐘)內(nèi)建立 閉塞性血栓(圖5A)。
在第三種獨(dú)立的模型中證實(shí)了在FXII-/-小鼠中動脈血栓形成中 的嚴(yán)重缺陷，在所述模型中通過體內(nèi)熒光顯微術(shù)來研究在受損的頸動 脈中的血小板募集。從供體小鼠純化血小板，進(jìn)行熒光標(biāo)記，并注射 到相同基因型的受體小鼠中。通過頸動脈的用力結(jié)扎來導(dǎo)致血管損傷， 所述結(jié)扎總是導(dǎo)致內(nèi)皮層的破壞和內(nèi)彈性膜的經(jīng)常破裂，隨后是在損 傷部位的快速的由膠原引發(fā)的血小板粘附和血栓形成(Gruner等人， Blood 102: 7/4/2007 2003 )。盡管野生型動物快速形成大的穩(wěn)定的血 栓(血栓面積102. 821 ± 39. 344 ,2; t = 5分鐘)，其不栓塞，但 是在突變型小鼠中僅僅形成小的和中等大小的聚集體，其經(jīng)常從損傷 部位上脫落(圖4B， C)。因此，在突變型小鼠中血栓面積顯著減小 (8. 120 ± 13, 900 nm2; t = 5分鐘)，盡管血管壁上初始的血小板粘 附似乎沒有缺陷。
為了測試在？乂11-/-小鼠中血栓形成中的嚴(yán)重缺陷是由于缺少血 漿FXII或血小板FXII，還是可能由于FXII缺陷的次級的未鑒定的影 響例如脈管系統(tǒng)中的改變而引起，在施用人FXII (2 jig/g體重)后 在？乂11-/-小鼠中研究了動脈血栓形成。該處理使PTT正?；?27±6 秒)，并且完全恢復(fù)了動脈血栓形成。在100。yi的經(jīng)FeCl3損傷的腸系 膜小動脈中，在損傷后10分鐘內(nèi)就已經(jīng)形成了>20 jim的血栓，并且 在觀察期內(nèi)所有血管都被完全閉塞(圖5A-C)。與未處理的野生型對 照小鼠相比，在重構(gòu)的FXII-/-小鼠中可檢測到甚至傾向于更快閉塞 (平均閉塞時間22. 7±8. 2分鐘對25. 6±8. 9分鐘)。當(dāng)在主動脈中 機(jī)械性地誘導(dǎo)損傷時，得到類似的結(jié)果。在所有測試的血管中，在損 傷后10分鐘內(nèi)發(fā)生完全和不可逆的閉塞(圖5D),這證實(shí)血漿FXII 的缺乏造成在？乂11-/-小鼠中觀察到的血栓形成缺陷。
上述研究證明，F(xiàn)XII對于動脈血栓形成是關(guān)鍵的，并且因此可以
用作抗血栓形成的耙標(biāo)。
為了直接對此進(jìn)行評估，將小鼠用2 mg/kg體重的多克隆兔抗小 鼠FXII抗體或非免疫兔抗體處理，并評估在經(jīng)FeCh-誘導(dǎo)的損傷后腸 系膜動脈中的血小板募集和血栓形成。如圖6A中所示，在損傷部位的 血小板粘附在兩組小鼠中相當(dāng)。然而，盡管在100%的對照血管中， 在損傷后10分鐘內(nèi)已經(jīng)形成了>20 nm的血栓，并且在觀察期內(nèi)所有 血管被完全閉塞(圖6B, C)，但是在用抗FXII抗體處理的動物中， 僅在67%的血管中觀察到>20 nm的血栓并且僅在50%的血管中發(fā)生 閉塞。
備選地，為了測試小分子FXII抑制劑的影響，在頸動脈中的 FeClr"誘導(dǎo)的損傷前5分鐘，將野生型小鼠用FXII抑制劑玉米胰蛋白 酶抑制劑(CTI， 50jig/g體重)進(jìn)行輸注(Wang等人(2005) J. Thromb. Hea血ost. 3: 695-702 )。抑制劑處理延長了 aPTT(62士ll秒，n=4 )， 但是在手術(shù)步驟期間沒有影響出血。在測試的動物中，沒有一只(0/4) 在施加FeCh后30分鐘內(nèi)產(chǎn)生閉塞血管的血栓。
這些結(jié)果證明，抗-FXII治療劑像抗-FXII抗體或者小分子FXII 抑制劑一樣，提供了對動脈血栓形成的顯著保護(hù)。
盡管50多年來FXII的接觸激活已經(jīng)被認(rèn)為是內(nèi)源性凝血級聯(lián)的 起點(diǎn)，但是該途徑被認(rèn)為與血液凝固是不相關(guān)的。在本發(fā)明中，使用 三種不同的體內(nèi)模型通過原位視頻顯微術(shù)和超聲波流量測量來分析在 FXII缺陷型小鼠中動脈損傷部位處的血小板募集和血栓形成，并且表 明明顯不能形成穩(wěn)定的三維血栓。該缺陷是基于血漿但不是其他區(qū)室 中的FXII缺乏，因?yàn)樗ㄟ^靜脈內(nèi)注射外源的人FXII而被完全逆轉(zhuǎn) (圖6)，從而也排除了 FXII缺陷的次級效果有助于所觀察到的表型 這種可能。
這些結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)榛谝恍﹫髮?dǎo)，認(rèn)為FXII是抗血栓 形成的而不是促血栓形成的酶，所述報導(dǎo)表明FX 11缺陷與靜脈血栓形 成的發(fā)生率增加相關(guān)(Kuhli，C. ， Scharrer，I.， Koch， F. ， Ohrloff，C. 和Hattenbach，L. 0. (2004).Factor XIIdeficiency: a
thrombophi1ic risk factor for retinal vein occlusion. Am. J. Ophthalmol. 137， 459-464; Halbmayer，W. M., Mannhalter，C.， Feichtinger，C.， Rubi，K.和 Fischer,M. (1993). [Factor XII (Hageman factor) deficiency: a risk factor for development of thromboembolism. Incidence of factor XII deficiency in patients after recurrent venous or arterial thromboembolism and myocardial infarction]. Wien. Med. Wochenschr. 143， 43-50)。 FXII缺陷型小鼠展示出正常的出血時間(圖1A)，并且不顯示出 自發(fā)或者增加的創(chuàng)傷后(手術(shù)中)出血的征兆，這證實(shí)FXII對于正常 的止血來說是可有可無的。最初看來，這些結(jié)果似乎與止血的中心法 則相矛盾，所述中心法則為僅僅其缺陷與出血或血栓形成有關(guān)的那些 因子與血液凝固相關(guān)。然而，仔細(xì)考慮起來，這些數(shù)據(jù)并不挑戰(zhàn)該法 則而是引起了有趣的可能性止血和動脈血栓形成可能通過不同的機(jī) 制而發(fā)生。
盡管上面討論的持續(xù)凝血酶產(chǎn)生機(jī)制可以足以產(chǎn)生止血塞，但是 數(shù)據(jù)表明，至少在小鼠中，穩(wěn)定的動脈血栓的形成需要內(nèi)源性凝血途徑 的額外激活。對于在FXII的功能或者酶的底物中存在物種特異性差異 這一可能性沒有證據(jù)。突變型小鼠的所有凝血參數(shù)和止血表型都與人 FXII缺陷相一致，并且在動物中所觀察到的所有改變都通過用人FXII 重構(gòu)而正?；?圖5).此外，排除了血栓形成缺陷局限于特定的實(shí) 驗(yàn)?zāi)Ｐ?，因?yàn)檠ㄐ纬扇毕菰谘芟到y(tǒng)的不同動脈分枝中發(fā)現(xiàn)并且不 依賴于損傷的類型?？赡茈y以確定哪種類型的損傷最好地反映了由動 脈粥樣硬化斑塊的破裂產(chǎn)生的血管損傷，動脈粥樣硬化斑塊被認(rèn)為是 急性心血管綜合征的主要引發(fā)物。動脈粥樣硬化損傷富含生成血栓的 組分，最重要的是TF和纖維膠原。在動脈粥樣化形成過程中，已經(jīng)表 明內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的膠原合成增強(qiáng)顯著促進(jìn)腔的狹窄。 斑塊的破裂或龜裂導(dǎo)致膠原原纖維暴露于流動的血液，這引發(fā)血小板 粘附和聚集。此外，它們誘導(dǎo)FXII激活，如本文對于I型纖維膠原所 示，I型纖維膠原是在血管壁中發(fā)現(xiàn)的主要膠原類型。但是膠原可能
不是在損傷部位處FXII的唯一的(病理)生理性激活劑。其他候選者 可以是從分解細(xì)胞釋放的或者暴露于ECM的物質(zhì)，包括HSP90或者可 溶性和不溶性的聚陰離子，例如核小體或糖胺聚糖。
在這些FXII激活劑中，膠原是最能形成血栓的，因?yàn)樗鼈円灿行?地激活血小板。在損傷部位，通過血小板GPIb-V-IX與結(jié)合有膠原的 vWf (其減小細(xì)胞的速度，從而允許其他受體的結(jié)合)的可逆相互作用， 血小板束縳至ECM。在這些之中，膠原受體GPVI是最重要的，因?yàn)樗?激活整聯(lián)蛋白o(hù)t 2 P 1和oc lib P 3，它們?nèi)缓蠼閷?dǎo)穩(wěn)定的粘附和促進(jìn)細(xì) 胞激活。此外，通過GPVI/FcRy-鏈復(fù)合物的血小板激活誘導(dǎo)了細(xì)胞 的促凝血狀態(tài)，其特征是磷脂酰絲氨酸(PS )的暴露以及(PS暴露性) 膜泡和微泡的產(chǎn)生。整聯(lián)蛋白o(hù)t2pi通過"由外向內(nèi)(outside-in)" 信號而直接促進(jìn)該過程并且通過增強(qiáng)GPVI-膠原相互作用而間接促進(jìn) 該過程。已確定含有PS的膜強(qiáng)烈加速凝血過程的兩個中心反應(yīng) tenase和凝血酶原酶反應(yīng)。本發(fā)明表明，促凝血的血小板通過涉及 GPVI/FcRy-鏈復(fù)合物以及cx2 P 1的機(jī)制在體外促進(jìn)FXII依賴性凝血 (圖2)。這可以至少部分解釋，為什么盡管在動脈損傷部位血小板 粘附未改變，但是oc2p l缺陷型小鼠顯示出在閉塞性血栓形成中的部 分缺陷。除了膠原外，正在凝固的血漿也通過整聯(lián)蛋白o(hù)cllbp 3-依賴 性機(jī)制有效地刺激血小板促凝血活性。在本實(shí)驗(yàn)中，a lib P 3的阻斷 幾乎完全抑制了在FXII依賴性凝血中的血小板沉淀，這表明ot IIbp 3 拮抗劑的公知的抗凝血活性可能部分基于由FXII驅(qū)動的內(nèi)源性凝血 途徑的抑制?？傊景l(fā)明表明由FXII驅(qū)動的接觸系統(tǒng)和血小板激活 可能是相互依賴的過程，它們在病理性血栓形成中共同發(fā)揮作用。
基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提出了在圖7中示意性描繪的病理性血栓形成的 模型。在血管損傷部位，第一層血小板與膠原在額外富含TF和血纖蛋 白的環(huán)境中接觸。因此，并不令人驚奇的是，在？乂11-/-小鼠中血小 板向著受損的血管壁的粘附?jīng)]有受到損害，并且這些細(xì)胞非?？赡鼙?完全激活并且處于促凝血狀態(tài)。然而，在正在生長的血栓中，不存在 膠原，并且由微泡提供的TF濃度與血管壁相比可能更低并且通過從活
化的血小板大量釋放的TFPI而降低了它們的活性。在這些條件下，需 要另外的才幾制來保持時間空間上的(spatio-temporal )凝血酶產(chǎn)生以 激活新近募集的血小板，并且通過形成血纖蛋白而引起它們的凝血活 性。？乂11-/-小鼠嚴(yán)重不能建立穩(wěn)定的血栓明確地表明，由FXII驅(qū)動 的內(nèi)源性凝血途徑是該過程中的必需參與者。與低TF的小鼠也展示出 受損害的動脈血栓形成這一觀察一起，這些結(jié)果提示，外源性和內(nèi)源 性的途徑必須是有效運(yùn)作的并且協(xié)同來促進(jìn)三維的和最終閉塞性的血 栓的形成。相反地，在？乂11-/-小鼠中缺少出血表明，在第三維中的 血栓生長可能不是封閉血管壁中的孔所必需的。這可以解釋為什么產(chǎn) 生第一薄層的血纖蛋白和激活的血小板的外源性途徑足夠介導(dǎo)正常的 止血。我們的結(jié)果產(chǎn)生了如下有趣的可能性三維血栓的形成發(fā)揮不 同于止血的功能。這些功能可以包括停止在組織創(chuàng)傷處的某些區(qū)域中 的血液流動以便防止入侵的病原體或毒素隨著血流的分布。
實(shí)驗(yàn)程序 動物
所有實(shí)驗(yàn)和照料都得到當(dāng)?shù)貏游镎樟虾褪褂梦瘑T會(Animal Care & Use Committee )的批準(zhǔn)。如所述的，產(chǎn)生缺少凝血因子XI(FXI-/-)、 凝血因子XII (FXII-/-) 、 ot2整聯(lián)蛋白(ot2-/-)的典型的小鼠突 變體(Gailani，D. ， Lasky，N.M.和Broze，G. J. ， Jr. (1997). Amurine model of factor XI deficiency. Blood Coagul. Fibrinolysis 8， 134-144; Pauer，H. U. ， Renne， T. ， Hemmerlein， B. ， Legler,T.， Fritzlar，S. ， Adham, I. ， Muller-Esterl， W. ， Emons，G. ， Sancken， U. Engel，W.和Burfeind，P. (2004). Targeted deletion of murine coagulation factor XII gene-a model for contact phase activation in vivo. Thromb. Haemost. 92， 503—508; Holtkotter，0.， Nieswandt， B. ， Smyth, N.， Muller,W. ， Hafner，M., Schulte，V.， Krieg，T.和Eckes，B. (2002). Integrin alpha 2-deficient mice develop normally, are fertile, but display partially defective platelet interaction with collagen. J Biol Chem JID - 2985121R 277, 10789-10794 )。使用C57B/6J小鼠(FXI-/一)或Svl29 ( FXII-/-) 作為對照。缺乏FcRy鏈的小鼠(Takai，T.， Li，M. ， Sylvestre，D., Clynes，R.和 Ravetch，J.V. (1994). FcR gamma chain deletion results in pleiotrophic effector cell defects. Cell 76， 519-529 )來自(Taconics， Ge簡ntown)。
抗-FXII抗體的產(chǎn)生
從129svwt小鼠的肝臟分離總細(xì)胞RNA，并用來自Qiagen的"一 步RT-PCR試劑盒"根據(jù)生產(chǎn)商的使用說明進(jìn)行FXII-cDM合成。使用 各25 pmol的分別引入BamH I和EcoR I限制性位點(diǎn)的5-和3 -引物 (ttggatccccaccatggaaagactccaag和ttgaattcgcgcatgaacgaggaca g)，按照下面的方案擴(kuò)增凝血因子FXII重鏈(第61-1062位，對應(yīng)
于殘基21-354):在熱循環(huán)儀(Bioraetra， G6ttingen， Germany)上 95。C 30秒，58"C 60秒和72r 1分鐘，共30個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物 克隆到pGEX-2T表達(dá)載體(Pharmacia)的BamH I和EcoR I位點(diǎn)中。 隨后，在大腸桿菌菌林BL21中表達(dá)待測序的蛋白質(zhì)。用0.5 mM異丙 基-p-D-硫代吡喃半乳糖苷刺激指數(shù)生長的細(xì)菌1小時，收獲，重懸 浮在含有1 mM EDTA、 200 mM NaCl、 10 jig/ml鹽酸節(jié)脒、10 jig/ml 苯基甲基磺酰氟的10 mM Tris-HCl ( pH 7.4)中，并以每次15秒的 脈沖進(jìn)行超聲波處理3分鐘。在4n下以15， 000 xg離心20分鐘后， 移出上清液并轉(zhuǎn)移到GST-sepharose柱(Pharmacia)上以進(jìn)行純化。 如從考馬斯染色的SDS-PAGE推斷的，洗脫出的蛋白質(zhì)純度>95%。按照 標(biāo)準(zhǔn)程序，在兔中產(chǎn)生針對GST-重鏈FXII的多克隆抗體。使用具有 融合至麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)的FXII重鏈的柱子從超免疫血清中選 擇抗體。與對于GST-融合構(gòu)建體所描述的類似地，使用pMAL-c2表達(dá) 系統(tǒng)和直鏈淀粉樹脂柱來表達(dá)和純化這些融合蛋白。
血小板制備
將小鼠在乙醚麻醉狀態(tài)下從眶后血管叢采集血液。將血液收集在 含有20 U/mL肝素的管中，并通過在室溫(RT)下以300 g離心10 分鐘而得到富含血小板的血漿(prp)。為了得到經(jīng)洗滌的血小板，將 prp以1000 g離心8分鐘，并將沉淀物在前列環(huán)素(0.1 pg/ml)和 腺苷三磷酸雙磷酸酶(0. 02 U/mL)存在下在經(jīng)修飾的Tyrodes-Hepes 緩沖液(134mMNaCl， 0. 34 mM Na2HP04， 2. 9 mM KC1， 12 mM NaHC03， 20 mMHepes， 5mM葡萄糖，0. 35%牛血清白蛋白，pH 6. 6 )中重懸浮兩次。 然后將血小板重懸浮在相同的緩沖液(pH 7.0， 0.02 U/mL腺苷三磷 酸雙磷酸酶)中，并在371C下溫育至少30分鐘后進(jìn)行分析。
流式細(xì)胞術(shù)
將肝素化的全血用含有5 mM葡萄糖、0. 35%牛血清白蛋白(BSA ) 和l mM CaCh的經(jīng)修飾的Tyrode-HEPES緩沖液(134 mM NaCl， 0.34
mM Na2HP04， 2.9 mM KC1， 12 mM NaHC03， 20 mM HEPES [N-2-羥乙基 哌溱-『-2-乙磺酸]，pH 7.0)作1:20稀釋。樣品和經(jīng)熒光團(tuán)標(biāo)記的 抗體在室溫下溫育15分鐘，并在FACScalibur (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany)上直接進(jìn)行分析(Nieswandt， B., Schulte，V. 和 Bergmeier，W. (2004). Flow-cytometric analysis of mouse platelet function. Methods Mol. Biol. 272， 255-268)。
聚集度測定術(shù)(Aggregometry )
為了測定血小板聚集，使用prp ( 200 jiL,具有0. 5xl(^個血小 板/jiL)測量光透射。用Fibrintimer 4通道聚集度計(APACT LaborgerSte und Analysensysteme， Hamburg, Germany)在IO分鐘 內(nèi)記錄透射，并表示為任意單位，用血漿調(diào)節(jié)出100%透射。通過加 入膠原(10 |ig/mL)和ADP (5 jiM)來誘導(dǎo)血小板聚集。
出血時間實(shí)驗(yàn)
通過腹膜內(nèi)注射三溴乙醇(Aldrich) (0.15 ml/10 g體重)來 麻醉小鼠，并用解剖刀切下尾尖的3咖節(jié)段。通過用濾紙輕輕吸收血 珠而不接觸傷口部位來監(jiān)視尾部出血。當(dāng)在15秒間隔后在紙上沒有觀 察到血液時，確定出血停止。必要時，在20分鐘后手工停止出血，按 照所指出的，用100 jig/小鼠的hFXII處理小鼠。
制備用于活體顯微鏡檢查的血小板
將小鼠血液(1體積)收集在0. 5體積的含有20 U/mL肝素的Hepes 緩沖液中。將血液以250 g離心10分鐘，并將富含血小板的血漿小心 地轉(zhuǎn)移到新管中。血小板用5-羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞氨基酯 (5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester, DCF)標(biāo) 記，并調(diào)節(jié)到200 x 106個血小板/250 jil的終濃度(Massberg，S.， Sausbier，M. ， Klatt，P'， Bauer,M.， Pfeifer，A. ， Siess，W.， Fassler，R. ，Ruth，P. ，Krombach， F. 和Hofmann， F. (1999).
Increased adhesion and aggregation of platelets lacking cyclic guanosine 3'，5'-monophosphate kinase I.J Exp Med 189， 1255-1264)。 《》
具有FeCl廣誘導(dǎo)的損傷的體內(nèi)血栓形成模型
通過腹膜內(nèi)注射2，2，2-三溴乙醇和2-曱基-2-丁醇(Sigma) (2. 5%溶液，0. 15 ml/10g體重)來麻醉4 — 5周齡的雄性和雌性小鼠。 靜脈內(nèi)注射經(jīng)熒光標(biāo)記的血小板。通過中線腹部切口小心地取出腸系 膜。用裝備有100-W HBO熒光燈源和連接到S-VHS錄像機(jī)(AG-7355, Panasonic, Matsushita Electric, Japan)的CCD照像機(jī)(CV-M300 ) 的Zeiss Axiovert 200倒置顯微鏡(xl0)顯現(xiàn)小動樂K ( 35-50 ,直 徑)。局部施加誘導(dǎo)血管損傷和內(nèi)皮剝脫的FeCl3 (20%)后，監(jiān)視小 動脈40分鐘直到發(fā)生完全的閉塞(血流停止的持續(xù)時間>1分鐘)。 將牢固的血小板粘附測定為直到損傷后5分鐘沉積在血管壁上的熒光 標(biāo)記的血小板的數(shù)目，將血栓表征為直徑大于20,的血小板聚集體， 將血管的閉塞時間表征為達(dá)到血液停止流動至少1分鐘所需的時間。
在所有實(shí)驗(yàn)中，基于暴露的性質(zhì)從每只小鼠選擇最多兩個小動脈。研 究了總共17個wt、 14個FXII-Z-和9個FXI-Z-小動脈。
活體顯微鏡檢查—頸動脈
基本上如所述的，進(jìn)行受損的頸動脈的活體顯微鏡檢查 (Massberg， S. ， Gawaz，M. ， Gruner， S. ， Schulte，V.， Konrad， I.， Zohlnhofer，D.， Heinzmann，U.和Nieswandt，B. (2003). A crucial role of glycoprotein VI for platelet recruitment to the injured arterial wall in vivo. J Exp Med JID - 2985109R 197, 41-49 )。 簡言之，通過腹膜內(nèi)注射氯胺酮/甲苯噻嗪(氯胺酮100 mg/kg， Parke-Davis， Karlsruhe, Germany; 曱苯噢漆5 mg/kg， Bayer AG, Leverkusen， Germany )麻醉小鼠。將聚乙烯導(dǎo)管(Portex， Hythe， England)植入右側(cè)頸靜脈，經(jīng)靜脈內(nèi)輸注發(fā)熒光的血小板(200 x106/250 pi)。通過有力的結(jié)扎來誘導(dǎo)用于內(nèi)皮剝脫的頸動脈損傷。 血管損傷之前和之后，使用具有用于落射式照明的100 W HB0汞燈的 Zeiss Axiotech顯微鏡(20x 7JC浸物鏡，W20x/0. 5， Zeiss, G6ttingen，
板。誘導(dǎo)損傷后5分鐘記錄血小板粘附和血栓形成，并使用計算機(jī)輔 助的圖像分析程序(Visitron， Munich, Germany)來評估錄像磁帶影 像。
肺血栓栓塞
通過腹膜內(nèi)注射2,2,2-三溴乙醇和2-甲基-2-丁醇(Aldrich) (2. 5%溶液，0.15 ml/10g體重)來麻醉小鼠。麻醉的小鼠接受注射 到頸靜脈中的膠原(0.8 mg/kg)和腎上腺素(60 jig/kg)的混合物。 將存活的小鼠的切口縫合，并讓它們恢復(fù)。對于在4%甲醛中固定的 肺進(jìn)行解剖和組織學(xué)研究，并用蘇木精/伊紅對石蠟切片進(jìn)行染色。
血小板計數(shù)
通過在FACScalibur ( Becton Dickinson, Heidelberg, Germany) 上的流式細(xì)胞術(shù)來確定血小板計數(shù)。結(jié)果表示為平均值士S.D，或者表 示為對照的百分比(wt， n = 19; FXII-/-， n = 14;和FcRy-Z-， n =5)。
閉塞時間
將麻醉的小鼠的腹腔縱向打開，并準(zhǔn)備好腹主動脈。在主動脈周 圍放置超聲波流量探測器，并通過用鑷子進(jìn)行一次用力的壓迫來誘導(dǎo) 血栓形成。監(jiān)視血液流動直到發(fā)生完全閉塞。45分鐘后手工停止實(shí)驗(yàn)。 按照所指出的，在即將進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)前經(jīng)靜脈內(nèi)替換人凝血因子XII。
組織病理學(xué)分析
將小鼠處死，快速取出肺，并在41C下在經(jīng)緩沖的4%福爾馬林(pH
7. 4; Kebo )中固定24小時。將組織脫水并用石蠟(Histolab Products AB)包埋，切成4 jim切片，并裝在載玻片上。除去石蠟后，將組織 用Mayers蘇木精(Histolab Products AB)和伊紅(Surgipath Medical Industries, Inc.)染色。
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、Western印跡法和免疫印跡法 (immunoprinting)
在1% (w/v) SDS (Laemmli， 1970 )存在下通過12.5% (w/v)聚 丙烯酰胺凝膠電泳來分離血漿(0，3 fil/泳道)。在IOO mA下將蛋白質(zhì) 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上30分鐘。膜用含有4% (w/v)奶粉和0.05% (w/v) Tween-20的PBS ( pH 7, 4 )封閉。用0. 5 pg/ml抗MBK3的單 克隆抗體(Haaseman J. Immunology 1988 )探測膜。用抗小鼠IgG 的綴合有過氧化物酶的二抗(稀釋度1: 5000 )接著施行化學(xué)發(fā)光檢測 方法來檢測結(jié)合的抗體。
凝血測定
為了確定再鈞化凝血時間，將100 jil用檸檬酸鹽作抗凝血處理 的小鼠血漿(0. 38%檸檬酸鈉)與各100 jil的Horm型膠原(Nycomed， Mtinchen, Germany)、鞣花酸、硫酸軟骨素(都來自Sigma)、高嶺 土或緩沖液(終濃度30 pg/ml)在KC10 "Kugelkoagulometer"
(Amelung, Lemgo， Germany)中在37t:下溫育120秒。為了測試血 小板激活對于FXII依賴性凝血的影響，將經(jīng)洗滌的血小板重懸浮在包 含4 mM Ca"和5 一 Ca"-離子載運(yùn)體A23187 (Sigma)的Tyrode緩沖 液中10分鐘，之后加入至無血小板的血漿中。通過用100 jil 25 mM CaCh-溶液進(jìn)行再鉤化來起始血塊形成，并使用凝血計時器KC4
(Amelung)記錄直到發(fā)生凝血的時間。
凝血分析
使用DadeBehring試劑，根據(jù)生產(chǎn)商對于人樣品所詳細(xì)描述的方
案，用自動化血液凝固系統(tǒng)(BCS， DadeBehring)來測定總體和單一 凝血參數(shù)。BCS測定方案的原理可以從DadeBehring包裝說明書中獲 得，其可以在Dade Behring的網(wǎng)站(http://www.dadebehring.com) 上找到。用來自Asserachrom ( Roche )的ELISA測量D-二聚體。根據(jù) 標(biāo)準(zhǔn)方案，在Sysmex XE 2100上測定外周血細(xì)胞計數(shù)。
凝血酶測量
根據(jù)Aronson等人(Circulation, 1985 )的方法并稍加修改來測 量凝血酶產(chǎn)生。將富含血小板或者無血小板的血漿等分試樣(0. 5 ml ) 置于用Horms型膠原(100 jig/ml, 24小時，41C )包被的圓底聚丙烯 管中，并加入20 jil 1 M Ca'+以起始凝血。以2.5-10分鐘的間隔在 60分鐘內(nèi)向含有90 jil 3. 8%檸檬酸鈉的微量滴定板的孔中加入樣品 (10 nl)。通過加入50 L在1 mol/L Tris ( pH 8.1)中的2 mmol/L S-2238 (H-D-Phe-Arg-冊-NO廣HCl，凝血酶特異性底物；Chromogenix， M61ndal， Sweden )來顯色2分鐘。使用Vmax微量滴定板讀取器(Easy Reader, EAR 340AT, SLT Lab Instruments GmbH, Vienna, Austria) 在405 nm波長下通過分光光度測定法來測量所釋放的有色產(chǎn)物的吸光 度。在每個時間點(diǎn)一式三份地獲得測量值。
統(tǒng)計學(xué)評價
使用不成對Student's t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
盡管在本文中僅僅具體地舉例說明和描述了優(yōu)選的實(shí)施方案，但 是將會認(rèn)識到，按照上面的教導(dǎo)，本發(fā)明的許多修飾和變化都是可能 的并且在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)而不背離本發(fā)明的精神和期望的范 圍。
權(quán)利要求
1.至少一種抗體和/或一種抑制劑用于抑制凝血因子XII以及防止血栓的形成和/或穩(wěn)定化從而防止三維腔內(nèi)血栓生長的用途。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述抗體是抗-FXII抗體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述抗體抑制FXII激活。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的用途，其中所述抑制劑是蛋白酶抑制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的用途，其中所述抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3的用途，其中所述蛋白酶抑制劑選自AT III 抑制劑、血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑、Cl抑制劑、抑酶肽、ot-l蛋白酶 抑制劑、抗蛋白酶([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨基甲?；?-L-Arg-L-Val-Arginal) 、 Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸鹽、DX88、亮抑 蛋白酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白 酶抑制劑、牛胰腺胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素、YAP(刺黃 蓋鰈抗凝蛋白)以及夢瓜胰蛋白酶抑制劑-V和,瓜同效抑制劑。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體和/或抑制劑在醫(yī)學(xué)中的 用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體和/或抑制劑在制備藥物 中的用途。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的抗體和/或抑制劑在治療或預(yù)炎:、補(bǔ);激活、纖維蛋白溶解、血4i生和/或與FXIl4導(dǎo)的激肽形成有關(guān)的疾病如遺傳性血管性水肺、肺的細(xì)菌感染、錐蟲感染、低血壓 性休克、胰腺炎、恰加斯病或關(guān)節(jié)痛風(fēng)中的用途。
10. 包含至少一種抗體和/或一種抑制劑的藥物制劑，其適于抑制 凝血因子XII，并且防止病理學(xué)血栓的形成和/或穩(wěn)定化。
11. 根據(jù)權(quán)利要求8的制劑，其中所述抗體是抗-FXII抗體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求8的制劑，其中所述抗體抑制FXII激活。
13. 根據(jù)權(quán)利要求8的制劑，其中所述抑制劑是蛋白酶抑制劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求8的制劑，其中所述抑制劑是絲氨酸蛋白酶抑制劑。
15. 根據(jù)權(quán)利要求10的制劑，其中所述蛋白酶抑制劑選自AT III 抑制劑、血管緊張肽轉(zhuǎn)變酶抑制劑、Cl抑制劑、抑酶肽、oc-l蛋白酶 抑制劑、抗蛋白酶([(S)-1-羧基-2-苯乙基]-氨基甲?；?-L-Arg-L-Val-Arginal ) 、 Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸鹽、DX88、亮抑 蛋白酶肽、脯氨酰寡肽酶的抑制劑例如Fmoc-Ala-Pyr-CN、玉米胰蛋白 酶抑制劑、牛胰腺胰蛋白酶抑制劑的突變體、大腸桿菌素、YAP(刺黃蓋鰈抗凝蛋白)以及夢瓜胰蛋白酶抑制劑-v和斧瓜同效抑制劑。
16. 凝血因子XII的用途，其通過由至少一種抗體和/或一種抑制 劑抑制凝血因子XII并因而防止血栓的形成和/或穩(wěn)定化或者血栓生長 而用作抗血栓形成的乾標(biāo)。
全文摘要
本發(fā)明涉及至少一種抗體和/或一種抑制劑用于抑制凝血因子XII和防止三維血栓的形成和/或穩(wěn)定化的用途。本發(fā)明還涉及藥物制劑以及凝血因子XII作為抗血栓形成的靶標(biāo)的用途。
文檔編號C07K14/81GK101102819SQ200580046575
公開日2008年1月9日 申請日期2005年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月23日
發(fā)明者B·涅斯萬德特, T·瑞恩尼 申請人:Csl百靈有限公司