具有抗氧化活性的小肽、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及具有抗氧化活性的小肽、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自由基理論被提出后，許多研宄結(jié)果都顯示自由基與人類多種疾病和衰老的發(fā)生 有關(guān)，如動脈粥樣硬化、血栓、心肌缺血再灌注損傷、糖尿病、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等?；?性氧（ROS)是一種廣泛存在于人體中的自由基，由線粒體產(chǎn)生，包括超氧陰離子自由基、羥 基自由基等，它們會損傷線粒體DNA、酶和I吳脂質(zhì)，從而引起各種疾病的發(fā)生。抗氧化劑具有 捕獲和中和自由基的能力，當機體中的自由基產(chǎn)生過多而超出清除能力的范圍時，通過補 充抗氧化劑可以清除多余的自由基，維持體內(nèi)自由基平衡，可以有效預(yù)防多種自由基引起 的疾病。人工合成的抗氧化劑如BHA、BHT、PG、TBHQ等，是多種食品的添加劑，它們能延緩 或阻止食品中的油脂酸敗、蛋白質(zhì)變性，提高食品的穩(wěn)定性、延長儲藏期。但長期服用會傷 害人體的肝、脾、肺，具有蓄積性致癌作用，影響與呼吸相關(guān)的酶的活性，人工抗氧化劑的應(yīng) 用因此受到了限制。從動物和植物中尋找具有抗氧化活性的天然物質(zhì)是解決這一問題的關(guān) 鍵，且天然抗氧化劑具有安全、高效、來源廣泛的特點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種具有較強抗氧化活性的小肽，來源于麥胚清蛋白，具有 安全、高效、來源廣泛的特點。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供上述小肽的制備方法，該方法簡單，安全，高效，重復(fù)性 好。
[0005] 本發(fā)明的再一目的是提供上述小肽在提高食品的穩(wěn)定性、延長食品儲藏期或者制 備具有抗氧化活性的保健食品方面的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明的目的采用如下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[0007] -種具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列為AREGETVVPG，如SEQIDNO: 1所示。
[0008] 本發(fā)明還提供所述小肽的制備方法，包括如下步驟：
[0009] (1)將麥胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物I;
[0010] (2)取所述清蛋白水解產(chǎn)物I中分子量小于IOKDa的組分，采用凝膠過濾色譜分 離，取具有抗氧化活性的組分作為清蛋白提取物II;
[0011] (3)將所述清蛋白提取物II采用堿性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物III;
[0012] (4)將所述清蛋白水解產(chǎn)物III依次采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離， 得到所述小肽。
[0013] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（2)中所述凝膠過濾色譜中的凝膠填料為Sephadex G-75,流動相為水。
[0014] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（4)中所述凝膠過濾色譜中的凝膠填料為Sephadex G-15,流動相為水，取具有抗氧化活性的洗脫液。
[0015] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（4)中所述反相高效液相色譜中使用WatersXBridgeTM pr印C18色譜柱，洗脫程序為：0~lOmin，流動相AlOO~85%線性降低，流動相BO~15% 線性升高；10~15min，流動相A85~80 %線性降低，流動相B15~20 %線性升高；收集對 應(yīng)于流動相B體積濃度為15. 8~16%時的洗脫液，即得所述小肽；所述流動相A是濃度為 0. 05-0. 15%三氟乙酸的水溶液，流動相B是濃度為0. 05-0. 15%三氟乙酸的乙腈溶液。
[0016] 步驟（1)中所述麥胚清蛋白優(yōu)選采用如下方法獲得：采用水提取脫脂麥胚粉中的 清蛋白，加入硫酸銨至飽和度為70 % -80 %，攪拌，離心取沉淀。
[0017] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述胰蛋白酶酶解過程中，每克清蛋白中加入6000-8000U胰 蛋白酶，酶解溫度為36. 5-37. 5,酶解pH7. 0-8. 0,酶解時間5-7h。
[0018] 優(yōu)選的技術(shù)方案中，步驟（3)中堿性蛋白酶酶解過程中，每克蛋白中加入堿性蛋 白酶0? 1-0. 2AU，酶解溫度45-55°C，酶解pH7. 5-8. 5,酶解時間L0-2.Oh。
[0019] 本發(fā)明還要求保護所述小肽在提高食品的穩(wěn)定性、延長食品儲藏期或者制備具有 抗氧化活性的保健食品方面的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明小肽，具有較強的抗氧化活性，來源于麥胚清蛋白，是理想的天然抗氧化 劑，具有安全、高效、來源廣泛、價格低廉的特點。該小肽可以應(yīng)用于提高食品的穩(wěn)定性、延 長食品儲藏期；或者制成具有抗氧化活性的保健食品，為人體的健康和疾病的預(yù)防提供更 多的選擇。
[0021] 本發(fā)明將麥胚清蛋白進行酶解后，巧妙選擇了超濾和色譜法從組分眾多、成分復(fù) 雜的蛋白水解物中分離到了具有抗氧化活性的小肽。該方法簡單，安全，高效，重復(fù)性好。
【附圖說明】
[0022] 圖1為S印hadexG-75分離圖譜。
[0023] 圖2為S印hadexG-15分離圖譜。
[0024] 圖3為RP-HPLC分離圖譜，其中橫坐標為保留時間，縱坐標為響應(yīng)值（單位mAU)。
[0025] 圖4為洗脫液P3中活性組分的的TIC圖，其中橫坐標為保留時間，縱坐標為峰高。
[0026] 圖5為洗脫液P3中活性組分的二級質(zhì)譜圖，其中橫坐標表示離子的質(zhì)荷比（m/z) 值，縱坐標表示離子流的強度。
[0027] 圖6為洗脫液P3中活性組分對細胞內(nèi)ROS的影響，其中橫坐標為不同的處理，縱 坐標為ROS的量。
【具體實施方式】
[0028] 實施例1制備具有抗氧化活性的小肽
[0029] (1)麥胚清蛋白的提取：準確稱取脫脂麥胚粉100g，加入1000 ml去離子水，混合均 勻，在40°C水浴中攪拌提取Ih;8000rpm離心30min，取上清液緩慢加入硫酸銨至飽和度為 75%，4°C下攪拌2h;12000rpm離心20min，棄去上清，收集沉淀，該沉淀即為麥胚清蛋白。為 了進行后續(xù)的純化，將麥胚清蛋白透析除鹽、冷凍干燥獲得麥胚清蛋白粉。
[0030] (2)胰蛋白酶酶解：用pH7. 6、濃度0.IM的磷酸鹽緩沖液溶解麥胚清蛋白粉，每克 蛋白加入7000U胰蛋白酶（購自上海生工生物工程有限公司，2500000U/g)，在37°C下酶解 6h，得到清蛋白水解產(chǎn)物I。pH7. 6、濃度0.IM的磷酸鹽緩沖液：取86. 6ml的磷酸氫二鉀 (IM)溶液和13. 4ml的磷酸二氫鉀（IM)溶液混合均勻并定容到1L。
[0031] (3)清蛋白水解產(chǎn)物I的分離純化：①超濾膜法：將截留分子量為IOKDa超濾膜安 裝在超濾裝置上，去離子水清洗；清蛋白水解產(chǎn)物I用pH7. 6、0.IM磷酸鹽緩沖液稀釋至質(zhì) 量百分濃度為〇? 1%后上樣；調(diào)節(jié)泵的壓力使進口端壓力不超過20psi，出口端的壓力不超 過30psi進行超濾。超濾后收集濾過液，其中含有分子量小于IOKDa的組分。將分子量小于 IOKDa的組分除鹽并冷凍干燥，獲得凍干粉。②凝膠過濾色譜法：S印hadexG-75干粉（購 自美國GE公司）用去離子水充分溶脹，利用重力沉降原理裝填入2. 5*75cm層析柱中，去離 子水平衡；將①得到凍干粉溶于去離子水配成質(zhì)量百分濃度為2 %的溶液，經(jīng)0. 22ym的濾 膜過濾除去顆粒物，采用S印hadexG-75凝膠柱分離，上樣量為柱體積的5% ;去離子水洗 脫，流速為30ml/h，檢測波長220nm，每IOmin收集一管洗脫液，收集液冷凍干燥，測抗氧化