用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)的試驗(yàn)裝置及其使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)、多肽的分離和純化技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]等電聚焦是一種重要的根據(jù)等電點(diǎn)分離肽、蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)的技術(shù)。早期的等電聚焦實(shí)驗(yàn)之所以往往難以與質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)匹配，是因?yàn)槠渲惺褂昧烁邼舛鹊妮d體兩性電解質(zhì)。后來(lái)在CN101294930B《一種整體型固定化pH梯度的制備方法及其應(yīng)用》專利文獻(xiàn)中公開(kāi)了一種無(wú)須在樣品中添加自由載體兩性電解質(zhì)的毛細(xì)管等電聚焦方法，其中使用了整體型固定化PH梯度技術(shù)，載體兩性電解質(zhì)分子通過(guò)共價(jià)鍵固定于聚合物表面，但不失其酸堿兩性及緩沖能力。為了分離復(fù)雜的生物樣品，開(kāi)發(fā)了窄梯度的整體型固定化pH梯度，其分辨率更高，可以進(jìn)一步分離在寬整體型固定化pH梯度上不能分開(kāi)的蛋白質(zhì)譜帶。
[0003]現(xiàn)有兩性分子的等電聚焦分離方法通常在凝膠或封閉的管道中進(jìn)行，聚焦結(jié)果的獲得分別采用在凝膠上染色或迀移后檢測(cè)的方法。聚焦后處理及聚焦組分的進(jìn)一步研宄、應(yīng)用受到限制，存在方法上的不足之處。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是要克服上述現(xiàn)有技術(shù)缺陷，研制一種用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)的試驗(yàn)裝置。
[0005]本裝置包括一底座，在底座的一側(cè)開(kāi)設(shè)一長(zhǎng)條狀凹槽，在設(shè)置所述長(zhǎng)條狀凹槽的底座一側(cè)設(shè)置活動(dòng)上蓋，當(dāng)上蓋與底座合上時(shí)，對(duì)長(zhǎng)條狀凹槽形成密封。
[0006]本裝置的長(zhǎng)條狀凹槽即為試驗(yàn)的分離通道，通過(guò)上蓋的打開(kāi)，可方便地裝載或取出試驗(yàn)用非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)，通過(guò)將上蓋與底座的連接，可將非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)密封于分離通道中。通過(guò)洗滌本裝置，可反復(fù)使用，節(jié)省試驗(yàn)成本。
[0007]為了方便地接入電極，本發(fā)明還在上蓋上，相對(duì)于所述長(zhǎng)條狀凹槽的兩端分別開(kāi)設(shè)正、負(fù)電極線插入通孔。
[0008]本發(fā)明還提出與以上試驗(yàn)裝置相適應(yīng)的試驗(yàn)方法，主要步驟如下:
O制備非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)；
2)打開(kāi)上述裝置的上蓋，先將非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)按PH梯度順序置于長(zhǎng)條狀凹槽中，再向長(zhǎng)條狀凹槽中加入待分離的兩性電解質(zhì)和磷酸鹽緩沖溶液，再向放置pH值最低的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端的長(zhǎng)條狀凹槽內(nèi)滴加磷酸水溶液，向放置PH值最高的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端的長(zhǎng)條狀凹槽內(nèi)滴加氫氧化鈉水溶液，待長(zhǎng)條狀凹槽中無(wú)空空和氣泡后合上上蓋，向放置PH值最低的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端施加正電極，向放置pH值最高的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端施加負(fù)電極，進(jìn)行蛋白質(zhì)等電聚焦分離；
3)待等電聚焦分離結(jié)束后，打開(kāi)上蓋，取出各段非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)進(jìn)行分析。
[0009]實(shí)驗(yàn)后的白色固體非凝膠固體載體可經(jīng)過(guò)清洗后反復(fù)使用，裝置待取出再非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)后以用去離子水沖洗，等待下次使用。
[0010]本發(fā)明利用非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)的緩沖能力及導(dǎo)電性，在特殊設(shè)計(jì)的上述裝置中建立PH梯度，從而實(shí)現(xiàn)兩性電解質(zhì)樣品(蛋白質(zhì)或多肽)的等電聚焦分離、純化。本發(fā)明裝置的分離通道(長(zhǎng)條狀凹槽)既可以打開(kāi)，也可以密封，方便樣品及非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)的添加與取出，因此非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)是可以反復(fù)使用的。
【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1為本發(fā)明裝置的一種結(jié)構(gòu)示意圖。
[0012]圖2為圖1的A-A向截面圖。
[0013]圖3為打開(kāi)裝置的上蓋后置入成梯度非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)后的示意圖。
[0014]圖4為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液等電聚焦的譜圖。
[0015]圖5為人肝細(xì)胞蛋白質(zhì)提取溶液等電聚焦譜圖。
[0016]圖6為人體血清蛋白質(zhì)溶液等電聚焦譜圖。
[0017]圖7為人體尿液提取蛋白質(zhì)溶液等電聚焦譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]—、裝置說(shuō)明:
如圖1、2、3所示，試驗(yàn)裝置設(shè)有一底座1，在底座I的一側(cè)開(kāi)設(shè)一長(zhǎng)條狀凹槽2，在設(shè)置所述長(zhǎng)條狀凹槽2的底座I 一側(cè)設(shè)置活動(dòng)上蓋3，當(dāng)上蓋3與底座I合上時(shí)，對(duì)長(zhǎng)條狀凹槽2形成密封。
[0019]在上蓋3上，相對(duì)于長(zhǎng)條狀凹槽3的兩端分別開(kāi)設(shè)正電極線插入通孔4和負(fù)電極線插入通孔5。
[0020]二、等電聚焦試驗(yàn)方法:
1、制備成梯度的白色固體非凝膠固體載體兩性電解質(zhì):
按照CN101294930B公開(kāi)的《一種整體型固定化pH梯度的制備方法及其應(yīng)用》的技術(shù)方法合成非凝膠固體載體兩性電解質(zhì):在10mL蒸餾水中加入1.0克丙烯酰胺、0.05克雙丙烯酰胺、0.1克丙烯酸、0.1克烯丙基胺、0.025克過(guò)硫酸銨、0.01克亞硫酸氫鈉，攪拌混勻，超聲脫氣10分鐘，置于-20°C聚合10小時(shí)，得到白色固體非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)。通過(guò)調(diào)節(jié)丙烯酸和烯丙基胺的用量比，可以取得一系列具有不同PH值的成梯度的白色固體非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)，然后以蒸餾水充分洗滌備用。
[0021]2、試驗(yàn)過(guò)程:
如圖3所示，將上述所制備的八段白色固體非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)按pH梯度的順序放入長(zhǎng)條狀凹槽2內(nèi)，并充滿長(zhǎng)條狀凹槽2的長(zhǎng)度。再將ImL蛋白質(zhì)樣品和0.20 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.6)加入長(zhǎng)條狀凹槽2，確定不存在空穴及氣泡。然后向放置pH值最低的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端(即試驗(yàn)電極的正極端)的長(zhǎng)條狀凹槽2內(nèi)滴加0.5 mol/L磷酸水溶液，向放置pH值最高的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端(即試驗(yàn)電極的負(fù)極端)的長(zhǎng)條狀凹槽2內(nèi)滴加氫氧化鈉水溶液。合上上蓋，壓緊密封。
[0022]從上蓋的兩個(gè)正電極線插入通孔4和負(fù)電極線插入通孔5中分別插入正、負(fù)電極，并使正電極與PH小的一端通道內(nèi)的白色固體非凝膠固體載體相接觸，使負(fù)電極與pH在的一端通道內(nèi)的白色固體非凝膠固體載體相接觸，通電(根據(jù)分離通道的長(zhǎng)度，施加+200kV/cm)即進(jìn)行反應(yīng)。
[0023]30分鐘后，斷電，打開(kāi)上蓋，取出樣品聚焦分離所得到的蛋白質(zhì)區(qū)帶。將所得到的蛋白質(zhì)區(qū)帶進(jìn)行下一步聚焦譜帶分析。
[0024]3、材料和裝置的重復(fù)使用說(shuō)明:
實(shí)驗(yàn)后的白色固體非凝膠固體載體可重復(fù)使用，方法是:以10 mmol/L十二烷基磺酸鈉和去離子水對(duì)實(shí)驗(yàn)后的白色固體非凝膠固體載體充分洗滌，干燥備用。裝置再使用方法:用去離子水對(duì)裝置沖洗，等待下次使用。
[0025]試驗(yàn)實(shí)例1:
按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)樣品是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度均為0.5 mg/mL)。聚焦完成后得到結(jié)果如圖4所示:1胃蛋白酶；2卵清蛋白；3牛血紅蛋白；4溶菌酶，說(shuō)明蛋白質(zhì)分離已經(jīng)完成。
[0026]試驗(yàn)實(shí)例2:
按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)樣品是人肝細(xì)胞蛋白質(zhì)提取溶液。聚焦完成后得到結(jié)果如圖5所示，說(shuō)明蛋白質(zhì)分離已經(jīng)完成。
[0027]試驗(yàn)實(shí)例3:
按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)樣品是人體血清蛋白質(zhì)溶液。聚焦完成后得到結(jié)果如圖6，說(shuō)明蛋白質(zhì)分離已經(jīng)完成。
[0028]試驗(yàn)實(shí)例4:
按照上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其中蛋白質(zhì)樣品是人體尿液提取蛋白質(zhì)溶液。聚焦完成后得到結(jié)果如圖7，說(shuō)明蛋白質(zhì)分離已經(jīng)完成。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)的試驗(yàn)裝置，其特征在于包括一底座，在底座的一側(cè)開(kāi)設(shè)一長(zhǎng)條狀凹槽，在設(shè)置所述長(zhǎng)條狀凹槽的底座一側(cè)設(shè)置活動(dòng)上蓋，當(dāng)上蓋與底座合上時(shí)，對(duì)長(zhǎng)條狀凹槽形成密封。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)的試驗(yàn)裝置，其特征在于在上蓋上，相對(duì)于所述長(zhǎng)條狀凹槽的兩端分別開(kāi)設(shè)正、負(fù)電極線插入通孔。
3.如權(quán)利要求1或2所述試驗(yàn)裝置的使用方法，包括以下步驟: O制備非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)； 2)打開(kāi)上述裝置的上蓋，先將非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)按PH梯度順序置于長(zhǎng)條狀凹槽中，再向長(zhǎng)條狀凹槽中加入待分離的兩性電解質(zhì)和磷酸鹽緩沖溶液，再向放置pH值最低的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端的長(zhǎng)條狀凹槽內(nèi)滴加磷酸水溶液，向放置PH值最高的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端的長(zhǎng)條狀凹槽內(nèi)滴加氫氧化鈉水溶液，待長(zhǎng)條狀凹槽中無(wú)空空和氣泡后合上上蓋，向放置PH值最低的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端施加正電極，向放置pH值最高的非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)端施加負(fù)電極，進(jìn)行蛋白質(zhì)等電聚焦分離； 3)待蛋白質(zhì)等電聚焦分離結(jié)束后，打開(kāi)上蓋，取出各段非凝膠態(tài)載體兩性電解質(zhì)進(jìn)行分析。
【專利摘要】用于等電聚焦分離兩性電解質(zhì)的試驗(yàn)裝置及其使用方法，涉及蛋白質(zhì)、多肽的分離和純化技術(shù)領(lǐng)域。在底座的一側(cè)開(kāi)設(shè)一長(zhǎng)條狀凹槽，在設(shè)置所述長(zhǎng)條狀凹槽的底座一側(cè)設(shè)置活動(dòng)上蓋，當(dāng)上蓋與底座合上時(shí)，對(duì)長(zhǎng)條狀凹槽形成密封。本裝置的長(zhǎng)條狀凹槽即為試驗(yàn)的分離通道，通過(guò)上蓋的打開(kāi)，可方便地裝載或取出試驗(yàn)用非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)，通過(guò)將上蓋與底座的連接，可將非凝膠固體載體兩性電解質(zhì)密封于分離通道中。通過(guò)洗滌本裝置，可反復(fù)使用，節(jié)省試驗(yàn)成本。
【IPC分類】C07K1-28
【公開(kāi)號(hào)】CN104788536
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510207292
【發(fā)明人】楊春, 劉國(guó)峰
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年4月28日