專利名稱：：抗動脈粥樣硬化血栓形成劑與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的聯(lián)合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗動脈粥樣硬化血栓形成劑(anti-atherothrombotic)與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angitenshi-convertingenxymeinhibitor,ACEI)的聯(lián)合，還涉及包含它們的藥物組合物。
背景技術(shù)：
：更具體地，本發(fā)明涉及TP受體的特異拮抗劑與ACEI的聯(lián)合。令人驚訝的是，我們已經(jīng)確定該聯(lián)合使得可以抑制E-選擇素(E-selectin)基因的表達，所述E-選擇素是涉及炎癥機制的115kDa的粘附分子，所述E-選擇素事實上在多種病理如糖尿病、動脈粥樣硬化血栓形成疾病、高血壓、肥胖癥、阿爾茨海默病等的特征性炎癥組織中過表達。更準確地，E-選擇素促進白細胞和內(nèi)皮細胞之間的可逆粘附，該粘附為任何炎性過程不可或缺的前提(FrenetteP.S.andWagnerD.D.，從敲除小鼠洞察選擇素的功能，1997,Thromb.andHaem.，78，60-64)。被稱作"翻滾"的該步驟使得必須在內(nèi)皮細胞表面上誘導(dǎo)來自選擇素家族的粘附分子(P-選擇素(或CD62P)和E-選擇素(或CD62E或ELAM，即"內(nèi)皮白細胞粘附分子"))，所述粘附分子隨后與它們的白細胞配體("唾液酸化的碳7jc化合物配體"，"P-選擇素糖蛋白配體1"或PSGL1)相互作用。由此，白細胞在血管內(nèi)皮壁上翻滾的進程被減緩。然后跟隨著被稱作"粘著"的穩(wěn)固粘附步驟，在此期間白細胞將它們自身固定在血管表面上。最后，白細胞通過趨化因子(TNF-a，IL-1，IL-8)梯度^ofii管壁轉(zhuǎn)移至炎癥組織(血細胞滲出)。重要的是注意到E-選擇素表達被限制在內(nèi)皮并應(yīng)答炎性刺激如IL-1，TNF-a或細菌脂多糖(LPS)。存在于細胞表面的E-選擇素的水平在刺激后4到6小時時最大。該過程較長，因為E-選擇素在細胞刺激后從頭合成。激活后24小時E-選擇素水平返回其基線水平，但是在某些情況下，體內(nèi)E-選擇素在細胞表面上持續(xù)更長時間。存在包括E-選擇素的多種粘附分子的循環(huán)形式。這些可溶形式可能由在接近膜插入點的位點處的酶切割產(chǎn)生。這些可溶分子的量與存在于內(nèi)皮細胞表面的粘附分子的水平相關(guān)(LeeuwenbergJFM，SmeetsEF，NeefjesJJ等，體外人內(nèi)皮細胞釋放E-選擇素和細胞間粘附分子1，1992，Immunology,77，543-549)。因此，可溶性粘附分子(更尤其是E-選擇素)循環(huán)水平的提高指示內(nèi)皮細胞的激活(SmithCW，循環(huán)E-選擇素的可能意義，1997，Circulation,95，1986-1988)。已經(jīng)在肥胖癥中確立血漿E-選擇素水平的提高，并已證明其與體重指數(shù)(bodymassindex)正相關(guān)(FerriC,DesideriG，Valenti等，內(nèi)皮粘附分子在肥胖高血壓男性中的早期上調(diào)，1999，Hypertension,34，568-573)。這些患者的心血管系統(tǒng)中提高的氧化應(yīng)激和/或代謝刺激物例如與內(nèi)皮接觸的胰島素可解釋這些觀察結(jié)果。事實上，E-選擇素水平和血管危險之間的相關(guān)性也存在于患有I型或II型糖尿病的糖尿病患者中(BannanS，MansfieldMW，GrantPJ，在NIDD患者的一級親屬中以及在NIDDM患者中可溶性血管細胞粘附分子1和E選擇素的水平與血管危險因素相關(guān)并與E選擇素基因型相關(guān)，1998，Diabetologia,41，460-466)。另外，E-選擇素水平也被認為是與糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥的標記物。胰島素抗性、高血糖癥和高胰島素血癥提高E-選擇素表達，從而解釋了在這些患者中觀察到的對動脈粥樣硬化的易感性。在高血脂癥患者中已經(jīng)廣泛地發(fā)現(xiàn)了循環(huán)的E-選擇素水平的提高，這些水平在降血脂治療后降低(HackmanA，AbeY，InsullW等，在異常脂血癥患者中可溶性粘附分子的水平，1996，Circulation,93，1334-1338)。這提示膽固醇水平影響可溶性E-選擇素的水平。嚴重的異常脂血癥事實上引起內(nèi)皮的功能障礙，其中內(nèi)皮細胞中E-選擇素表達提高。大量研究已經(jīng)顯示E-選擇素的表達及水平和高膽固醇血癥及動脈粥樣硬化之間的相關(guān)性?？紤]到E-選擇素合成被細胞因子誘導(dǎo)的事實，E-選擇素水平的提高可能是血管炎癥的標記物。大量研究也已經(jīng)證明，在患有慢性靜脈疾病的患者中，由靜脈高壓導(dǎo)致的內(nèi)皮細胞的激活和由此造成的粘附分子循環(huán)水平的提高(SaharayM，ShieldsDA，GeorgiannosSN等人，在慢性靜脈疾病患者中內(nèi)皮的激活，1998,EurJVascSurg，15，342-349;VerbeurenTJ，BouskelaE，CohenRA等，粘附分子的調(diào)節(jié)治療慢性靜脈功能不全的新靶點，2000，Microcirculation,7，S41-S48)。另外，在高血壓患者中也描述了提高的E-選擇素水平(FerriC，BelliniC,DesideriG等人，在人類鹽敏感性高血壓中血管損傷的內(nèi)皮標記物的聚類，膳食鈉負載和耗竭的影響，1998，Hypertension,32，862-868)。類似地，文獻中的大量參考資料描述了E-選擇素在腎系統(tǒng)并發(fā)癥中的作用(SingbartlK，LeyK，通過阻斷E選擇素防止缺血-再灌注誘導(dǎo)的^i急性腎衰竭，2000，Crit.Care.Med.28(7)，2507-2514，NakataniK，F(xiàn)ujiiH，HasegawaH等，內(nèi)皮粘附分子在腎小球損傷中在狼療才莫型中與其嚴重性和多樣性有關(guān)，KidneyInt.,65(4)，1290-1300)。也已經(jīng)證明了E-選擇素涉及患有阿爾茨海默病的患者，事實上在這些患者中已觀察到提高的E-選擇素水平(BorroniB，VolpiR，MartiniG，DelBonoR,ArchettiS，ColciaghiF,AkkawiNM，DilucaM，RomanelliG,CaimiL，和PadovaniA，阿爾茨海默病的外周血異常早期內(nèi)皮功能障礙的證據(jù)，2002，Alzheimer'sdiseaseandAssociateddisorders,16(3)，150-155)。最后，大量出版物證明E-選擇素水平涉及瘤轉(zhuǎn)移過程并因此涉及癌癥(KobayashiH，BoelteKC，LinPC,內(nèi)皮細胞粘附分子及癌癥進程，2007，CurrentMedicalChemistry,14，377-386;KneuerC,EhrhardtC，RadomskiMW，BakowskyU，選擇素——潛在的藥理學(xué)靼標？，2006，DrugDiscoveryToday,Vol.11，N。21/22，1034-1040)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及抗動脈粥樣硬化血栓形成劑和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)的聯(lián)合，其中(CH2)「C02H的化合物(A),或者是其可藥用的加成鹽。在專利說明書EP648741中描述了該化合物是TP受體的有效拮抗劑，更具體地是血栓烷A2和前列腺素-內(nèi)過氧化物受體(PGG2-PGH2)的特異拮抗劑。另外還證實該化合物在糖尿病性動脈粥樣化的ApoE一小鼠中顯著降低粘附分子VCAM-1的內(nèi)皮表達(ZuccoUoA，ShiC，MastroianniRetal，血松烷A2受體拮抗劑S18886防止由糖尿病引起的動脈粥樣化形成增加，2005，Circulation,112，3001-3008)。-血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)選自但不僅限于以下化合物培哚普利(perindopril)(任選地以其活性代謝物培哚普利拉(perindoprilate)的形式)，雷米普利(ramipril)(任選地以其活性代謝物雷米普利拉(ramiprilate))的形式，依拉普利(enalapril)(任選地以其活性代謝物依拉普利拉(enalaprilate))的形式，卡托普利(captopril)，賴諾普利(lisinopril),地拉普利(delapril)，福辛普利(fosinopril)，奮那普利(quinapril),螺普利(spirapril),咪達普利(imidapril)，群多普利(trandolapril)(任選地以其活性代謝物群多普利拉(trandolaprilate))的形式，貝那普利(benazepril),西拉普利(cilazapril)，替莫普利(temocapril)，阿拉普利(alacepril),西洛普利(ceronapril)，莫替普利(moveltipril)和莫西普利(moexipril)，及其與可藥用酸或堿的加成鹽?？勺⒁獾侥承〢CEI在用血管緊張素II灌注的ApoE一小鼠的內(nèi)皮細胞中抑制對粘附分子表達的誘導(dǎo)(daCunhaV，ThamDM，Martin-McNultyB等，依拉普利減弱血管緊張素II誘導(dǎo)的動脈粥樣硬化和血管炎癥，2005，Atherosclerosis,178，9-17)。通過研究血檢烷A2-TP受體和腎素-血管緊張素系統(tǒng)之間的相互作用，我們已經(jīng)證明這些途徑在粘附分子表達方面的實質(zhì)性協(xié)同作用。為此，在下述濃度下使用TP受體拮抗劑，所述濃度對人內(nèi)皮細胞中由TNF-a誘導(dǎo)的E-選擇素表達沒有影響。然后針對此相同的濃度，在存在幾種ACEI的多種相似的無活性濃度時實施檢測。然后用兩種化合物的聯(lián)合觀察到人內(nèi)皮細胞中由TNF-a誘導(dǎo)的E-選擇素表達的顯著降低，證明這兩種化合物之間的協(xié)同作用，該協(xié)同作用是無法預(yù)見到的。也已在大鼠的血栓形成和動脈壓試驗中證明了該協(xié)同作用。在該試驗強，并以極為實質(zhì)性的且完全不可預(yù)見的方式提高。該試驗也證明了式(I)的化合物(A)的存在以實質(zhì)性的和不可預(yù)見的方式加強化合物(B)的抗高血壓作用。式(I)的化合物(A)和化合物(B)的聯(lián)合也使得可以在糖尿病性動脈粥樣化小鼠模型中清楚并實質(zhì)性地降低血管細胞粘附分子l(VCAM-l)在主動脈中的表達和纖連蛋白在腎中的表達。這些結(jié)果使得可以想到在藥物的制造中利用聯(lián)合[TP受體拮抗劑/ACEI，所述藥物用于治療血管的和更特別地是心血管和腦血管的并發(fā)癥，所述并發(fā)癥與糖尿病、動脈粥樣硬化血栓形成病、高血脂癥、高血壓癥、慢性靜脈疾病、炎癥、肥胖相關(guān)代謝綜合征或癌癥相關(guān)。在動脈粥樣硬化血栓形成疾病中，根據(jù)本發(fā)明的組合物特別適用于治療心肌梗死、心絞痛、腦卒中綜合征、主動脈瘤或下肢動脈炎。另外，與糖尿病、高血壓或炎性疾病相關(guān)的腎病也是該聯(lián)合[TP受體拮抗劑/ACEI]特別適用的適應(yīng)癥。最后，糖尿病性視網(wǎng)膜病變也屬于本發(fā)明優(yōu)選的治療適應(yīng)癥。血管危險因素和血管疾病如高血壓、月巴胖癥、糖尿病、心臟病、腦血管疾病和高血脂癥及因此動脈粥樣硬化涉及癡呆如阿爾茨海默病和血管性癡呆的發(fā)生(QiuC.，DeRonchiD.和FratiglioniL.，癡呆的流行病學(xué)更新，2007，CurrentOpinioninPsychiatry,20，380-385)。另外，在神經(jīng)變性疾病如阿爾茨海默病中，已》見察到isoprostane水平的提高。這些isoprostane是可能處于疾病源頭的氧化應(yīng)激的標記物以及介質(zhì)(MontuschiP.，BarnesPJ.和JacksonRobertsIIL.，Isoprostanes:氧4匕應(yīng)激的才示^己物和介質(zhì)，2004，TheFASEBJournal,18，1791-1800)。所述isoprostane通過刺激TP受體展示它們的至少部分活性(MontuschiP.，BarnesPJ.AndJacksonRobertsIIL"Isoprostanes:氧化應(yīng)激的標記物和介質(zhì)，2004，TheFASEBJournal,18，1791-1800)，因此它們的活性可以被;Mi合阻斷。如本專利申請中所述研究所證明的，本聯(lián)合作用于血管疾病，所i^jk管疾病是癡呆的危險因素。優(yōu)選的ACEI是式(B)的培咮普利和式(C)的雷米普利及其鹽，更特別的是式(B)的培味普利及其鹽C02EtC02Et(B)(C)在培咮普利的加成鹽中，可以提到但不僅限于與可藥用堿的加成鹽，如叔丁胺鹽、精氨酸鹽、鈉鹽、鉀鹽等。培咮普利優(yōu)選地是叔丁胺鹽或精氨酸鹽的形式。在根據(jù)本發(fā)明的聯(lián)合中，化合物(A)優(yōu)選地是3-[(6R)-6-[[(4-氯苯基)磺酰^J^-2-甲基-5，6，7，8-四氫萘-l-基丙酸，也稱作terutroban。也可設(shè)想涉及其他TP受體拮抗劑如伊非曲班(ifetroban)或雷馬曲班(ramatroban)的類似聯(lián)合。在化合物(A)的加成鹽中，可以提到但不僅限于與可藥用堿的加成鹽，如鈉鹽、鉀鹽、叔丁胺鹽、二乙胺鹽等等。更特別地優(yōu)選terutroban的鈉鹽。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，ACEI和TP受體拮抗劑的量與這些活性成分的性質(zhì)匹配，因此它們的相對比例將隨著活性成分的不同而是可變的。當化合物(A)是鈉鹽形式的terutroban且ACEI是叔丁胺鹽或精氨酸鹽形式的培咮普利時，比例為占活性成分總重量10%到40%的培咮普利和占活性成分總重量60%到90%的terutroban。該聯(lián)合優(yōu)選的百分比為15%到25%的叔丁胺鹽形式的培哚普利對75%到85%的鈉鹽形式的terutroban,和20%到30%的精氨酸鹽形式的培咮普利對70%到80%的鈉鹽形式的terutroban。本發(fā)明還涉及藥物組合物，所述藥物組合物包含化合物(A)和ACEI的聯(lián)合與一種或多種適宜的、惰性的、無毒性的載體或賦形劑，所述化合物(A)和ACEI之一或二者是可藥用鹽的形式。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，活性成分的重量比例(活性成分重量占組合物總重的比例)為從5%到50%。關(guān)于可藥用的賦形劑，可以提到但不僅限于粘合劑、稀釋劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、潤滑劑、芳香劑、香料或甜"未劑。在根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物中，更特別地選擇適用于通過下述途徑施用的那些組合物經(jīng)口、腸胃外并特別為靜脈內(nèi)、經(jīng)皮或透皮的、鼻的、直腸的、經(jīng)舌的、眼的或呼吸途徑，更特別地為片劑或錠劑、舌下片劑、硬明^i^嚢、glossettes、膠嚢、糖錠、可注射制劑、氣霧劑、滴眼劑、滴鼻劑、栓劑、霜劑、軟骨劑、皮膚凝膠等等。優(yōu)選的施用途徑是口服途徑，且相應(yīng)的藥物組合物可以允許活性成分的瞬時或延期釋，放。優(yōu)選的藥物組合物是片劑?？梢愿鶕?jù)病癥的性質(zhì)和嚴重性、施用途徑以及患者的年齡和體重改變單位劑量。在根據(jù)本發(fā)明的組合物中，對于化合物(A)而言單位劑量在從lmg到lOOmg的范圍內(nèi)；并且根據(jù)ACEI的性質(zhì)為每24小時0.5mg到100mg，分一次或多次施用。當ACEI是培咮普利時，施用的每日劑量為從0.5mg到20mg，分一次或多次施用。給出下文的組合物實施例而不含有任何限制的意味。Terutroban/培咮普利片劑實施例1:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>藥理學(xué)結(jié)果體外抑制E-選擇素表達1)細胞培養(yǎng)物在人內(nèi)皮細胞HUVEC(人臍靜脈內(nèi)皮細胞，CloneticsCo)上進行研究。在補充有2%FCS(胎牛血清)和EGM2(內(nèi)皮生長培養(yǎng)基，CloneticsCo)的EBM2培養(yǎng)基(內(nèi)皮1^出培養(yǎng)基，cloneticsCo)中培養(yǎng)細胞。2)E-選擇素啟動子克隆a)通過PCR擴增啟動子通過PCR擴增并亞克隆一條850bp的片段，該片段對應(yīng)于人E-選擇素啟動子，從位置-800的核苷酸延長至+50的核苷酸(登錄號no.M64485;Tamaru等人，激活的經(jīng)典蛋白激酶C和由白介素-l卩而非肺瘤壞死因子a引起的信號的共存在協(xié)同地誘導(dǎo)E選擇素基因表達，1999，J.Biol.Chem，274，3753-3763)。在100ji1的最終反應(yīng)體積中，在存在l照人基因組DNA(Clontech)、200nMdNTP(三磷酸脫氧核苷酸)(Clontech)和200ng引物時，向含有酶特異的緩沖液的介質(zhì)中添加5個單位的天然pyrococcusfuriosus(Pfu)DNA聚合酶(Stratagene)。使用的引物組如下5，-GAGCTTAAGCTTCTGTCTCAGGTCAGTATAGG(SEQIDNO.2)在GeneAmpPCR系統(tǒng)9700設(shè)備上進行的PCR程序包括在94。C起始1分鐘，然后擴增35個循環(huán)(94X:l分鐘，55n1分鐘，72"C3分鐘)。然后在存在pH5.2的0.3M乙酸鈉和乙醇時在-20lC過夜沉淀PCR產(chǎn)物。于4X:在14000rpm離心后，將沉淀物重懸于70%乙醇中并再次于4匸在14000rpm離心。然后干燥獲得的沉淀并隨后溶于水中。b)消化啟動子序列然后用限制性酶KpnI和HindIII在兩個步驟中消化擴增的序列。在存在30個單位酶和lOOjig/mlBSA(牛血清白蛋白)時，于30"C將擴增的序列消化1小時30分鐘。每次消化后，將獲得的產(chǎn)物在MicroBio-Spin色鐠柱(Bio-Rad)上系統(tǒng)地純化，以去除緩沖鹽。c)構(gòu)建PGL3/E-選擇素質(zhì)粒根據(jù)與插入物相同的方案用限制性酶KpnI和HindIII消化含有螢火蟲螢光素酶基因的pGL3Basic質(zhì)粒(Promega)，然后在低熔點的1%瓊脂糖凝膠上純化。使用T4-DNA連接酶(來自Promega的LigaFastTM快速DNA連接系統(tǒng))進行pGL3-Basic質(zhì)粒載體與對應(yīng)于E-選擇素啟動子的插入物的連接。常規(guī)地，在連接期間使用等于載體量三倍的過量的插入物。另外，因為該插入物是載體長度的六分之一(0.85kb對4.8kb)，維持化學(xué)計量平衡需要載體量的六倍。因此，在存在3個單位的T4連接酶時，在室溫下將10.6ng插入物和25ngpGL3Basic載體反應(yīng)。3)HUVEC細胞的轉(zhuǎn)染在第四次傳代之前將PGL3/E-選擇素質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進HUVEC細胞中。轉(zhuǎn)染在50%細胞匯合的平板中進行，在每孔中存放Lipofectin⑧(Invitrogen)和3ngPGL3/E-選擇素質(zhì)粒。先在OPTI-MEM培養(yǎng)基(GIBCCFM)中將Lipofectin(6ng/ml)活化30分鐘，然后與先已用培養(yǎng)基稀釋的質(zhì)粒接觸15分鐘。在含5%C02和95。/。02的空氣中將細胞于37*€下孵育4小時。去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基并用滋養(yǎng)培養(yǎng)基置換過夜，從而穩(wěn)定細胞。在不含血清的M199培養(yǎng)基(GIBCOTM)中經(jīng)4小時誘導(dǎo)報告基因的表達。刮取細胞并在裂解緩沖液(Dual-Luciferase⑧試劑盒，Promega)中裂解，然后儲存于-20'C。HUVEC細胞的誘導(dǎo)期在存在100U/ml胂瘤壞死因子-a(TNF-a)時為4小時。在該誘導(dǎo)期內(nèi)，一方面添加不同濃度的一培味普利拉(0至ij100nM)，terutroban納鹽(0到100jiM)，或terutroban鈉鹽(30jiM)+不同濃度的培咮普利拉(10、30和IOOjiM)(表l)，另一方面添加不同濃度的-雷米普利拉(0到100nM)，terutroban鈉鹽(0到100fiM)，或terutroban鈉鹽(10nM)+不同濃度的雷米普利拉(30和lOOfiM)(表2)。4)測定啟動子活性通過定量產(chǎn)生的螢光素酶活性(Dual-Luciferase⑧試劑盒，Promega)確定E-選擇素啟動子活性。向每孔中添加縈火蟲螢光素酶的底物營光素溶液。這導(dǎo)致光的發(fā)射。因為縈光素酶活性是光敏性的，故將平板在暗中孵育10分鐘，然后開始發(fā)光計讀數(shù)，從而定量發(fā)射的光子(Wallac，PerkinElmer)，獲得的結(jié)果是為期5秒的平均cpm(每分鐘的計數(shù))。5)terutroban-培咮普利的結(jié)果用TNF-a裔導(dǎo)后在HUVEC細胞上以不同濃度(0、10、30、IOOjiM)分開地測試鈉鹽形式的terutroban(化合物A)和活性代謝物培哚普利拉形式的培咮普利(化合物B)。以類似的方式，研究鈉鹽形式的化合物A(30nM)+不同濃度的活性代謝物形式的化合物B(0、10、30、100nM)。在該誘導(dǎo)的狀態(tài)下在對照條件下和在存在產(chǎn)品時測量E-選擇素啟動子的活性?；钚栽诒韑中給出，所述活性以cpm表示并表示為對照觀察結(jié)果的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表l:在TNF-a誘導(dǎo)的條件(lOOU/ml)下，在存在化合物A的鈉鹽或化合物B的活性代謝物，或存在化合物A的鈉鹽(30jiM)+化合物B的活性代謝物時測量E-選擇素啟動子的活性。*p<0.05;**p<0.01相對于對照單因數(shù)ANOVA，及Dunnett后檢驗(post-testDunnett)(n=4-5)Terutroban鈉鹽和活性代謝物培哚普利拉形式的培咮普利在測試的濃度下對E-選擇素基因的表達沒有影響。將培咮普利拉與terutroban鈉鹽(30fiM)共同孵育時，從10jiM培咮普利拉起觀察到E-選擇素基因表達的抑制(與無產(chǎn)品時的100%相比，60.8%的E-選擇素基因表達活性；p<0.01，單因數(shù)ANOVA，及Dunnett后檢驗)。料的實質(zhì)性協(xié)同作用。6)terutroban-雷米普利的結(jié)果用TNF-a誘導(dǎo)后在HUVEC細胞上以不同濃度(0、30、100jiM)分開地測試鈉鹽形式的terutroban(化合物A)和活性代謝物雷米普利拉形式的雷米普利(化合物C)。以類似的方式，研究鈉鹽形式的化合物A(10pM)+不同濃度的活性代謝物形式的化合物((0、30、100nM)。在該誘導(dǎo)的狀態(tài)下在對照*下和在存在產(chǎn)品時測量E-選擇素啟動子的活性?；钚栽诒?中給出，所述活性以cpm為單位并表示為對照觀察結(jié)果的百分比。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>表2:在TNF-a誘導(dǎo)的條件(IOOU/ml)下，在存在化合物A的鈉鹽或化合物C的活性代謝物時，或在存在化合物A的鈉鹽(10pM)+化合物C的活性代謝物時測量E-選擇素啟動子的活性。**p<0.01相對于對照單因數(shù)ANOVA，及Dunnett后檢驗(11=3)。試的濃度下對E-選擇素基因的表達沒有影響。將雷米普利拉與temtroban鈉鹽(10pM)共同孵育時，從30^iM雷米普利拉起觀察到E-選擇素基因表達的抑制(與無產(chǎn)品的100%相比，55.2%的E-選擇素基因表達活性；p<0.01，單因數(shù)ANOVA,及Du騰tt后檢驗)。料的實質(zhì)性協(xié)同作用。一方面，鈉鹽形式的terutroban(化合物A)和活性代謝物形式的培咮普利(化合物B)的聯(lián)合，另一方面鈉鹽形式的terutroban(化合物A)和活性代謝物形式的雷米普利(化合物C)的聯(lián)合的結(jié)果顯示，式(I)的化合物(A)與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑之間的聯(lián)合具有完全出乎預(yù)料的實質(zhì)性協(xié)同作用。在大鼠中抑制血栓形成和動脈壓1)i殳備和方法使用的血栓形成技術(shù)是Tanaka和同事的技術(shù)(Eur.J.Pharmacol.,2008;401，:413畫18)。a)動樂，血栓形成使用戊巴比妥50mg/kgIP麻醉CD大鼠(350-375g)并置于恒溫控制的毯子上。剖腹手術(shù)后，暴露主動脈。通過將用FeCl350。/。飽和的濾紙(8mm)小球置于適當位置10分鐘誘導(dǎo)血栓形成。去除小球后20分鐘，將動脈結(jié)扎并切開；稱重形成的凝塊。用0.1mg/kg劑量的鈉鹽形式的terutroban(化合物A)處理一些動物，用lmg/kg劑量的叔丁胺鹽形式的培咮普利(化合物B)處理另一些動物，并用0.1mg/kg劑量的鈉鹽形式的terutroban(化合物A)加lmg/kg劑量的叔丁胺鹽形式的培咮普利(化合物B)處理其它動物ob)動脈壓使用戊巴比妥(50mg/kgIP)麻醉后，將動物置于恒溫控制的趙子上。暴露頸動脈并引入導(dǎo)管，從而借助于與AcqKnowledge軟件相連的Gould感應(yīng)器監(jiān)測動脈壓。在處理后1小時記錄30分鐘動脈壓。用0.1mg/kg劑量的鈉鹽形式的terutroban(化合物A)處理一些動物，用0.3mg/kg劑量的叔丁胺鹽形式的培味普利(化合物B)處理另一些動物，并用O.lmg/kg劑量的鈉鹽形式的terutroban(化合物A)加0.3mg/kg劑量的叔丁胺鹽形式的培哚普利(化合物B)處理其它動物。2)結(jié)果a)動務(wù)^血栓形成對照大鼠中的凝塊重量是17.1±1.3mg;用0.1mg/kgterutroban(化合物A)鈉鹽處理不改變該重量16.8±1.3mg。對照大鼠中的凝塊重量是15.6±0.7mg;用1mg/kg培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽處理不改變該重量15.2±1.1mg。對照大鼠中凝塊的重量為16.3±0.8mg;用0.1mg/kgterutroban(化合物A)鈉鹽與1mg/kg培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽的聯(lián)合處理4吏凝塊的重量顯著地降低至10.1±0.6mg。這些結(jié)果證明兩種物質(zhì)在動樂^血栓形成方面具有預(yù)料不到的協(xié)同作用。b)動脈壓對照大鼠的動脈壓是131±7mmHg。0.1mg/kgterutroban(化合物A)鈉鹽或0.3mg/kg(這在大鼠中是無活性的劑量)培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽均不改變該動脈壓分別為126±7mmHg和120±9mmHg。Terutroban(化合物A)鈉鹽與培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽的聯(lián)合將動JI^壓明顯地且顯著地降寸氐至95±7mmHg。該試驗證明terutroban(化合物A)與培咮普利(化合物B)的聯(lián)合在血栓形成和動樂，壓方面的抑制活性，并相應(yīng)地闡明了使用該聯(lián)合治療動脈病如血栓形成疾病(心M^死、心絞痛、腦卒中綜合征、下肢動脈炎等)和高血壓癥的潛力。體內(nèi)抑制主動脈血管細胞粘附分子l(VCAM-l)和腎纖連蛋白的表達在該研究中使用四組栽脂蛋白E缺陷的小鼠(ApoE一，它們的主動脈中自發(fā)形成動脈粥樣化斑)，每組9只。在8周齡時，通過在5天內(nèi)5次腹膜內(nèi)注射70mg/kg鏈唑霉素使小鼠患糖尿病。在第9周將動物分為四組不處理的對照組、用terutroban(化合物A)鈉鹽處理(食物中1mg/kg/天)的組、用培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽處理(飲水中0.1mg/kg/天)的組，和用terutroban(化合物A)鈉鹽(食物中1mg/kg/天)與培咪普利(化合物B)叔丁胺鹽(飲水中O.lmg/kg/天)的聯(lián)合處理的組。對于腎纖連蛋白的表達而言，將小鼠處理6周然后在使用異氟烷麻醉后處死。對于主動脈VCAM-1的表達而言，將小鼠處理13周然后處死。切下主動脈和右側(cè)腎，解剖并冷凍在液氮中。將組織冷凍磨碎并使用RNeasy孩支量試劑盒(Qiagen)提取總RNA。然后使用SuperscripTMIII第一鏈cDNA合成試劑盒(Invitrogen)在1照總RNA上進行反轉(zhuǎn)錄。通過實時PCR定量主動脈VCAM-1的表達和腎纖連蛋白的表達，并根據(jù)3個參考基因?qū)⑵錁藴驶痯-肌動蛋白、次黃噤呤鳥噪呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(HPRT)和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)。使用IQTMSYBRGreensupermix試劑盒(Biorad)，2^1cDNA和每種引物各150nM。將樣品在95"C變性5分鐘并才艮據(jù)以下的方案擴增40個循環(huán)在95C下變性20秒，對于纖連蛋白而言在52X:下、對于VCAM-1、p-肌動蛋白和HPRT而言在54t:下、對于GAPDH而言在56X:下雜交和延伸1分鐘。根據(jù)參考基因(視為100%)將未處理動物的主動脈VCAM-1和腎纖連蛋白的閾值循環(huán)(定義為熒光被認為顯著高于背景噪音時的循環(huán))標準化，然后與處理動物的進行比較。使用的特異引物如下VCAM-1:5，-AGAGCAGACTTTCTATTTCAC-3,(有義)(8￡()IDNO,3)和5，-CCATCTTCACAGGCATTTC-3，(反義)(SEQIDNO.4)纖連蛋白5，-TGACAAATACACTGGGAAC-3，(有義)(SEQIDNO,5)和5，-GCCAATCTTGTAGGACTG-3，(反義)(SEQIDNO.6)P-肌動蛋白5，-AAGACCTCTATGCCAACACAG陽3，(有義)(SEQIDNO,7)和5，-AGCCACCGATCCACACAG-3，(反義)(SEQIDNO.8)HPRT:5，-AGCTACTGTAATGATCAGTCAACG國3，(有義)(SEQIDNO.9)和5，-AGAGGTCCTTTTCACCAGCA畫3，(反義)(SEQIDNO.10)GAPDH:5，-GCCTTCCGTGTTCCTACCC-3，(有義)(SEQIDNO.ll)和5，畫TGCCTGCTTCACCACCTT-3，(反義)(SEQIDNO,12)。通過將主動脈VCAM-1和腎纖連蛋白的表達水平與未處理的動物(視為100%)比較來評價化合物terutroban(化合物A)鈉鹽、培哚普利(化合物B)叔丁胺鹽及它們的聯(lián)合的活性。腎纖連蛋白用terutroban(化合物A)鈉鹽或培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽單獨處理小鼠對腎纖連蛋白基因的表達沒有顯著影響(與未處理的100%相比，terutroban(化合物A)鈉鹽為69±16%，培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽為86±9.9%，NS，單因數(shù)ANOVA，及Dunnett后檢驗)。當用terutroban(化合物A)鈉鹽和培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽的聯(lián)合處理小鼠時,觀察到纖連蛋白基因表達的抑制(與未處理的100%相比為43±9.1%，P<0.01，單因數(shù)ANOVA,Du騰tt后檢驗)。主動務(wù)KVCAM-1用terutroban(化合物A)鈉鹽或培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽單獨處理小鼠對主動脈VCAM-1基因的表達沒有顯著影響(與未處理的100%相比，terutroban(化合物A)鈉鹽的殘余表達為88±22%，且培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽的殘余表達為76±21%,NS，單因數(shù)ANOVA,Dunnett后檢驗)。當用terutroban(化合物A)鈉鹽和培咮普利(化合物B)叔丁胺鹽的聯(lián)合處理小鼠時，觀察到VCAM-1基因表達的抑制(與未處理的100%相比，殘余表達為27±6.2%,P<0.01,單因數(shù)ANOVA，Du匿tt后檢驗)。因此，用聯(lián)合terutroban(化合物A)鈉鹽/培咪普利(化合物B)叔主動脈中VCAM-1的表達和腎中纖連蛋白的表達，這相對于未處理的動物，或相對于用terutroban(化合物A)鈉鹽或培味普利(化合物B)叔丁胺鹽單獨處理的動物均是事實。該結(jié)果非常清楚地說明聯(lián)合施用這兩種化合物使得可以獲得完全出乎預(yù)料的實質(zhì)性協(xié)同作用。該試驗證明了聯(lián)合terutroban(化合物A)/培咮普利(化合物B)對治療動脈病的潛能，所述動脈病如與糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥、高血壓癥、動脈粥樣硬化、炎癥、與肥胖相關(guān)的代謝綜合征，與肥胖相關(guān)的血管并發(fā)癥、心絞痛、下肢動脈炎和腦卒中綜合征?？紤]到粘附分子在靜脈疾病中所起的作用，該聯(lián)合也可治療該疾病。序列表<110>瑟維爾實驗室(LesLaboratoiresServier)<120〉抗動脈粥樣硬化血栓形成劑與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑的聯(lián)合<130>18886-PERIND0〈160〉12<170〉Patentlnversion3.5<210>1<211〉32<212〉DNA<213>人工序列<220><223>引物<220><221><222〉(1)..(32)<400>1ggatccggtaccgagatggcgtttctccatgt32<210>2<211〉32<212〉腿<213>人工序列<220〉<223〉引物<220〉<221〉引物結(jié)合<222〉(1)..(32)<400〉2gagcttaagcttctgtctcaggtcagtatagg32〈210〉3〈211〉21<212〉腿〈213〉人工序列<220><223>引物<220><221>引物結(jié)合<222〉(1)..(21)〈400〉3agagcagactttctatttcac21<210〉4<211〉19<212>DNA<213〉人工序列<220〉<223〉引物<220〉<221〉引物結(jié)合<222>(1)..(19)<400〉4ccatcttcacaggcatttc19〈210〉5<211〉19<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物〈220〉〈221〉引物結(jié)合<222〉(1),,(19)<400〉5tgacaaatac3ctggg肪c〈210〉6<211〉18<212〉瞧<213〉人工序列<220>〈223〉引物<220><221〉引物結(jié)合<222〉(1)..(18)<400〉6gccaatcttgtaggactg<210〉7<211〉21〈212>廳<213>人工序列<220><223〉引物<220><221>引物結(jié)合〈222〉(1)..(21)〈400〉7aagacctctatgccaacacag<210〉8<211>18<212〉DNA〈213〉人工序列說明書第20/22頁1918<220><223>引物<220〉<221>引物結(jié)合<222〉(1)..(18)<400〉8agccaccgatccacacag18<210〉<211〉<212〉〈213〉〈220〉<223〉<220><221〉<222〉924腿人工序列l(wèi)物引物結(jié)合(l)..(24)<400>9agctactgtaatgatcagtcaacg24<210>〈211〉<212〉<213>1020廳人工序列〈220〉<223>引物<220><221><222>引物結(jié)合<400>10agaggtccttttcaccagca20<210>11<211〉19〈212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉引物<220><221>引物結(jié)合〈222〉(1)..(19)〈400〉11gccttccgtgttcctaccc19<210>12〈211>18<212>DNA<213>人工序列<220〉<223>引物<220〉〈221〉引物結(jié)合〈222〉(1)..(18)〈400>12tgcctgcttcaccacctt18權(quán)利要求1、式(I):的化合物(A)或其可藥用鹽之一與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或其可藥用鹽之一的聯(lián)合，其中所述化合物(A)任選地為光學(xué)異構(gòu)體形式。2、根據(jù)權(quán)利要求l的聯(lián)合，特征在于化合物(A)是terutroban,3、根據(jù)權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的聯(lián)合，特征在于化合物(A)是鈉鹽的形式。4、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3中任一項的聯(lián)合，特征是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是培咮普利，任選地以其活性代謝物培咮普利拉的形式；雷米普利，任選地以其活性代謝物雷米普利拉的形式；依拉普利，任選地以其活性代謝物依拉普利拉的形式；卡托普利，賴諾普利，地拉普利，福辛普利，喹那普利，螺普利，咪達普利；群多普利，任選地以其活性代謝物群多普利拉的形式；貝那普利，西拉普利，替莫普利，阿拉普利，西洛普利，莫替普利或莫西普利，或它們與可藥用酸或堿的加成鹽。5、根據(jù)權(quán)利要求1到4中任一項的聯(lián)合，特征是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑是式(B)的培咮普利或其與可藥用酸或堿的加成鹽。6、根據(jù)權(quán)利要求5的聯(lián)合，特征是式(B)的培味普利是叔丁胺鹽或精氨酸鹽的形式，7、包含根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的聯(lián)合作為活性成分以及一種或多種惰性的、可藥用的賦形劑或載體的藥物組合物。8、根據(jù)權(quán)利要求7的藥物組合物，特征是活性成分的總重量被分為60%到90%的化合物(A)和10%到40%的式(B)的培哚普利。9、根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的藥物組合物，其被用于治療與糖尿病、動脈粥樣硬化血栓形成病、高血脂癥、高血壓癥、慢性靜脈疾病、炎癥、肥胖相關(guān)代謝綜合征或癌癥相關(guān)的血管并發(fā)癥。10、根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其用于治療與糖尿病、動脈粥樣硬化血松形成病、高血脂癥、高血壓癥、慢性靜脈疾病、炎癥、肥胖相關(guān)代謝綜合征或癌癥相關(guān)的心血管和腦血管并發(fā)癥。11、根據(jù)權(quán)利要求9或權(quán)利要求10的藥物組合物，其用于治療心M^死、腦卒中綜合征、主動脈瘤或下肢動脈炎。12、根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其用于治療與糖尿病、高血壓癥或炎性疾病相關(guān)的腎病。13、根據(jù)權(quán)利要求9的藥物組合物，其用于治療糖尿病性視網(wǎng)膜病變或腎病。14、根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求8的藥物組合物，其用于治療癡呆。15、根據(jù)權(quán)利要求14的藥物組合物，其用于治療阿爾茨海默病或血管性癡呆。16、根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的聯(lián)合在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療與糖尿病、動脈粥樣硬化血栓形成病、高血脂癥、高血壓癥、慢性靜脈疾病、炎癥、肥胖相關(guān)代謝綜合征或癌癥相關(guān)的血管并發(fā)癥。17，根據(jù)權(quán)利要求16的聯(lián)合在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療與糖尿病、動脈粥樣硬化血栓形成病、高血脂癥、高血壓癥、慢性靜脈疾病、炎癥、肥胖癥相關(guān)代謝綜合征或癌癥相關(guān)的心血管和腦血管并發(fā)癥。18、根據(jù)權(quán)利要求16或權(quán)利要求17的聯(lián)合的用途，特征是動脈粥樣硬化血松形成病是心M^使死、腦卒中綜合征、主動脈瘤或下肢動脈炎。19、根據(jù)權(quán)利要求16的聯(lián)合的用途，特征是血管并發(fā)癥是與糖尿病、高血壓癥或炎性疾病相關(guān)的腎病。20、根據(jù)權(quán)利要求16的聯(lián)合的用途，特征是血管并發(fā)癥是糖尿病性視網(wǎng)膜病變或腎病。21、根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的聯(lián)合在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療與糖尿病相關(guān)的血管并發(fā)癥。22、根據(jù)權(quán)利要求1到6中任一項的聯(lián)合在制造藥物中的用途，所述藥物用于治療癡呆。23、根據(jù)權(quán)利要求22的聯(lián)合的用途，特征是該癡呆為阿爾茨海默病或血管性癡呆。全文摘要本發(fā)明提供抗動脈粥樣硬化血栓形成劑與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)的聯(lián)合，以及包含它們的藥物組合物，其中所述抗動脈粥樣硬化血栓形成劑為式(I)的化合物或其可藥用鹽；其中所述式(I)化合物任選地為光學(xué)異構(gòu)體形式。文檔編號A61K45/00GK101385723SQ20081021355公開日2009年3月18日申請日期2008年9月11日優(yōu)先權(quán)日2007年9月11日發(fā)明者A·呂潘,G·拉維埃勒,L·勒龍,M-D·弗拉塔奇,M-O·瓦萊,P·桑塞爾維斯特里-莫雷,T·韋伯朗申請人:瑟維爾實驗室