專(zhuān)利名稱(chēng)：：用作雙重胱天蛋白酶-2/-6抑制劑的新肽及其生物學(xué)應(yīng)用的制作方法用作雙重胱天蛋白酶-2/-6抑制劑的新肽及其生物學(xué)應(yīng)用本發(fā)明涉及用作雙重胱天蛋白酶-2/胱天蛋白酶-6抑制劑的新肽類(lèi)。本發(fā)明還涉及其生物學(xué)應(yīng)用。所有胱天蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)均表現(xiàn)出具有在天冬氨酸殘基和裂解位點(diǎn)N-末端一般4個(gè)連續(xù)氨基酸的識(shí)別序列后裂解的絕對(duì)要求的高度特異性。使用組合手段將它們分類(lèi)成三個(gè)不同的特異性組對(duì)Trp-Glu-His-Asp具有優(yōu)先性的I組(胱天蛋白酶-l，-4，-5);對(duì)Asp-Glu-X-Asp具有優(yōu)先性的11組(胱天蛋白酶-2，-3，-7);和對(duì)(Leu/Val)-Glu-X-Asp具有優(yōu)先性的III組(胱天蛋白酶-6，-8，-9和-IO)。這種特征特異性對(duì)細(xì)胞凋亡過(guò)程而言是決定性的，因?yàn)樗婕耙杂行蚍绞?而非無(wú)差別蛋白水解)裂解特定組的蛋白質(zhì)?；谄湓诩?xì)胞環(huán)境中的作用，可以將胱天蛋白酶視為執(zhí)行(直接裂解在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)或信號(hào)傳導(dǎo)途徑中起作用的特異性下游蛋白底物)或起始胱天蛋白酶(作為細(xì)胞凋亡途徑上游調(diào)節(jié)物起作用)。由于其在調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡中的中樞作用，所以胱天蛋白酶為重要的治療靶標(biāo)。多種神經(jīng)疾病與胱天蛋白酶細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)并且已經(jīng)證實(shí)某些小的胱天蛋白酶抑制劑可阻斷神經(jīng)元細(xì)胞死亡效應(yīng)。作為癌癥和神經(jīng)變性疾病治療所期望的，胱天蛋白酶的受控活化更難以實(shí)現(xiàn)?？赡艿牟呗钥梢园ㄔO(shè)計(jì)特異性抑制指定病理環(huán)境中的必需胱天蛋白酶而非所有胱天蛋白酶的化合物。發(fā)現(xiàn)胱天蛋白酶-2作為第一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的胱天蛋白酶。近期研究揭示出胱天蛋白酶-2作為起始物參與非神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞凋亡的外在和內(nèi)在途徑(Lassus等，2002)。另外，胱天蛋白酶-2既作為默認(rèn)起始物起作用，又作為默認(rèn)執(zhí)行胱天蛋白酶起作用。近來(lái)，本發(fā)明者證實(shí)胱天蛋白酶-2啟動(dòng)原代皮質(zhì)神經(jīng)元即部分模擬體內(nèi)腦缺血的體外模型中血清剝奪所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(Chauvier等，2005)。胱天蛋白酶-2還能夠裂解亨廷頓蛋白，由此可能參與亨廷頓疾病的發(fā)病機(jī)制。其底物特異性尚未完全了解，并且僅獲得了基于兩種五肽VDVAD和LDESD的抑制劑。胱天蛋白酶-6涉及神經(jīng)元(發(fā)育)細(xì)胞死亡并且是執(zhí)行胱天蛋白酶而非起始物。存在至少4種病理學(xué)情況，已知胱天蛋白酶-6在其中被活化在阿爾茨海默病的營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)突和神經(jīng)原纖維纏結(jié)中；在人胎兒和成年人腦缺血過(guò)程中(Guo等，2004);在提示對(duì)于癲癇發(fā)生和癲癇的作用的大鼠紅藻氨酸癲癇發(fā)作模型中；在胃腸內(nèi)襯上皮細(xì)胞的失巢凋亡中。對(duì)胱天蛋白酶-6底物特異性了解不足。獲得了基于四肽VEI(或H)D的抑制劑，但是未獲得用于胱天蛋白酶-6抑制的基于五肽的抑制劑。I/發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明屬于分子建模、醫(yī)學(xué)生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域，并且涉及新化合物和包含所述化合物的藥物組合物，它們抑制促細(xì)胞凋亡性胱天蛋白酶-2(Nedd-2;Ich-l)和/或抑制促細(xì)胞凋亡性胱天蛋白酶-6(Mch2)并且用于治療涉及胱天蛋白酶-2活性和/或胱天蛋白酶-6的疾病和損傷。本發(fā)明涉及具有選自下組的核心序列的新肽類(lèi)SEQIDN°1:VDEADSEQIDN。2:LDEGDSEQIDN°3:VDEGDSE(JIDN°4:VDESDSEQIDN°5:LDEKDSEQIDN°6:FDESDSEQIDN°7:LDEAD。所述的肽類(lèi)有利地具有N-末端和/或C-末端保護(hù)基。按照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，所述的肽類(lèi)具有N-末端保護(hù)基M，其表示A-(CH2)nl，其中.nl=0-20;.當(dāng)nl-O時(shí)，M為H;.A為C1-C20烷基、一個(gè)或幾個(gè)稠合環(huán)和/或雜環(huán)；.當(dāng)不為H，并且當(dāng)nl大于2時(shí)，A為飽和或不飽和的并且任選被一個(gè)或幾個(gè)基團(tuán)取代，所述的基團(tuán)諸如為H、0H、0Ra、(CH2)nlOH、(CH2)nlORa、COOH、C00Ra、(CH2)nlC00H、(CH2)nlC00Ra、C廣C3烷基或環(huán)烷基、(CH丄廣烷基、CO-NH-烷基、Ar、(CH丄廣Ar、CO-NH-Ar、卣素、CF3、S03H、(CH2)xP03H2,B(0H)2、N02、S0萬(wàn)、S02NHRa;其中x=0,1或2;Ra為d-C3烷基并且Ar為任選取代的芳基或雜芳基；或.A為一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基；或.A表示發(fā)色、熒光、發(fā)光、吸收(UV至近IR)基團(tuán)；放射性同位素；金屬粒子，諸如用于電子顯微鏡檢查的金屬粒子；比色基團(tuán)；生物素/鏈審抗生物素/neutravidin標(biāo)記系統(tǒng)；或類(lèi)似物。按照可選與上述披露的實(shí)施方案聯(lián)用的另一個(gè)實(shí)施方案，本發(fā)明的肽類(lèi)具有羰基(carbony)，其中X為H或羧基保護(hù)基，所述的羧基保護(hù)基選自下組0Rb、NHRb、SRb、CH20Rb、CH2NHRb、CH2SRb、CH肌和CH2Y,其中Rb-?；⑼榛?、取代的烷基、芳基、雜芳基、取代的芳基或雜芳基，其任選與一個(gè)或幾個(gè)環(huán)和/或雜環(huán)稠合；C1-C20取代或未被取代的脂族基團(tuán)、芳烷基碳環(huán)、烷基碳環(huán)或雜環(huán)基，其任選與一個(gè)或幾個(gè)芳族或非芳族環(huán)稠合，并且Y為卣原子(F、Cl、Br或I)或N02，或X表示發(fā)色、熒光、發(fā)光、吸收(UV至近IR)基團(tuán)、放射性同位素諸如用于電子顯微鏡檢查的金屬粒子、比色基團(tuán)、生物素/鏈霉抗生物素/neutravidin標(biāo)記系統(tǒng)或類(lèi)似物。正如通過(guò)實(shí)施例解釋的，上述披露的肽類(lèi)特別具有對(duì)胱天蛋白酶-2和/或-6活性的抑制劑特性。本發(fā)明由此還涉及其作為抑制劑用于預(yù)防或阻斷細(xì)胞死亡，特別是神經(jīng)元、神經(jīng)元細(xì)胞或非神經(jīng)元細(xì)胞中胱天蛋白酶-2活性的應(yīng)用。此外，本發(fā)明的肽類(lèi)具有高度無(wú)害性。通過(guò)在成年Swiss小鼠中iv或ip注射100mg/kg未觀察到毒性。所述的特性有利地用于藥物組合物。本發(fā)明還涉及包含治療有效量的至少一種諸如上述定義的肽或胱天蛋白酶-2和/或-6抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。所述的藥物組合物采用適合于通過(guò)口服、鼻部、局部(例如皮下、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)植入浸漬了化合物或藥物組合物的材料、大腦內(nèi)植入機(jī)械遞送裝置)或全身(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)….)給藥以減少細(xì)胞死亡的形式。以適合于所治療的病理學(xué)情況和患者年齡的劑量給予本發(fā)明的組合物。所述的劑量特別為l(Tmg-lOOg/Kg，尤其是0.1-10mg/kg。這類(lèi)劑量可有效地治療新生兒(足月分娩)、兒童、成年人的總體缺血?？梢酝ㄟ^(guò)口服途徑或通過(guò)ip、iv或皮下注射(1次或幾次)給予它們。所述的藥物組合物特別用于治療病理情況，包括缺氧-缺血(H-1)H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)；病理情況，包括腦缺氧-缺血(H-I)(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)；神經(jīng)元死亡，特別是在總體性或局部性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中；.神經(jīng)元死亡，特別是在成年人、胎兒或圍產(chǎn)期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中；.神經(jīng)元死亡，特別是暫時(shí)性或永久性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中；.神經(jīng)元死亡，特別是H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況，存在或不存在再灌注情況的腦損傷(例如腦、腎、心力衰竭)；.神經(jīng)元死亡，特別是在成年人、胎兒或圍產(chǎn)期H-I中的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCA0)中；.神經(jīng)元死亡，特別是當(dāng)合并下列病理事件的至少一種或多種時(shí)存在或不存在再灌注的總體或局部、暫時(shí)性或永久性、成年人或胎兒或圍產(chǎn)期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，在腦水平上或在整體水平上；.神經(jīng)元死亡，特別是在腦損傷后的至少一種或多種情況時(shí)；.神經(jīng)元死亡，特別是在圍產(chǎn)期腦損傷后的至少一種或多種情況時(shí)。更具體地說(shuō)(a)本發(fā)明涉及五肽-胱天蛋白酶-2蛋白質(zhì)復(fù)合物的分子對(duì)接，所述的復(fù)合物使得能夠(i)鑒定提供與胱天蛋白酶-2接觸所需的氨基酸殘基和(ii)確定這些序列與胱天蛋白酶-2之間相互作用的性質(zhì)。(b)本發(fā)明涉及獲得新的五肽序列/基于它們的抑制劑，其誘導(dǎo)與胱天蛋白酶-2的可逆或不可逆復(fù)合物形成(即具有更低的最小能量)，由此產(chǎn)生對(duì)胱天蛋白酶-2活性的實(shí)驗(yàn)性抑制。(c)本發(fā)明涉及獲得第一種五肽序列/基于五肽的化合物，其抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性，但不抑制其它胱天蛋白酶或蛋白酶(需鈣蛋白酶，粒酶B)。(d)本發(fā)明涉及獲得第一種五肽序列或基于五肽的化合物，其導(dǎo)致胱天蛋白酶-6抑制。(e)本發(fā)明涉及獲得第一種五肽序列或基于五肽的化合物，其以相似劑量范圍抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性。(f)可以通過(guò)組合分子對(duì)接和功能性裂解體外試驗(yàn)而對(duì)新的胱天蛋白酶-2抑制劑進(jìn)行合理設(shè)計(jì)。(g)在一種非限制性實(shí)施方案中，可以將這些序列合并到在其N(xiāo)-末端的甲基丙二酰衍生物、喹啉基衍生物。在一種非限制性實(shí)施方案中，可以將離核體如2,6-二氟苯基酯、2，6-二氟苯氧基、2-溴苯甲酰氧基、氟添加到羧基末端位置上。在一種非限制性實(shí)施方案中，氨基酸側(cè)鏈可包含保護(hù)基，諸如甲基，以便改善細(xì)胞滲透性和保留?；谙惹暗臄?shù)據(jù)，這類(lèi)五肽序列/相關(guān)化合物為抑制體外缺血性神經(jīng)元細(xì)胞死亡(尤其是細(xì)胞凋亡，Chauvier等，2005)和體內(nèi)病理學(xué)情況包括腦(缺氧-)缺血性損傷(局部暫時(shí)性圍產(chǎn)期H-1或MCA0(大腦中動(dòng)脈閉塞)FR專(zhuān)利申請(qǐng)0306190和W02004/103389;TheraptosisSA)的精確模板。(h)本發(fā)明涉及如下發(fā)現(xiàn)新的胱天蛋白酶-2抑制劑預(yù)防或減少體內(nèi)病理學(xué)情況中的腦細(xì)胞死亡，所述病理學(xué)情況包括心臟停搏或心血管損傷過(guò)程中血流減少/缺氧后成年人全腦缺血。(i)本發(fā)明涉及新的胱天蛋白酶抑制劑的新的應(yīng)用，包括局部(例如腦室內(nèi)、海馬內(nèi)……)遞送或全身(腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)….)給藥以便減少病理學(xué)情況過(guò)程中的腦細(xì)胞死亡，在所述的病理學(xué)情況中，血流和氧壓受到擾亂，即腦(暫時(shí)性或永久性)局部或總體缺血。(j)本發(fā)明涉及治療存在細(xì)胞死亡的病理學(xué)情況，特別是缺血和中風(fēng)性損傷的方法，包括給予治療有效劑量的諸如上述定義的藥物組合物。(k)包含有效量的本發(fā)明肽類(lèi)的藥物組合物特別用于預(yù)防、減少和治療存在細(xì)胞死亡的病理情況，特別是在H-I損傷和中風(fēng)樣情況的腦損傷中例如總體或局部的暫時(shí)或永久性成年人、胎兒、圍產(chǎn)期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，其源自腦或心臟水平，存在或不存在再灌注；或MCAO(大腦中動(dòng)脈閉塞)。本發(fā)明的具體特征和優(yōu)點(diǎn)在下列數(shù)據(jù)中給出并且參照附圖1-17,這些附圖分別表示-附圖l:本發(fā)明胱天蛋白酶-2抑制劑的結(jié)構(gòu)；-附圖2:胱天蛋白酶-2活性部位上的化合物i(Ac-LDESD-cho);—附圖3:Ac-LDESD-cho1_的結(jié)構(gòu)和某些殘基和官能團(tuán)；-附圖4:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho]_和Ac-LDEAD-choH的重疊；-附圖5:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-choL和Qco-VDVAD-choH的重疊；-附圖6:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho1_和Ac-LDEAD-choH的重疊；-附圖7:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-cho匕和Ac-LDEKD-choH的重疊；—附圖8:新設(shè)計(jì)的五肽抑制劑對(duì)人重組胱天蛋白酶-2的抑制曲線；—附圖9:本發(fā)明五肽抑制劑對(duì)人重組胱天蛋白酶-2抑制作用的三種典型模式；—附圖10:胱天蛋白酶-2抑制的實(shí)驗(yàn)推定(IC50以nM計(jì))，-附圖11:Ac-VDVAD-cho的抑制i脊；-附圖12:Ac-LDEAD-cho的抑制鐠；—附圖13:Ac-VDEAD-cho的抑制謙；一附圖14:新設(shè)計(jì)的五肽抑制劑對(duì)重組需鉤蛋白酶I和II的抑制譜；—附圖15:新設(shè)計(jì)的五肽抑制劑對(duì)重組粒酶B的抑制譜；—附圖16:SEQ8對(duì)胱天蛋白酶-2的體外抑制；-附圖17:當(dāng)缺血后l小時(shí)i.p.給藥時(shí)SEQ8使得新生兒缺血性腦損傷的梗塞體積減小(48小時(shí))。11/序列和胱天蛋白酶-2抑制劑的合理設(shè)計(jì)11-1/胱天蛋白酶-2-抑制劑復(fù)合物相當(dāng)于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)構(gòu)lpyo(Schweizer等，2003)。以不帶電荷形式在介電常數(shù)為1時(shí)研究所有模型。通過(guò)Accelrys的Biopolymer模塊(SanDiego，CA)手動(dòng)修飾抑制劑。固定酶原子并且使用2000個(gè)步驟的接合梯度，應(yīng)用Discover模塊使該抑制劑最小化，直到RMS<0.0001Kcal/mol.A。使用InsightII模塊計(jì)算非共價(jià)能值(范德瓦耳斯能和庫(kù)侖能)。11-2/結(jié)果和討論附圖1顯示通過(guò)使用上述方法進(jìn)行分子建模研究的一系列化合物。這些化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的功效的特征在于相應(yīng)酶-抑制劑復(fù)合物的最低能量(Ucal/mo1)(附圖1)。該能量由兩種成分組成(i)因抑制劑與酶殘基之間的氫鍵和鹽橋所致的電或庫(kù)侖成分(E庫(kù)侖)5(U)因抑制劑與酶之間的范德瓦耳斯相互作用產(chǎn)生的排斥-吸引(E范德瓦耳斯)。附圖2顯示胱天蛋白酶-2活性部位上的參考分子Ac-LDESD-choi。正如所示的，將這種五肽的原子表示如下(a)綠色-碳；(b)白色=氫；(c)藍(lán)色=氮；(d)紅色=氧。這種抑制劑與胱天蛋白酶-2之間的電相互作用(氫鍵和鹽橋)由綠色虛線表示。在該附圖中，與抑制劑1_發(fā)生相互作用的酶殘基用黃色表示并且那些不與抑制劑發(fā)生相互作用的酶殘基用紅紫色表示。抑制劑殘基由其1字母密碼隨后是表明其在抑制劑序列中的位置的數(shù)字表示。還顯示了第一個(gè)殘基上的氨基的保護(hù)。為清楚目的，未在附圖1中顯示范德瓦耳斯互作用。在全文中將相同的條理用于表示其它新設(shè)計(jì)的五肽抑制劑與胱天蛋白酶-2酶之間形成的復(fù)合物。正如附圖2中所示，使Ac-LDESD-cho1_與胱天蛋白酶-2活性部位之間的復(fù)合物穩(wěn)定的氬鍵和鹽橋如下Ll(mO-TB233(OH)，L1(C0)-TB233(NH)，D2(NH)-YB273(CO)，D2(0&)-YB273(NH)，D2(0&)-WB238(巧I咮)和NB232(NH2)，E3(NH)-RB231(CO)，E3(0&)-RB231(胍，鹽橋)，E3(C0)-RB231(NH)，D5(NH)-AB229(CO)，D5(0&)-QA153(NH》和RA54(NH2)，D5(0&)-RB231(胍，鹽橋)和RA54(胍，鹽橋)，D5(C0)-CA155(NH)和HA112(咪唑)和GA113(NH)。用于設(shè)計(jì)殘基的命名、殘基側(cè)鏈的氧原子和第一個(gè)殘基的氨基保護(hù)如附圖3所示。將所研究的每種化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的能力與在所用模型中表現(xiàn)出-76.6Kcal/mol最低能量(Ein)的參照五肽Ac-LDESD-choL進(jìn)行比較。由此可以從本發(fā)明者的工作中推導(dǎo)出下列結(jié)論?！ńzf換Ll被VI置換(Ac-VDESD-cho2，Erain--101.2Kcal/mol)使得抑制劑-胱天蛋白酶-2復(fù)合物的穩(wěn)定性更好。該抑制劑的功效在S4被下列殘基置換時(shí)甚至更大(i)K4(Ac-LDEKD-choH，Emin=-101.2Kcal/mol);(ii)A4(Ac-LDEAD-cho，化合物M，Enin=-133.7Kcal/mol);或(iii)G4(Ac-LDEGD-cho，化合物Enin=-135.0kcal/mole)。這些觀察結(jié)果由此證實(shí)化合物2，11，H和1L為比參照化合物i(Ac-LDESD-cho)更好的胱天蛋白酶-2抑制劑。附圖4顯示在胱天蛋白酶-2活性部位中化合物L(fēng)和11(Ac-LDEAD-cho)的重疊。將化合物M(Emin=-113.2Kcal/mol,Ll被VI置換且S4被A4置換，Ac-VDEAD-cho)與化合物2(E^=-101.2Kcal/mo1，Ll被VI置換，Ac-VDESD-cho)比較顯示，在4位上丙氨酸(A4)比絲氨酸(S4)使得酶-抑制劑復(fù)合物更好的穩(wěn)定。使用化合物|(EninE-85.4kcal/mole，Ll被VI置換，E3被V3置換且S4被A4置換，Ac-VDVAD-cho)和l--113.2Kca1/mo1，Ll被VI置換且S4被A4置換，Ac-VDEAD-cho)獲得的結(jié)果表明谷氨酸(E3)能夠使得胱天蛋白酶-2穩(wěn)定優(yōu)于3位上為纈氨酸(V3)。此外，將化合物l(Ein=-97.2Kcal/mo1，Ll被Fl置換，Ac-FDESD-cho)與l(Enin=-128.6Kcal/mol,Ac-LDESD-cho)比較顯示在1位上為亮氨酸(Ll)使得酶-抑制劑復(fù)合物穩(wěn)定優(yōu)于苯丙氨酸(F1)殘基。此外，在所有所研究的化合物中，D2和/或D5被其它氨基酸置換顯示出抑制劑-胱天蛋白酶-2復(fù)合物的最低能量(Ein)大大增加(結(jié)果未顯示)，從而表明這兩種殘基必須在新設(shè)計(jì)的胱天蛋白酶-2抑制劑中保持不變。？/岸一個(gè)戎差W我差保^為了鑒定胱天蛋白酶-2酶的更有效抑制劑，研究了第一個(gè)殘基的氨基官能基的不同保護(hù)基對(duì)抑制劑-酶復(fù)合物穩(wěn)定性的作用。為了這一目的，使用所用的4種不同五肽序列LDESD、VDVAD、LDEAD和VDEAD。結(jié)果如下所示(在文件的最后定義所用的縮寫(xiě))廣WZ/^5^系/厶胱天蛋白酶-2酶與化合物i(Ac-LDESD-cho，Enin=-76.6Kcal/mol)，^(Qop-LDESD-cho，Efflin--8.3Kcal/mol)，!(Suc-LDESD-cho，Emin=-85.7Kcal/mol),，a卜LDESD-cho，Enin=-128.6Kcal/mol),互(Qmal-LDESD-cho，E"=-53.8kcal/mole)或^!(0xa-LDESD-cho，Enin=-9.5Kcal/mol)之間形成的復(fù)合物顯示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mai)基團(tuán)使得能夠遠(yuǎn)比乙?；玫匾种齐滋斓鞍酌?2酶；(ii)3-氧代-3-喹啉基丙?；?Qop)、3-(2-喹啉基)丙二酰基(Qma1)和草?；?Oxa)導(dǎo)致形成的酶-抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定性比乙酰基低。0,raWZ,/y。胱天蛋白酶-2與化合物，(Ac-VDVAD-cho，Ein=-85.4Kcal/mol),^(Qop-VDVAD-cho，Erain--14.2Kcal/mol),M(Mal-VDVAD-cho，Enin=-134,9Kcal/mol),U(Suc-VDVAD-cho，Enin=-91.9Kcal/mol)，U(Qmal-VDVAD-cho，Ein=—59.0Kcal/mol),U(Qco-VDVAD-cho，Ein=+38.0Kcal/mol附圖5)，n(Bz-VDVAD-cho，Enin--4.8Kcal/mol),U(Z-雷AD-cho，Emin--31.8Kcal/mol),li(Hxa-VDVAD-cho，Erain=-59.0Kcal/mol)和H(雨AD-cho,Erain=-32.0kcal/mol)之間形成的復(fù)合物顯示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mai)基團(tuán)比乙?；鶎?dǎo)致形成更穩(wěn)定性的酶-抑制劑復(fù)合物且由此對(duì)胱天蛋白酶-2的抑制更好；(ii)3-氧代-3-喹啉基丙?；?Qop)、2-喹啉基丙二?；?Qmal)、2-喹淋基羰基(Qco)、苯甲酰基(Bz)和己?；?Hxa)導(dǎo)致抑制劑的功效低于乙?；?。正如使用未被保護(hù)的五肽H所證實(shí)的，第一個(gè)殘基上缺乏保護(hù)還導(dǎo)致形成的酶-抑制劑復(fù)合物的穩(wěn)定性較低。應(yīng)注意是在酶的原子固定情況下實(shí)現(xiàn)對(duì)接。這可以解釋對(duì)2-喹啉基羰基化合物U，^和ll的最低能量觀察到的正值。表1.某些抑制劑-胱天蛋白酶-2復(fù)合物的最低能量(Kcal/mo1)<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>該系列化合物還表明，Qco-VDVAD-cho13表現(xiàn)出作為胱天蛋白酶-2酶抑制劑的功效較低。實(shí)際上，正如上文表l中所示，當(dāng)化合物i被化合物il替換時(shí)，Enin的電(E庫(kù)侖)和疏水性(E范德瓦耳斯)成分均增加。下表2和3顯示不同殘基(V1，D2，V3，A4和D5)和保護(hù)基(乙酰基和2-喹啉基羰基)對(duì)抑制劑-胱天蛋白酶-2復(fù)合物穩(wěn)定的促進(jìn)。這些結(jié)果表明乙?；?-奮啉基羰基置換(表3)導(dǎo)致-1位上的纈氨酸(Vl)與胱天蛋白酶-2活性部位之間的相互作用較弱；-保護(hù)基的羰基(O0)官能團(tuán)與酶之間的相互作用較弱；-酶-抑制劑復(fù)合物因位阻的2-會(huì)啉基羰基而不穩(wěn)定。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>經(jīng)證實(shí)實(shí)驗(yàn)室中合成的Qco-VDVAD-CH20(2,6-二氟苯基)為胱天蛋白酶-2的有效抑制劑(IC5=80nM)。這表明在形成酶-抑制劑復(fù)合物的過(guò)程中可能存在酶的調(diào)節(jié)以便誘導(dǎo)抑制劑更好地適合于胱天蛋白酶-2活性部位。另一種解釋可能為這種類(lèi)型的化合物結(jié)合入酶上的變構(gòu)部位(另外參見(jiàn)化合物U，ll和ll，附圖l)。將進(jìn)行使用未固定的胱天蛋白酶-2殘基的額外研究以便獲得對(duì)Qco-VDVAD-CH20(2，6-二氟苯基)觀察到的生物學(xué)結(jié)果的洞察。ZZ^4"-/厶對(duì)化合物H(Ac-LDEAD-cho，Emin=-133.7kcal/mole),U(Mal-LDEAD-cho，Enin=-179.2Kcal/mol)，i^(Memal-LDEAD-cho，Emin=-145.9Kcal/mol),^(Mac-LDEAD-cho，Emin=-97.6Kcal/mol)和li(Ps-LDEAD-cho，Enin--71.6Kcal/mol)的研究進(jìn)一步證實(shí)了丙二?；?Mal)和3-甲基丙二酰基(Memal)比乙?；姑?抑制劑復(fù)合物穩(wěn)定性更好。該系列還顯示出3-甲氧基乙酰基(Mac)和苯基磺?；?Ps)產(chǎn)生的抑制劑有效性比乙酰基所產(chǎn)生的低。f刃ra^/#/{/。使用化合物^((Ac-VDEAD-cho，Emin=-113.2kcal/mole)和21(Memal-VDEAD-cho，Enin=-126.1Kcal/mol)獲得的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)3-曱基丙二?；?Memal)比乙?；a(chǎn)生了更有效的抑制劑。班絲麟費(fèi)為了研究D5殘基構(gòu)型對(duì)抑制胱天蛋白酶-2的作用，還研究了化合物M(d5，Emin=+65.5Kcal/mole)。將由此觀察到的最低能量(Erain)與化合物U(Emin=+38.0Kcal/mol)和化合物l￡(d5，Ein=+65.5Kcal/mol)比較清楚地表明5位上的少構(gòu)型導(dǎo)致抑制劑的功效降低。這一結(jié)果通過(guò)比較酶與化合物M(Ac-LDEAD-cho，Erain=-133.7kcal/mole)和化合物li(Ac-LDEAd-cho,Enin=-107.8Kcal/mol)之間形成的復(fù)合物的能量而得以證實(shí)。實(shí)際上，正如附圖6中所示，化合物ll與酶之間形成的復(fù)合物會(huì)喪失D5羰基與胱天蛋白酶-2半胱氨酸A155殘基的巰基之間的C-S共價(jià)鍵。此外，該天冬氨酸殘基的側(cè)鏈與酶之間的氫鍵會(huì)喪失。4/減凝辨農(nóng)類(lèi)使用化合物ll(Z-VAD-cho，Erain=-7.6Kcal/mol)和H(Z-VD-choEmin=+66.6Kcal/mol)獲得的結(jié)果表明這些截短的肽類(lèi)為有效性較低的胱天蛋白酶-2抑制劑。II-3/結(jié)論這種對(duì)新胱天蛋白酶-2抑制劑的搜尋顯示(a)VDVAD序列產(chǎn)生了比LDESD序列稍更有效的胱天蛋白酶-2抑制劑(對(duì)比化合物1_和1，1和2,l和ii，l和j^，i和U)。(b)LDEAD，LDEGD和LDEKD序列產(chǎn)生了比VDVAD序列更有效的胱天蛋白酶-2抑制劑(對(duì)比化合物i與ii，li與U,l與&，和l與iy。(c)VDESD(參見(jiàn)化合物2)和VDEAD(參見(jiàn)化合物1序列提供了優(yōu)于VDVAD序列的胱天蛋白酶-2酶抑制劑。Z/婆洽逸舉和放射'勝標(biāo)記本研究清楚地證實(shí)胱天蛋白酶-2活性部位可以適應(yīng)五肽抑制劑4位上的不同殘基。例如，在化合物1L中，如附圖7中所示，這通過(guò)將賴(lài)氨酸殘基(K4)側(cè)鏈定位在酶活性部位外部來(lái)實(shí)現(xiàn)。在這種情況中形成的高度穩(wěn)定的復(fù)合物(化合物II,在4位上的絲氨酸被賴(lài)氨酸置換)表明，熒光發(fā)色團(tuán)(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、若丹明和AlexaFluor)或生物素可以被引入該位置，由此能夠在生物系統(tǒng)中對(duì)這些五肽抑制劑進(jìn)行路由選擇。這種胱天蛋白酶-2酶容納在4位上幾種殘基的能力還表明，在該位置上可以引入離代苯丙氨酸或酪氨酸殘基以便進(jìn)行放射性標(biāo)記。J/f^iJ:天冬扇^的^藝用于合成化合物i(附圖l)的醛或甲基酮類(lèi)似物的常規(guī)操作步驟有時(shí)產(chǎn)生D5殘基的差向異構(gòu)化。形成的異構(gòu)體混合物有時(shí)難以分離。正如在II-2.3/部分中所示的，由此形成的頭差向異構(gòu)體的功效因該殘基與酶之間的氫鍵和共價(jià)相互作用的喪失而低于Z-異構(gòu)體。4力在丄扇差f雜窗^保^乙酰基被其它保護(hù)基置換產(chǎn)生了如下結(jié)論和評(píng)價(jià)(a)2-喹啉基羰基(Qco)表現(xiàn)出導(dǎo)致酶-抑制劑復(fù)合物不穩(wěn)定(參見(jiàn)化合物13，23和30)。這一觀察結(jié)果并不嚴(yán)格按照使用Qco-VD(0me)VAD(0me)-CH20(2，6-二氟苯基)獲得的生物數(shù)據(jù)，表明誘導(dǎo)的適應(yīng)機(jī)制可能在形成抑制劑-胱天蛋白酶-2復(fù)合物的過(guò)程中起作用。變構(gòu)結(jié)合也可以解釋這種在//w7/co與體外結(jié)果之間觀察到的差異。(b)在所研究的保護(hù)基中，丙二?；?Mal)表現(xiàn)出導(dǎo)致對(duì)胱天蛋白酶-2的抑制遠(yuǎn)優(yōu)于其它基團(tuán)(參見(jiàn)化合物11，Erain=-179.2Kcal/mo1)。此外，3-甲基丙二酰基(Memal,化合物16，Erain--145.9Kca1/mo1)也表現(xiàn)出產(chǎn)生高度穩(wěn)定的酶-五肽復(fù)合物。如果諸如H這類(lèi)化合物可以被酯酶水解成相應(yīng)的衍生物11，此后與胱天蛋白酶-2活性部位結(jié)合，那么甚至可以觀察到更有效的抑制作用。因此，極大的注意力會(huì)集中在這種Mema1基團(tuán)用于設(shè)計(jì)新胱天蛋白酶-2抑制劑。J/-義J/席去差時(shí)逸舉為了研究離去基對(duì)這些抑制劑功效的作用，合成并且在不同生物系統(tǒng)中評(píng)價(jià)了在D5殘基上具有不同離核體的五肽類(lèi)。根據(jù)其理化特性及其報(bào)導(dǎo)的生物特性諸如毒性和細(xì)胞滲透性和保留性選擇這些離去基。這些選擇的抑制劑由此具有通式32:其中(i)GP如上述對(duì)M所定義且特別-保護(hù)基，諸如丙二?；?、甲基丙二?；?、2-會(huì)啉基羰基、琥珀?；趸牾；⒁阴；?-喹啉基丙二?；?；雜環(huán)，諸如取代或未被取代的四氫喹啉、四氫異喹啉、二氫吖啶、苯并吖庚因、吡咯烷、嗎啉、硫代嗎啉、哌溱、哌咬、二氫吡咬、苯并咪唑、咪唑、咪唑啉、吡咯、吡咯烷、吡咯啉、吡唑啉、吡唑烷、三唑、旅咬、嗎啉、減，代嗎啉、腺溱、呼唑、吩逸嗪、吩喁嗪、二氫吩嗪、二氫噌啉、二氫喹喔啉、二氫萘啶、四氫萘啶、二氫吖啶、吲哚、異吲哚、二氫吲哚、吲哚滿(mǎn)、吲唑、嘌呤、9,10-二氫菲啶、5H-二苯并[b，f]吖庚因、10，11-二氫-5H-二苯并[b，f]吖庚因、p-^啉、吡啶并[4，3-b]吲哚、2，3，9-三氮雜芴、9-硫雜-2，10-二氮雜蒽、噻吩并[3，2b]吡咯、二氫菲、千氧羰基等....；氫原子、Cw。脂族基團(tuán)、芳基、取代的芳基(實(shí)例4-硝基苯基或香豆素衍生物)、雜芳基(實(shí)例2-吡啶)、取代的雜芳基、環(huán)烷基、萘基、取代的萘基、(CH丄環(huán)烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基(實(shí)例2，6-二鹵代苯基)、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄雜芳基或(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、藥甲基；GP還可以為R、U、CO(CH丄歸)、CO(CH2)nS(U),其中U為(未被)取代的(2-，3-，4-，5-,6-，7-或8-)奮啉基、Ch。直鏈或支鏈烷基、(CH2)n環(huán)烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄雜芳基、生物素、二硝基苯基(DNP)、碘乙酰胺類(lèi)、DTNB、C0R(實(shí)例2-喹啉基羰基)、C00R、CO(CH2)nNH(Z)、吖啶衍生物(紅、黃、橙….)、熒光素衍生物(熒光素、FITC、FAM(羧基熒光素)、5-(和-6)-羧基萘并熒光素、羧基熒光素、BCECF、萘并熒光素(napto熒光素)……)、OregonGreen(2'，7'-二氟熒光素)染料(OregonGreen488，OregonGreen514".)、B0DIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜"-indacene-3-丙酸)染料(B0DIPYFL，B0DIPYTMR，B0DIPYTR，B0DIPY630/650，B0DIPY630/665.....)、Bimane、香豆素衍生物(氨曱基香豆素(AMC)、AMCA、氨基香豆素、二乙氨基香豆素、羥甲基香豆素；羥基香豆素、甲氧基香豆素、AFC、…)、花青苷衍生物(藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7...)、赤蘚素/藻紅蛋白衍生物(R-藻紅蛋白(PE)、B-藻紅蛋白…)、APC/PE-Cy綴合物(PE-Cy5綴合物、PE-Cy7綴合物、APC-Cy7綴合物….)、釣黃綠素衍生物(鈣黃綠素、SNAFL鈣黃綠素….)、DANS、DANSA、CascadeBlue、Luciferyellow、NBD、Red613、FluorX、若丹明衍生物(若丹明123、若丹明110、若丹明B、若丹明6A、若丹明6G、TRITC、X-若丹明、磺基若丹明、若丹明Red-X、Lissamine若丹明B、DHR、若丹明Green….)、PerCP、德克薩斯紅、TruRed、AlexaFluo(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750...,)、Q-DOTs7"衍生物(655、605、585、525，…)、SNARF、ZenonTM衍生物(ZenonAlexaFluor350、ZenonAlexaFluor488、ZenonAlexaFluor555、ZenonAlexaFluor594、ZenonAlexaFluor647、Zenon另'J藻藍(lán)蛋白、Zenon生物素-XX、ZenonR-藻紅蛋白............);NBD、TexasRed、QSY⑧染料(QSY⑧7、QSY9、QSY35、QSY21)、Hoechst(33342、33258)、DAPI、色霉素A3、普卡霉素、SYTOX(藍(lán)、綠、橙)、乙錠、溴乙錠、7-AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO-PRO染料、B0B0染料、JO-PRO染料、L0-PR0染料、P0-PR0染料、Y0-PR0染料、ThiazoleOrange、碘乙錠(PI)、LDS751、Indo⑧染料(Indo-1…)、Fluo⑧染料(Fluo-3".)、DCFH、pNA、SYBR綠II、SyPro(橙、深紅)、EDANS、IR800、Dil、DiO、DiD、SNARF⑧衍生物、Fura染料、QUIN染料、NAN0G0LD顆粒、NAN0G0LD馬來(lái)酰亞胺、AlexaFluorFluoroNANOGOU)、AlexaFluorFluoroNANOGOLD鏈霉抗生物素、孔雀綠、Dabcyl，Dabsyl、Cascadeyellow、dansyl、Dapoxyl、PyMPO、芘、苯并噍二哇衍生物、鏈霉抗生物素"Vneutravidin-/生物素-標(biāo)記的焚光微球、CMNB-籠形鏈霉抗生物素?zé)晒饩Y合物、calcofluorwhite、尼羅紅、Y66F、Y66H、EBFP、GFP野生型、QFP突變體H9/P4/P9/P11/W、GFPuv、ECFP、Y66W、S65A、S65C、S65L、S65T、EGFP、EYFP、ECFP、DsRedl、DsRed2、NAN0G0LD顆粒、鏈霉抗生物素-Nanogold、MonomaleidoNanogold、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold⑧、MonoaminoNanogold⑧、帶正電荷/負(fù)電荷的Nanogold(NN、NHSN、NHSNA、NHSNS)、非官能化Nanogold、MonomaleidoNanogold、Mono-Sulfo-NHS-Nanogold⑧、MonoaminoNanogold、非官能Nanogold、Nanogold⑧一綴合物、Nanogold⑧一鏈霉抗生物素、月旨質(zhì)-Nanogold(棕櫚酰Nanogold、DPPENanogold、棕櫚酰Undecagold、DPPEUndecagold)、Ni-NTA-Nanogold⑧、AlexaFluor488FluoroNanogold、AlexaFluor594FluoroNanogold、熒光素FluoroNanogold、HRP底物-Nanogold、比色基團(tuán)(pNA…)或生物發(fā)光底物、放射性同位素……放射性同位素(實(shí)例I125、H3、S35、C"、P33、P32、Cr51、Ca45、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137，Eu152、Ra226、Xe133、锝99、鉈201)。在一種非限制性實(shí)施方案中，產(chǎn)熒光部分發(fā)射光，將電子轉(zhuǎn)移至受體(FRET)或在裂解后淬滅或?qū)LIP、FLIM、FRAP技術(shù)敏感。(n)X=氫原子、0R、NHR、SR、CH2OR、CH2NHR、CH2SR、CH2OR和CHJ;其中R=?；?、烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基和為脂族基團(tuán)、芳基、芳烷基、碳環(huán)基、烷基碳環(huán)基或雜環(huán)基，Y=卣原子(F、Cl、Br或I)或N2。X還可以為Cw。脂族基團(tuán)、取代或未被取代的芳基、環(huán)烷基、萘基、取代的萘基、2-苯并喁唑基、取代的2-喁唑基、(CH丄環(huán)烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄雜芳基、CH2N2、CH2Y、0H、0R、NH2、NHR、NR2、SR、COR、C02R、CONR2、CH2OCOR、CH20-C0芳基、CH20-C(0)取代的芳基(實(shí)例2，6-二甲基苯甲酰氧基甲基)、CH20-C(0)取代的芳基、CH20-C(0)雜芳基、CH20-C(0)取代的雜芳基或CH2OPOR2;其中R-氫原子、Ch。脂族基団、芳基、取代的芳基(實(shí)例4-硝基苯基或香豆素衍生物)、雜芳基(實(shí)例2-吡啶)、取代的雜芳基、環(huán)烷基、萘基、取代的萘基、(CH丄環(huán)烷基、(CH丄苯基，(CH丄取代的苯基(實(shí)例:2，6-二面代苯基)、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄雜芳基或(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、努甲基。其中Y為負(fù)電離去基，包括面素，諸如F、Cl、Br或I;芳基或烷基磺酰氧基、三氟曱磺酰氧基、0R、SR、C00R、0P(0)R2，其中R為脂族基團(tuán)、芳基、芳烷基、碳環(huán)基、烷基碳環(huán)基或雜環(huán)基；其中X-U為(未被)取代的(2-，3-，4-，5-，6-，7-或8-)喹啉基、d—2。直連或支鏈烷基、(ClUn環(huán)烷基、(CH丄苯基、(CH丄取代的苯基、(CH丄(l-或2-萘基)、(CH丄雜芳基、生物素、二硝基苯基(DNP)、DTNB、吖啶衍生物(紅、黃、橙….)、熒光素衍生物(熒光素、FITC、FAM(羧基熒光素)、5-(和-6)-羧基萘并熒光素、羧基熒光素、BCECF、萘并熒光素……)、OregonGreen(2'，7'-二氟熒光素)染料(OregonGreen488、OregonGreen514…)、BODIPY(4，4-二氟-5，7-二甲基-4-硼雜-3a，4a-二氮雜-s-indacene-3-丙酸)染料(BODIPYFL，BODIPYTMR、BODIPYTR、BODIPY630/650、BODIPY630/665"...)、Bimane、香豆素衍生物(氨曱基香豆素(AMC)、AMCA、氨基香豆素、二乙氨基香豆素、羥甲基香豆素；羥基香豆素、甲氧基香豆素、AFC、…)、花青苷衍生物(藻藍(lán)蛋白、別藻藍(lán)蛋白(APC)、CY3.18、CY5.18、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7...)、赤蘚素/藻紅蛋白衍生物(R-藻紅蛋白(PE)、B-藻紅蛋白…)、APC/PE-Cy綴合物(PE-Cy5綴合物、PE-Cy7綴合物、APC-Cy7綴合物….)、鈣黃綠素衍生物(鈣黃綠素、SNAF"丐黃綠素….)、DANS、謹(jǐn)SA、CascadeBlue、Uciferyellow、NBD、Red613、FluorX、若丹明衍生物(若丹明123、若丹明110、若丹明B、若丹明6A、若丹明6G、TRITC、X-若丹明、磺基若丹明、若丹明Red-X、Lissamine若丹明B、DHR，若丹明Green….)、PerCP、德克薩斯紅、TruRed、AlexaFluo(AlexaFluor350、AlexaFluor430、AlexaFluor488、AlexaFluor532、AlexaFluor546、AlexaFluor555、AlexaFluor568、AlexaFluor594、AlexaFluor633、AlexaFluor647、AlexaFluor660、AlexaFluor680、AlexaFluor700、AlexaFluor750"..)、Q-D0Ts"*衍生物(655、605、585、525，...)、S膽F、Zenon衍生物(ZenonAlexaFluor350、ZenonTMAlexaFluor488、ZenonAlexaFluor555、ZenonAlexaFluor594、ZenonAlexaFluor647、ZenonTM別藻藍(lán)蛋白、ZenonTM生物素-XX、ZenonR—藻紅蛋白、...........);NBD、TexasRed、QSY⑧染料(QSY⑧7、QSY9、QSY35、QSY21)、Hoechst(33342、33258)、DAPI、色霉素A3、普卡霉素、SYTOX(藍(lán)、綠、橙)、乙錠、溴乙錠、7-AAD、TOTO染料、YOYO染料、TO-PRO染料、BOBO染料、JO-PRO染料、LO-PRO染料、P0-PR0染料、Y0-PR0染料、ThiazoleOrange、捵丙錠(PI)、LDS751、Indo⑧染料(Indo-l…)、Fluo⑧染料(Fluo-3…)、DCFH、pNA，SYBRgreenII、SyPro(橙，深紅)、EDANS、IR800、Dil、DiO、DiD、SNARF砂時(shí)生物、Fura染料、QUIN染料、NANOGOLD顆粒、NAN0G0LD馬來(lái)酰亞胺、AlexaFluorFluoroNANOGOLD、AlexaFluorFluoroMN0G0LD鏈霉抗生物素、孔雀綠、Dabcyl、Dabsyl、Cascadeyellow、dansyl、Dapoxyl、PyMPO、芘、苯并嚙二唑衍生物、比色基團(tuán)(pNA…)或生物發(fā)光底物、放射性同位素(實(shí)例I125、H3、S35、C14、P33、P32、Cr51、Ca"、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、锝99、鉈201)。在一種非限制性實(shí)施方案中，產(chǎn)熒光部分發(fā)射光，將電子轉(zhuǎn)移至受體(FRET)或在裂解后淬滅或?qū)LIP、FLIM、FRAP技術(shù)敏感。(iii)R1，113和R4-天然和非天然氨基酸側(cè)鏈，每種氨基酸的絕對(duì)構(gòu)型為Z或Z;(iv)R2和R5=氫原子、烷基、取代的烷基、芳基和取代的芳基；(x)n為0-20;除非另作陳述，否則，應(yīng)使用如本文所用的下列定義。縮寫(xiě)Qco表示喹啉基羰基。本文的術(shù)語(yǔ)"脂族"意指完全飽和或含有一個(gè)或多個(gè)不飽和單元的直鏈或支鏈d-2。烴類(lèi)。術(shù)語(yǔ)"烷基"單獨(dú)使用或作為較大部分的組成部分意指含有l(wèi)-20個(gè)碳原子的直鏈或支鏈。術(shù)語(yǔ)"芳基"意指帶有5-14個(gè)原子的單環(huán)或多環(huán)芳環(huán)基團(tuán)，諸如苯基、萘基或蒽基。術(shù)語(yǔ)"雜環(huán)基，，意指含有一個(gè)或多個(gè)雜原子且環(huán)大小為3-9的飽和或不飽和多環(huán)或單環(huán)環(huán)系，諸如呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二氧戊環(huán)基、鳴唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噍唑基、異噻唑基、鳴二唑基、二喁烷基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、噠喚基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹溱基、喹啉基、異喹啉基、噌啉基、酞溱基、喹唑啉基、喹喔啉基、1，8-萘啶基、蝶啶基、奎寧環(huán)基、^"唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基或吩喁嗪基。"雜芳基"意指為芳族的雜環(huán)。術(shù)語(yǔ)"碳環(huán)基"意指3-14個(gè)碳的可以與芳基或雜環(huán)基稠合的不飽和單環(huán)或多環(huán)碳環(huán)系。脂族基團(tuán)、烷基、芳基、雜芳基(實(shí)例喹啉)、雜環(huán)基或碳環(huán)基在單獨(dú)使用或作為較大部分的組成部分時(shí)意指取代或未被取代的基團(tuán)。當(dāng)取代時(shí)，這些基團(tuán)可以含有一個(gè)或多個(gè)取代基。這些取代基可以為鹵素(F、Cl、Br、I)、0H、U、CO(CH2)nNH(U)、CO(CH2)nS(U)、0R、SR、NH2、NHR、NR2、0C0R、0P(0)R"其中R為月旨族基團(tuán)、芳基或取代的基團(tuán)、芳烷基、碳環(huán)基、烷基碳環(huán)基、雜環(huán)基或放射性同位素(實(shí)例I125、H3、S35、C"、P33、P32、Cr51、Ca"、Fe59、Ni63、Ba133、Cs137、Eu152、Ra226、Xe133、锝99、鉈201)。FITC表示異硫氦酸熒光素。盡管使用肽醛類(lèi)進(jìn)行本研究，但是強(qiáng)調(diào)采用治療上可靠的化合物，如曱基酮衍生物或苯氧基衍生物，因?yàn)槿╊?lèi)在輸送過(guò)程中易于降解。此外，這些衍生物表現(xiàn)出-比相應(yīng)的醛類(lèi)在代謝上更為穩(wěn)定；和-產(chǎn)生不可逆的胱天蛋白酶抑制。in/序列和胱天蛋白酶-2抑制劑的功能性驗(yàn)證ni-i/按照下列方案在體外胱天蛋白酶-2裂解試驗(yàn)中比較新設(shè)計(jì)的抑制劑(Ac-LDEAD-CH0、Ac-VDEAD-CHO.......)與Ac-VDVAD-CHO(附圖8)。將人重組胱天蛋白酶(25-50U;QuantiZymeAssaySystem,BI0M0L，Plymouth,Pennsylvania,USA)與抑制劑(0.005-2jjM)在最終100|jl最終試驗(yàn)緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，lOOmMNaCl，0.1%CHAPS，10mMDTT，ImMEDTA，10%甘油)中預(yù)溫育30分鐘且然后與200pM產(chǎn)熒光的胱天蛋白酶底物(BIOMOL)Ac-VDVAD-AMC混合。根據(jù)劑量響應(yīng)S形曲線確定相當(dāng)于可以抑制50%胱天蛋白酶活性的濃度的ICs。值。在371C下2小時(shí)后在熒光微量平板讀出器上通過(guò)在405nm激發(fā)后監(jiān)測(cè)510nm處的發(fā)射來(lái)測(cè)定人重組胱天蛋白酶1-10對(duì)基于AMC的底物的裂解。111-2/結(jié)果和討論正如通過(guò)分子對(duì)接和體外胱天蛋白酶試驗(yàn)所測(cè)定的，基于LDEAD-和VDEAD-的化合物為推定有效的胱天蛋白酶-2抑制劑，其中對(duì)胱天蛋白酶-2的E^值高于通?；赩DVAD-或LDESD-的抑制劑提供的值，而IC5。值低于其提供的值(附圖8;表1和4)。其它新設(shè)計(jì)的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制劑具有高于基于LDEAD-和VDEAD-的化合物的IC5。，但可以認(rèn)為(根據(jù)其ICs。值)是中度(VDESD、VDEGD、LDEKD)或弱(LDEGD、FDESD)的胱天蛋白酶-2抑制劑(附圖8和表4)。然而，這些基于五肽的化合物抑制胱天蛋白酶-2的抑制性?xún)?nèi)在功效還可以根據(jù)其相應(yīng)的抑制曲線確定(表4和附圖9):2組涉及基于VDVAD-的抑制劑，具有特征性S形劑量響應(yīng)；1組涉及在較低劑量下對(duì)胱天蛋白酶-2的活性相對(duì)高于基于VDVAD-的抑制劑的抑制劑，但它們具有相似的IC50值(LDEAD和VDEAD);3組涉及基于五肽的抑制劑，它們?cè)谳^低劑量下對(duì)胱天蛋白酶-2的活性低于基于VDVAD-的抑制劑，并且表現(xiàn)出較高的ICs。(LDEGD、FDESD、LDESD、LDEKD、VDESD、VDEGD)e因此，這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)提供了如附圖9中所示的胱天蛋白酶-2抑制劑的合理設(shè)計(jì)的一致性(根據(jù)肽性胱天蛋白酶抑制劑的P5P4P3P2P1常規(guī)命名法)(i)需要D1和D4;(ii)需要V3或D3;對(duì)S2或G2的耐受如同P2殘基，但V1對(duì)L1而言是優(yōu)選的。在這類(lèi)情況中，基于LDEAD-和VDEAD-的化合物表現(xiàn)為更有意義的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制劑，因?yàn)樗鼈兣c基于VDVAD的抑制劑相比具有低IC50并且在較低劑量下具有抑制功效。就細(xì)胞和體內(nèi)目的而言，這類(lèi)序列為在產(chǎn)生如下所述在N和C末端具有修飾的其它嵌合分子中具有巨大意義的模板。表4.新的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制劑的特征<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>IV/序列和抑制劑對(duì)胱天蛋白酶-6的功能性驗(yàn)證IV-1/方法按照下列方案在體外裂解試驗(yàn)過(guò)程中對(duì)一大組胱天蛋白酶(1-10)測(cè)試新設(shè)計(jì)的抑制劑(Ac-LDEAD-CH0、Ac-VDEAD-CHO.......)。將人重組胱天蛋白酶(25-50U;Biomol)與抑制劑(0.005-2yM)在最終IOOjjI最終試驗(yàn)緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，0.1%CHAPS10mMDTT，lmMEDTA，10%甘油)中預(yù)溫育30分鐘且然后與200jjM其特異性產(chǎn)熒光胱天蛋白酶底物(BIOMOL)(Ac-YVAD-AMC(胱天蛋白酶-l)、Ac-VDVAD-AMC(胱天蛋白酶-2)、Ac-DEVD-AMC(胱天蛋白酶-3/-7)、Ac-VEID-AMC(胱天蛋白酶-6)、Ac-IETD-AMC(胱天蛋白酶-8/-10)、Ac-LEHD-AMC(胱天蛋白酶-9)混合。在37T下2小時(shí)后在熒光微量平板讀出器上通過(guò)在405nm激發(fā)后監(jiān)測(cè)510nm處的發(fā)射來(lái)測(cè)定人重組胱天蛋白酶l-10對(duì)基于AMC的底物的裂解。IV-2/結(jié)果和討論因?yàn)槲咫男蛄信c胱天蛋白酶-2的分子對(duì)接并不預(yù)示對(duì)其它胱天蛋白酶的識(shí)別和抑制，所以對(duì)一組人重組胱天蛋白酶測(cè)定了最有效的基于五肽的胱天蛋白酶-2抑制劑(Ac-LDEAD-cho和Ac-VDVEAD-cho)的抑制i普(附圖14-16)。增加劑量的常規(guī)Ac-VDVAD-cho胱天蛋白酶-2抑制劑并未顯示出對(duì)其它胱天蛋白酶的高度交叉反應(yīng)(在高劑量下在低于20%抑制的可接受的閾值范圍內(nèi))(附圖11)。令人意外的是，新的基于LDEAD-和VDEAD-的抑制劑表現(xiàn)出對(duì)胱天蛋白酶-6的一定交叉抑制作用(附圖15和16)。盡管這些化合物抑制50%的胱天蛋白酶-2活性表現(xiàn)出100nM范圍(表4，附圖8)，但是它們也能夠以較高IC5。抑制胱天蛋白酶-6(附圖15和16)，對(duì)基于LDEAD-和VDEAD-的化合物而言分別為接近2|jM和0.1-05jjM。VDEAD為比LDEAD更有效的胱天蛋白酶-6抑制劑(附圖15和16)。首次描述了基于五肽的胱天蛋白酶-6抑制劑。此外，首次描述了基于五肽的胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6雙重抑制劑.這些抑制劑表現(xiàn)出對(duì)兩種胱天蛋白酶即胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6的區(qū)別敏感性。VDEAD-衍生的化合物能夠以接近相似劑量范圍以接近相似水平抑制這兩種胱天蛋白酶(附圖13)。相比之下，LDEAD-衍生的抑制劑可以在對(duì)胱天蛋白酶-6活性較低的劑量下抑制胱天蛋白酶-2(附圖12)。V/對(duì)其它蛋白酶的無(wú)交叉反應(yīng)性V-l/方法另外，對(duì)需鉀蛋白酶和粒酶B檢查新設(shè)計(jì)的抑制劑的特異性。將人重組需鈣蛋白酶1(0.8U)和大鼠重組需鈣蛋白酶IH20U)(均來(lái)自Biomol)與抑制劑在最終IOOjjI最終試驗(yàn)緩沖液(50mMHEPES，pH7.4，100mMNaCl，0.1%CHAPS，5mMCaCh，lmMEDTA，10%甘油，2mMp-巰基乙醇)中預(yù)溫育30分鐘且然后分別與20pM產(chǎn)熒光的需鈣蛋白酶底物I或II(Calbiochem)混合。ALLN和ALLM(lyM)為抑制的內(nèi)部對(duì)照。在37*€下2小時(shí)后在熒光微量平板讀出器上通過(guò)對(duì)需鈣蛋白酶I在380nm激發(fā)后監(jiān)測(cè)460nm處的發(fā)射或?qū)π桡^蛋白酶II在485nm激發(fā)后監(jiān)測(cè)530nm處的發(fā)射而測(cè)定重組酶對(duì)底物的裂解。將人粒酶B(50U;Biomol)與抑制劑在最終100jjl最終粒酶試驗(yàn)緩沖液(Biomol)中預(yù)溫育10分鐘且然后與400jjMAc-IEPD-pNA(Biomol)混合。3,4DCIC(ljjM)用作抑制的陽(yáng)性對(duì)照。在371c下1小時(shí)后在分光光度計(jì)上在360nm處測(cè)定底物的裂解。V-2/結(jié)果和討論基于LDEAD-和VDEAD-的抑制劑(2JJM)并非對(duì)其它半胱氨酸蛋白酶需鈣蛋白酶I/II的強(qiáng)抑制劑(附圖14)?；贚DEAD-和VDEAD-的抑制劑(2JJM)并非其它蛋白酶粒酶B的強(qiáng)抑制劑(附圖15)。VI/胱天蛋白酶抑制減輕了圍產(chǎn)期缺血性損傷VI-1/新生Wistar大鼠(雌親加上每窩9只幼仔)獲自Janvier(LeGenest-St-Isle，F(xiàn)rance),此時(shí)幼仔為3-4日齡，使幼仔與其雌親圏養(yǎng)在一起，處于12:12小時(shí)光照-黑暗周期中，并且可自由地取食和飲水。按照法國(guó)和歐共體對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指導(dǎo)原則進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。使用腹膜內(nèi)注射水合氯醛(350mg/kg)麻醉大鼠幼仔。如先前所述使7日齡大鼠(17-21g)中發(fā)生缺血(Renolleau等，1998)。將麻醉大鼠仰臥定位并且在頸部做正中切口，以便暴露左頸總動(dòng)脈。然后將大鼠置于右側(cè)臥位并且在耳與眼之間做斜皮膚切口。在切除顳肌后，從額縫至顴弓以下的水平去除顱骨。然后使恰在其在嗅裂上出現(xiàn)后暴露的左側(cè)大腦中動(dòng)脈在大腦靜脈下方水平處凝固。在該操作步驟后，力文置夾子以便封閉左頸總動(dòng)脈。然后將大鼠放入保溫箱以避免低體溫。50分鐘后，取下夾子。借助于顯微鏡驗(yàn)證恢復(fù)的頸動(dòng)脈血流。然后關(guān)閉頸部和顱部皮膚切口。在手術(shù)操作過(guò)程中，使體溫維持37-38匸。將幼仔轉(zhuǎn)移至保溫箱(321C)中，直到其恢復(fù)，然后使其返回雌親。在缺血后1小時(shí)(相應(yīng)于再灌注)通過(guò)腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)給予化合物。對(duì)照組動(dòng)物接受等體積的溶解五肽胱天蛋白酶抑制劑所需的載體。在再灌注后48小時(shí)處死大鼠并且取出大腦。由不了解動(dòng)物治療的觀察者對(duì)梗塞損害(蒼白區(qū))目視評(píng)分。在放大鏡下觀察無(wú)清晰缺血性蒼白區(qū)的腦。將那些未顯示出明顯MCA(大腦中動(dòng)脈)閉塞的腦棄去。選擇從前紋狀體到后海馬的切片(相當(dāng)于Paxinos，大鼠腦圖鐠中第9-27片)，取O.5-咖間隔的等距。使用圖像分析儀對(duì)甲酚紫-染色的切片測(cè)定損害面積并且將相應(yīng)冠狀切片之間的距離用于計(jì)算梗塞體積。VI-2/結(jié)果和討論其中R-H、甲基、烷基或芳基；n-0，12-喹啉基羰基-Z-纈氨酰基-Z-天冬氨?；?甲基酯)-Z-纈氨?；?Z-丙氨?；?Z-天冬氨?；?甲基酯)2，6-二氟苯基酯-SEQ8對(duì)重組胱天蛋白酶-2測(cè)試新設(shè)計(jì)的五肽-抑制劑SEQ8的特異性。SEQ8阻斷胱天蛋白酶-2在體外對(duì)VDVAD-AMC的裂解，與商購(gòu)胱天蛋白酶-2可逆(Ac-VDVAD-Cho)或不可逆(Z-VDVAD-FMK)抑制劑同樣有效(附圖16)，但不同于胱天蛋白酶-9抑制劑z-LEHD-fmk。然后在發(fā)育中的大腦中的缺氧-缺血性損傷的急性模型中測(cè)試SEQ8，其中細(xì)胞死亡因細(xì)胞凋亡而非壞死而發(fā)生。在這種暫時(shí)單側(cè)缺血模型中，大鼠幼仔發(fā)生永久性的左側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞以及具有再灌注的左頸總動(dòng)脈暫時(shí)閉塞。然后在這種圍產(chǎn)期缺血模型中給藥時(shí)檢驗(yàn)SEQ8的神經(jīng)保護(hù)作用。在缺血發(fā)作后1小時(shí)通過(guò)i.p.(附圖17)或i.v.(附圖18)給予l劑量的SEQ8(0.l或lmg/kg)或栽體。然后在48小時(shí)后分析大腦，在此時(shí)間點(diǎn)時(shí)梗塞穩(wěn)定，無(wú)明顯水腫(不超過(guò)1.550。缺血性梗塞體積在受損同側(cè)半球中約占22-25%損害。缺血后1小時(shí)通過(guò)i.p.給予單劑量的SEQ8(0.1或1mg/kg)將梗塞體積顯著減少了44-53%(附圖17)。在所研究的動(dòng)物上，超過(guò)50%展示出部分或極為明顯減少的梗塞(參見(jiàn)直方圖中的中值和甲酚紫染色的切片)。此外，單劑量的SEQ8(1mg/kg)在缺血后1小時(shí)給予時(shí)也顯著減少了(至少30%)梗塞體積(附圖18)。在所研究的動(dòng)物上，接近50%展示出部分或極為明顯減少的梗塞(參見(jiàn)直方圖中的中值和新鮮提取的腦上的灰白色斑點(diǎn)區(qū))?？偠灾覀兊臄?shù)據(jù)證實(shí)新的胱天蛋白酶-2抑制劑提供了對(duì)新生兒缺血性腦損傷的強(qiáng)神經(jīng)保護(hù)作用。VII/胱天蛋白酶抑制減輕了成年缺血性損傷VII-1/方法按照Pulsinelli衍生的方法(Pulsinelli和Buchman，1988)在年輕-成年大鼠(雄性10-12周齡Wistar，320g+/-10g;Janvier)中通過(guò)4-血管閉塞(4V0)誘發(fā)全腦缺血。第一天，在腦功能區(qū)定位耳棒上對(duì)麻醉大鼠的頭定位并且向下傾斜與水平線成約30°。在頸推水平上做正中切口后，在顯微鏡下暴露兩條推動(dòng)脈且然后在第一頸稚水平通過(guò)翼孔用電烙針凝固。然后在24小時(shí)后暴露兩條頸總動(dòng)脈并且鉗夾20-30分鐘(在對(duì)兩條推動(dòng)脈充分進(jìn)行電烙術(shù)時(shí)，大鼠陷入昏迷)。然后解開(kāi)頸動(dòng)脈的夾子以使血流再灌注。在缺血(頸動(dòng)脈閉塞)的頭5分鐘內(nèi)在左側(cè)腦室水平給予載體和SEQ8。將大鼠放回其籠中并且可以自由取食和飲水。在72小時(shí)時(shí)評(píng)價(jià)了脆弱細(xì)胞的選擇性喪失和SEQ8的作用。處死大鼠并且通過(guò)使用低聚曱醛經(jīng)心臟灌注固定腦。用甲酚紫染色額腦切片(25jjm)或用Hoechst33342和FluorojadeB共同染色以便評(píng)估海馬和皮層中的細(xì)胞死亡。甲酚紫為標(biāo)記活細(xì)胞中胞質(zhì)尼氏體(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu))和核的粉紅色染料，由此在瀕死細(xì)胞中產(chǎn)生淺染色或無(wú)染色。FluoroJadeB(綠色熒光)攝入僅能夠在具有可滲透的質(zhì)膜的細(xì)胞發(fā)生，由此更是瀕死細(xì)胞的特征。Hoechst33342(藍(lán)色熒光)標(biāo)記所有細(xì)胞的核并且能夠在細(xì)胞死亡過(guò)程中識(shí)別核形態(tài)的改變。在左側(cè)腦半球中的海馬(CA1)中在這類(lèi)水平上在3個(gè)連續(xù)的切片中計(jì)數(shù)細(xì)胞。在白色光下觀察甲酚紫染色的切片。在安裝了x40物鏡和LEICAIM1000/Qfluorobase軟件的LeicaDMIRB倒置熒光顯微鏡下觀察FluoroJadeB和Hoechst染色的切片(就Hoechst而言，合并有LP425發(fā)射濾光片的BP340-80的激發(fā)濾光片；就FluoroJadeB而言，合并有BP515-560發(fā)射濾光片的BP480/40激發(fā)濾光片)。VII-1/結(jié)果和討論附圖23-25顯示缺血后72小時(shí)成年大鼠海馬中CA1水平發(fā)生的細(xì)胞死亡90-100%的細(xì)胞已經(jīng)喪失了其甲酚紫染色并且具有異常細(xì)胞形態(tài)(附圖19)，40-60%表現(xiàn)出核改變和缺血性腦的CA1中保留的FluoroJadeB(附圖20)。在腦缺血后72小時(shí)中在單一i.c.v60ngSEQ8給藥后研究了SEQ8在CA1水平的細(xì)胞保護(hù)作用。與缺血性大鼠形成鮮明對(duì)比，SEQ8治療的動(dòng)物較少存在異常核(核較大并且收縮較少)并且?guī)缀鯖](méi)有細(xì)胞摻入了FluorojadeB(10-2(^而非50-60%)(附圖20)。因此，染色的切片看起來(lái)非常象非缺血切片。此外，曱酚紫染色強(qiáng)度部分恢復(fù)至無(wú)缺血的動(dòng)物的水平，但細(xì)胞形態(tài)未完全恢復(fù)(附圖19)。死亡定量。成年大鼠中缺血后72小時(shí)海馬(CA1，CA3，DG，)和皮層(C0R)中的細(xì)胞死亡。通過(guò)4血管閉塞((4V0;n=5)誘發(fā)總體和暫時(shí)性腦缺血。用DMSO處理(icv)大鼠(此處，7,255%;0.7255%，未顯示)(n-5)。A:在注射DMS0或TRP6(1)，(2)后650ym或(3)后780pm水平，甲酚紫陽(yáng)性細(xì)胞的定量。B:通過(guò)缺血和無(wú)缺血腦的海馬(CAla,b,。，CA3，DG)和皮層(C0R)中Hoechst染色評(píng)價(jià)的異常核定量。C:缺血和無(wú)缺血腦的海馬(CAla,b,e，CA3，DG)和皮層(C0R)中FluoroJadeB陽(yáng)性細(xì)胞的定量。權(quán)利要求1.具有在包含下列序列的組中選擇的核心序列的肽類(lèi)SEQIDN°1VDEADSEQIDN°2LDEGDSEQIDN°3VDEGDSEQIDN°4VDESDSEQIDN°5LDEKDSEQIDN°6FDESDSEQIDN°7LDEAD。2.權(quán)利要求l的肽類(lèi)，具有N-末端保護(hù)基和/或C-末端保護(hù)基。3.權(quán)利要求2的肽類(lèi)，其中N-末端保護(hù)基為M=A-(CH2)nl，其中.nl=0-20;.當(dāng)nl-0時(shí)，M為H;.A為C1-C20烷基、一個(gè)或幾個(gè)稠合環(huán)和/或雜環(huán)；.當(dāng)不為H，并且當(dāng)nl大于2時(shí)，A為飽和或不飽和的并且任選被一個(gè)或幾個(gè)基團(tuán)取代，所述的基團(tuán)諸如為H、0H、0Ra、(CH2)nlOH、(CH2)nlORa、COOH、C00Ra、(CH2)nlC00H、(CH2)nlC00Ra、C廣C3烷基或環(huán)烷基、(CH丄廣烷基、C0-NH-烷基、Ar、(CH丄廣Ar、CO-NH-Ar、卣素、CF3、S03H、(CH2)XP03H2、B(0H)2、N02、SO萬(wàn)、S02NHRa;其中x-0，1或2;Ra為d-C3烷基并且Ar為任選取代的芳基或雜芳基；或.A為一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基；或.A表示發(fā)色、熒光、發(fā)光、吸收(UV至近IR)基團(tuán)；放射性同位素；金屬粒子，諸如用于電子顯微鏡檢查的金屬粒子；比色基團(tuán)；生物素/鏈霉抗生物素/neutravidin標(biāo)記系統(tǒng)；或類(lèi)似物。4.權(quán)利要求2或3的肽類(lèi)，其中所述的肽類(lèi)具有C-末端保護(hù)基X，其中X為H或羧基保護(hù)基，所述的羧基保護(hù)基選自下組0Rb、NHRb、SRb、CH20Rb、CH識(shí)b、CH2SRb、CH20Rb和CH2Y，其中Rb=?；?、烷基、取代的烷基、芳基、雜芳基、取代的芳基或雜芳基，其任選與一個(gè)或幾個(gè)環(huán)和/或雜環(huán)稠合；Cl-C20取代或未被取代的脂族基團(tuán)、芳烷基碳環(huán)烷基碳環(huán)或雜環(huán)基，其任選與一個(gè)或幾個(gè)芳族或非芳族環(huán)稠合，并且Y為鹵原子(F、Cl、Br或I)或N02，或X表示發(fā)色、熒光、發(fā)光、吸收(UV至近IR)基團(tuán)、放射性同位素、諸如用于電子顯微鏡檢查的金屬粒子、比色^&團(tuán)、生物素/鏈霉抗生物素/neutravidin標(biāo)記系統(tǒng)或類(lèi)似物。5.藥物組合物，包含治療有效量的至少一種權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的肽或抑制劑與藥學(xué)上可接受的載體。6.權(quán)利要求5所述的藥物組合物，用于通過(guò)口服、鼻部、局部(例如，皮下、腦室內(nèi)、大腦內(nèi)植入浸漬了化合物或藥物組合物的材料、大腦內(nèi)植入用于機(jī)械遞送的裝置)或全身(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)….)給藥進(jìn)行給藥以便減少細(xì)胞死亡。7.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療病理情況，包括缺氧-缺血(H-1)H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)。8.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療病理情況，包括腦缺氧-缺血(H-I)(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)。9.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是在總體性或局部性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中的神經(jīng)元死亡。10.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是在成年人、胎兒或圍產(chǎn)期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中的神經(jīng)元死亡。11.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是暫時(shí)性或永久性H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況(例如腦、腎、心力衰竭)中的神經(jīng)元死亡。12.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)損傷和中風(fēng)樣情況，存在或不存在再灌注情況的腦損傷(例如腦、腎、心力衰竭)。13.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是在成年人、胎兒或圍產(chǎn)期H-I中的大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)中的;f中經(jīng)元死亡。14.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是當(dāng)合并下列病理事件中的至少一種或多種時(shí)存在或不存在再灌注的總體或局部、暫時(shí)性或永久性、成年人或胎兒或圍產(chǎn)期H-I(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，在腦水平上或在整體水平上。15.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是在腦損傷后的至少一種或多種情況時(shí)。16.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)元死亡，特別是在圍產(chǎn)期腦損傷后的至少一種或多種情況時(shí)。17.權(quán)利要求5或6所述的藥物組合物-用于預(yù)防和/或治療慢性變性疾病過(guò)程中的細(xì)胞死亡，例如神經(jīng)變性疾病，包括阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈病、帕金森病、多發(fā)性硬化、肌萎縮性側(cè)索硬化、脊髄延髄萎縮、朊病毒疾病、癡呆；或-用于預(yù)防和/或治療癲癇或癲癇發(fā)生；或-用于預(yù)防和/或治療脊髄損傷過(guò)程中的細(xì)胞凋亡或用于預(yù)防和/或治療因外傷性腦損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡；或-用于提供神經(jīng)保護(hù)作用；或-用于提供大腦保護(hù)作用；或-用于預(yù)防和/或治療與自身免疫病和移植物排斥相關(guān)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；或-用于預(yù)防心肌細(xì)胞的細(xì)胞死亡，包括心力衰竭、心肌病、心臟病毒感染或細(xì)菌感染、心肌缺血、心肌梗塞和心肌缺血、冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)；或-用于預(yù)防和/或治療例如作為化療或HIV療法結(jié)果的線粒體藥物毒性；或-用于預(yù)防病毒感染或細(xì)菌感染過(guò)程中的細(xì)胞死亡；或-用于預(yù)防和/或治療炎癥或炎性疾病、炎癥性腸病、膿毒病和膿毒性休克；或-用于預(yù)防從卵泡到卵母細(xì)胞階段，從卵母細(xì)胞到成熟卵階段的細(xì)胞死亡(Nutt等2Q05;Bergeron等，1998);和精子死亡(例如冷凍和移植卵巢組織、人工受精(fecondation)的方法)，或-用于保存化療后女性和男性的生育力；或-用于保存雌性和雄性動(dòng)物的生育力；或-用于預(yù)防和/或治療黃斑變性和青光眼或用于預(yù)防和/或治療急性肝炎、慢性活動(dòng)性肝炎、乙型肝炎和丙型肝炎；-用于預(yù)防脫發(fā)和因男性型禿、放射、化療或情緒應(yīng)激導(dǎo)致的所述脫發(fā)；或-用于治療或改善皮膚損害(因接觸高水平放射、熱、灼傷、化學(xué)品、日曬和自身免疫病導(dǎo)致)；或-用于預(yù)防骨髓增生異常綜合征中骨髄細(xì)胞的細(xì)胞死亡；或-用于治療胰腺炎；或-用于治療呼吸綜合征；或-用于預(yù)防和/或治療胃腸內(nèi)襯上皮細(xì)胞的死亡；或-用于治療骨關(guān)節(jié)炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病、腎小球腎炎、動(dòng)脈粥樣硬化和移植物抗宿主疾??；或-用于治療視網(wǎng)膜周細(xì)胞細(xì)胞凋亡、視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、青光眼、視網(wǎng)膜損害、因缺血、糖尿病性視網(wǎng)膜病或其它創(chuàng)傷導(dǎo)致的黃斑變，性；或-用于治療與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)的疾病狀態(tài)；或-用于預(yù)防植物中的細(xì)胞死亡(例如植物、花、原植體植物(蘑菇、海藻)...)。抑制胱天蛋白酶-2和/或6活性的體外方法，包括使用權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)的肽。全文摘要本發(fā)明涉及具有選自包含下列序列的組中的核心序列的肽類(lèi)SEQIDN°1VDEADSEQIDN°2LDEGDSEQIDN°3VDEGDSEQIDN°4VDESDSEQIDN°5LDEKDSEQIDN°6FDESDSEQIDN°7LDEAD，它們用作胱天蛋白酶-2和/或-6活性抑制劑的應(yīng)用。文檔編號(hào)C07K7/00GK101223187SQ200580046297公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2005年11月24日優(yōu)先權(quán)日2004年11月24日發(fā)明者D·肖維耶,J·厄貝克,R·卡齊米爾申請(qǐng)人:薩拉普托斯股份公司