專利名稱：：花色苷及對(duì)chop基因的調(diào)控在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種花色苷單體，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷在制備預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物和保健食品中的用途；同時(shí)涉及對(duì)CHOP(C/EBP同源蛋白)基因的調(diào)控在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：100多年來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化的流行呈越演越烈之勢(shì)，在世界范圍內(nèi)，動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成導(dǎo)致的死亡人數(shù)占全部死亡人數(shù)的52%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了第二位死因的腫瘤(24%),成為名副其實(shí)的死亡第一殺手。動(dòng)脈粥樣硬化是一種全身性疾病，可導(dǎo)致全身主要器官，如心、腦、腎乃至肢體等功能障礙而嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，還給家庭和社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此，尋找高效、低毒藥物預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化顯得十分必要。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚未完全明了。近年來(lái)越來(lái)越多的研究證實(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已知的一些心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，如同型半胱氨酸、肥胖和細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇的積聚均能引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則可能通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的積聚，激活炎癥反應(yīng)通路和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路的激活可能是動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程中的共同發(fā)病機(jī)制，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)通路中的關(guān)鍵因子也可能成為動(dòng)脈粥樣硬化治療的新耙點(diǎn)。CHOP，即C/EBP同源蛋白，也稱為生長(zhǎng)停滯和DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153(GADD153)或DNA損傷誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄子3(DDIT3)，是聯(lián)系內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與細(xì)胞凋亡的重要中間信號(hào)分子。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)CHOP基因的表達(dá)，可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡而致內(nèi)皮功能損傷，引發(fā)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌的凋亡致細(xì)胞殘骸沉積在血管，從而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CHOP一巨噬細(xì)胞對(duì)膽固醇誘導(dǎo)的凋亡不敏感。這些發(fā)現(xiàn)均強(qiáng)烈支持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化的主要因素之一。目前，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化尚無(wú)一種很有效的防治藥物和方法?？箘?dòng)脈粥樣硬化研究的主要方向集中在通過(guò)調(diào)脂、抗氧化、抗血小板聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)內(nèi)皮功能等方法抑制斑塊增長(zhǎng)，通過(guò)抗炎、抑制細(xì)胞因子表達(dá)、阻止基質(zhì)降解、抗細(xì)胞凋亡等穩(wěn)定斑塊。有些藥物在降脂和預(yù)防斑塊破裂上顯示較好作用，但其副作用也不可小視。動(dòng)脈粥樣硬化的主要預(yù)防措施是健康飲食，適當(dāng)運(yùn)動(dòng)。因此找到一種既可以預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化，又具有治療作用的物質(zhì)呢？自1987年發(fā)現(xiàn)法國(guó)某些地區(qū)人民高脂肪膳食卻出現(xiàn)低冠心病死亡率的所謂"法蘭西悖論"后，法國(guó)葡萄酒的主要成分花青素引起了人們的極大的關(guān)注。花青素是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，是黃酮類中的多酚化合物。自然條件下游離的花青素極少見(jiàn)，常與單糖形成糖苷，即花色苷?；ㄉ諒V泛存在于植物的果實(shí)、種子、花和外皮中，也存在于某些飲料(茶葉、啤酒)、蔬菜、水果和糧食中。攝入的花色苷在胃和小腸吸收后，很快達(dá)到最高血液濃度。血漿半衰期約7小時(shí)，體內(nèi)保留時(shí)間達(dá)達(dá)72小時(shí)，其生物可利用度高，基本無(wú)毒。近幾年的研究顯示，花色苷具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、防治心腦血管疾病、降血糖、抗炎、抗腫瘤、促進(jìn)視力等多種藥理作用。特別是其在防治心血管疾病中的作用令人振奮。研究顯示花色苷能有效清除自由基，保護(hù)血管內(nèi)皮抵抗過(guò)氧化亞硝基陰離子引起的內(nèi)皮功能障礙；能改善彈性纖維抗降解能力，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管壁的正常功能；可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合成酶的活性，提高一氧化氮水平，舒張血管；在體外實(shí)驗(yàn)中，花色苷能明顯抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集；可以有效地降低膽固醇及低密度脂蛋白水平，預(yù)防心腦血管疾病的發(fā)生；用花色苷加膽固醇喂養(yǎng)的家兔，其血漿膽固醇水平、巨噬細(xì)胞攝取氧化型低密度脂蛋白以后轉(zhuǎn)變成泡沫細(xì)胞的數(shù)量以及主動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生率均低于單純喂養(yǎng)膽固醇家兔。花色苷還能顯著改善載脂蛋白E基因4缺陷小鼠血脂代謝，抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成并增加其穩(wěn)定性。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，花色苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白核因子KB而影響多種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)因子的基因表達(dá)，包括血管細(xì)胞粘附分子-1、細(xì)胞間粘附分子-1。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，用黑醋栗汁來(lái)源的花色苷喂養(yǎng)遺傳性高脂血癥兔，發(fā)現(xiàn)花色苷對(duì)高脂血癥兔的血脂代謝無(wú)影響，并不能拮抗動(dòng)脈粥樣硬化的形成?；ㄉ盏倪@些不同結(jié)果是什么原因造成的呢？由于目前對(duì)于花色苷抗動(dòng)脈粥樣硬化的研究，多選用不同植物來(lái)源的花色苷提取混合物，從單體成分獲得的數(shù)據(jù)甚少，從而決定了現(xiàn)今已有研究結(jié)果的不確定性。同時(shí)，大多數(shù)研究均局限在對(duì)調(diào)脂療效、主動(dòng)脈粥樣斑塊厚度、面積及某些生化指標(biāo)的觀察上，較少深入到對(duì)細(xì)胞及亞細(xì)胞活性物質(zhì)表達(dá)及機(jī)制的水平。由于天然來(lái)源的花色苷的無(wú)毒或低度特性，運(yùn)用現(xiàn)代的先進(jìn)研究萬(wàn)法和新技術(shù)手段對(duì)花色苷單體的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用及其機(jī)理加以闡述和證明，無(wú)疑將推動(dòng)其在世界范圍內(nèi)的推廣和應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種花色苷在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的用途；以及調(diào)控CHOP基因的表達(dá)在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。具體涉及一種花色苷的單體，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷改善氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系損傷的作用，并探討其作用機(jī)制。因此，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷可在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明采用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞(小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，來(lái)源于上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCM13)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，目錄號(hào)74397)對(duì)ox-LDL處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響。并提取細(xì)胞總RNA，用AflfymetrixMouseU4302.0基因表達(dá)譜芯片(來(lái)源于美國(guó)Affymetrix公司)進(jìn)行標(biāo)記雜交實(shí)驗(yàn)，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法對(duì)Affyemtrix基因芯片的掃描結(jié)果進(jìn)行差異基因分析，篩選出差異基因，隨后采用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)表達(dá)的差異基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，具體探討矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷的作用機(jī)制。具體
發(fā)明內(nèi)容如下A.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷為花色苷單體(購(gòu)買于美國(guó)Sigma公司，目錄號(hào)74397)，可人工合成，研究證實(shí)無(wú)任何毒副作用。B.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的作用將培養(yǎng)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞(來(lái)源于上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCM13)接種于96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成80~90%融合的單層后，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、30、60、90、120、150pmol/L花色苷組，每組重復(fù)8孔，分別加以0、30、60、90、120、150pmol/L矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷處理，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后，以3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍(lán)，MTT)法檢測(cè)細(xì)胞的存活率，倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)。-C.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)致小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系損傷的改善作用將培養(yǎng)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)成80~90%融合的單層后，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、0、30、60、90、120pmol/L花色苷組，每組重復(fù)8孔，實(shí)驗(yàn)中先以0、30、60、90、120pmol/L濃度的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷預(yù)處理細(xì)胞1小時(shí)，然后加入ox-LDL(終濃度40mg/L)，空白對(duì)照組用無(wú)血清常規(guī)RPMI1640培養(yǎng)基代替ox-LDL和花色苷，置于37。C、5%(302培養(yǎng)箱中共同孵育24小時(shí)后，以倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率。'D.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系基因表達(dá)譜的作用將培養(yǎng)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于60ml培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)成80~90%融合的單層后，隨機(jī)分為3組，g卩①對(duì)照組RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L;③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的花色苷培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL。每組重復(fù)3次，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞，分別提取純化各組細(xì)胞總RNA，利用AffymetrixMouseU4302.0基因表達(dá)譜芯片(來(lái)源于美國(guó)Affymetrix公司)進(jìn)行標(biāo)記雜交實(shí)驗(yàn)，RMA(Robustmultiarrayanalysis)法對(duì)Affyemtrix基因芯片的掃描結(jié)果進(jìn)行差異基因分析，篩選出差異基因。E.矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系CHOP(C/EBP同源蛋白)基因表達(dá)的作用將培養(yǎng)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于60ml培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長(zhǎng)成80~卯％融合的單層后，隨機(jī)分為3組，即①對(duì)照組RPMI1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L;③花色苷+OX-LDL組先用60(amol/L的花色苷培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL。每組重復(fù)3次，各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞，分別提取純化各組細(xì)胞總RNA，用實(shí)時(shí)定量PCFi法對(duì)基因芯片篩選出的差異基因CHOP的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷為一種花色苷的單體，化學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，可人工合成，研究證實(shí)無(wú)任何毒副作用。2、本發(fā)明表明，當(dāng)矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、卯、120pmol/L時(shí)，小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞呈橢圓形，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，MTT結(jié)果顯示細(xì)胞活力與正常對(duì)照組沒(méi)有顯著差異。說(shuō)明矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30120pmol/L范圍內(nèi)為安全濃度。3、本發(fā)明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30~120pmol/L范圍內(nèi)均可改善ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞的損傷作用，且其改善作用沒(méi)有劑量依賴性。4、本發(fā)明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷主要保護(hù)了ox-LDL對(duì)脂質(zhì)內(nèi)膜的破壞，增強(qiáng)了細(xì)胞增殖能力和組織結(jié)構(gòu)的再形成能力。5、本發(fā)明表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷能降低ox-LDL導(dǎo)致的編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中關(guān)鍵CHOP蛋白基因的高表達(dá)，減輕動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，從而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。圖1.不同濃度花色苷作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞活力比較。*與對(duì)照組比較，P<0.05。圖2.不同濃度花色苷對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞活力的影響。*與對(duì)照組比較，P<0.05;#與ox-LDL組比較，P<0.05。圖3.顯微鏡下觀察120nmol/L花色苷對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理RAW264.7巨噬細(xì)胞的形態(tài)(x200)。圖4.定量PCR中Ct值(Cyclethreshold,循環(huán)閾值)設(shè)定示意圖。圖5.定量PCR法檢測(cè)各組細(xì)胞中CHOP基因的表達(dá)水平。具體實(shí)施方式下面用矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷進(jìn)行關(guān)于對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)處理的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究及機(jī)制探討，說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域的新用途。實(shí)施例1:矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對(duì)小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞的作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷為花色苷的一種單體，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，目錄號(hào)74397，英文名Cyaninchloride,也稱為Cyanidin-3，5-di-0-glucoside，分子式C27H31C1016,分子量646.98，化學(xué)結(jié)構(gòu)如下所示。OH1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞即小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞，來(lái)源于上海中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)TCM13。1.3試劑3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(噻唑藍(lán)，MTT)購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)GibC0公司；胰蛋白酶購(gòu)自武漢生命科學(xué)技術(shù)公司。1.4儀器.二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)(YJ-1450型)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)LEICA公司；熒光酶標(biāo)儀購(gòu)自瑞士TECAN公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)正常生長(zhǎng)的RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、20%mmol/L4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)及125mg/L谷氨酸鹽的RPMI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37"、5%C02，接種密度為1xl07個(gè)/L，倍增時(shí)間為4872h。21分組及給藥方法采用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基依次稀釋矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1xl07個(gè)/L，然后均勻接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板中，37°C、5%(302培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)成良好單層。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24小時(shí)使細(xì)胞同步化，隨后隨機(jī)分為①空白對(duì)照組無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；②花色苷組矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷終濃度分別為30、60、90、120、150pmol/L。每組重復(fù)8孔，置于37。C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。2.3MTT法培養(yǎng)于96孔板中的細(xì)胞處理結(jié)束后，吸出細(xì)胞孔中的殘余液體，用預(yù)熱至37'C的PBS溶液漂洗2次；然后每孔加20pi的MTT(5mg/ml溶于磷酸鹽緩沖液)溶液及180^的不含血清的RPM-I1640培養(yǎng)基，于37。C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)；隨后每孔加入100^DMSO，在水平搖床上緩慢振蕩10分鐘，以溶解細(xì)胞中的紫色結(jié)晶物；最后在酶標(biāo)儀上570nm處測(cè)定其光吸收值。細(xì)胞對(duì)照空OD值-實(shí)驗(yàn)孔OD值細(xì)胞增殖抑制率(％)=-——""^-X100%細(xì)胞對(duì)照空OD值2.4觀測(cè)的指標(biāo)(1)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變(2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以^±5表示，多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果倒置相差顯微鏡觀察顯示，正常的RAW264.7細(xì)胞呈橢圓形或多邊形，貼壁生長(zhǎng)。當(dāng)矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、90、120pmol/L時(shí)，細(xì)胞仍呈橢圓形，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。當(dāng)矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度達(dá)150pmol/L時(shí)，出現(xiàn)部分細(xì)胞脫落、漂浮。.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖l)顯示，當(dāng)矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為30、60、90、120pmol/L時(shí)，細(xì)胞活力與正常對(duì)照組無(wú)明顯差異。當(dāng)矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度達(dá)150pmol/L時(shí)，細(xì)胞活力與正常對(duì)照組相比明顯下降。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度在30120^mol/L范圍內(nèi)為安全濃度。實(shí)施例2:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)ox-LDL致小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系損傷的改善作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實(shí)施例l。1.2.實(shí)驗(yàn)對(duì)象小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞同具體實(shí)施例1。1.3試劑ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)和生化室；MTT購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自武漢生命科學(xué)技術(shù)公司。1.4儀器同具體實(shí)施例l。2實(shí)驗(yàn)方法2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)同具體實(shí)施例l。2.2分組及給藥方法采用不含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基依次稀釋矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1x107個(gè)/L，然后均勻接種于無(wú)菌96孔培養(yǎng)板中，37°C、5%0)2培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)成良好單層。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24小時(shí)使之同步化，隨后隨機(jī)分為①空白對(duì)照組無(wú)血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組分別用安全濃度為30、60、90、120pmol/L的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)。每組重復(fù)8孔，置于37'C、5%<:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。2.3MTT法同具體實(shí)施例1。2.4觀測(cè)的指標(biāo)(1)倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變。(2)MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力2.5數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)以；±5表示，多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析，各組間的比較采用Tukey法。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖2)顯示，40mg/L的ox-LDL能明顯降低細(xì)胞活力，而不同安全濃度的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷(30、60、90、120pmol/L)均能明顯改善ox-LDL對(duì)細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞活力。圖3顯示的是倒置相差顯微鏡下觀察的正常對(duì)照、40mg/L的ox-LDL及矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷濃度為120pmol/L是細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況圖。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷可改善ox-LDL對(duì)RAW264.7細(xì)胞的損傷，且濃度沒(méi)有劑量依賴性。實(shí)施例3:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系基因表達(dá)譜的作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實(shí)施例l。1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞同具體實(shí)施例1。L3.試劑ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)和生化室；MTT購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自武漢生命科學(xué)技術(shù)公司；TRIZOL試劑購(gòu)自上海生物工程公司產(chǎn)品；RNA純化試劑盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)來(lái)源于美國(guó)QIAGEN公司；AffymetrixMouseU4302.0基因表達(dá)譜芯片來(lái)源于美國(guó)Affymetrix公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pmmega公司；乙醇、異丙醇、正庚烷、正己垸、乙腈均為色譜級(jí)，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯仿均為化學(xué)純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。1.4'儀器二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)(YJ-1450型)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)LEICA公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)同具體實(shí)施例1。2.2分組及給藥方法.常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1xi(^個(gè)/L，然后均勻接種于無(wú)菌60ml培養(yǎng)瓶中，37°C、5%<:02培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)成良好單層。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24小時(shí)使之同步化，隨后隨機(jī)分為①空白對(duì)照組無(wú)血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞供檢測(cè)。2.3RNA的提取及檢測(cè)2.3.1總RNA的提取(TRIZOL法)131)均質(zhì)化取2xl0細(xì)胞加入lmlTRIZOL，用lml移液器反復(fù)吹打。2)均質(zhì)化的樣品在153(TC放置5分鐘，然后加入0.2倍體積的氯仿，蓋子蓋緊后劇烈振搖15秒使混勻，在1530'C放置23分鐘，4'C，7000rpm離心15分鐘，離心后形成下層紅色的酚氯仿相，中間相和上層無(wú)色水相。3)將上層水相轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的離心管(水相的體積大約為均質(zhì)化時(shí)所用TRIZOLl體積的60。/。)，加入0.8倍體積的異丙醇，劇烈振搖使混勻，4'C，7000rpm離心15分鐘，棄上清。4)加入70%(ml/ml)酒精，顛倒離心管數(shù)次以洗去沉淀所含鹽分。如沉淀較大可用移液器頭先將沉淀打散。然后4。C，7000rpm離心10分鐘，棄上清。5)重復(fù)以上步驟l次。6)153(TC晾干，然后加入適量的無(wú)RNA酶的水溶解。.7)用分光光度計(jì)分析RNA濃度，在260nm波長(zhǎng)，10D約等于40嗎/ml的RNA。8)1%(mg/ml)瓊脂糖電泳。2.3.2脂A的純化(QIAGENRNeasyTotal脂AIsolationkit)具體方法按QIAGEN公司隨試劑盒提供的操作手冊(cè)進(jìn)行。2.4基因芯片和分析方法基因芯片制作由上海生物芯片有限公司完成。使用AffymetrixMouseU4302.0基因表達(dá)譜芯片，該芯片含45000個(gè)探針集，34000個(gè)已知功能基因2.4.1樣本類型與基因芯片編號(hào)表l:樣本分組及意義<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>2.4.2基因芯片數(shù)據(jù)預(yù)處理應(yīng)用RMA(Robustmultiarrayanalysis)對(duì)Affyemtrix基因芯片的eel格式文件進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，該文件中包含了每個(gè)探針集的原始強(qiáng)度。RMA完全基于基因的PM探針信號(hào)值，在計(jì)算信號(hào)值的過(guò)程中，進(jìn)行五個(gè)步驟①通過(guò)探針鄰近區(qū)域背景的加權(quán)平均對(duì)每個(gè)探針背景校正；②去除信號(hào)響應(yīng)值為P的基因占基因總數(shù)比例低于50%的樣本；③對(duì)校正后的PM對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換；估計(jì)PM對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的均值，而后對(duì)均值進(jìn)行指數(shù)化；⑤對(duì)指數(shù)化后的均值去除極大極小值后，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。2.4.3差異基因顯著性分析經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)預(yù)處理后，分析花色苷+ox-LDL組、正常對(duì)照、ox-LDL組三組間的差異表達(dá)基因。尋找組間差異基因的方法是基于隨機(jī)方差模型的方差分析方法。由于每組中的樣本數(shù)量較少，無(wú)法判斷樣本分布是否符合正態(tài)分布，因此，不能簡(jiǎn)單地使用基于正態(tài)分布進(jìn)行分組樣本的方差分析。在此，使用貝葉斯統(tǒng)計(jì)理論的共軛先驗(yàn)分布推斷基因標(biāo)化后信號(hào)值(之后簡(jiǎn)稱信號(hào)值)在樣本中的均值和方差中的分布。若要保證兩者符合正態(tài)分布，則這兩者的聯(lián)合共軛先驗(yàn)分布則應(yīng)該為反伽馬分布。因此，問(wèn)題將溯源至確定先驗(yàn)分布是否為反伽馬分布，而后在確定其超參數(shù)。在此，發(fā)明人使用極大似然法確定先驗(yàn)分布。由于隨機(jī)方差模型分析根據(jù)實(shí)際數(shù)據(jù)推斷先驗(yàn)分布，從而推斷出理論分布，因此，在應(yīng)用貝葉斯方法處理統(tǒng)計(jì)問(wèn)題時(shí)，不但完全利用有限的樣本信息K還利用了先驗(yàn)分布，從而推導(dǎo)出實(shí)際的后驗(yàn)分布狀況。因此，大大增加了對(duì)有限信息的利用效率，從而更為有效地提高差異表達(dá)基因鑒別的準(zhǔn)確性。2.4:4分析對(duì)象花色苷+ox-LDL組、正常對(duì)照、ox-LDL組三組的所有基因檢測(cè)值。2.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法在此，以任何兩個(gè)分組間之間都不存在差異作為零假設(shè)，而后檢驗(yàn)零假設(shè)是否成立，從而發(fā)現(xiàn)分組間的顯著性差異基因。在此，t值為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>3實(shí)驗(yàn)結(jié)果基因芯片結(jié)果顯示在34000個(gè)已知功能基因中，有差異基因309條。其中，ox-LDL組和對(duì)照組比較上調(diào)基因24條，下調(diào)基因87條；花色苷+ox-LDL組和ox-LDL組比較上調(diào)基因16條，下調(diào)基因22條。經(jīng)共表達(dá)基因的顯著性分析后，篩選出兩個(gè)基因群構(gòu)建基因功能相似性網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中心點(diǎn)，得出在花色苷+ox-LDL組禾nox-LDL組比較中，CHOP(C/EBP同源蛋白)基因是矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷下調(diào)的主要調(diào)控基因。矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷主要保護(hù)了ox-LDL對(duì)脂質(zhì)內(nèi)膜的破壞，增強(qiáng)了細(xì)胞增殖能力和組織結(jié)構(gòu)的再形成能力。實(shí)施例4:矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷對(duì)ox-LDL處理小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系CHOP(C/EBP同源蛋白)基因表達(dá)的作用1實(shí)驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)藥物矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷同具體實(shí)施例l。1.2實(shí)驗(yàn)對(duì)象小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞同具體實(shí)施例1。1.3試劑ox-LDL購(gòu)自北京協(xié)和生化室；MTT購(gòu)自美國(guó)Fluka公司；DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RPMI-1640培養(yǎng)基及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶購(gòu)自武漢生命科學(xué)技術(shù)公司；TRIZOL試劑購(gòu)自上海生物工程公司產(chǎn)品；RNA純化試劑盒(RNeasyTotalRNAIsolationkit)來(lái)源于美國(guó)QIAGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司；定量PCR試劑(PowerSYBRGreenPCRMasterMix)購(gòu)于美國(guó)ABI公司；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；乙醇、異丙醇、正庚烷、正己垸、乙腈均為色譜級(jí)，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)；三氯乙酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氯仿均為化學(xué)純，購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)。1.4儀器二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SHEL-LAB公司；超凈工作臺(tái)(YJ-1450型)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備公司；倒置相差顯微鏡購(gòu)自德國(guó)LEICA公司；定量PCR儀(7300SequenceDetectionSystem)購(gòu)于美國(guó)ABI公司。2實(shí)驗(yàn)方法2.1RAW264.7細(xì)胞的培養(yǎng)同具體實(shí)施例1。2.2分組及給藥方法'常規(guī)培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1xl07個(gè)/L，然后均勻接種于無(wú)菌60ml培養(yǎng)瓶中，37°C、5%(302培養(yǎng)24小時(shí)，使細(xì)胞生長(zhǎng)成良好單層。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前用等體積無(wú)血清培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)24小時(shí)使之同步化，隨后隨機(jī)分為①空白對(duì)照組無(wú)血清培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)；②ox-LDL組ox-LDL終濃度為40mg/L。③花色苷+ox-LDL組先用60pmol/L的矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)，然后加入終濃度為40mg/L的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后收獲細(xì)胞供檢測(cè)。2.3RNA的提取及檢測(cè)2.3，1總RNA的提取(TRIZOL法)—同具體實(shí)施例3。2.3.2RNA的純化(QIAGEN脂easyTotalRNAIsolationkit)同具體實(shí)施例3。2.4RT-PCR反應(yīng)2.4.1cDNA第一鏈合成(1)從-80'C冰箱中取出RNA，在2025'C下解凍，然后在0.2mlPCR管17中配制反應(yīng)溶液?？俁NA3|ig01igo-dT(15)(l嗎/pl)0，dNTPmix(10mM)l^ilddH20(DEPC)_Xpi總體積12^1(2)將反應(yīng)管置于PCR儀中，65'C預(yù)變性5分鐘。'(3)變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系5Xfirst-strandbuffer4.0|al0.1MDTT2.0|ilRNAinhibitor1.0SuperscriptII(200U/pi)1.0piddH20(DEPC)_Xpi總體積20pi(4)將PCR管子置于PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，42。C保溫50分鐘后，70'C變性15分鐘，4'C保存。2.4:2SYBRGreenRT-PCR反應(yīng)體系2xSYBRGreenPCRbuffer12.5ulprimer(5pmo1)1(illTemplate(10ng)+ddH2011，50。C孵育2分鐘，然后95。C，IO分鐘；接著進(jìn)行40個(gè)循環(huán)95°C，15秒；60°C，l分鐘。儀器使用ABI公司的Prism7300系統(tǒng)。2.4.3CHOP基因引物設(shè)計(jì).引物設(shè)計(jì)如下ForwardPrimer:CTGAGGAGAGGACTGAGGGTAGACReversePrimer:CTGGACATGGACAGTAATAAACAATGT2.5統(tǒng)計(jì)、作圖方法(1)通過(guò)一系列的參數(shù)設(shè)定分析，得到不同樣本相對(duì)于不同基因的Ct值。.Ct值，C代表Cycle(循環(huán))，t代表threshold(閾值)，Ct值的含義是每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(如圖4所示)。(2)研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因?yàn)楸容^的是轉(zhuǎn)錄水平的差異，所以通過(guò)檢測(cè)每個(gè)樣品的管家基因，將目的基因歸一化。PCR產(chǎn)物的增長(zhǎng)形式為211，如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N就是循環(huán)數(shù)。所以先得到ACt=Ct待測(cè)基因一Ct管家基因，再轉(zhuǎn)換為原始模板濃度=2-ACt2.6重復(fù)性檢驗(yàn)每個(gè)樣品3個(gè)平行樣，計(jì)算同一樣品的3個(gè)平行樣Ct值的變異系數(shù)，分析樣品目標(biāo)基因定量結(jié)果的批內(nèi)變異系數(shù)。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果如圖5所示，其進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果，證實(shí)矢車菊素—3，5-二葡萄糖苷能降低ox-LDL導(dǎo)致的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞中CHOP基因的高表達(dá)。權(quán)利要求1、花色苷在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。2、調(diào)控CHOP基因的表達(dá)在制備治療或預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的應(yīng)用。3、根據(jù)權(quán)利要求r所述的應(yīng)用，其特征是所述花色苷為矢車菊素-3,5-二葡萄糖苷。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種花色苷在治療動(dòng)脈粥樣硬化藥物中的用途，以及對(duì)CHOP基因的調(diào)控在防治動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。涉及花色苷單體矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對(duì)氧化低密度脂蛋白致巨噬細(xì)胞損傷的改善作用，并探討其作用機(jī)制。本發(fā)明采用小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)MTT法測(cè)定矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷對(duì)氧化低密度脂蛋白處理的RAW264.7巨噬細(xì)胞活性的影響。并提取細(xì)胞總RNA，用AffymetrixMouseU4302.0基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行標(biāo)記雜交實(shí)驗(yàn)，RMA法對(duì)Affyemtrix基因芯片的掃描結(jié)果進(jìn)行差異基因分析，篩選出差異基因，隨后采用實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)表達(dá)的差異基因進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)果證實(shí)，矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷能下調(diào)CHOP基因表達(dá)，對(duì)氧化低密度脂蛋白損傷的巨噬細(xì)胞具有明顯的保護(hù)作用。文檔編號(hào)A61P9/00GK101322716SQ20081004863公開(kāi)日2008年12月17日申請(qǐng)日期2008年7月30日優(yōu)先權(quán)日2008年7月30日發(fā)明者張葉敏,陽(yáng)李,歐陽(yáng)靜萍,畢勇毅,同沈,王保華申請(qǐng)人:武漢大學(xué)