一種雷公藤甲素的提取制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種雷公藤甲素的提取制備方法，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 雷公藤（TripterygiumwilfordiiHookf.)系衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，中藥大辭 典記載，具有祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、消腫止痛、解毒殺蟲的功效，臨床用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié) 炎、慢性腎炎和紅斑狼瘡等自身免疫性疾病，近年來用于器官移植的抗排斥反應(yīng)治療，均取 得了較好療效?，F(xiàn)代研宄相繼發(fā)現(xiàn)雷公藤有抗炎、抗免疫、抗生育、抗腫瘤、抗菌活性等作 用。至今從雷公藤中已分離出200多種化學(xué)單體，其中二萜類、倍半萜生物堿類、三萜類為 主要活性成分。
[0003] 雷公藤甲素（triptolide)是從雷公藤中分離出的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化 合物，是雷公藤的主要有效成分之一，其相關(guān)效價(jià)比雷公藤總苷高100-200倍。經(jīng)藥理和臨 床試驗(yàn)表明，其具有確切的免疫抑制、抗炎、抗生育及抗腫瘤等生物活性。
[0004] 然而雷公藤甲素在雷公藤中的含量很低，其提取分離的得率也很低，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道， 植物分離得率僅為0. 001 % (w/w)。
[0005] 雷公藤甲素粗提物的制備工藝主要有乙醇回流提取一中性氧化鋁吸附一三氯 甲烷萃取、乙醇回流提取一三氯甲烷萃取、乙醇回流提取一乙酸乙酯萃取和水煮醇沉一 乙酸乙醋或三氯甲烷萃取等，所得的三氯甲烷浸膏中雷公藤甲素的含量為0.23%左右。 CN101434638A提供了一種從雷公藤中提取雷公藤甲素粗品的方法，采用含氯的烷烴進(jìn)行加 壓提取，提取液減壓濃縮后得雷公藤甲素粗品，純度1 %左右。
[0006] CN101367862公開了一種從雷公藤中分離高純度雷公藤甲素的方法，用醇對(duì)藥材 進(jìn)行熱提，所得醇提物先用石油醚萃取，然后用氯仿或二氯甲烷萃取，氯仿或二氯甲烷萃取 物上氧化鋁或硅膠柱進(jìn)行柱層析，以氯仿/甲醇或二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫，將分段收 集的餾分再上高效制備液相色譜得到雷公藤甲素半成品，最后在有機(jī)溶劑中結(jié)晶得雷公藤 甲素純品。
[0007] CN103524591A公開了一種以雷公藤根為原料提取雷公藤甲素的方法：雷公藤根 的醇提取浸膏分配在由聚合物-無機(jī)鹽水溶液和乙醇形成的雙水相體系中，然后用水不溶 性有機(jī)溶劑對(duì)分配在雙水相體系中雷公藤浸膏進(jìn)行萃取，得到有效部位。將得到的有效部 位用醇溶解，加水結(jié)晶除去大部分非有效物質(zhì)得到富集的有效部位。該富集的有效部位經(jīng) 過硅膠柱層析分離，重結(jié)晶后得到雷公藤甲素。
[0008] 目前雷公藤甲素提取純化方法普遍存在粗提物雷公藤甲素富集率低、純化工藝復(fù) 雜、耗時(shí)長(zhǎng)、效率低、收率低、成本高等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種雷公藤甲素提取制備的新方 法，可以大大簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝提高生產(chǎn)效率、提高雷公藤甲素收得率。
[0010] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0011] 提供一種雷公藤甲素的提取制備方法，其包括如下步驟：
[0012] (1)提取：將雷公藤藥材粉碎至20~30目，用5~15倍量（重量）乙酸乙酯回 流提取2~3次，每次4~8小時(shí)，過濾后濃縮提取液得到重量為雷公藤藥材重量2~3% 的浸膏；
[0013] (2)堿洗：將浸膏用二氯甲烷溶解后用0. 2~0. 8moL/L NaOH溶液洗滌2~3次， 濃縮二氯甲烷相得堿洗后浸膏；
[0014] (3)第一次柱層析：將堿洗后浸膏上正相硅膠柱，先用二氯甲烷洗脫，洗脫液顏色 變淡后用二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫1~2個(gè)柱體積，然后用甲醇洗脫，濃縮甲醇洗脫液 得甲醇洗脫物；
[0015] (4)第二次柱層析：將甲醇洗脫物再上正相硅膠柱，用石油醚/乙酸乙酯混合溶劑 進(jìn)行梯度洗脫，收集含雷公藤甲素的洗脫液，濃縮至1/4~1/10倍體積后靜置析晶，得雷公 藤甲素粗品；
[0016] (5)純品制備：將雷公藤甲素粗品用有機(jī)溶劑溶解后靜置析晶，過濾出晶體得雷 公藤甲素純品。
[0017] 任選地，步驟（1)回流提取時(shí)可加入藥材重量0.05~0.15%的抗壞血酸。
[0018] 在一實(shí)施方案中，步驟（2)所述二氯甲烷的用量為每公斤藥材用二氯甲烷0.5~ 1. 5升，每次堿洗NaOH溶液用量為二氯甲烷的0. 5~1. 6倍（體積）。
[0019] 在一實(shí)施方案中，步驟（3)柱層析采用200~300目正相硅膠，用量為浸膏重量的 2~10倍，采用濕法裝柱的方式，所述混合溶劑為二氯甲烷：甲醇=80~10:1(體積比） 的混合溶劑。
[0020] 在一實(shí)施方案中，步驟（4)柱層析采用200~300目正相硅膠，用量為浸膏重量的 20~60倍，采用干法裝柱或濕法裝柱的方式，所述混合溶劑為石油醚：乙酸乙酯=10~ 1:1(體積比）的混合溶劑。
[0021] 在一實(shí)施方案中，步驟（4)所述梯度洗脫方式為依次用石油醚：乙酸乙酯=10:1、 6:1、4:1、2:1、1:1(體積比）的混合溶劑洗脫，每個(gè)比例洗脫3~10個(gè)柱體積。
[0022] 在一實(shí)施方案中，步驟（5)所述有機(jī)溶劑選自以下溶劑體系：石油醚/二氯甲烷、 石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮、異丙醚。
[0023]在一實(shí)施方案中，步驟（4)、（5)所述靜置析晶的溫度為4°C或室溫。
[0024] 本發(fā)明柱層析待分離樣品的制備方法：適量二氯甲烷溶解浸膏，加入適量80目正 相硅膠中攪拌吸附，約50°C減壓蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑后研散成均勻的沙粒狀即得。
[0025] 本發(fā)明所采用的雷公藤藥材優(yōu)選雷公藤甲素含量大于30ppm(即0. 003% )的藥 材，與低含量藥材相比，相同的成本消耗可以得到更多量的雷公藤甲素產(chǎn)品，有助于更好地 降低單位產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。
[0026] 藥材中雷公藤甲素的含量測(cè)定方法：取50g藥材粉碎至20~30目，用20倍甲醇回 流提取2次，每次4小時(shí)，提取液過濾后濃縮，用甲醇溶解并定容至50mL作為供試品溶液； 取雷公藤甲素對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并制成每ImL含50yg的溶液作為對(duì)照品 溶液；HPLC色譜條件：色譜柱：phenomenex C18(4.6_X250mm，5ym);流動(dòng)相：A:甲醇，B: 甲醇-水（40:60);流速：0.9mL/min，按下表進(jìn)行梯度洗脫：
[0027] 雷公藤甲素梯度洗脫條件
[0028]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 提取：將雷公藤藥材粉碎至20~30目，用5~15倍量（重量）乙酸乙酯回流提 取2~3次，每次4~8小時(shí)，過濾后濃縮提取液得到重量為雷公藤藥材重量2~3%的浸 膏； (2) 堿洗：將浸膏用二氯甲燒溶解后用0. 2~0. 8moL/LNaOH溶液洗絳2~3次，濃縮 二氯甲烷相得堿洗后浸膏； (3) 第一次柱層析：將堿洗后浸膏上正相硅膠柱，先用二氯甲烷洗脫，洗脫液顏色變淡 后用二氯甲烷/甲醇混合溶劑洗脫1~2個(gè)柱體積，然后用甲醇洗脫，濃縮甲醇洗脫液得甲 醇洗脫物； (4) 第二次柱層析：將甲醇洗脫物再上正相硅膠柱，用石油醚/乙酸乙酯混合溶劑進(jìn)行 梯度洗脫，收集含雷公藤甲素的洗脫液，濃縮至1/4~1/10倍體積后靜置析晶，得雷公藤甲 素粗品； (5) 純品制備：將雷公藤甲素粗品用有機(jī)溶劑溶解后靜置析晶，過濾出晶體得雷公藤 甲素純品。
2. 如權(quán)利要求1所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（1)回流提取時(shí) 加入藥材重量0. 05~0. 15%的抗壞血酸。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（2)所述二 氯甲烷的用量為每公斤藥材用二氯甲烷〇. 5~1. 5升，每次堿洗NaOH溶液用量為二氯甲烷 的0? 5~1. 6倍（體積）。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（3)柱層析 采用200~300目正相硅膠，用量為浸膏重量的2~10倍，采用濕法裝柱的方式，所述混合 溶劑為二氯甲烷：甲醇=80~10:1 (體積比）的混合溶劑。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（4)柱層析 采用200~300目正相硅膠，用量為浸膏重量的20~60倍，采用干法裝柱或濕法裝柱的方 式，所述混合溶劑為石油醚：乙酸乙酯=10~1:1(體積比）的混合溶劑。
6. 如權(quán)利要求5所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（4)所述梯度洗 脫方式為依次用石油醚：乙酸乙酯=1〇:1、6 :1、4:1、2:1、1:1(體積比）的混合溶劑洗脫， 每個(gè)比例洗脫3~10個(gè)柱體積。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（5)所述有 機(jī)溶劑選自以下溶劑體系：石油醚/二氯甲烷、石油醚/乙酸乙酯、石油醚/丙酮、異丙醚。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于步驟（4)、（5)所 述靜置析晶的溫度為4°C或室溫。
9. 如權(quán)利要求1~8任一項(xiàng)所述的雷公藤甲素的提取制備方法，其特征在于，所述雷公 藤藥材為雷公藤甲素含量大于30ppm的藥材。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種雷公藤甲素的提取制備方法，用乙酸乙酯提取雷公藤藥材，浸膏用二氯甲烷溶解后堿洗，然后進(jìn)行二次正相硅膠柱層析，第一次柱層析依次用二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇混合溶劑、甲醇洗脫，第二次柱層析用石油醚/乙酸乙酯混合溶劑梯度洗脫，最后通過結(jié)晶操作制得雷公藤甲素純品。該制備方法步驟少、操作簡(jiǎn)便，可高收率地得到高純度的雷公藤甲素產(chǎn)品，大大降低了雷公藤甲素的生產(chǎn)成本。
【IPC分類】C07J73-00
【公開號(hào)】CN104788532
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510213692
【發(fā)明人】謝相林, 付書青
【申請(qǐng)人】成都健騰生物技術(shù)有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日