活性。分離色譜圖如圖1所示。經(jīng)測定，對應(yīng)于保留時間6. 5h~8. 25h的洗脫液具有抗氧 化活性，將該洗脫液作為清蛋白提取物II，冷凍干燥，獲得凍干粉。
[0032] (4)堿性蛋白酶酶解：將清蛋白提取物II凍干粉溶于pH8. 0、濃度0.IM的磷酸鹽緩 沖液，每克蛋白中加入〇. 15AU堿性蛋白酶（購自諾維信公司，2. 4AU/ml)酶解，在50°C下酶 解I. 5h，得到清蛋白水解產(chǎn)物III，冷凍干燥得到凍干粉。
[0033] (5)清蛋白水解產(chǎn)物III的分離純化：①凝膠過濾色譜法：SephadexG-15干粉（購 自美國GE公司）用去離子水充分溶脹，利用重力沉降原理裝填入I. 5*60cm層析柱中，去 離子水平衡；清蛋白水解產(chǎn)物III凍干粉溶于去離子水配成質(zhì)量百分濃度為2%的溶液，經(jīng) 0. 22ym的濾膜過濾除去顆粒物，采用SephadexG-15凝膠柱分離，上樣量為柱體積的3%; 去離子水洗脫，流速為30ml/h，檢測波長220nm，每IOmin收集一管洗脫液，收集液冷凍干 燥，測抗氧化活性。分離色譜圖如圖2所示。對應(yīng)于保留時間I. 5h~2. 5h的洗脫液具有 抗氧化活性，收集該洗脫液冷凍干燥后進行下一步純化。②制備型RP-HPLC法：將Sephadex G-15凝膠柱分離到的組分采用反相高效液相色譜法分離。選用WatersXBridgeTMprep C18色譜柱（購自美國Waters公司），流動相A是是體積百分濃度為0.I%TFA(三氟乙酸） 的去離子水溶液，流動相B是體積百分濃度為0. 1%TFA(三氟乙酸）的乙腈溶液。
[0034] 洗脫程序為：0~lOmin，流動相AlOO~85 %線性降低，流動相BO~15 %線性升 高；10~15min，流動相A85~80%線性降低，流動相B15~20%線性升高。檢測波長為 214nm，柱溫為25°C。分離圖譜如圖3所示。收集對應(yīng)于流動相B體積濃度為15. 8~16% 的洗脫液P3,其抗氧化活性最高，進行進一步的結(jié)構(gòu)鑒定。
[0035] (6)結(jié)構(gòu)鑒定：采用LC-MS/MS檢測反相高效液相色譜色譜法中洗脫液P3中的活 性組分純度及氨基酸序列。將待測樣品溶于去離子水配制成濃度為20yg/ml的蛋白溶液。 流動相A為0.1% (質(zhì)量百分濃度）甲酸的水溶液，B為0.1% (質(zhì)量百分濃度）甲酸的乙 腈溶液，選用BEHC18色譜柱柱。洗脫程序為：0-5min，流動相AlOO~85%線性降低，流動 相BO~15%線性升高；5~lOmin，流動相A85~100%線性升高，流動相B15%~0線性降 低。樣品經(jīng)過液相色譜分離系統(tǒng)后，再由質(zhì)譜系統(tǒng)將肽段打成不同分子量的碎片，并由質(zhì)量 分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器檢測得到質(zhì)譜圖，實驗結(jié)果如圖4-5。分析質(zhì)譜 圖，發(fā)現(xiàn)洗脫液P3中的活性組分為氨基酸序列為AREGETVVPG的小肽，分子量為1014. 52Da。 洗脫液P3的凍干粉中該小肽的純度為85%。
[0036] (7)測定小肽AREGETVVPG的抗氧化活性
[0037] ①采用DPPH法測樣品的抗氧化活性，方法步驟為：準(zhǔn)確稱量DPPH(1，1_二苯 基-2-三硝基苯肼，購自美國Sigama公司）0. 0046g，用無水乙醇溶解后定容到100ml，配成 0. 12mM的DPPH溶液；待測樣品稀釋成不同濃度，將Iml待測樣品和ImlDPPH溶液混合均 勻，25 °C下避光反應(yīng)30min，反應(yīng)結(jié)束后在517nm波長下測定吸光值A(chǔ)i。實驗需設(shè)置空白組 和對照組。其中，空白組中以水替代樣品，其他步驟同樣品檢測方法，得到吸光值A(chǔ)tl;對照組 中以無水乙醇替代DPPH溶液，其他步驟同樣品檢測方法，測定吸光值A(chǔ)j。每組設(shè)置3個平 行，按如下公式計算清除率：
[0038]
【主權(quán)項】
1. 一種具有抗氧化活性的小肽，氨基酸序列為aregetvvpg。
2. 權(quán)利要求1所述小肽的制備方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 將麥胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物I; (2) 取所述清蛋白水解產(chǎn)物I中分子量小于IOKDa的組分，采用凝膠過濾色譜分離，取 具有抗氧化活性的組分作為清蛋白提取物II; (3) 將所述清蛋白提取物II采用堿性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物III; (4) 將所述清蛋白水解產(chǎn)物III依次采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離，得到 所述小肽。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述制備方法，其特征在于步驟（2)中所述凝膠過濾色譜中的凝膠 填料為SephadexG-75,流動相為水。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述制備方法，其特征在于步驟（4)中所述凝膠過濾色譜中的凝膠 填料SephadexG-15,流動相為水，取具有抗氧化活性的洗脫液。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述制備方法，其特征在于步驟（4)中所述反相高效液相色譜中 使用WatersXBridgeTMprepC18色譜柱，洗脫程序為：0~lOmin，流動相A100~85% 線性降低，流動相B0~15 %線性升高；10~15min，流動相A85~80 %線性降低，流動 相B15~20 %線性升高；收集對應(yīng)于流動相B體積濃度為15. 8~16 %時的洗脫液，即 得所述小肽；所述流動相A是濃度為0. 05-0. 15 %三氟乙酸的水溶液，流動相B是濃度為 0. 05-0. 15%三氟乙酸的乙腈溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述制備方法，其特征在于步驟（1)中所述麥胚清蛋白采用如下方 法獲得：采用水提取脫脂麥胚粉中的清蛋白，加入硫酸銨至飽和度為70 % -80 %，攪拌，離 心取沉淀。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述制備方法，其特征在于所述胰蛋白酶酶解過程中，每克清蛋白 中加入6000-8000U胰蛋白酶，酶解溫度為36. 5-37. 5,酶解pH7. 0-8. 0,酶解時間5-7h。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述制備方法，其特征在于步驟（3)中堿性蛋白酶酶解過程中， 每克蛋白中加入堿性蛋白酶〇. 1-0. 2AU，酶解溫度45-55°C，酶解pH7. 5-8. 5,酶解時間 1. 0~2, 0h〇
9. 權(quán)利要求1所述小肽在提高食品的穩(wěn)定性、延長食品儲藏期或者制備具有抗氧化活 性的保健食品方面的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供具有抗氧化活性的小肽、制備方法及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該小肽的氨基酸序列為AREGETVVPG。該小肽的制備方法包括：將麥胚清蛋白采用胰蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物Ⅰ；取所述清蛋白水解產(chǎn)物Ⅰ中分子量小于10KDa的組分，采用凝膠過濾色譜分離，取具有抗氧化活性的組分作為清蛋白提取物Ⅱ；將所述清蛋白提取物Ⅱ采用堿性蛋白酶酶解，得到清蛋白水解產(chǎn)物Ⅲ；將所述清蛋白水解產(chǎn)物Ⅲ依次采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離，得到所述小肽。本發(fā)明小肽具有較強抗氧化活性，來源于麥胚清蛋白，具有安全、高效、制備方法簡單重復(fù)性好的特點，可以應(yīng)用于提高食品的穩(wěn)定性、儲藏期或制備具有抗氧化活性保健食品。
【IPC分類】C07K7-06, C12P21-06, C07K1-20, C07K1-16, A23L1-305, A23L3-3544
【公開號】CN104788541
【申請?zhí)枴緾N201510228999
【發(fā)明人】沈新春, 陳思遠, 劉永祥, 曹小舟, 蘇安詳, 俞凌
【申請人】南京財經(jīng)大學(xué)
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年5月7日