專(zhuān)利名稱(chēng)：對(duì)FcRn的結(jié)合被改變的Fc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)涉及優(yōu)化的IgG免疫球蛋白變體，產(chǎn)生他們的加工方法以及他 們的應(yīng)用，特別是用于治療目的。
背景技術(shù)：
抗體是結(jié)合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小白鼠的大多數(shù)哺乳 動(dòng)物中，可以/人配對(duì)的重多肽鏈和輕多肽鏈構(gòu)建抗體。每條鏈都由獨(dú)立的 免疫球蛋白(Ig)域組成，因此統(tǒng)稱(chēng)術(shù)語(yǔ)免疫球蛋白被用來(lái)描述這種蛋白。每 條鏈由稱(chēng)為可變區(qū)和恒定區(qū)的兩個(gè)不同的區(qū)組成。輕鏈和重鏈可變區(qū)顯示 出抗體之間顯著的序列多樣性，他們負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示出較低 的序列多樣性，而且他們負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引起重要的生化事件。 人類(lèi)有五種不同類(lèi)別的抗體，包括IgA(包括亞類(lèi)IgAl和IgA2)、 IgD、 IgE、 IgG(包括亞類(lèi)IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4)和IgM。雖然這些抗體的V區(qū)可 以存在細(xì)微的差異，但他們之間的區(qū)別特征在他們的恒定區(qū)。圖l顯示了 在這里作為描述免疫球蛋白一般結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的實(shí)例的IgGl抗體。IgG抗體是 由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由從N-到C-末端依次 為VH-CH1-CH2-CH3的四個(gè)免疫球蛋白域組成，VH-CH1-CH2-CH3分別被 稱(chēng)為重鏈可變域、重鏈恒定域1、重鏈恒定域2和重鏈恒定域3(也稱(chēng)為
VH-Cyl-Cy2-CY3，分別指重鏈可變域、恒定yl域、恒定72域和恒定丫3 域)。IgG輕鏈由從N-到C-末端依次為VL-CL的兩個(gè)免疫球蛋白域組成， VL-CL分別被稱(chēng)為輕鏈可變域和輕鏈恒定域。
抗體的可變區(qū)包含該分子的抗原結(jié)合決定簇，因此它決定了抗體對(duì)靶 抗原的特異性。可變區(qū)的序列與來(lái)自同一類(lèi)別的其他抗體的序列差異最大， 可變區(qū)也因此得名。序列差異性大部分發(fā)生在互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)?？偣灿? 個(gè)CDRs，重鏈和輕鏈各三個(gè)，被命名為VHCDR1、 VHCDR2、 VHCDR3、 VL CDR1 、 VL CDR2和VL CDR3 。 CDRs外的可變區(qū)被稱(chēng)為骨架(FR)區(qū)。 雖然FR區(qū)的變化不如CDRs大，但不同抗體之間的FR區(qū)也會(huì)出現(xiàn)序列差 異?？偟恼f(shuō)來(lái)，抗體的這些特征性結(jié)構(gòu)提供了穩(wěn)定的支架(FR區(qū))，免疫系 統(tǒng)基于該支架能探索實(shí)質(zhì)性的抗原結(jié)合多樣性(CDRs)以獲得針對(duì)較寬抗原 系列的特異性?？梢垣@取來(lái)自不同生物體的多種可變區(qū)片段的大量高分辨 率結(jié)構(gòu)，其中一些可變區(qū)片段是非結(jié)合的， 一些與抗原形成了復(fù)合物。已 經(jīng)能很好地表征抗體可變區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(Morea et al., 1997， Biophys Chem 68:9-16; Moreaet al.， 2000， Methods 20:267-279,全部引入作為參考)、 抗體的保守特征已經(jīng)使大家能開(kāi)發(fā)大量的抗體工程技術(shù)(Maynard et al.， 2000， Annu Rev BiomedEng 2:339-376，全部引入作為參考)。例如將來(lái)自 一種抗體，例如鼠抗體的CDRs嫁接到另一種抗體，例如人抗體的框架區(qū)上 是可的。在本領(lǐng)域被稱(chēng)為"人源化"的這一過(guò)程能從非人類(lèi)抗體產(chǎn)生免疫原性 較低的抗體治療劑。當(dāng)不存在抗體其他區(qū)時(shí)，包含可變區(qū)的片段可以存在， 包括，例如包含VH-Cyl和VH-CL的抗原結(jié)合片段(Fab)、包含VH和VL 的可變區(qū)片段(Fv)、在同一條鏈中包含連接在一起的VH和VL的單鏈可變 區(qū)片段(scFv),以及多種其他可變區(qū)片段。
抗體的Fc區(qū)與大量Fc受體和配體相互作用，賦予抗體一系列重要的 被稱(chēng)為效應(yīng)器功能的性能。如

圖1和2所示，IgG的Fc區(qū)包含Ig域Cy2， Cy3和引入Cy2的N-末端鉸鏈。IgG類(lèi)Fc受體的重要家族是Fc y受體 (FcyRs)。這些受體介導(dǎo)抗體和免疫系統(tǒng)細(xì)胞臂之間的聯(lián)系(Raghavan et al., 1996， Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al.， 2001， Annu Rev Immunol 19:275-290,都全部引入作為參考)。在人類(lèi)中，這些蛋白家族包括 包含亞型FcyRIa、 FcyRIb和FcyRIc的FcyRI(CD64)，包含亞型FcyRIIa(包 括同種異型H131和R131)、 FcyRIIb(包括FcYRIIb-1和FcyRIIb-2)和FcyRIIc 的FcyRII(CD32);以及包含亞型FcyRIIIa(包括同種異型VI58和F158)和 FcyRIIIb(包括同種異型 FcyRIIIb-NAl 和 FcyRIIIb-NA2)的 FcyRIII(CD16)(Jefferis et al,, 2002， Immunol Lett 82:57-65,全部引入作為參 考)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fc結(jié)合的胞外域、跨膜區(qū)和介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一些 信號(hào)事件的胞內(nèi)域。這些受體在包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、 樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、 郎格罕氏細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和T細(xì)胞的多種免疫細(xì)胞中表達(dá)。 Fc/FcyyR復(fù)合物的形成將這些效應(yīng)細(xì)胞招募到結(jié)合抗原的位點(diǎn)，通常會(huì)導(dǎo)致 細(xì)胞內(nèi)發(fā)生信號(hào)發(fā)送事件和隨后重要的免疫反應(yīng)，例如炎癥介質(zhì)的釋放、B 細(xì)胞激活、內(nèi)吞作用、吞噬作用和細(xì)胞毒素攻擊。調(diào)節(jié)細(xì)胞毒素和吞噬效
應(yīng)器功能的能力是抗體破壞靶細(xì)胞的潛在機(jī)制。細(xì)胞介導(dǎo)的其中表達(dá)FqRs 的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體并隨后導(dǎo)致靶細(xì)胞裂解
的反應(yīng)被稱(chēng)為抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)(Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie w a/" 2000, v4mw i ev 7wwwwo/ 18:739-766; Ravetch da/., 2001,^國(guó)Wev/畫(huà)薩/ 19:275-290,全部引入作 為參考)。細(xì)胞介導(dǎo)的其中表達(dá)FqRs的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞 上結(jié)合的抗體并隨后引起靶細(xì)胞吞噬作用的反應(yīng)被稱(chēng)為抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo) 的吞噬作用(ADCP)。已經(jīng)弄清楚人FcyRs，包括F(ryRIIa(pdb登記入冊(cè)代碼 1H9V，全部引入作為參考)(Sondermann et al" 2001, J Mol Biol 309:737-749， 全部引入作為參考)(pdb登記入冊(cè)代碼1FCG，全部引入作為參考)(Maxwell et al" 1999， Nat Struct Biol 6:437-442,全部引入作為參考)、FcyRIIb(pdb登 記入冊(cè)代碼2FCB,全部引入作為參考)(Sondermann et al.， 1999, Embo J 18:1095-1103，全部引入作為參考)和FcyRmb(pdb登記入冊(cè)代碼1E4J,全 部引入作為參考)(Sondermann et al.， 2000， Nature 406:267-273，全部引入作為 參考)的細(xì)胞外域的大量結(jié)構(gòu)。所有FqRs都結(jié)合圖1顯示的Fc上的Cy2 域的N-末端和鉸鏈之前的相同區(qū)。從結(jié)構(gòu)上可以很好地表征這一相互作用 (Sondermannetal., 2001， J Mol Biol 309:737-749，全部引入作為參考)，已經(jīng) 弄清楚結(jié)合到人FcYRIIIb的細(xì)胞外域的人Fc的幾個(gè)結(jié)構(gòu)(pdb登記入冊(cè)代碼 1E4K，全部引入作為參考)(Sondermann et al., 2000， Nature 406:267-273, entirely incorporated by reference,全部引入作為參考)(pdb登記入冊(cè)代碼1IIS 和1IIX , 全部引入作為參考)(Radaev et al., 2001， J Biol Chem
276:16469-16477，全部引入作為參考)，而且他們具有人IgEFc/FcsRIa復(fù)合 物的結(jié)構(gòu)(pdb登記入冊(cè)代碼1F6A,全部引入作為參考)(Garman et al.， 2000, Nature 406:259-266,全部引入作為參考)。
不同的IgG亞類(lèi)對(duì)FcyRs具有不同的親和力，IgGl和IgG3通常比IgG2 和IgG4能更好地結(jié)合受體(Jefferis et al.， 2002, Immunol Lett 82:57-65 ，全部 引入作為參考)。所有的FcyRs可以結(jié)合IgG Fc上的相同區(qū)，但親和力不同 高親和力結(jié)合劑FcyRI結(jié)合IgGl的Kd為l(T8 M"，而低親和力受體FcyRII 和FcyRIII結(jié)合時(shí)的Kd通常分別為l(T6和l(T5。 FcyRIIIa和FcyRIIIb的細(xì)胞 外域的96%是相同的；但是，F(xiàn)cyRinb沒(méi)有胞內(nèi)信號(hào)發(fā)送域。而且，F(xiàn)cyRI、 FcYRIIa/c和FcyRIIIa是免疫復(fù)合物觸發(fā)激活的正調(diào)節(jié)物，其特征在于具有 有基于酪氨酸的免疫受體激活基序(ITAM)的胞內(nèi)域，而FcYRIIb具有基于酪 氨酸的免疫受體抑制基序(ITIM)，因此它是抑制性的。因此前者被稱(chēng)為激活 受體，F(xiàn)cYRIIb被稱(chēng)為抑制性受體。該受體的表達(dá)模式和水平在不同的免疫 細(xì)胞上也不相同。復(fù)雜的另一水平在于人蛋白組中存在大量FcYR多態(tài)性。 具有臨床意義的特別相關(guān)的多態(tài)性是V158/F158 FqRnia。人IgGl結(jié)合到 V158同種異型上的親和力比結(jié)合到F158同種異型上的親和力大。已經(jīng)證 明親和力差異，以及推測(cè)的該差異對(duì)ADCC和/或ADCP的影響是抗CD20 抗體利妥昔單抗(Rituxan⑧，Biogenldec)功效重要的決定因素。具有V158 同種異型的病人能更順利地對(duì)利妥昔單抗治療作出響應(yīng)；但是，具有較低 親和力的F158同種異型的病人的響應(yīng)弱(Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758,全部引入作為參考)。大約10-20%的人是V158/V158純合子， 450/。是V158/F158雜合體，35-45%的人是F158/F158純合子(Lehrnbecher et al., 1999， Blood 94:4220-4232; Cartron et al.， 2002, Blood 99:754-758,都全部 完全引入作為參考)。因此，80-90%的人是弱應(yīng)答者，也就是說(shuō)他們擁有F158 FcyRIIIa的至少一個(gè)等位基因。
圖1顯示的Fc上的重疊但分離的位點(diǎn)起補(bǔ)體蛋白Clq分界面的作用。 Fc/Clq的結(jié)合介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)，方式與Fc/FcyR結(jié)合介導(dǎo) ADCC相同。Clq與絲氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復(fù)合物以產(chǎn)生CI復(fù)合物。 Clq能結(jié)合六個(gè)抗體，但是結(jié)合兩個(gè)IgGs就足以激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)。與Fc 和FcyRs的相互作用相似，不同的IgG亞類(lèi)對(duì)Clq具有不同的親和力，IgGl 和IgG3通常比IgG2和IgG4能更好地結(jié)合FcyRs(Jefferis et al., 2002,
Immunol Lett 82:57-65,全部引入作為參考)。
在IgG中，位于Fc上Cg2和Cg3域之間的位點(diǎn)(圖l)介導(dǎo)與新生受體 FcRn的相互作用，其中結(jié)合可以讓來(lái)自內(nèi)體的內(nèi)吞抗體再循環(huán)到血流中 (Raghavan et al., 1996， A腿Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000， Annu Rev Immunol 18:739-766,都全部引入作為參考)。這一過(guò)程與防止大 的全長(zhǎng)分子引起的腎臟濾過(guò)一起產(chǎn)生一到三周的有利的抗體血清半衰期。 Fc與FcRn的結(jié)合在抗體轉(zhuǎn)運(yùn)中也起關(guān)鍵作用。Fc上結(jié)合FcRn的位點(diǎn)也是 細(xì)菌蛋白A和G結(jié)合的位點(diǎn)。與這些蛋白的緊密結(jié)合通常可以用作蛋白純 化期間，使用蛋白A或蛋白G親和色譜法純化抗體的方式。因此，F(xiàn)c上該 區(qū)域的保真度對(duì)抗體的臨床特性和他們的純化都很重要。可利用的大鼠 Fc/FcRn復(fù)合物(Burmeister et al.， 1994， Nature, 372:379-383; Martin et al" 2001， Mol Cell 7:867-877，都全部引入作為參考)、以及Fc與蛋白A和G的 復(fù)合物(Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al" 1995， Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481 ，都全部引入作為參考)的結(jié)構(gòu)提供了洞察Fc與這些蛋白相互作用 的方式。FcRn受體也負(fù)責(zé)將IgG轉(zhuǎn)移到新生兒的腸道和成年人的腸上皮腔 中(Ghetie and Ward, A匪.Rev. Immunol" 2000, 18:739-766; Yoshida et al" Immunity, 2004, 20(6):769-783,都全部引入作為參考)。
對(duì)大鼠和人Fc域的研究表明， 一些Fc殘基對(duì)結(jié)合FcRn很重要。大鼠 和人序列在Fc區(qū)(Kabat等編號(hào)的殘基237-443)具有大約64%的序列同 一性。 大鼠/人Fc、 FcRn重鏈和FcRn輕鏈((3-2-微球蛋白)的比對(duì)參見(jiàn)圖3, 4和5。 根據(jù)現(xiàn)有大鼠Fc/FcRn復(fù)合物結(jié)構(gòu)構(gòu)建了人Fc/FcRn復(fù)合物模型(Burmeister et al.， 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al.， 2001, Mol Cell 7:867-877,全 部引入作為參考)。大鼠和人序列共用一些對(duì)FcRn結(jié)合起關(guān)鍵作用的殘基， 例如H310和H435 (Medesan et al" 1997 J. Immunol. 158(5):221-7; Shields et al.,2001,J.Bio1, Chem, 276(9):6591-6604，都全部引入作為參考)。但是，人和 大鼠蛋白在多個(gè)位點(diǎn)具有不同的氨基酸，致使上述殘基在人序列中與在大 鼠序列中相比，處于不同的環(huán)境，并且可以有不同的特性。這種差異性限 制了將特性從一種同系物轉(zhuǎn)移到另 一種同系物的能力。
在鼠Fcy中，位點(diǎn)t252、 t254和t256的隨才幾突變和噬菌體展示選褲r 導(dǎo)致產(chǎn)生了 FcRn親和力增加3.5倍，血清半衰期增加1.5倍的三聯(lián)突變體 T252L/T254S/T256F(Ghetie et al.， 1997, Nat. Biotech. 15(7): 637-640,全部引
入作為參考)。
大鼠Fc/FcRn復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)鑒定了對(duì)FcRn結(jié)合重要的Fc殘基 (Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994); Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001)，都全部引入作為參考)。在1994年已經(jīng)確定了分辨率為 6人的原始Fc/FcRn復(fù)合結(jié)構(gòu)(表2a, Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994)，全部引入作為參考)。Marin等在2001年確定的更高分辨率結(jié)構(gòu)顯 示了側(cè)鏈位置更詳細(xì)的視圖(Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877 (2001)， 全部引入作為參考)。利用包含破壞FcRn結(jié)合的突變 T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E的一個(gè)單體與包含野生型Fc單體 的一個(gè)單體的Fc 二聚體確定了結(jié)合大鼠FcRn的大鼠Fc的晶體結(jié)構(gòu)。
人Fey的突變研究已經(jīng)對(duì)結(jié)合FcRn重要的一些殘基進(jìn)行了研究，結(jié)果 表明他們具有增加的血清半衰期。Hinton等在人Fc丫l中逐一地將三個(gè)殘基 突變成了另外19種常見(jiàn)的氨基酸。Hinton等發(fā)現(xiàn)一些點(diǎn)突變的雙重突變體 增加了 FcRn結(jié)合親和力(Hinton et al" 2004， J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216，全部引入作為參考)。兩種突變?cè)黾恿嗽诤镏械陌胨テ?。Shields 等幾乎專(zhuān)門(mén)將殘基突變成了 Ala,并研究了他們對(duì)FcRn和FcyR的結(jié)合 (Shields et al., 2001, J. Biol. Chem., 276(9):6591-6604,全部引入作為參考)。
Dall' Acqua等利用噬菌體展示選擇了結(jié)合FcRn的親和力增加的Fc突 變(Dall'Acqua et al. 2002, J. Immunol. 169:5171-5180,全部引入作為參考)。 選擇的DNA序列主要是雙重和三重突變體。參考文獻(xiàn)中已經(jīng)表達(dá)了由許多 所選擇的序列編碼的蛋白，而且發(fā)現(xiàn)一些蛋白能比野生型Fc更緊密地結(jié)合 FcRn。
施用作為治療劑的抗體和Fc融合蛋白需要以與蛋白清除和半衰期特征 相關(guān)的規(guī)定頻率進(jìn)行注射。體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)可以容許次數(shù)更少的注射或以 較低的劑量給藥，而這顯而易見(jiàn)是有利的。雖然過(guò)去對(duì)Fc域的突變已經(jīng)導(dǎo) 致一些蛋白對(duì)FcRn的結(jié)合親和力增加和體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)，但還沒(méi)有從這些 突變中鑒定出具有增強(qiáng)的體內(nèi)半衰期的最佳突變。
Fc區(qū)的一個(gè)特征是發(fā)生在圖1顯示的N297上的保守N連接糖基化。 有時(shí)提到這種糖或低聚糖對(duì)抗體的結(jié)構(gòu)和功能起決定性作用，而且也是必 須利用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)抗體的主要原因之一。Umaflaetal., 1999,7Va
腸tec/2朋/ 17:176-180; Davies e a/.， 2001,腸&c/wo/ A固g 74:288-294; Mimura d a/.， 2001， /腸/ C7zem 276:45539-45547.; Radaev " a/., 2001, Ozem 276:16478-16483; Shields & a/.， 2001， /C7^m 276:6591-6604; Shields " a/., 2002， 《/編Cta 277:26733-26740; Simmons W a/.， 2002, / 7m附Mwo/ MeZ/zo(iy 263:133-147 ; Radaev a/., 2001， 《/ CTzem 276:16469-16477和Krapp a/., 2003， Mo/Ao/325:979-989,都全部引入作 為參考)。
已經(jīng)開(kāi)發(fā)出用于治療的抗體。與這種治療相關(guān)的代表性的出版物包括 Chamow et al., 1996， Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997， Curr Opin Immunol 9:195-200, Cragg et al., 1999， Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410, McLaughlin et al., 1998， J Clin Oncol 16:2825-2833和Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648，都全 部引入作為參考。在目前的抗癌治療中，死亡率方面的任何小的改進(jìn)都能 決定成功。這里公開(kāi)的某些IgG變體增強(qiáng)了抗體限制靶癌細(xì)胞進(jìn)一步生長(zhǎng) 或破壞，至少部分破壞靶癌細(xì)胞的能力。
抗體的抗腫瘤效能是通過(guò)他們介導(dǎo)細(xì)胞毒素效應(yīng)器功能，例如ADCC、 ADCP和CDC的能力的增強(qiáng)實(shí)現(xiàn)的。實(shí)施包括Clynes et al.， 1998， Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656; Clynes et al.， 2000, Nat Med 6:443-446和Cartron et al,， 2002， Blood 99:754-758,都全部引入作為參考。
人IgGl是最經(jīng)常用于治療目的的抗體，在上下文中已經(jīng)構(gòu)建了大部分 加工設(shè)計(jì)研究過(guò)程。IgG類(lèi)的不同同種型，包括IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4 具有獨(dú)特的物理、生物和臨床特性。本領(lǐng)域需要設(shè)計(jì)改善的IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4變體。更進(jìn)一步地需要設(shè)計(jì)與天然IgG多肽相比，對(duì)FcRn的 結(jié)合被改善和/或體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)的這種變體。本申請(qǐng)滿足了這些需要及其 他需要。
發(fā)明概述
本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)FcRn受體的結(jié)合增強(qiáng)和體內(nèi)血清滯留延長(zhǎng)的Fc域新 變體的產(chǎn)生，F(xiàn)c域包括在抗體、Fc融合物和免疫粘附物中發(fā)現(xiàn)的那些Fc 域。本發(fā)明另一方面是，使FcRn結(jié)合相對(duì)于野生型增加(具體在較低pH, 大約pH6.0時(shí))，以促進(jìn)內(nèi)體中的Fc/FcRn結(jié)合。本發(fā)明另一方面是，設(shè)計(jì)
的變體在大約pH6時(shí)的結(jié)合優(yōu)于它們?cè)诖蠹spH7.4時(shí)的結(jié)合，這樣可以促 進(jìn)Fc在細(xì)胞內(nèi)再循環(huán)后再次釋放到血液中。
本發(fā)明另 一 方面涉及，設(shè)計(jì)對(duì)FcRn的結(jié)合降低和體內(nèi)半衰期縮短的Fc 變體。這種蛋白包含使FcRn親和力降低和/或使體內(nèi)半衰期縮短的突變，它 們可用于多種治療和診斷，包括遞送和監(jiān)測(cè)放療，在所述放療中，放射標(biāo) 記物的半衰期理論上大約等于它的蛋白偶聯(lián)物的體內(nèi)半衰期。
本發(fā)明另 一方面涉及改變與FcR,例如人中的FcyRI、 FcyRIIa、 FcyRIIb、 FqRnia結(jié)合的Fc域。這些受體負(fù)責(zé)誘導(dǎo)抗體的各種效應(yīng)器功能。因此， 本發(fā)明另 一方面涉及改變Fc域的效應(yīng)器功能，例如抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì) 胞毒作用(ADCC)、補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)和抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬 作用(ADCP)。
本發(fā)明另 一方面涉及一種Fc變體，其FcRn結(jié)合有變且Fcg結(jié)合有變， 導(dǎo)致對(duì)包含該Fc的蛋白的體內(nèi)半衰期和效應(yīng)器功能都產(chǎn)生影響。例如這 些變體可具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和改進(jìn)的ADCC。例如，所述變體可具有 延長(zhǎng)的半衰期和降低的CDC。
本發(fā)明另 一方面提供了編碼變體Fc蛋白的重組核酸、表達(dá)載體和宿主 細(xì)胞。
另一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生包含F(xiàn)c變體的蛋白的方法，該方法包括 在適合表達(dá)該蛋白的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
本發(fā)明另 一方面提供了包含本發(fā)明的變體Fc蛋白和藥學(xué)載體的藥物組 合物。
本發(fā)明另一方面提供了治療紊亂的方法，包括給病人施用包含本發(fā)明 的變體Fc的蛋白。
另一方面，本發(fā)明提供了在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)修飾的 親代Fc多肽的Fc區(qū)變體，其中與親代多肽相比，所述變體蛋白對(duì)FcRn的 結(jié)合顯示出改變，而且其中所述Fc變體包含至少一個(gè)選自由246H， 246S， 247D， 247T, 248H， 248P， 248Q， 2概，248Y， 249T, 249W， 251D, 251E, 251H， 2511, 251K, 251M， 251N, 251T, 251V， 251Y， 252F, 252L, 253L, 253T， 253V, 254H, 254L, 254N， 254T， 254V,八254N, 255E， 255F, 255H， 255K, 255S， 255V， 256E， 256H, 256V, 257A, 257C, 257D, 257E， 257F， 257G, 257H， 2571， 257K， 257L， 257M, 257N， 257Q, 257R， 257S,
257T， 257V， 257W， 257Y, 258R, 258V, 279A， 279C， 279D， 279F， 279G， 279H, 2791， 279K, 279L, 279M， 279N， 279P, 279Q, 279R， 279S, 279T, 279W， 279Y, 280E, 280H, A281A， A281D， A281S， A281T, 282D，
282F,282H,2821,282T，283F,2831， 283L， 283Y, 284H, 284K， 284P，
284Q,284R,284S，284Y，285S,285V， 286#， 286L, 287H， 287S， 287V，
287Y，288H，288Q,288R,288S，305H， 305T， 306F, 306H, 3061， 306N,
306T,306V，306Y，307D，307V,307Y， 308A, 308C, 308D， 308E, 308F，
308G，308H，3081，308K，308L，308M, 308N， 308P, 308Q， 308R, 308S，
308T,308W，308Y,309F,309H,3091， 309N, 309P, 309Q， 309V, 309Y,
310K，310N，310T，311H，311L,311S, 311T， 311V, 311W， 312H， 313Y,
315E，315G,315H,315Q，315S，315T, 317H, 317S， 339P， 340P， 341S,
374H,374S，376H，376L,378H,378N, 380T, 380Y， 382H， 383H, 383K,
383Q,384E,384G，384H,385A,385C， 385D， 385E, 385F, 385H, 3851,
385K,385L,385M,385N,385P，385Q， 385R， 385S， 385T， 385V， 385W,
385Y，386E,386H,386K,387#,387A， 387H, 387K, 387Q， 389E, 389H,
楊E，426H,426L，426N,426R,426V， 426Y， 4271, 429D, 429F, 429K,
429N,429Q，429S，429T,429Y，430D, 430H， 430K, 430L, 430Q, 430Y,
431G，431H，4311，431P,431S，432F, 432H， 432N， 432S， 432V, 433E,
433N，433P，433R，433S,434H，434Q， 434S， 434Y, 435N， 436E, 436F，
436H，436L,436Q，436V， 436W, 437E， 437V, 438E, 438H和438K組成的群組的修飾。其中參照EU指數(shù)進(jìn)行編號(hào)，a表示在指定位置后的插入， #表示指定位置的缺失。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)選自由246H, 246S, 247D， 247T， 248H， 248P， 248Q, 248R， 248Y， 249T, 249W, 251D, 251E， 251H, 2511， 251K， 251M, 251N， 251T， 251V， 251Y, 252L， 253L, 253T, 253V， 254H， 254L, 254N， 254V, A254N, 255E, 255F, 255H， 255K， 255S, 255V， 256H， 256V， 257A, 257C, 257D, 257E， 257F, 257G， 257H， 2571, 257K, 257L, 257M, 257N， 257Q, 257R， 257S, 257T, 257V， 257W， 257Y， 258R， 258V, 279A， 279C， 279D， 279F， 279G, 279H， 2791， 279K， 279M, 279N, 279P， 279Q， 279R， 279S， 279T, 279W, 279Y, 280H, A281A， A281D, A281S, A281T, 282D, 282F， 282H, 2821， 282T， 283F， 2831, 283L, 283Y, 284H, 284K, 284P, 284Q， 284R, 284S, 284Y, 285S， 285V， 286#, 286L, 287H， 287S， 287V， 287Y, 288H, 288Q, 288S, 305H, 305T， 306F， 306H, 3061, 306N, 306T， 306V, 306Y, 307D, 307V, 307Y, 308C， 308E, 308F， 308G， 308H， 3081， 308K, 308L, 308M, 308N， 308P, 308Q, 308R, 308S， 308W, 308Y, 309F， 309H, 309N, 309Q， 309V， 309Y, 310K, 310N， 310T, 311L， 311T, 311V, 311W, 312H， 313Y， 315E， 315G, 315H, 315Q， 315S， 315T, 317H, 317S, 339P, 340P， 341S， 374H， 374S， 376H, 376L， 378H, 378N, 380T, 380Y, 382H， 383H， 383K， 383Q， 384E, 384G, 384H, 385A, 385C， 385F， 385H， 3851， 385K, 385L， 385M， 385N, 385P， 385Q， 385S， 385T, 385V, 385W， 385Y, 386E, 386H， 386K， 387#, 387A， 387H, 387K， 387Q， 389E, 389H, 426E， 426H, 426L, 426N, 426R, 426V， 426Y， 4271， 429D， 429F, 429K, 429N, 429Q， 429S, 429T, 429Y, 430D， 430H， 430K, 430L, 430Q, 430Y， 431G, 431H, 4311， 431P, 431S， 432F， 432H, 432N, 432S， 432V, 433E, 433N， 433P， 433S， 434H， 434Q， 434S， 435N, 436E， 436F, 436L， 436V, 436W, 437E， 437V, 438H 和438K組成的群組的修飾的Fc變體。
在另一方面，本發(fā)明提供了包含至少一個(gè)選自由246H， 246S, 247D， 247T, 248P， 248Q， 248Y, 249T， 249W, 251D， 251E， 251H， 2511, 251T， 251V, 252L， 253L， 253T, 253V， 254H, 254L, 254N， 254V， A254N, 255E， 255H， 255K, 255V, 256H, 256V, 257A， 257C， 257F， 257G, 2571, 257L， 257M， 257N, 257Q， 257S, 257T, 257V, 257W， 257Y, 258V, 279A， 279C， 279F， 2791， 279P, 279S, 279T, 279W， 279Y, A281A, A281D， A281S， A281T， 282F, 2821， 282T, 283F, 2831, 283L, 283Y, 284P， 285V, 286#， 286L， 287V， 288Q， 288S, 305T, 306F, 306H, 3061, 306N, 306T， 306V， 306Y, 307V， 308C, 308F, 308G, 308L, 308M, 308N， 308P， 308Q, 308S, 308W, 308Y， 309F, 309N, 309Q， 309V, 309Y， 310T, 311L, 311T, 311V, 311W, 313Y, 315G， 315Q, 315S， 315T， 339P, 340P, 341S, 374H, 374S， 376L， 378H， 378N, 380T, 380Y, 382H， 383Q， 384E， 384G， 384H, 385A, 385C， 385F， 3851， 385L， 385M, 385N, 385P， 385Q， 385S， 385T， 385V, 385W， 385Y, 386E， 386H, 386K, 387#, 387A, 387H, 387K， 387Q, 389H, 426L, 426N, 426V, 426Y， 4271， 429D, 429F， 429K, 429N，
429Q, 429S， 429T, 429Y, 430L, 431G, 4311, 431P, 431S, 432F, 432H， 432V， 433E， 433N, 433P, 433S， 434H, 434Q, 434S, 435N， 436F, 436L， 436V， 436W， 437E和437V組成的群組的修飾的Fc變體。
附圖簡(jiǎn)述
圖l.抗體結(jié)構(gòu)和功能。顯示全長(zhǎng)人IgGl抗體的模型，利用來(lái)自pdb登 記入冊(cè)代碼lCEl(James et al.， 1999, J Mol Biol 289:293-301，全部引入作為 參考)的人源化Fab結(jié)構(gòu)和來(lái)自pdb登記入冊(cè)代碼1DN2(DeLano et al.， 2000, Science 287:1279-1283,全部引入作為參考)的人IgGl Fc結(jié)構(gòu)構(gòu)建模型。沒(méi) 有顯示連接Fab和Fc區(qū)的可彎曲鉸鏈。IgGl是同型二聚體，具有多個(gè)由兩 條輕鏈和兩條重鏈組成的異二聚體。包含抗體的Ig域已經(jīng)被標(biāo)記，包括輕 鏈的VL和CL，以及重鏈的VH Cgammal (Cyl)、Cgamma2 (Cy2)和Cgamma3 (Oy3)。標(biāo)記了Fc區(qū)。標(biāo)記了相關(guān)蛋白的結(jié)合部位，包括可變區(qū)的抗原結(jié)合 部位，以及Fc區(qū)中結(jié)合FcyR、 FcRn、 Clq，以及蛋白A和G的結(jié)合部位。 圖2.按照Kabat等進(jìn)行EU編號(hào)的用于本發(fā)明的人IgG序列。 圖3.按照Kabat等進(jìn)行EU編號(hào)的用于本發(fā)明的人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物的IgG 序列實(shí)例。
圖4,用于本發(fā)明的人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物FcRn重鏈序列的實(shí)例。 圖5.用于本發(fā)明的人和嚙齒類(lèi)動(dòng)物P-2-微球蛋白序列的實(shí)例。 圖6>人大鼠結(jié)構(gòu)(Burmeisteretal.， 1994， Nature, 372:379-383; Martinet al.， 2001， Mol Cell 7:867-877，都全部引入作為參考)產(chǎn)生的人Fc/FcRn復(fù)合 模型。 一些組氨酸殘基顯示在FcRn鏈(淡灰)和Fc多肽(深灰)上填充空間的 原子中。
圖7.用于設(shè)計(jì)包含插入或缺失的變體的一些概念的說(shuō)明。 圖8.本發(fā)明的變體。 圖9.本發(fā)明的變體。 圖10.本發(fā)明的變體。
圖ll.用于構(gòu)建Fc變體的載體pcDNA3.1 Zeo+的圖。
圖12.野生型Fc和本發(fā)明的Fc變體竟?fàn)幗Y(jié)合FcRn的數(shù)據(jù)。在每個(gè)畫(huà) 面中，本發(fā)明的Fc變體都用左邊的曲線顯示(紅或深灰)，野生型曲妥單抗 (trastuzumab)都用右邊的曲線顯示(藍(lán)或淡灰)。
圖13. Fc變體結(jié)合FcRn特性的概要。從右到左的欄分別顯示FcRn結(jié) 合的修飾、使用的免疫球蛋白、其他修飾、通過(guò)AlphaScreenTM竟?fàn)幵囼?yàn)測(cè) 定的與野生型相比的相對(duì)FcRn親和力(中值)、實(shí)施測(cè)定的數(shù)目和蛋白的的 參考號(hào)。相對(duì)FcRn親和力編號(hào)大于l.O表明結(jié)合相對(duì)于野生型增加了。
圖14.本發(fā)明的Fc變體結(jié)合FcRn的數(shù)據(jù)。Fc變體位于阿侖單抗 (alemtuzumab)或曲妥單抗中。與野生型相比，顯示出成倍增加的結(jié)合力。
圖15.對(duì)FcRn的結(jié)合有改進(jìn)的Fc變體的表面質(zhì)子共振實(shí)驗(yàn)的概要。 條形圖顯示相對(duì)于野生型Fc域，每個(gè)變體的FcRn結(jié)合親和力成倍增加。
圖16.野生型抗體和本發(fā)明的變體的表面質(zhì)子共振實(shí)驗(yàn)。蹤跡顯示在 pH6.0時(shí)，F(xiàn)c變體抗體與FcRn的結(jié)合和解離。
圖17.本發(fā)明Fc變體對(duì)FcRn的結(jié)合的測(cè)定。顯示的是在pH 6.0(a和b) 和pH 7.0(c)時(shí)，AlphaScreenTM測(cè)量的直接結(jié)合測(cè)定。
圖18.本發(fā)明Fc變體對(duì)FcRn的結(jié)合的測(cè)定。顯示的是變體Fc結(jié)合到 表面結(jié)合的FcRii上時(shí)產(chǎn)生的表面質(zhì)子共振單位。
發(fā)明詳述
本發(fā)明公開(kāi)了對(duì)FcRn受體的結(jié)合增強(qiáng)的Fc域新變體的產(chǎn)生，F(xiàn)c域包 括在抗體、Fc融合物和免疫粘附物中發(fā)現(xiàn)的那些Fc域。如上所述，結(jié)合 RcRn導(dǎo)致體內(nèi)較久的血清滯留。
為了增加Fc蛋白的體內(nèi)滯留，結(jié)合親和力的增加必須是pH 6左右時(shí)的 增加，同時(shí)不伴隨pH 7.4左右時(shí)親和力的增加。雖然仍在研究中，但仍認(rèn) 為Fc區(qū)具有較久的體內(nèi)半衰期是因?yàn)閜H6時(shí)在內(nèi)體中與FcRn的結(jié)合隔離 了 Fc(Ghetie and Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598,全部引入作為 參考)。內(nèi)體室然后將Fc再循環(huán)到細(xì)胞表面。 一旦該室向細(xì)胞間隙開(kāi)放，更 高的pH( 7.4)將導(dǎo)致Fc釋放回血液中。Dal1' Acqua等顯示在pH 6和pH 7.4 時(shí)具有增加的FcRn結(jié)合力的Fc突變體實(shí)際上具有降低的血清濃度和與野 生型相同的半衰期(Dall' Acqua et al. 2002， J. Immunol. 169:5171-5180,全部 引入作為參考)。認(rèn)為pH 7.4時(shí)Fc對(duì)FcRn的親和力的增加阻止了 Fc釋放 回血液中。因此，增加Fc體內(nèi)半衰期的Fc突變理論上將增加較低pH時(shí)的 FcRn結(jié)合，但仍然允許在更高的pH釋放Fc。在pH 6.0-7.4的范圍內(nèi)，氨 基酸組氨酸可以改變它的電荷狀態(tài)。因此，在Fc/FcRn復(fù)合物的重要位點(diǎn)發(fā)
現(xiàn)His殘基并不會(huì)令人覺(jué)得驚訝(圖6)。
本發(fā)明另一方面是，使FcRn結(jié)合相對(duì)于野生型增加(具體在較低pH, 大約pH 6.0時(shí))，以促進(jìn)內(nèi)體中的Fc/FcRn結(jié)合。本發(fā)明也公開(kāi)了對(duì)FcRn 的結(jié)合有變且對(duì)另一類(lèi)Fc受體FcyR的結(jié)合有變的Fc變體，對(duì)FqR的差 異結(jié)合，特別是對(duì)FcyRIIIb的結(jié)合增加和對(duì)FcYRIIb的結(jié)合降低，導(dǎo)致功效 增強(qiáng)。
定乂
為了更完全地理解本申請(qǐng)，下文闡述了幾個(gè)定義。這種定義有意包括 語(yǔ)法上的同等物。
這里使用的"ADCC"或"抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用"指一種細(xì)胞介 導(dǎo)反應(yīng)，在該反應(yīng)中，表達(dá)FcyR的非特異性細(xì)胞毒活性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上 結(jié)合的抗體并隨后引起該靶細(xì)胞裂解。
這里使用的"ADCP"或"抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用"指一種細(xì)胞介導(dǎo) 的反應(yīng)，在該反應(yīng)中，表達(dá)FcyR的非特異性細(xì)胞毒活性細(xì)胞識(shí)別靶細(xì)胞上 結(jié)合的抗體并隨后引起該靶細(xì)胞的吞噬。
這里的"氨基酸修飾"指多肽序列中的氨基酸替換、插入和/或缺失。
這里的"氨基酸替換"或"替換"指用另 一個(gè)氨基酸替換親代多肽序列特 殊位點(diǎn)的一個(gè)氨基酸。例如替換物E272Y指變體多肽，在這種情況下指 位點(diǎn)272的谷氨酸被酪氨酸替換的Fc變體。
這里的"氨基酸插入"或"插入"指在親代多肽序列的特殊位點(diǎn)添加一個(gè) 氨基酸。例如-233E或A233E指在位點(diǎn)233之后和位點(diǎn)234之前插入谷氨 酸。另外，-233ADE或〃233ADE指在位點(diǎn)233之后和位點(diǎn)234之前插入 AlaAspGlu。
這里的"氨基酸缺失"或"缺失"指在親代多肽序列的特殊位點(diǎn)除去一個(gè) 氨基酸。例如E233-或E233弁指位點(diǎn)233的谷氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233指從位點(diǎn)233開(kāi)始的序列GluAspAla的缺失。
這里使用的"變體蛋白"或"蛋白變體"或"變體"指由于至少一個(gè)氨基酸修 飾而不同于親代蛋白的蛋白。蛋白變體可以參考蛋白本身，包含該蛋白組 合物或編碼它的氨基序列。與親代蛋白相比，蛋白變體優(yōu)選具有最少一個(gè) 氨基酸修飾，例如大約一個(gè)到大約十個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選與親代相比大約 一個(gè)到大約五個(gè)的氨基酸修飾。這里的蛋白變體序列優(yōu)選具有與親代蛋白
序列至少大約80%的同源性，最優(yōu)選至少大約90%的同源性，更優(yōu)選至少 大約95%的同源性。蛋白變體可以參考變體蛋白本身，包含該蛋白變體的 組合物或編碼它的氨基酸序列。因此，這里使用的"抗體變體"或"變體抗體" 或"變體"指由于至少 一個(gè)氨基酸修飾而不同于親代抗體的抗體。這里使用的 "IgG變體"或"變體IgG"指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而不同于親代IgG的抗 體，這里使用的"免疫球蛋白變體"或"變體免疫球蛋白"或"變體"指由于至少 一個(gè)氨基酸修飾而不同于親代免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。變體可 以包含非天然氨基酸。實(shí)例包括US6586207; WO 98/48032; WO 03/073238; US2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin et al.， (2002)， Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G, Schultz, (2002)， ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin, et al.， (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; and, L, Wang, & P. G. Schultz, (2002)， Chem. 1-10，都全部引入作為參考
這里使用的"蛋白"指至少兩個(gè)共價(jià)連接的氨基酸，包括蛋白、多肽、寡 肽和肽。肽基可以包含天然發(fā)生的氨基酸和肽鍵，或合成的肽模擬結(jié)構(gòu)， 即"類(lèi)似物"，例如類(lèi)肽(參見(jiàn)Simon et al.， PNAS USA 89(20):9367 (1992), 全部引入作為參考)。正如本領(lǐng)域所理解的那樣，氨基酸可以是天然發(fā)生或 非天然發(fā)生的氨基酸。例如同型苯丙氨酸、瓜氨酸和noreleucie被認(rèn)為是 可用于本發(fā)明目的的氨基酸，而且D和L(R或S)構(gòu)型的氨基酸都可以被使 用。本發(fā)明的變體可以包含包括利用，例如Schultz和其同事的技術(shù)，包括 但不限于Cropp & Shultz， 2004, Trends Genet, 20(12):625-30， Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101(2):7566-71 ， Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3和Chin et al.， 2003， Science 301(5635):964-7描述的方法整合 的非天然氨基酸的修飾。另外，多肽可以包括一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈或末端的合 成衍生作用、糖基化、PEG化、環(huán)狀排列、環(huán)化、與其他分子連接、融合 到蛋白或蛋白域和添加肽標(biāo)簽或標(biāo)記。
這里使用的"殘基"指蛋白中的位置，以及它伴隨的氨基酸同一性。例如 天冬酰胺297(也稱(chēng)為Asn297,也稱(chēng)為N297)是人抗體IgGl中的殘基。
這里使用的"Fab"或"Fab區(qū)"指包含VH、 CHI 、 VL和CL免疫球蛋白區(qū) 的多肽。Fab可以指分離狀態(tài)的這些區(qū)，或處于全長(zhǎng)抗體或抗體片段前后關(guān) 系中的這些區(qū)。 這里使用的"IgG亞類(lèi)修飾"指將一種IgG同種型中的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)換成
配對(duì)的不同IgG同種型中的對(duì)應(yīng)氨基酸的氨基酸修飾。例如因?yàn)镮gGl在 EU位點(diǎn)296包含酪氨酸，而IgG2包含苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y替 換被認(rèn)為是IgG亞類(lèi)修飾。
這里使用的"非天然發(fā)生的修飾"指不是同型的氨基酸修飾。例如因?yàn)?沒(méi)有IgGs在位點(diǎn)332包含谷氨酸，因此在IgGl、 IgG2、 IgG3或IgG4中的 I332E替換被認(rèn)為是非天然發(fā)生的修飾。
這里使用的"氨基酸"和"氨基酸特性"指20個(gè)天然氨基酸或出現(xiàn)在具體 指定位點(diǎn)的任何非天然類(lèi)似物中的一個(gè)。
這里使用的"效應(yīng)器功能"指由抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用引 起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)器功能包括，但不局限于ADCC、 ADCP和CDC。
這里使用的"效應(yīng)細(xì)胞"指表達(dá)一種或多種Fc受體并介導(dǎo)一種或多種效 應(yīng)器功能的免疫系統(tǒng)細(xì)胞。效應(yīng)細(xì)胞包括，但不局限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞、中性粒細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、 大顆粒淋巴細(xì)胞、郎格罕氏細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞和y5T細(xì)胞，而且他們 可以來(lái)源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物體。
這里使用的"IgG Fc配體"指結(jié)合IgG抗體的Fc區(qū)以形成Fc/Fc配體復(fù) 合物的來(lái)自任何生物體的分子，優(yōu)選多肽。Fc配體包括，但不局限于FcyRs、 FcyRs、 FcyRs、 FcRn、 Clq、 C3、甘露聚糖結(jié)合凝集素、甘露糖受體、葡 萄球菌蛋白a、鏈球菌蛋白g和病毒FcyR。 Fc配體也包括是Fc受體家族 的與FcyRs同源的Fc受體同系物(FcRH)(Davis et al.， 2002， Immunological Reviews 190:123-136，全部引入作為參考)。Fc配體可以包括未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合 Fc的分子。具體IgGFc配體有FcRn和Fcy受體。這里使用的"Fc配體"指 結(jié)合抗體Fc區(qū)以形成Fc/Fc配體復(fù)合物的來(lái)自任何生物體的分子，優(yōu)選多 肽。
這里使用的"FcY受體"或"FcyR"指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)的由FcyR基因編 碼的蛋白家族的任何成員。在人類(lèi)中，這些蛋白家族包括但不局限于包括 亞型FcyRIa、 FcyRIb和FcyRIc的FcyRI(CD64);包括亞型FcyRIIa(包括同 種異型H131和R131)、 FcyRIIb(包括Fc丫RIIb-l和FcyRIIb-2)和FcyRIIc的 FcyRII(CD32);和包括亞型FcyRIIIa(包括同種異型V158和F158)和 FcyRIIIb(包括同種異型Fc丫RIIIb-NAl和FcyRIIIb-NA2)的
FcYRIII(CD16)(Jefferis et al.， 2002, Immunol Lett 82:57-65,全部引入作為參 考)，以及未發(fā)現(xiàn)的人FcyRs或FcyR亞型或同種異型。FcyR可以來(lái)源于包 括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物體。小白鼠Fc丫Rs包 括^f旦不局限于 FcyRI(CD64) 、 FcyRII(CD32) 、 FcyRIII(CD16)和 FcyRIII-2(CD16-2)，以及任何未發(fā)現(xiàn)的小白鼠FcyRs或FcyR亞型或同種異 型。
這里使用的"FcRn"或"新生Fc受體"指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)的至少部分由 FcRn基因編碼的蛋白。FcRn可以來(lái)源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、 兔子和猴的任何生物體。功能性FcRn蛋白包含經(jīng)常被稱(chēng)為重鏈和輕鏈的兩 條多肽，輕鏈?zhǔn)荍3-2-微球蛋白，重鏈由FcRn基因編碼。除非這里記錄了其 他方式，否則FcRn或FcRn蛋白指FcRn重鏈與|3-24效球蛋白的復(fù)合物。具 有特殊意義的FcRn序列，特別是人類(lèi)的序列顯示在附圖中。
這里使用的"親代多肽"指隨后被修飾以產(chǎn)生變體的未經(jīng)修飾的多肽。親 代多肽可以是天然發(fā)生多肽，或天然發(fā)生多肽的變體或經(jīng)過(guò)加工的形式。 親代多肽可以參考多肽本身，包含該親代多肽的組合物或編碼它的氨基酸 序列。因此，這里使用的"親代免疫球蛋白"指被修飾以產(chǎn)生變體的未經(jīng)修飾 的免疫球蛋白多肽，這里使用的"親代抗體"指被修飾以產(chǎn)生變體抗體的未經(jīng) 修飾的抗體。應(yīng)注意"親代抗體"包括下文列出的已知的市場(chǎng)上可買(mǎi)到的重組 生產(chǎn)的抗體。
這里使用的"位點(diǎn)"指蛋白序列中的位置?？梢詫?duì)位點(diǎn)進(jìn)行連續(xù)編號(hào)，或 者可以依照已確定的形式，例如Kabat等的EU指數(shù)進(jìn)行編號(hào)。例如位點(diǎn) 297是人抗體IgGl中的位點(diǎn)。
這里使用的"靶抗原"指被給定抗體的可變區(qū)特異結(jié)合的分子。靶抗原可 以是蛋白、糖、脂質(zhì)或其他化合物。
這里使用的"靶細(xì)胞"指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。
這里使用的"可變區(qū)"指包含一個(gè)或多個(gè)基本上由Vk、 VX和/或VH基因 中的任何一種編碼的Ig域的免疫球蛋白區(qū)域，其中Vk、 VX和/或VH基因 分別組成k、 X和免疫球蛋白重鏈基因位點(diǎn)。
這里的"野生型或WT"指在自然界中發(fā)現(xiàn)的包括等位基因變異的氨基 酸序列或核苷酸序列。WT蛋白具有沒(méi)有被故意修飾的氨基酸序列或核苷酸 序列。
本發(fā)明涉及對(duì)FcRn的結(jié)合被調(diào)節(jié)的抗體(調(diào)節(jié)包括增加以及降低結(jié) 合)。例如在有些情況下，增加的結(jié)合會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞再循環(huán)抗體，并由此延 長(zhǎng)，例如治療抗體的半衰期。有時(shí)，降低FcRn結(jié)合是合乎需要的，例如用 作包含放射標(biāo)記的診斷抗體或治療抗體。另外，對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出增加， 同時(shí)對(duì)其他Fc受體，例如FqRs的結(jié)合被改變的抗體可以用于本發(fā)明。因 此，本發(fā)明提供抗體。
抗體
本申請(qǐng)涉及包含調(diào)節(jié)對(duì)FcRn的結(jié)合力的氨基酸修飾的抗體。具有特殊 意義的是在較低的pH時(shí)，對(duì)FcRn的結(jié)合親和力顯示出增加，而在更高的 pH時(shí)，結(jié)合基本上不顯示出改變的最低限度地包含F(xiàn)c區(qū)的抗體或其功能 性變體。
傳統(tǒng)的抗體結(jié)構(gòu)單位通常包含四聚體。每個(gè)四聚體通常由兩個(gè)相同的 多肽鏈對(duì)組成，每對(duì)具有一條"輕"鏈(通常具有大約25 kDa的分子量)和一條 "重"鏈(通常具有大約50-70 kDa的分子量)。人輕鏈被分為K和人輕鏈。重 鏈被分為|i、 △、 y、 a或s,限定的抗體同種型分別為IgM、 IgD、 IgG、 IgA 和IgE。 IgG具有幾個(gè)亞類(lèi)，包括但不限于IgGl、 IgG2、 IgG3和IgG4。 IgM 也具有亞類(lèi)，包括但不限于IgMl和IgM2。因此，這里使用的"同種型"指 由免疫球蛋白的恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特性限定的任何免疫球蛋白亞類(lèi)。已 知的人免疫球蛋白同種型有IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgAl、 IgA2、 IgMl、 IgM2、 IgD和IgE。
每條鏈的氨基末端部分包含主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別的有大約100到110或
更多氨基酸的可變區(qū)。在可變區(qū)中，重鏈v域中的三個(gè)環(huán)和輕鏈v域中的 三個(gè)環(huán)聚集在一起形成抗原結(jié)合簇。每個(gè)環(huán)被稱(chēng)為互補(bǔ)決定區(qū)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為
"CDR")，互補(bǔ)決定區(qū)中氨基酸序列變化最顯著。
每條鏈的羧基末端部分限定了主要負(fù)責(zé)效應(yīng)器功能的恒定區(qū)。Kabat等 收集了重鏈和輕鏈可變區(qū)的許多一級(jí)序列。他們基于序列保守程度，將各 個(gè)一級(jí)序列分為CDR和框架，并制作了他們的列表(參見(jiàn)SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabatetal.，全部引入作為參考)。
免疫球蛋白IgG亞類(lèi)的重鏈中有幾個(gè)免疫球蛋白功能區(qū)。這里的"免疫 球蛋白(Ig)域"指具有獨(dú)特三級(jí)結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白區(qū)域。在本發(fā)明中有意義的
有重鏈域，包含重鏈恒定(CH)域和鉸鏈域。在IgG抗體背景中，每個(gè)IgG
同種型具有三個(gè)CH區(qū)。因此，IgG背景中的"CH"域顯示如下"CH1"指依 照Kabat的EU指數(shù)進(jìn)行編號(hào)的位點(diǎn)118-220。 "CH2"指依照Kabat的EU指 數(shù)進(jìn)行編號(hào)的位點(diǎn)237-340, "CH3"指依照Kabat的EU指數(shù)進(jìn)行編號(hào)的位點(diǎn) 341-447。
另一種重鏈Ig域是絞鏈區(qū)。這里的"鉸鏈"或"絞鏈區(qū)"或"抗體絞鏈區(qū)" 或"免疫球蛋白絞鏈區(qū)"指在抗體的第一和第二恒定域之間包含氨基酸的可 彎曲的多肽。在結(jié)構(gòu)上，IgGCHl域終止于EU位點(diǎn)220， IgGCH2域起始 于EU位點(diǎn)237的殘基。因此，對(duì)IgG來(lái)說(shuō)，這里限定的抗體鉸鏈包含位點(diǎn) 221(IgGl中的D221)到236(IgGl中的G236)'其中依照Kabat等的EU指數(shù) 進(jìn)行編號(hào)。在一些實(shí)施例中，例如在Fc區(qū)背景中，可以包含較少的鉸鏈， "較少的鉸鏈"泛指位點(diǎn)226或230。
在本發(fā)明中有特殊意義的是Fc區(qū)。這里使用的"Fc"或"Fc區(qū)"指包含排 除第一恒定區(qū)免疫球蛋白功能區(qū)，有時(shí)還排除部分鉸鏈的抗體恒定區(qū)的多 肽。因此，F(xiàn)c指IgA、 IgD和IgG的最后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白功能域，IgE 和IgM的最后三個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白功能域，和這些域N-末端的可彎曲的 鉸鏈。對(duì)IgA和IgM來(lái)說(shuō)，F(xiàn)c可以包含J鏈。對(duì)IgG來(lái)說(shuō)，F(xiàn)c包含免疫球 蛋白功能域Cy2和Cy3(Cy2和Cy3)，以及Cyl(Cyl)和Cy2(Cy2)之間較低的 絞鏈區(qū)，這一點(diǎn)如圖1所示。雖然，F(xiàn)c區(qū)的分界線可以變化，但通常限定 人IgG重鏈Fc區(qū)包含殘基C226或P230到羧基末端，其中依照Kabat的EU 指數(shù)進(jìn)行編號(hào)。如下所述，F(xiàn)c可以指分離狀態(tài)的這些區(qū)，或處于Fc多肽前 后關(guān)系中的這些區(qū)。這里使用的"Fc多肽"指包含全部或部分Fc區(qū)的多肽。 Fc多肽包括抗體、Fc融合物、分離的Fcs和Fc片>^。
在一些實(shí)施例中，抗體是全長(zhǎng)的。這里的"全長(zhǎng)抗體"指組成抗體天然生 物類(lèi)型的包括可變區(qū)和恒定區(qū)的包括這里列出的一種或多個(gè)修飾的結(jié)構(gòu)。
或者，抗體可以具有多種結(jié)構(gòu)，包括但不限于抗體片段、單克隆抗體、 雙特異抗體、微型抗體(minibodies)、域抗體、合成抗體(這里有時(shí)稱(chēng)為"抗體 模擬物")、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(有時(shí)稱(chēng)為"抗體偶聯(lián)物")， 以及每一種的片段。
抗體片段
在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是抗體片段。尤其感興趣的是包含重鏈Fc區(qū)、
Fc融合物和恒定區(qū)(CHl-鉸鏈-CH2-CH3)的抗體，還可包括重鏈恒定區(qū)融合物。
特異性抗體片段包括，但不局限于(i)由VL、 VH、 CL和CH1域組成 的Fab片段、(ii)由VH和CH1域組成Fd片段、(iii)由單個(gè)抗體的VL和VH 域組成Fv片段；(iv)由單個(gè)可變區(qū)組成的dAb片段(Ward et al.， 1989, Nature 341:544_546,全部引入作為參考)、(v)分離的CDR區(qū)、(vi)包含兩個(gè)連接的 Fab片段的二價(jià)片段F(ab')2片段(vii)單鏈Fv分子(scfV)，其中通過(guò)允許兩 個(gè)域聯(lián)合形成抗原結(jié)合部位的肽接頭連接VH域和VL域(Bird et al., 1988, Science 242:423-426， Huston et al., 1988, Proc, Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883，全部引入作為參考)(viii)雙特異單鏈Fv(WO 03/11161,引入 作為參考)和(ix)通過(guò)基因融合構(gòu)建的"雙體"或"三體"，多價(jià)或多特異性片段
(Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al.， 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448,都全部引入 作為參考)?？梢孕揎椏贵w片段。例如可以通過(guò)整合連接VH和VL域的 二硫鍵穩(wěn)定該分子(Reiter et al.， 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245,全部引
入作為參考)。
嵌合抗體和人源化抗體
在一些實(shí)施例中，支架成分可以是來(lái)自不同物種的混合物。這時(shí)，如 果所述抗體是一種抗體，那么這種抗體可以是嵌合抗體和/或人源化抗體。 一般而言，"嵌合抗體"和"人源化抗體"都指組合來(lái)自多個(gè)物種的功能區(qū)的抗 體。例如傳統(tǒng)的"嵌合抗體"包含來(lái)自小白鼠(或者有時(shí)是大鼠)的可變區(qū)和 來(lái)自人的恒定區(qū)。"人源化抗體"泛指可變區(qū)的框架區(qū)被換成人抗體中發(fā)現(xiàn)的 序列的非人抗體。通常，在人源化抗體中，除CDRs之外的全部抗體是由人 來(lái)源的多核苷酸編碼的，或者除CDRs之外等同于這種人來(lái)源的抗體。由起 源于非人生物體的核酸編碼的一些或所有CDRs ;陂移#_到人抗體可變區(qū)的 (3-片層骨架中以產(chǎn)生抗體，其中特異性由移入的CDRs決定。都全部引入作 為參考的WO 92/11018， Jones, 1986， Nature 321:522-525， Verhoeyen et al.， 1988， Science 239:1534-1536中描述了制備這種抗體的過(guò)程。經(jīng)常需要將選 擇的受體骨架殘基"回復(fù)突變"為對(duì)應(yīng)的供體殘基以恢復(fù)初期被移植的構(gòu)建
物中喪失的親和力(US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213，都全
部^ 1入作為參考)。最佳的人源化抗體還將包含免疫球蛋白恒定區(qū)的至少一 部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分，因此將通常包含人FC區(qū)。還可
以利用免疫系統(tǒng)被遺傳操縱的小白鼠產(chǎn)生人源化抗體。Roque et al., 2004， Biotechnol. Prog. 20:639-654，全部引入作為參考。人源化和改造非人抗體的 多種技術(shù)和方法在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?參見(jiàn)See Tsurushita & Vasquez, 2004， Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)和其中引用的參考文獻(xiàn)，都全部引入作為參 考)。人源化方法包括但不限于都全部引入作為參考的Jones W a/., 1986， 胸騰321:522-525; Riechmann " a/.，1988;淑騰332:323-329; Verhoeyen d a/., 1988, 5We腳，239:1534-1536; g謝w "a/.， 1989,尸rac淑"c^5W, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter " a/., 1992， 尸rac iVw/爿cad Sc/ f/SJ S義42S5-9， Presta et al.， 1997， Cancer Res.57(20):4593畫(huà)9 ; Gorman et al., 1991， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor Wa/., 1998,五"g 11:321-8中描述的方法。降
例如，引入作為參考的Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973中描述了該方法。在一個(gè)實(shí)施例中，親代抗體已經(jīng)被親合成熟， 這一點(diǎn)本領(lǐng)域已經(jīng)已知。基于結(jié)構(gòu)的方法可以用于人源化和親合成熟，例 如USSN 11/004,590中對(duì)此進(jìn)行了描述?；谶x擇的方法可以用于人源化和 /或親合成熟抗體可變區(qū)，包括但不限于都全部引入作為參考的Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162 ; Baca et al" 1997, J. Biol. Chem. 272(16): 10678-10684; Rosok et al., 1996， J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al" 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al" 2003, Protein Engineering 16(10):753-759中描述的方法。其他人源化方法涉及僅嫁 接部分CDRs,包括但不限于都全部引入作為參考USSN 09/810,510; Tan et al.， 2002， J. Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis et al.， 2002, J. Immunol. 169:3076-3084中描述的方法。 雙特異性抗體
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是多特異性抗體，特別是雙特異性抗 體，有時(shí)也稱(chēng)為"雙體"。這些抗體結(jié)合兩種(或更多種)不同的抗原?？梢岳?用本領(lǐng)域已知的多種方式制造雙體(Holliger and Winter, 1993， Current
OpinionBiotechnol. 4:446-449，完全引入作為參考)，例如，可以用化學(xué)方法 制備或從雜種雜交瘤制備。 微型抗體(Minibodies)
在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是微型抗體(minibody)。微型抗體(minibody)是包 含與CH3域相連的scFv的最小化抗體樣蛋白。Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061，全部引入作為參考。在有些情況下，scFv可以與Fc區(qū)連接， 還可以包括部分或全部絞鏈區(qū)。
人抗體
在一個(gè)實(shí)施例中，抗體是具有這里列出的至少 一個(gè)修飾的完全的人抗 體。"完全的人抗體"指具有來(lái)源于人染色體的抗體的基因序列、并具有這里 列出的》務(wù)飾的人抗體。
戎謬嚴(yán)合游
在 一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的抗體是抗體融合蛋白(有時(shí)在這里稱(chēng)為"抗體 偶聯(lián)物")?？贵w融合的一種類(lèi)型包括將Fc區(qū)與偶聯(lián)配偶體連接的Fc融合物。 這里使用的"Fc融合物"指其中一種或多種多肽操作性地與Fc區(qū)連接的蛋 白。Fc融合物在這里與現(xiàn)有技術(shù)中使用的術(shù)語(yǔ)"免疫粘合素"、"Ig融合物"、 "Ig嵌合體"和"受體球蛋白"(有時(shí)帶破折號(hào))同義(Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997， Curr Opin Immunol 9:195-200，都 全部引入作為參考)。Fc融合物將免疫球蛋白的Fc區(qū)與通常是任何蛋白或 小分子的融合配偶體連接。事實(shí)上任何蛋白或小分子都可以連接到Fc上以 產(chǎn)生Fc融合物。蛋白融合配偶體包括，但不局限于任何抗體的可變區(qū)、受 體的靶標(biāo)結(jié)合區(qū)、粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子或一些其它 的蛋白或蛋白域。小分子融合配偶體可以包括指導(dǎo)Fc融合物到治療靶的任 何治療劑。這種靶可以是任何分子，優(yōu)選是參與疾病的胞外受體。因此， 該IgG變體可以連接到一種或多種融合配偶體上。在一個(gè)可選4奪的實(shí)施例 中，IgG變體被連接或操作性地連接到另一種治療化合物上。治療化合物可 以是細(xì)胞毒活性制劑、化療劑、毒素、放射性同位素、細(xì)胞因子，或其他 治療活性劑。IgG可以與多種非蛋白聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙 二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物連接。
除Fc融合物之外，抗體融合物包括重鏈恒定區(qū)與 一種或多種融合配偶 體的融合(此外又包括任何抗體的可變區(qū))，而其他抗體融合是基本全長(zhǎng)抗體
或完全全長(zhǎng)抗體與融合配偶體的融合。在一個(gè)實(shí)施例中，融合配偶體的作 用是介導(dǎo)靶標(biāo)結(jié)合，因此它在功能上類(lèi)似于抗體可變區(qū)(而且實(shí)際上可以就 是抗體可變區(qū))。事實(shí)上任何蛋白或小分子都可以連接到Fc上產(chǎn)生Fc融合 物(或抗體融合物)。蛋白融合配偶體包括，但不局限于受體的靶標(biāo)結(jié)合區(qū)、 粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子或一些其它的蛋白或蛋白域。 小分子融合配偶體可以包括指導(dǎo)FC融合物到治療耙位的任何治療劑。這種 靶可以是任何分子，優(yōu)選是與疾病有關(guān)的胞外受體。
偶聯(lián)配偶體可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者通常是利用抗體和偶 聯(lián)配偶體上的功能基團(tuán)產(chǎn)生的。例如，銜接物在本領(lǐng)域是已知的，例如 同或異雙功能銜接物是眾所周知的(參見(jiàn)，1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers, pages 155-200，在這里引入作為參考)。
適當(dāng)?shù)呐悸?lián)物包括，但不局限于如下所述的標(biāo)記、藥物和細(xì)胞毒活性 制劑，其中藥物和細(xì)胞毒活性制劑包括但不限于細(xì)胞毒類(lèi)藥物(例如化療 劑)，毒素或這種毒素的活性片段。適當(dāng)?shù)亩舅睾退麄兊膶?duì)應(yīng)片段包括白喉 毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、瀉果素、巴豆 毒素、酚霉素、伊諾霉素等等。細(xì)胞毒活性制劑也包括通過(guò)將放射性同位 素連接到抗體上或者讓放射性核素結(jié)合已經(jīng)共價(jià)附著于抗體的螯合劑上制 備的放射化學(xué)試劑。另外的實(shí)施例利用了刺孢霉素(calicheamicin)、 auristatins 、 格爾德、霉素(geldanamycin)、 美登素(maytansine), 以及 duocarmycins和類(lèi)似物；后者參見(jiàn)在此全部引入作為參考的美國(guó) 2003/0050331A1。
戎伴W兵斧發(fā)辨
抗體的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，而且通常在翻譯后進(jìn)行，但 不總是如此。例如，通過(guò)讓抗體的特異氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑反應(yīng)可以 將幾種類(lèi)型的抗體共價(jià)修飾引入該分子中，其中有機(jī)衍生劑能與選擇的側(cè) 鏈或N或C末端殘基反應(yīng)。
半胱氨酰殘基與a-囟乙酸(和對(duì)應(yīng)的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應(yīng)產(chǎn) 生羧曱基或羧酰氨曱基衍生物是最常見(jiàn)的。也可以通過(guò)與溴三氟丙酮 (bromotrifluoroacetone)、 a-溴-卩-(5-咪峻基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基石壽酸鹽、 N-烷基馬來(lái)酰亞胺、3-硝基-2-他啶二硫化物、曱基2-吡啶二硫化物、p-對(duì)
氯汞苯曱酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯-2-氧雜-l,3-二唑等等反應(yīng) 衍生化半胱氨酰殘基。
通過(guò)在pH 5.5-7.0時(shí)與焦碳酸二乙酯反應(yīng)可以衍化組氨酰殘基，因?yàn)檫@ 種情況下這種制劑可以相對(duì)特異地針對(duì)組氨酰側(cè)鏈。對(duì)-溴苯酰基溴化物也 是有用的；優(yōu)選在pH6.0時(shí)，在O.IM二曱胂酸鈉中實(shí)施該反應(yīng)。
賴氨?；?Lysinyl)和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應(yīng)。這些 制劑的衍生作用具有逆轉(zhuǎn)賴氨殘基電荷的效果。衍生包含a氨基的殘基的 其他適當(dāng)試劑包括亞氨酸酯，例如曱基皮考啉亞氨酸酯(methyl picolinimidate);磷酸吡口多醛；p比,醛；硼氫化氯(chloroborohydride);三硝 基苯磺酸；O-曱基異尿素；2,4-戊二酮和由轉(zhuǎn)氨酶催化的與乙醛酸的反應(yīng)。
通過(guò)與苯曱酰曱醛、2,3-丁二酮(butanedione)、 1,2-環(huán)己二酮和茚三酮中 的一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)可以修飾精氨酰殘基。因?yàn)殡夜δ軋F(tuán)的pKa高， 因此精氨酸殘基的衍生作用要求在堿性條件下實(shí)施反應(yīng)。而且，這些試劑 可以與賴氨酸基團(tuán)，以及精氨酸s氨基反應(yīng)。
通過(guò)與芳香族重氮化合物或四硝基曱烷反應(yīng)可以對(duì)酪氨酰殘基進(jìn)行特 異修飾，實(shí)現(xiàn)引入光譜標(biāo)記到酪氨酰殘基中的特殊目的。用N-acetylimidizole 和四硝基曱烷分別形成O-乙酰酪氨酰種類(lèi)和3-硝基衍生物是最常見(jiàn)的?？?以利用1251或131I碘化酪氨酰殘基以制備供放射免疫測(cè)定用的標(biāo)記蛋白， 如上所述的氯胺T法是適當(dāng)?shù)姆椒ā?br> 通過(guò)與碳化二亞胺(R '-N = C = N-R ')反應(yīng)可以有選擇地修飾羧基側(cè)基 (天冬氨?；蚬劝滨?，其中R和R '隨意地是不同的烷基，例如l-環(huán)己基 -3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或1-乙基-3-(4-氮-4,4- 二曱戊 (dimethylpentyl))碳化二亞胺。而且，通過(guò)與銨離子反應(yīng)，可以將天冬氨酰 基和谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化為天冬酰胺酰和谷氨酰胺?；鶜埢?。
與雙功能試劑的衍生作用可用于將抗體交聯(lián)到不溶于水的支持基質(zhì)或 表面上，其中所述基質(zhì)或表面還用于除如下所述方法之外的多種方法。通 常使用的交聯(lián)劑包括，例如，1,1-二(重氮乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基 琥珀酰亞胺酯，例如具有4-疊氮水楊酸的酯、同(基)雙功能亞氨酸酯，包 括雙琥珀酰酯(disuccinimidyl esters),例如3,3 '-dithiobis(琥珀酰丙酸鹽)、雙 功能馬來(lái)酰亞胺，例如雙氮馬來(lái)酰亞胺-l,8辛烷。衍生試劑，例如曱基-3-(p-疊氮苯)二^i代]propioimidate可產(chǎn)生存在光時(shí)能形成交聯(lián)的光^:化中間物。
或者，都全部引入作為參考的美國(guó)專(zhuān)利Nos.3，969,287; 3,691,016; 4,195,128; 4,247,642; 4,229,537和4,330,440中描述的不溶于水的反應(yīng)性基質(zhì)，例如溴 化氰激活的糖和反應(yīng)性底物可以用于蛋白固定。
谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢?jīng)常分別被脫去酰胺基而成為對(duì)應(yīng) 的谷氨酰和天冬氨酰殘基?；蛘?，在溫和的酸性條件下可以使這些殘基脫 去酰胺基。這些殘基的兩種形式中的任何一種都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用、絲氨?；蛱K氨酰殘基的 羥基的磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側(cè)鏈a氨基的曱基化(T.E. Creighton， Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]，全部引入作為參考)、N-末端胺的乙?；腿魏蜟末端羧 基的酰胺化。
絲/么
另一種共價(jià)修飾是糖基化。在另一個(gè)實(shí)施例中，可以修飾這里公開(kāi)的 IgG變體以包括一種或多種加工的糖形。這里使用的"加工的糖形"指共價(jià)附 著于IgG的糖組合物，其中所述的糖組合物化學(xué)上不同于親代IgG的糖。 加工的糖形可用于多種目的，包括但不限于增強(qiáng)或降低效應(yīng)器功能?？梢?通過(guò)本領(lǐng)域已知的多種方法產(chǎn)生加工的糖形(Umafia et al.， 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al.， 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002， J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; US 6,602,684; USSN 10/277,370; USSN 10/113,929; PCTWO00/61739A1; PCT WO 01/29246A1; PCT WO 02/31140A1; PCTWO 02/30954A1,都全部引入作為參考；(Potelligent 技術(shù)[Biowa， Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb 糖基化工程技術(shù)[Glycart Biotechnology AG， Ziirich， Switzerland])。這些技術(shù)中的許多都基于控制共價(jià)附著于Fc區(qū)的巖 藻糖化的寡糖和/或等分的寡糖的水平，例如可通過(guò)在各種生物體或細(xì)胞系 中表達(dá)IgG、加工或其他方法(例如Lec-13 CHO細(xì)胞或大鼠雜交瘤YB2/0 細(xì)胞)、通過(guò)調(diào)節(jié)參與糖基化路徑的酶(例如FUT8 [1，6-墨角藻糖基轉(zhuǎn)移酶] 和/或卩l(xiāng)-4-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶ni [GnTIII])、或通過(guò)在表達(dá)IgG后修飾 糖進(jìn)行控制。加工的糖形通常指不同的碳水化合物或寡糖，因此IgG變體， 例如抗體或Fc融合物可以包含加工的糖形?；蛘?，加工的糖形可以指包含 不同碳水化合物或寡糖的IgG變體。糖基化模式既取決于蛋白序列(例如存
在或缺少下述具體糖基化氨基酸殘基)，又取決于生產(chǎn)蛋白的宿主細(xì)胞或生 物體，這一點(diǎn)本領(lǐng)域是已知的。下文討論了具體表達(dá)系統(tǒng)。
多肽的糖基化通常是N-連接或O-連接。N-連接指碳水化物部分附著到
天冬酰胺殘基的側(cè)鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨
酸是酶催化碳水化物部分附著到天冬酰胺側(cè)鏈上的識(shí)別順序，其中x是除 脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任何一個(gè)
就可以產(chǎn)生潛在的糖基化位點(diǎn)。O-連接糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳 糖或木糖中的一個(gè)附著到羥氨基酸上，雖然可以使用5-羥脯氨酸或5-羥基 賴氨酸，但通常大多數(shù)附著到絲氨酸或蘇氨酸上。
通過(guò)改變氨基酸序列使其包含一個(gè)或多個(gè)上述的三肽序列(適合于N-連接的糖基化位點(diǎn))，可以方便地添加糖基化位點(diǎn)到抗體上。也可以通過(guò)添 加或替換一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基到起始序列上來(lái)實(shí)施改變(適合于 O-連接糖基化位點(diǎn))。簡(jiǎn)單說(shuō)來(lái)，優(yōu)選通過(guò)DNA水平的變化來(lái)改變抗體的 氨基酸序列，特別是通過(guò)突變編碼靶多肽的DNA的預(yù)選堿基以產(chǎn)生將翻譯 成目的氨基酸的密碼子來(lái)進(jìn)行改變。
催化偶合糖苷到蛋白上。這些過(guò)程是有利的，因?yàn)樗麄儾恍枰诰哂蠳-和 O-連接糖基化能力的宿主細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白。糖可以附著于(a)精氨酸和組氨 酸、(b)自由羧基、(c)自由硫氫基，例如半胱氨酸的那些硫氫基、(d)自由羥 基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸中的那些羥基、(e)芳香族殘基，例如 苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些殘基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基，具體 附著方式取決于使用的偶合方式。都全部引入作為參考的WO 87/05330和 Aplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem.， pp. 259-306中描述了這些 方法。
可以用化學(xué)方法或酶方法完成除去存在于起始抗體上的碳水化合物部 分的過(guò)程?；瘜W(xué)去糖基化需要將蛋白暴露于化合物三氟曱磺酸或同等化合 物。這種處理會(huì)導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大 部分或全部糖被切割，剩下完整無(wú)缺的多肽。都全部引入作為參考的 Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al" 1981, Anal. Biochem. 118:131中描述了化學(xué)去糖基化。通過(guò)利用全部引入作 為參考的Thotakura et al" 1987, Meth. Enzymol. 138:350描述的多種內(nèi)-和外
糖苦酶可以實(shí)現(xiàn)用酶從多肽上切割糖部分。通過(guò)利用全部？ 1入作為參考的
Duskin et al.， 1982, J. Biol, Chem. 257:3105描述的化合物衣霉素可以防止?jié)?在糖基化位點(diǎn)發(fā)生糖基化。衣霉素阻斷蛋白-N-糖苷連接形成。
抗體的另 一種共價(jià)修飾包括按照，例如都全部引入作為參考的 2005-2006 PEG Catalog from Nektar Therapeutics (從Nektar網(wǎng)站可以獲4尋) 美國(guó)專(zhuān)利4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192或4，179，337 列出的方式，將抗體連接到多種非蛋白聚合物上，包括但不限于連接到各 種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯上。另外，可以在抗體內(nèi) 的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行氨基酸替換以促進(jìn)聚合物，例如PEG的添加，這一點(diǎn)本領(lǐng) 域已經(jīng)已知。例如，參見(jiàn)完全引入作為參考的美國(guó)公開(kāi)No. 2005/0114037A1。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體的共價(jià)修飾包括添加 一種或多種標(biāo) 記。有些情況下，這些也被認(rèn)為是抗體融合物。術(shù)語(yǔ)"標(biāo)記基團(tuán)"指任何可檢 測(cè)的標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)減少潛在空間阻礙的各種長(zhǎng)度的間隔 臂將標(biāo)記基團(tuán)連接到抗體上。標(biāo)記蛋白的多種方法本領(lǐng)域已經(jīng)已知，而且 這些方法都可以用于實(shí)施本發(fā)明。
通常，依據(jù);險(xiǎn)測(cè)標(biāo)記的測(cè)定將標(biāo)記分為多種類(lèi)別a)同位素標(biāo)記，可以 是放射性同位素或重同位素；b)》茲性標(biāo)記(例如，》茲顆粒)；c)氧化還原活性 部分；d)熒光染料；酶催化基團(tuán)(例如，辣根過(guò)氧化酶、p-半乳糖苷酶、熒 光素酶、堿性磷酸酶)；e)生物素化基團(tuán)；和f)被第二報(bào)告物識(shí)別的預(yù)先確 定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈配對(duì)序列、第二抗體結(jié)合部位、金屬結(jié)合 域、表位標(biāo)簽等等)。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)減少潛在空間阻礙的各種長(zhǎng) 度的間隔臂將標(biāo)記基團(tuán)連接到抗體上。標(biāo)記蛋白的多種方法本領(lǐng)域已經(jīng)已 知，而且這些方法都可以用于實(shí)施本發(fā)明。
特異性標(biāo)記包括光學(xué)染料，包括但不限于生色團(tuán)、磷和熒光團(tuán)，后者 在許多情況下是特異性的。熒光團(tuán)可以是"小分子"或蛋白性質(zhì)的fluores。
"焚光標(biāo)記"指通過(guò)固有的熒光特性被檢測(cè)的任何分子。適當(dāng)?shù)臒晒鈽?biāo)記 包含，但不局限于熒光素、若丹明(rhodamine)、四曱基若丹明、伊紅(eosin)、 藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、曱基香豆素、芘(pyrene)、孔雀綠(Malacite green)、 1-2-二苯乙烯、熒光黃、Cascade BlueJ、得克薩斯紅、IAEDANS、 EDANS、 BODIPYFL、 LC Red 640、 Cy 5、 Cy5,5、 LC Red 705、 Oregon green、
Alexa-Fluor染料(Alexa Fluor 350、 Alexa Fluor 430、 Alexa Fluor 488、 Alexa Fluor 546、 Alexa Fluor 568 、 Alexa Fluor 594、 Alexa Fluor 633 、 Alexa Fluor 660、 Alexa Fluor 680)、 Cascade Blue、 Cascade Yellow和R畫(huà)藻紅蛋白 (PE)(Molecular Probes, Eugene, OR)、 FITC、若丹明和得克薩斯紅(Pierce， Rockford， IL)、 Cy5、 Cy5.5、 Cy7(Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)。全
^包括熒光;在內(nèi)的適當(dāng)?shù)墓鈱W(xué)染料。 、 適當(dāng)?shù)牡鞍仔再|(zhì)的熒光標(biāo)記也包括，但不局限于綠色熒光蛋白、包括 Renilla、 Ptilosarcus或Aequorea物種的GFP(Chalfie et al.， 1994， Science 263:802-805)、 EGFP(Clontech Laboratories, Inc., Genbank登記入藏號(hào) U55762)、 藍(lán)熒光蛋白(BFP， Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9; Stauber， 1998， Biotechniques 24:462-471; Heim et al" 1996， Curr. Biol. 6:178-182)、增強(qiáng)的黃色熒光蛋白(EYFP, Clontech Laboratories, Inc.)、熒光素 酶(Ichiki et al., 1993， J. Immunol. 150:5408-5417)、卩半乳糖苷酶(Nolan et al., 1988， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607)和Renilla(W092/15673， WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, WO99/49019,美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5292658， 5418155, 5683888, 5741668， 5777079, 5804387, 5874304， 5876995, 5925558)。本段中引用的所有文獻(xiàn)引入這里作為參考。 IgG變體
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了 IgG變體蛋白。IgG變體至少包含含 有重鏈CH2-CH3區(qū)的抗體片段。另外，適當(dāng)?shù)腎gG變體包含F(xiàn)c域(例如包 含較低的絞鏈區(qū))，包含重鏈恒定區(qū)(CHl-鉸鏈-CH2-CH3)的IgG變體在本發(fā) 明中也是有用的，所有這些變體都可以融合到融合配偶體上。
相對(duì)于親代IgG多肽，有時(shí)是相對(duì)于野生型IgG， IgG變體包含一種或 多個(gè)氨基酸修飾。IgG變體可以具有一種或多種優(yōu)化的特性。至少一個(gè)氨基 酸修飾導(dǎo)致IgG變體的氨基酸序列不同于它的親代IgG。因此，與親代相比， IgG變體具有至少一個(gè)氨基酸修飾?；蛘?，與親代相比，IgG變體具有一個(gè) 以上的氨基酸修飾，例如大約一個(gè)到大約五十個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選與親代 相比大約 一 個(gè)到大約十個(gè)的氨基酸修飾，最優(yōu)選與親代相比大約 一 個(gè)到大 約五個(gè)的氨基酸修飾。
因此，IgG變體的序列和親代FC多肽的序列基本上是同源的。例如，
這里的IgG變體序列與親代IgG變體序列將具有大約80%的同源性，優(yōu)選 至少大約90%的同源性，最優(yōu)選至少大約95%的同源性。可以利用分子生 物學(xué)產(chǎn)生遺傳修飾，或者可以用化學(xué)方法或酶方法產(chǎn)生修飾。
事實(shí)上，IgG變體可以靶向任何抗原，包括但不限于屬于下列列表中的 靶抗原的蛋白、亞單位、域、基序和/或表位，下列列表包括如細(xì)胞因子的 可溶性因子和膜結(jié)合因子，膜結(jié)合因子包括跨膜受體17-IA， 4-lBB， 4Dc, 6-keto-PGFla, 8-iso匿PGF2a, 8-oxo-dG，腺芬受體，A33, ACE， ACE-2， 活化素，活化素A，活化素AB,活化素B，活化素C，活化素RIA，活化 素RIAALK-2，活化素RIBALK-4，活化素RIIA,活化素RIIB， ADAM， ADAMIO， ADAM12， ADAM15, ADAM17/TACE, ADAM8， ADAM9， ADAMTS， ADAMTS4， ADAMTS5，地址素，aFGF， ALCAM， ALK， ALK-l, ALK-7, a-l-抗胰蛋白酶，a-V/卩-l拮抗劑，ANG， Ang， APAF-l, APE， APJ， APP, APRIL, AR， ARC, ART, Artemin，抗-Id, ASPARTIC，心房 利鈉因子，av/b3整聯(lián)蛋白，Axl,b2M， B7-1, B7-2， B7-H， B-淋巴細(xì)胞刺 激物(BlyS)， BACE， BACE-1， Bad, BAFF， BAFF-R， Bag-l， BAK, Bax， BCA-l, BCAM， Bcl, BCMA， BDNF， b畫(huà)ECGF, bFGF, BID， Bik, BIM， BLC， BL-CAM， BLK， BMP, BMP-2 BMP-2a, BMP-3成骨蛋白(Osteogenin), BMP-4BMP陽(yáng)2b, BMP-5, BMP-6Vgr-l， BMP-7(OP-l), BMP-8 (BMP-8a， OP-2)， BMPR， BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB (ALK-6), BRK-2, RPK-l, BMPR-II (BRK-3)， BMPs, b-NGF, BOK，蛙皮素(Bombesin),骨衍生神經(jīng) 營(yíng)養(yǎng)因子，BPDE， BPDE-DNA， BTC，補(bǔ)體因子3 (C3), C3a, C4， C5, C5a, C10， CA125， CAD-8,降4丐素，cAMP，癌胚抗原(CEA)，癌相關(guān)抗 原，組織蛋白酶A，組織蛋白酶B,組織蛋白酶C/DPPI,組織蛋白酶D, 組織蛋白酶E,組織蛋白酶H,組織蛋白酶L，組織蛋白酶O，組織蛋白 酶S，組織蛋白酶V，組織蛋白酶X/Z/P, CBL, CCI， CCK2， CCL， CCL1, CCL11, CQL12, CCL13， CCL14， CCU5， CCL16, CCE17, CCL18, CCU9, CCL2， CCL20， CCL21, CCL22， CCX23， CCL24， CCL25, CCL26, CCL27, CCX28， CCX3, CCL4, CQL5， CCL6, CCU7, CCL8， CCX9/10， CCR, CCR1， CCR10， CCR10， CCR2, CCR3， CCR4， CCR5， CCR6， CCR7，
CCR8， CCR9, CD1, CD2， CD3， CD3E, CD4, CD5, CD6， CD7， CD8， CD10, CDlla, CDllb, CDllc, CD13, CD14, CD15， CD16， CD18， CD19， CD20， CD21， CD22， CD23， CD25, CD27L， CD28， CD29, CD30， CD30L， CD32， CD33 (p67蛋白)，CD34, CD38， CD40, CD40L， CD44， CD45， CD46, CD49a， CD52， CD54, CD55， CD56, CD61， CD64, CD66e， CD74, CD80CB7-1)， CD89, CD95, CD123, CD137, CD138, CD140a， CD146， CD147， CD148， CD152, CD164， CEACAM5， CFTR， cGMP, CINC，肉 毒桿菌毒素，產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素，CKb8-l， CLC， CMV， CMVUL， CNTF， CNTN-1， COX, C-Ret， CRG-2, CT-1， CTACK， CTGF， CTLA-4， CX3CL1， CX3CR1， CXCX, CXCL1， CXCX2, CXCL3， CXCL4, CXCX5， CXCX6, CXCL7， CXCL8， CXCL9, CXCL10, CXCL11, CXCL12, CXCL13， CXCL14， CXCL15, CXCL16， CXCR， CXCR1， CXCR2, CXCR3， CXCR4, CXCR5, CXCR6，細(xì)胞角蛋白肺瘤相關(guān)抗原，DAN， DCC, DcR3， DC-SIGN,衰變加 速因子，des(l-3)-IGF-I (腦IGF-1)， Dhh,地高辛，DNAM-1， Dnase， Dpp， DPPIV/CD26, Dtk， ECAD， EDA， EDA-A1， EDA-A2, EDAR, EGF, EGFR (ErbB畫(huà)l), EMA， EMMPRIN， ENA,內(nèi)皮素受體，腦啡肽酶，eNOS， Eot, 嗜酸細(xì)胞活化趨化因子l(eotaxinl)， EpCAM, Ephrin B2/ EphB4， EPO， ERCC, E-選擇素(E-selectin), ET-1，因子IIa,因子VII，因子VIIIc，因 子IX，成纖維細(xì)胞激活蛋白(FAP)， Fas， FcRl, FEN-1，鐵蛋白，F(xiàn)GF， FGF-19, FGF-2, FGF3， FGF-8， FGFR， FGFR曙3，纖維蛋白，F(xiàn)L， FIJP， Flt畫(huà)3， Flt-4，促卵泡激素，F(xiàn)ractalkine， FZD1, FZD2， FZD3， FZD4, FZD5， FZD6， FZD7, FZD8， FZD9， FZDIO， G250， Gas 6, GCP-2， GCSF, GD2， GD3， GDF， GDF-1， GDF-3 (Vgr-2)， GDF-5 (BMP-14, CDMP畫(huà)1), GDF-6 (BMP-13， CDMP陽(yáng)2)， GDF-7 (BMP隱12， CDMP-3)， GDF-8 (筒箭毒堿)，GDF-9, GDF-15 (MIC-1)， GDNF， GDNF， GFAP， GFRa畫(huà)l ， GFR-al, GFR-a2， GFR-a3, GITR,胰高血糖素，Glut 4,糖蛋白1Ib/nia(GPIIb/IIIa)， GM-CSF, gpl30， gp72, GRO,生長(zhǎng)激素釋放因子，半抗原(NP-cap或NIP-cap)， HB-EGF, HCC, HCMVgB包月莫if唐蛋白，HCMV)gH包月莫并唐蛋白,HCMVUL，造血生 長(zhǎng)因子(HGF), Hep B gpl20,類(lèi)肝素酶，Her2， Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3)， Her4 (ErbB-4),單純皰滲病毒(HSV) gB糖蛋白，HSV gD糖蛋白， HGFA,高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)， HlVgpl20， HIV IIIB gp 120 V3環(huán)，HLA, HLA-DR, HM1.24， HMFG PEM， HRG, Hrk，人心臟 肌球蛋白，人巨細(xì)胞病毒(HCMV)，人生長(zhǎng)激素(HGH), HVEM,I-309, IAP, ICAM， ICAM-1， ICAM-3， ICE, ICOS， IFNg， Ig, IgA受體，IgE， IGF， IGF結(jié)合蛋白，IGF-1R, IGFBP， IGF陽(yáng)I， IGF-II， IL, IL-1， IL-1R， IL畫(huà)2， IL-2R, IL畫(huà)4， IL-4R， IL陽(yáng)5， IL-5R， IL-6， IL陽(yáng)6R， IL-8， IL-9， IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18， IL-18R, IL-23，干擾素(INF)-a, INF-卩，INF-y,抑 制素，iNOS,胰島素A-鏈，胰島素B-鏈，胰島素樣生長(zhǎng)因子1，整聯(lián)蛋 白a2，整聯(lián)蛋白a3，整聯(lián)蛋白a4，整聯(lián)蛋白a4/pi，整聯(lián)蛋白a4/p7，整聯(lián) 蛋白a5 (aV)，整聯(lián)蛋白a5/pi，整聯(lián)蛋白a5/|33,整聯(lián)蛋白a6，整聯(lián)蛋白(31， 整聯(lián)蛋白(32，干擾素y, HMO, I-TAC， JE,激肽釋放酶2，激肽釋放酶5， 激肽釋放酶6，激肽釋放酶11，激肽釋放酶12，激肽釋放酶14，激肽釋 放酶15，激肽釋放酶Ll,激肽釋放酶L2，激肽釋放酶L3，激肽釋放酶L4， KC， KDR，角質(zhì)化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(KGF)，層粘連蛋白5， LAMP, LAP, LAP(TGF-1)，潛在TGF-1，潛在TGF-lbpl， LBP， LDGF， LECT2， Lefty， Lewis-Y抗原，Lewis-Y相關(guān)抗原，LFA-l, LFA-3， Lfo， LIF, LIGHT, 脂蛋白，LIX， LKN, Lptn， L-選擇蛋白，LT-a, LT-b, LTB4， LTBP-1，肺 表面活性物質(zhì)，促黃體發(fā)生激素，淋巴細(xì)胞毒素B受體，Mac-l， MAdCAM， MAG， MAP2， MARC， MCAM, MCAM， MCK-2, MCP， M-CSF， MDC， Mer，金屬蛋白酶，MGDF受體，MGMT， MHC (HLA-DR)， MIF， MIG, MIP， MIP-l-a， MK， MMAC1, MMP， MMP-l, MMP-IO， MMP-ll ， MMP-12， MMP-B， MMP-14， MMP-15， MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7， MMP曙8， MMP-9， MPIF, Mpo, MSK, MSP，粘蛋白(Mucl), MUC18, Muellerian-抑制素(inhibitin)物質(zhì)，Mug， MuSK， NAIP, NAP， NCAD, N隱Cadherin, NCA90， NCAM， NCAM， Neprilysin，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3,-4或-6, Neurturin, 神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF), NGFR， NGF畫(huà)(3, nNOS, NO， NOS， Npn， NRG-3, NT, NTN， OB, OGG1, OPG， OPN, OSM， OX40L, OX概，p150， p95， PADPr，曱狀旁腺激素，PARC, PARP， PBR， PBSF， PCAD,胎盤(pán)鈣粘蛋 白(P-Cadherin)， PCNA, PDGF， PDGF， PDK-l, PECAM, PEM, PF4, PGE， PGF, PGI2， PGJ2, PIN， PLA2,月臺(tái)盤(pán)石威'性石粦酸酵(PLAP)， P1GF， PLP， PP14，前胰島素，前松弛素(Prorelaxin),蛋白C, PS, PSA， PSCA，前列 腺特異性膜抗原(PSMA)， PTEN， PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK， RANKL，
RANTES， RANTES，松弛素A-鏈，松弛素B-鏈，腎素，呼吸道合胞病毒 (RSV)F, RSVFgp, Ret,類(lèi)風(fēng)濕因子，RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL， SDF-1， SERINE,血清白蛋白，sFRP-3, Shh, SIGIRR， SK-l, SLAM， SLPI， SMAC， SMDF， SMOH, SOD, SPARC， Stat, STEAP， STEAP-II, TACE, TACI， TAG-72 (腫瘤相關(guān)糖蛋白-72)， TARC, TCA-3, T-細(xì)胞受體(例如T-細(xì)胞受體a/p), TdT， TECK, TEM1, TEM5, TEM7, TEM8, TERT，睪丸 PLAP樣堿性磷酸酶，T漢，TGF, TGF-a， TGF-|3, TGF-卩Pan特異，TGF畫(huà)P RI (ALK-5)， TGF-P RII, TGF-卩RIIb， TGF-卩RIII， TGF陽(yáng)卩l(xiāng), TGF畫(huà)卩2， TGF-|33， TGF-P4， TGF-卩5，凝血酶，胸腺Ck-1,促曱狀腺激素，Tie, TIMP， TIQ， 凝血激酶(Tissue Factor), TMEFF2， Tmpo， TMPRSS2, TNF, TNF-a, TNF-a 卩，TNF-卩2， TNFc， TNF-RI, TNF-RII, TNFRSF1 OA (TRAIL Rl Apo-2， DR4)， TNFRSF10B (TRAIL R2 DR5, KILLER, TRICK-2A， TRICK-B)， TNFRSF 10C (TRAIL R3 DcRl ， LIT, TRID), TNFRSF 10D (TRAIL R4 DcR2, TRUNDD)， TNFRSFllA(RANKODFR, TRANCE R), TNFRSF11B (OPG OCIF， TR1), TNFRSF12 (TWEAK RFN14), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFF R)， TNFRSF 14 (HVEM ATAR, HveA， LIGHT R， TR2)， TNFRSF 16 (NGFR p75NTR)， TNFRSF 17 (BCMA)， TNFRSF 18 (GITR AITR)， TNFRSF 19 (TROY TAJ, TRADE), TNFRSF 19L (RELT), TNFRSF 1A (TNF RI CD 120a, p55-60)， TNFRSF1B (TNF RII CD120b, p75-80), TNFRSF26 (TNFRH3)， TNFRSF3 (LTbRTNFRIII， TNFCR)， TNFRSF4 (OX40 ACT35， TXGP1 R), TNFRSF5 (CD40p50), TNFRSF6(FasApo-l， APT1, CD95), TNFRSF6B (DcR3 M68， TR6), TNFRSF7 (CD27), TNFRSF8 (CD30)， TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA), TNFRSF21 (DR6) ， TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2) , TNFRST23 (DcTRAILRl TNFRH1), TNFRSF25 (DR3 Apo曙3, LARD, TR畫(huà)3， TRAMP, WSL-l)， TNFSF10 (TRAIL Apo-2配體，TL2)， TNFSF11 (TRANCE/RANK配 體ODF，OPG配體)，TNFSF12 (TWEAK Apo-3配體，DR3配體)，TNFSF13 (APRIL TALL2), TNFSF 13B (BAFF BLYS， TALL1， THANK, TNFSF20)， TNFSF 14 (LIGHT HVEM配體，LTg), TNFSF 15 (TL1A/VEGI), TNFSF 18 (GITR配體AITR配體，TL6), TNFSF 1A (TNF-a Conectin, DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-bLTa, TNFSF1), TNFSF3 (LTbTNFC, p33)， TNFSF4 (OX40 配體gp34, TXGPl)， TNFSF5 (CD40配體CD154, gp39, HIGM1, IMD3,
TRAP), TNFSF6(Fas配體Apo陽(yáng)l配體，APT1配體)，TNFSF7 (CD27酉己 體CD70), TNFSF8(CD30配體CD153), TNFSF9(4-1BB配體CD137配 體)，TP-1， t-PA, Tpo， TRAIL, TRAIL R， TRAIL-R1， TRAIL畫(huà)R2， TRANCE, 轉(zhuǎn)移因子，TRF, Trk, TROP-2, TSG， TSLP,腫瘤相關(guān)抗原CA 125，腫 瘤相關(guān)抗原表達(dá)Lewis Y相關(guān)碳水化合物，TWEAK， TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1,尿激酶，VCAM， VCAM-1， VECAD, VE-4丐粘蛋白，VE-4丐粘蛋 白-2， VEFGR-1 (flt-l)， VEGF, VEGFR， VEGFR曙3 (flt畫(huà)4)， VEGI, VIM, 病毒抗原，VLA， VLA-1， VLA-4， VNR整聯(lián)蛋白，von Willebrands因子， WIF-1, WNT1， WNT2， WNT2B/13， WNT3，麗T3A， WNT4， WNT5A， WNT5B, WNT6, WNT7A,濯T7B， WNT8A， WNT8B， WNT9A,麗T9A， 濯T9B， WNT10A,麗T10B， WNTll，麗T16, XCL1， XCL2, XCR1， XCR1， XEDAR, XIAP， XPD,以及激素和生長(zhǎng)因子受體。
本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解上述耙標(biāo)列表不僅指具體蛋白和生物分 子，而且也指包含他們的生物化學(xué)路徑。例如CTLA-4作為靶抗原暗示組 成T細(xì)胞共同刺激路徑的配體和受體也是靶標(biāo)，其中配體和受體包括 CTLA-4、 B7-l、 B7-2、 CD28和任何其他的未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合這些蛋白的配體 或受體。因此，這里使用的靶標(biāo)不僅指具體的生物分子，而且指與所述靶 標(biāo)相互作用的一類(lèi)蛋白和所述靶標(biāo)屬于其中的生物化學(xué)路徑的成員。本領(lǐng) 域熟練技術(shù)人員應(yīng)更進(jìn)一步地理解上述任何目標(biāo)抗原、結(jié)合他們的配體或 受體、或他們對(duì)應(yīng)的生物化學(xué)路徑的其他成員可以操作性地與本發(fā)明的Fc 變體連接以產(chǎn)生Fc融合物。因此，通過(guò)將Fc變體操作性地連接到EGF、 TGF-b或任何發(fā)現(xiàn)或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的其他配體上可以構(gòu)建靶向EGFR 的Fc融合物。因此，可以將本發(fā)明的Fc變體操作性地連接到EGFR上以 產(chǎn)生結(jié)合EGF、 TGF-b或任何發(fā)現(xiàn)或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的其他配體的Fc 融合物。因此，事實(shí)上任何多肽，不論配體、受體或其它蛋白或蛋白域，
作性地連接到本發(fā)明的Fc變體上以產(chǎn)生Fc融合物。
適當(dāng)抗原的選擇取決于想要實(shí)現(xiàn)的用途。對(duì)抗癌治療來(lái)說(shuō)，具有表達(dá) 只限于癌細(xì)胞的靶標(biāo)是合乎需要的。已經(jīng)證明一些特別適合用于抗體治療 的靶標(biāo)是那些具有信號(hào)發(fā)送功能的靶標(biāo)。其他的治療抗體通過(guò)抑制受體和 它的同族配體之間的結(jié)合阻斷受體發(fā)送信號(hào)來(lái)發(fā)揮他們的作用。治療抗體
的另一種作用機(jī)制是使受體下調(diào)。其他抗體不通過(guò)發(fā)送信號(hào)通過(guò)他們的目 標(biāo)抗原起作用。有時(shí)使用針對(duì)傳染病因子的抗體。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的FC變體被摻入抗細(xì)胞因子抗體中。或者， Fc變體與細(xì)胞因子融合或偶聯(lián)。這里使用的"細(xì)胞因子"是一群細(xì)胞釋放的
作為細(xì)胞間介質(zhì)作用于另一細(xì)胞的蛋白總稱(chēng)。例如正如特別引入作為參 考的Penichet et al., 2001， J Immunol Methods 248:91-101中所述，可以將細(xì)胞 因子融合到抗體上以提供合乎需要的特性組。這種細(xì)胞因子的實(shí)例有淋巴 因子、單核因子和傳統(tǒng)的多肽激素。包括在細(xì)胞因子之中的有生長(zhǎng)激素， 例如人生長(zhǎng)激素、N-曱硫氨酰人生長(zhǎng)激素和牛生長(zhǎng)素；曱狀旁腺激素；曱 狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛肽；前松弛素；糖蛋白激素，例如促卵 泡激素(FSH)、促曱狀腺激素(TSH)和促黃體生成激素(LH);肝臟生長(zhǎng)因子； 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子；催乳素；胎盤(pán)催乳素；腫瘤壞死因子-a和-P; mullerian-抑制物質(zhì)；小白鼠促性腺激素相關(guān)肽；抑制素；活化素；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因 子；整聯(lián)蛋白；促血小板生成素(TPO);神經(jīng)生長(zhǎng)因子，例如NGF-(3;血小 板生長(zhǎng)因子；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFs),例如TGF-a和TGF-(3;胰島素樣生長(zhǎng) 因子-I和-II;促紅細(xì)胞生成素(EPO);骨誘導(dǎo)性因子；干擾素，例如干擾素-a、 卩和-y;集落刺激因子(CSFs),例如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF);粒細(xì)胞-巨噬細(xì) 胞-CSF(GM-CSF)和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF);白細(xì)胞介素(IL)，例如IL-1， IL-la， IL-2, IL-3, IL-4， IL-5, IL-6， IL-7， IL-8， IL畫(huà)9， IL-10, IL-ll， IL-12,IL-15; 肺瘤壞死因子，例如TNF-a或TNF-P; C5a;及其他多肽因子，包括LIF和 試劑盒配體(KL)。這里使用的術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子包括來(lái)自天然來(lái)源或來(lái)自重組 細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白，以及天然序列細(xì)胞因子的生物學(xué)活性同等物。
細(xì)胞因子和可溶性靶標(biāo)，例如TNF超家族成員是用于本發(fā)明變體的優(yōu) 選輩巴標(biāo)。例如抗VEGF、抗CTLA-4和抗TNF抗體或其片^殳是用于增加 FcRn結(jié)合的Fc變體的特別優(yōu)良的抗體。針對(duì)這些靶標(biāo)的治療經(jīng)常涉及治療 自身免疫疾病，而且需要長(zhǎng)期多次注射。因此，本發(fā)明變體帶來(lái)的較長(zhǎng)的
血清半衰期和較低的治療頻率是特別優(yōu)選的。
批準(zhǔn)在臨床試驗(yàn)或在研發(fā)中使用的大量抗體和Fc融合物可以從本發(fā)明 的Fc變體得益。這些抗體和Fc融合物在這里稱(chēng)為"臨床產(chǎn)物和候選物"。因 此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽可以用于大量臨床產(chǎn)物和候選物。 例如大量靶向CD20的抗體可以從本發(fā)明的Fc多肽得益。例如，本發(fā)明
的Fc多肽可以用于基本上與嵌合的批準(zhǔn)用于治療非何杰金(氏)淋巴瘤的抗
CD20抗體利妥昔單抗(rituximab, Rituxan , IDEC/Genentech/Roche)(例如參 見(jiàn)US 5,736,137)相似的抗體；Genmab目前的抗CD20 HuMax-CD20、 US 5,500,362中描述的抗CD20抗體、AME隱133(Applied Molecular Evolution), hA20 (Immunomedics, Inc.) 、 HumaLYM(Intracel) 和 PRO70769 (PCT/US2003/040426，題為"免疫球蛋白變體及其用途")。靶向表皮生長(zhǎng)因 子受體家族成員，包括EGFR(ErbB-l)、 Her2/neu(ErbB-2)、 Her3(ErbB-3)、 Her4(ErbB-4)的大量抗體可以從本發(fā)明的Fc多肽得益。例如，本發(fā)明的Fc 多肽可以用于基本上與批準(zhǔn)用于治療乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗體曲妥 單抗(trastuzumab， Herceptin ， Genentech)(例如參見(jiàn)US 5,677,171 )相似的抗 體；Genentech目前的pertuzumab(rhuMab-2C4, Omnitarg ); US 4,753,894 中描述的抗-Her2抗體；在多種癌的臨床試驗(yàn)中使用的嵌合的抗EGFR抗體 西妥昔單抗(cetuximab, Erbitux , Imclone)(US4,943,533; PCT WO96/40210); Abgenix-Immunex-Amgen目前的ABX-EGF (US6,235,883); Genmab目前的 HuMax畫(huà)EGFr(USSN 10/172,317) ; 425 、 EMD55900 、 EMD62000和 EMD72000(Merck KGaA)(US 5,558,864; Murthy et al. 1987， Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4):315-20; Kettleborough et al.， 1991, Protein Eng. 4(7):773-83); ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO95/20045; Modjtahedi et al.， 1993, J. Cell Biophys. 1993， 22(l-3):129-46; Modjtahedi et al.， 1993, Br J Cancer. 1993， 67(2):247-53; Modjtahedi et al, 1996， Br J Cancer, 73(2):228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105(2):273畫(huà)80); TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba(US 5,891,996; US 6,506,883; Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1 ):71-81); an-Kettering) (Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44); KSB-102 (KS Biomedix); MRl-1 (IVAX, National Cancer Institute) (PCT WO 0162931A2)和SCI00 (Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fc多肽可以用于目前批準(zhǔn) 用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單克隆抗體阿侖單抗 (alemtuzumab, Campath , Millenium)。本發(fā)明的Fc多肽可以用于基本上與 其他臨床產(chǎn)物和候選物相似的多種抗體或Fc融合物，包括但不限于Ortho Biotech/Johnson&Johnson的抗CD3抗體莫羅單抗
(muromonab)-CD3(Orthoclone OKT3 )、 IDEC/Schering AG的抗CD20抗體 替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan, Zevalin )、 Celltech/Wyeth的抗CD33(p67 蛋白)4元體gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg⑧)、Biogen的4元LFA匿3 Fc融合 物alefacept (Amevive )、 Centocor Lilly的阿昔單抗(abciximab， ReoPro )、 Novartis的巴利昔單抗(basiliximab, Simulect )、 Medlmmune的帕利珠單抗 (palivizumab， Synagis )、 Centocor的4元TNFa ^t體英夫利昔單4元(infliximab， Remicade )、 Abbott的抗TNFa抗體阿達(dá)木單抗(adalimumab， Humira )、 Celltech的抗TNFa抗體HumicadeTM、 I腿unex/Amgen的抗TNFa Fc融合 物etanercept (Enbrel) )、 Abgenix的抗CD 147抗體ABX-CBL、 Abgenix的 抗IL8抗體ABX-IL8、 Abgenix的抗MUC18抗體ABX-MA1 、 Antisoma正 在的抗MUC1 Pemtumomab(R1549, 90Y-muHMFGl)、 Antisoma的抗MUC1 抗體Therex(R1550)、 Antisoma的AngioMab(AS1405)、 Antisoma的HuBC-1 、 Antisoma的Thioplatin(AS1407)、 Biogen的抗a-4-(3-l(VLA-4)和a-4-(3-7抗體 Antegren (那他珠單抗(natalizumab))、 Biogen的抗VLA-1整聯(lián)蛋白抗體 VLA-1 mAb、 Biogen的抗淋巴細(xì)胞毒素(3受體(LTBR)抗體LTBR mAb、 Cambridge Antibody Technology的抗TGF-卩2抗體CAT-152、 Cambridge Antibody Technology和Abbott的抗IL-12抗體J695、 Cambridge Antibody Technology和Genzyme的抗TGF卩1抗體CAT-192、 Cambridge Antibody Technology的抗嗜酸細(xì)胞活化趨化因子抗體CAT-213、 Cambridge Antibody Technology禾口 Human Genome Sciences Inc.6々4元Blys 4元體LymphoStat-BTM、 Cambridge Antibody Technology 和 Human Genome Sciences Inc.的抗 TRAIL-R1抗體TRAIL-RlmAb、 Genentech的抗VEGF抗體AvastinTM(^伐 單抗(bevacizumab)， rhuMAb-VEGF)、 Genentech的抗HER受體家族抗體、 Genentech的抗組織因子抗體抗組織因子(ATF)、 Genentech的抗IgE抗體 Xolair (Omalizumab) 、 Genentech 和 Xoma 的抗 CDlla抗體 RaptivaTM(Efalizumab)、 Genentech和Millenium Pharmaceuticals的MLN-02 抗體(以前的LDP-02)、 Genmab的抗CD4抗體HuMax CD4、 Genmab和 Amgen的4元IL15 4元體HuMax-IL15、 Genmab和Medarex的HuMax-Inflam、 Genmab禾口 Medarex和Oxford GcoSciences的4元類(lèi)肝素酶I 4元體HuMax-癌、 Genmab和Amgen的HuMax-淋巴瘤、Genmab的HuMax-TAC、 IDEC Pharmaceuticals的抗CD40L抗體IDEC-131、 IDEC Pharmaceuticals的抗
CD40L抗體IDEC-151(克立昔單抗(clenoliximab))、 IDEC Pharmaceuticals 的抗CD80抗體IDEC-114、IDEC Pharmaceuticals的抗CD23抗體IDEC-152、 IDEC Pharmaceuticals的抗巨噬細(xì)胞遷移因子(MIF)抗體、Imclone的抗獨(dú)特 型抗體BEC2 、 Imclone的抗KDR抗體IMC-1C11 、 Imclone的抗flk-1抗體 DC 101 、 Imclone的抗VE 4丐粘蛋白抗體、Immunomedics的抗癌胚抗原(CEA) 抗體 CEA-CideTM (labetuzumab) 、 Immunomedics 的抗 CD22 抗體 LymphoCideTM(依帕珠單4元(Epratuzumab))、 Immunomedics的AFP-Cide、 Immunomedics的MyelomaCide、 Immunomedics的LkoCide、 Immunomedics 的ProstaCide 、 Medarex的抗CTLA4抗體MDX-010 、 MDMedarex的抗CD3 0 抗體MDX-060、 Medarex的MDX-070、 Medarex的MDX-018、 Medarex和 Immuno-Designed Molecules的抗Her2抗體OsidemTM(IDM-1) 、 Medarex和 Genmab的抗CD4抗體HuMaxTM-CD4、 Medarex和Genmab的抗IL15抗體 HuMax-IL15、 Medarex和Centocor/J & J的抗TNFa抗體CNTO 148、 Centocor/J & J的抗細(xì)胞因子抗體CNTO 1275、 MorphoSys的抗在細(xì)胞間粘 附分子-l(ICAM-l)(CD54)抗體MORI01和MORI02、 MorphoSys的抗成纖 維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體3(FGFR-3)抗體MOR201 、Protein Design Labs的抗CD3 抗體Nuvion (visilizumab) 、 Protein Design Labs 的抗y 干擾素抗體 HuZAFTM、 Protein Design Labs的抗a5卩l(xiāng)整聯(lián)蛋白、Protein Design Labs 的抗IL-12 、 Xoma的抗Ep-CAM抗體ING-1 、 和Xoma的抗B2整聯(lián)蛋白 抗體MLNOl,本段中引用的所有文獻(xiàn)引入這里作為參考。
本發(fā)明Fc多肽可以整合到上述臨床候選物和產(chǎn)物中，或者整合到與他 們基本相似的抗體和Fc融合物中。本發(fā)明Fc多肽可以整合到上述臨床候 選物和產(chǎn)物的用某種其他方法人源化、親合成熟、加工或修飾的形式中。
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc多肽被用來(lái)治療自身免疫、炎性或移 植適應(yīng)癥。與這種疾病相關(guān)的耙抗原和臨床產(chǎn)物和候選物包括但不局限于 抗-a鄰7整聯(lián)蛋白抗體，例如LDP-02,抗p2整聯(lián)蛋白抗體，例如LDP-01 ，抗 補(bǔ)體(C5)抗體，例如5G1.1,抗CD2抗體，例如BTI-322, MEDI-507，抗 CD3抗體，例如OKT3, SMART抗CD3,抗CD4抗體，例如IDEC-151, MDX-CD4， OKT4A,抗CDlla抗體，抗CD14抗體，例如IC14,抗CD18 抗體，抗CD23抗體，例如IDEC 152,抗CD25抗體，例如Zenapax,抗 CD40L抗體，例如5c8， Antova， IDEC-131,抗CD64抗體，例如MDX-33,抗
CD80抗體，例如IDEC-114，抗CD147抗體，例如ABX-CBL,抗E-選擇素 抗體，例如CDP850,抗gpIIb/IIIa抗體，例如ReoPro/Abcixima，抗ICAM-3 抗體，例如ICM3,抗ICE抗體，例如VX-740,抗FcRl抗體，例如MDX-33， 抗IgE抗體，例如rhuMab-E25,抗IL-4抗體，例如SB-240683,抗IL-5抗 體，例如SB-240563， SCH55700,抗IL-8抗體，例如ABX-IL8，抗干擾素y 抗體，抗-TNF (TNF, TNFa， TNFa， TNF-a)抗體，例如CDP571, CDP870, D2E7，英夫利昔單抗，MAK-195F和VLA-4抗體，例如Antegren。
本發(fā)明的Fc變體，例如那些對(duì)FcRn的結(jié)合增強(qiáng)的變體可以用在TNF 抑制劑分子中以提供增強(qiáng)的特性。有用的TNF抑制劑分子包括在哺乳動(dòng)物 中抑制TNF-a作用的任何分子。適當(dāng)?shù)膶?shí)例包括Fc融合物Enbrel (etanercept)，抗體Humira⑧(阿達(dá)木單抗)和Remicade⑧(英夫利昔單抗)。利 用本發(fā)明的Fc變體加工以增加FcFn結(jié)合的單克隆抗體(例如Remicade和 Humira)可以通過(guò)延長(zhǎng)的半衰期轉(zhuǎn)變?yōu)樽詈玫墓πА?br> 在一些實(shí)施方案中，可以使用針對(duì)傳染性疾病的抗體。針對(duì)真核細(xì)胞 的抗體包括靶向酵母細(xì)胞的抗體，包括但不限于釀酒酵母OSacc/^ramyc&s erei^/ae)、多形漢森酵母(/7"rae"w/a po/;wo^ /2a)、脆壁克魯維酵母 (^7j(yv^Y 附7c&s戶(3g77/力和H酸克魯纟,酵母(A^./ac /力、/7c/z/a gw〃/en.附o"(iz.z.和
巴斯德畢赤酵母(/！ / OSton》、牙夏酒裂殖酵母(iSc/2/zasaCc/207-O附少C&S1 /70附6e)、
惡'l"生疾原、蟲(chóng)(p/osmoWww力/c^ ahww)和解月旨耶氏酵母(l^/row/a /z) o/j"ca)。
針對(duì)其他真菌細(xì)胞的抗體也是有用的，包括與包含光滑假絲酵母 (Gaw//<ia g/a6rato)、白色念珠菌(C. a/Z)/c<ms)、克柔氏念珠菌(C. ^ra化/)、葡萄 牙念珠菌(C. /^/tom'ae)和麥芽糖假絲酵母(C. wa/tosa)的念珠菌屬菌林，以及 曲霉(Js/ erg/〃w"、隱球菌屬(O少ptococcw"、組織胞漿菌屬(T^to; /asma)、 主求孑包子菌屬(Cbcc/(i/o/(i&s)、芽生菌(5/a^o附;/ces)和青霉菌(尸ew.c/〃/w附)的菌種 有關(guān)的靶抗原。
針對(duì)與原生動(dòng)物有關(guān)的靶抗原的抗體包括，但不局限于與錐蟲(chóng)屬 (7>_y; a"asoma)、 包4舌;f土氏矛H十曼原蟲(chóng)(Uowovam'/)的利4十曼蟲(chóng)(丄e/s/7ma"/a) 種、癡原、蟲(chóng)種(尸/osmo^wm s/ / .)、卡氏月申嚢蟲(chóng)(/V^wmoc^st^ can'"/z') 、 'J 、 3求隱 孑包子蟲(chóng)(CV7/ to5/ orWwm / arram)、蘭氏賈第鞭毛蟲(chóng)(G7ani/a /awWa)、溶組織 內(nèi)阿米巴(五"tomoe6a /^to(y"ca)和圓孑包子蟲(chóng)(Cyc/twpora cajetawera/s)有關(guān)的 抗體。
針對(duì)原核生物抗原的抗體也是有用的，包括針對(duì)適當(dāng)?shù)募?xì)菌，例如致 病和不致病原核生物的抗體，其中致病和不致病原核生物包括但不限于芽
孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽桿菌(5.朋Arac/》；弧菌屬(Vibrio)，例如霍亂 弧菌(K c/zo/erae);埃希氏菌屬(Escherichia),例如腸產(chǎn)毒性大腸桿菌 (Enterotoxigenic ;志賀氏菌屬(Shigella)、例如痢疾志賀氏菌(S.
辦化"&n'"e);沙門(mén)氏菌屬(Salmonella),例如傷寒沙門(mén)氏菌(S, (Kp/n');分枝桿 菌屬(Mycobacterium),例如結(jié)核分枝詳干菌(M. /w6e/rw/a^)、麻風(fēng)分枝桿菌(M /印rae)/梭菌屬(Clostridium)，例如肉毒梭菌(C. 、破傷風(fēng)梭菌(C.
^tom')、艱難梭菌(C. 4^7"7e)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(C.p^/h'"gms);棒狀桿菌屬 (Cornyebacterium)，例Jt口白p娛4干菌(C. (iz) /2f/2en'ae);鏈3求菌屬(Streptococcus), 膿鏈球菌/5y0ge"e力、月申炎鏈球菌(51. / wewwom'ae); 葡萄球菌屬 (Staphylococcus), 例如金黃色葡萄球菌(5*. aM w力；嗜血桿菌屬 (Haemophilus)，例如流感嗜血桿菌(77. /"/7we"zae); 奈瑟氏菌屬(Neisseria)， 例如腦月莫炎奈奈瑟菌(TV. 、淋病奈瑟菌go"o玎/zoeae);耶爾森
氏菌屬(Yersinia)，例如賈第鞭毛蟲(chóng)耶爾森氏菌(7/amMa)、鼠疫耶爾森氏菌 (K; es他,)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如銅綠假單胞菌CR aerag/"osa)、 惡臭假單胞菌(戶pz^Wa);衣原體(Chlamydia),例如沙眼衣原體(C /rac/zow加》；博德特氏菌屬(Bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(及 / eWas57'力；牙每毒蟲(chóng)累i走體(Treponema), <列長(zhǎng)口才每毒蟲(chóng)茅J走體(!T pa〃a&ww); 5. aw/Zwac/s 、布魯氏才干菌(5n/ce〃a 5^/ .)、 F /w/arews/s 、 5. wa〃e/、 5.;wew(iom"〃e/、 沙門(mén)氏菌CSa/wowe〃a^; .)、 SEBV.霍亂毒素B、大腸桿菌0157:H7、李斯特 菌(ZiWen'a spp.)、 白色毛孑包子菌(7Hc/20sporaw 6e/ge///)、纟工酵母(i /zoiioton/A3 s/7e"'^s)、 異常漢遜氏酵母(Z/imye"w/a ""o,/a)、 腸軒菌(五她ra6(3"er ■ / .)、 克雷伯氏桿菌(A7eZwW/a ^.)、李斯特菌(丄Men'a sp.)、支原體(Myco/ /"; m(3 s/ .) 等等。
在一些方案中，抗體針對(duì)病毒感染；這些病毒包括，但不局限于包括 正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如呼吸道合月包病毒(respiratory syncytial vims)、 腿腺炎病毒(mumps virus)、麻滲病毒(measles virus))、 腺病 毒、鼻病毒(rhinovims)、 冠狀病毒(coronavirus)、 呼腸病毒(reovirus)、才皮月莫 病毒(togavirus)(如J 3口風(fēng)滲病毒(rubella virus))、纟田小病毒(parvovirus)、痘病毒 (例^口類(lèi)天花病毒(variola virus)、痘苗病毒(vaccinia virus))、腸道病毒(例^口脊髓灰質(zhì)炎病毒(poliovims)、柯薩奇病毒(coxsackievirus))、肝炎病毒(包括曱、 乙和丙型)、皰滲病毒(例如單純皰瘆病毒、水痘-帶狀皰滲病毒 (varicella-zoster virus)、 巨細(xì)月包病毒、EB病毒)、4侖^l犬病毒、i若瓦克病毒 (Norwalk vims)、 漢坦病毒(hantavirus)、 沙粒病毒(arenavirus)、 棒狀病毒 (rhabdovirus)(例如狂犬病病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括艾滋病病毒、HTLV-I和 -II)、 乳多空病毒(papovavirus)(例如乳頭瘤病毒(papillomavims))、 多瘤病毒 (polyomavirus)和纟田小核糖核酸病毒(picornavirus)等等。 優(yōu)化的IgG變體特性
本申請(qǐng)也提供了多種治療相關(guān)特性被優(yōu)化的IgG變體。被加工或預(yù)計(jì) 顯示出一種或多種優(yōu)化特性的IgG變體在這里被稱(chēng)為"優(yōu)化的IgG變體"?？?以被優(yōu)化的最優(yōu)選的特性包括，但不局限于對(duì)FcRn的親和力增強(qiáng)或降低和 體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)或降低。適當(dāng)?shù)膶?shí)施方式包括在較低的pH，例如與內(nèi)體有 關(guān)的pH，例如pH 6.0時(shí)顯示出對(duì)FcRn的結(jié)合親和力增加，而在更高的pH， 例如7.4時(shí)不顯示出相應(yīng)的增高的結(jié)合親和力以允許內(nèi)體吸收增加，同時(shí)保 持正常的釋放速率。同樣，F(xiàn)cRn結(jié)合被調(diào)節(jié)的這些抗體可以隨意地具有其 他合乎需要的特性，例如經(jīng)調(diào)節(jié)的FcyR結(jié)合，如U.S.S.N.sl 1/174,287, 11/124,640, 10/822,231, 10/672,280， 10/379,392和2005年10月21日提交的 標(biāo)題為具有優(yōu)化的效應(yīng)器功能的IgG免疫球蛋白變體的申請(qǐng)?zhí)枮閚o.
_的專(zhuān)利申請(qǐng)所列出的其他特性。也就是說(shuō)，優(yōu)化特性也包括，
但不局限于對(duì)FqR的親和力增強(qiáng)或降低。在一個(gè)隨意的實(shí)施方式中，可以 優(yōu)化IgG變體使其對(duì)人激活FqR具有增強(qiáng)的親和力，除FcRn結(jié)合譜之外， 還優(yōu)選對(duì)FcYRIIIa具有增強(qiáng)的親和力。在另 一 隨意的可替換的實(shí)施方案中， 可以優(yōu)化IgG變體使其對(duì)人抑制性受體FcyRIIb具有降低的親和力。也就是 說(shuō)，具體實(shí)施方式
包括利用對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出增加和對(duì)FcyRIIIa的結(jié)合 顯示出增加的抗體。其他的實(shí)施方式利用了對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出增加和對(duì) FcyRIIIa的結(jié)合顯示出增加的抗體的用途。預(yù)期這些實(shí)施例可以提供在人中 具有增強(qiáng)的治療特性，例如具有增強(qiáng)的效應(yīng)器功能和更高的抗癌效能的IgG 多肽。在可選擇的實(shí)施方式中，可以優(yōu)化IgG變體使其具有增加或降低的 FcRn親和力，以及增加或降低的人Fc丫R,包括但不限于Fc丫RI、 FcyRIIa、 FcyRIIb、 FcyRIIc、 FcyRIIIa和包括他們的等位基因變異的FcyRIIIb親和力。 預(yù)期這些實(shí)施例可以提供在人中具有增強(qiáng)的治療特性，例如具有延長(zhǎng)的血
清半衰期和降低的效應(yīng)器功能的IgG多肽。在其他實(shí)施方式中，IgG變體提
供了增強(qiáng)的FcRn親和力，以及增強(qiáng)的一種或多種FqRs親和力，但對(duì)一種 或多種其他FcyRs的親和力降低。例如IgG變體對(duì)FcRn和FcyRIIIa的結(jié) 合可以增強(qiáng)，但對(duì)FcyRIIb的結(jié)合降低?；蛘?，IgG變體對(duì)FcRn和FcryR的 結(jié)合可以降低。在另一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體具有降低的FcRn親和力， 以及增強(qiáng)的FcyRIIb親和力，但對(duì)一種或多種激活FcyRs的親和力降低。在 另一實(shí)施方式中，IgG變體具有延長(zhǎng)的血清半衰期和降低的效應(yīng)器功能。
優(yōu)選實(shí)施方案包括優(yōu)化對(duì)人FcRn和FcyR的結(jié)合，但是在可選擇的實(shí) 施方案中，IgG變體對(duì)來(lái)自非人類(lèi)生物體，包括但不限于嚙齒類(lèi)動(dòng)物和非人 靈長(zhǎng)目動(dòng)物的FcRn和FqR具有增強(qiáng)或降低的親和力。對(duì)非人類(lèi)FcRn的結(jié) 合被優(yōu)化的IgG變體可以用于實(shí)驗(yàn)中。例如可以獲得能測(cè)試給定藥物候 選者的特性，例如功效、毒性和藥物動(dòng)力學(xué)的多種疾病的小白鼠模型?？?以通過(guò)稱(chēng)為異種移植的方法將癌細(xì)胞移植或注入到小白鼠中以模仿人類(lèi)癌 癥，這一點(diǎn)本領(lǐng)域已經(jīng)已知。對(duì)IgG變體的測(cè)試可以提供關(guān)于蛋白清除特 性、它的清除機(jī)制等有價(jià)值的信息，其中IgG變體包括對(duì)FcRn的結(jié)合被優(yōu) 化的IgG變體。也可以優(yōu)化IgG變體以使其在非糖基化(aglycosylated)形式 中具有增強(qiáng)的功能性和/或溶解特性。Fc配體包括，但不局限于FcRii、FcyRs、 Clq和蛋白A和G,而且可以來(lái)自任何來(lái)源，包括但不限于人、小白鼠、 大鼠、兔子或猴，優(yōu)選人。在可選擇的優(yōu)選實(shí)施方案中，可以優(yōu)化IgG變 體使其比親代IgG變體的非糖基化形式更穩(wěn)定和/或更可溶。
IgG變體可以包括調(diào)節(jié)與除FcRn和FcyRs以外的Fc配體，包括但不限 于補(bǔ)體蛋白和Fc受體同系物(FcRHs)的相互作用的修飾。FcRHs包括但不局 限于FcRHl、 FcRH2、 FcRH3、 FcRH4、 FcRH5和FcRH6(Davis et al.， 2002, Immunol. Reviews 190:123-136,全部引入作為參考)。
優(yōu)先地，IgG變體的Fc配體特異性將決定它的治療應(yīng)用。給定IgG變 體用于治療目的將取決于靶抗原的表位或形式，以及待治療的疾病或適應(yīng) 癥。對(duì)大多數(shù)靶和適應(yīng)癥來(lái)說(shuō)，增強(qiáng)的FcRn結(jié)合可是更優(yōu)選的，因?yàn)樵鰪?qiáng) 的FcRn結(jié)合可以導(dǎo)致血清半衰期延長(zhǎng)。較長(zhǎng)的血清半衰期允許治療時(shí)以較 低的頻率和劑量給藥。為了使需要重復(fù)給藥的適應(yīng)癥作出反應(yīng)而施用該治 療劑時(shí)，這種特性可是特別優(yōu)選的。對(duì)一些靶和適應(yīng)癥來(lái)說(shuō)，當(dāng)需要變體 Fc具有增加的清除或降低的血清半衰期時(shí)，例如當(dāng)Fc多肽用作顯象劑或》文 是特別優(yōu)選的。
可以使用包含提供了增強(qiáng)的FcRn親和力，增強(qiáng)的激活FqRs親和力和 /或降低的抑制性FcyRs親和力的IgG變體的IgG變體。對(duì)一些靶和適應(yīng)癥 來(lái)說(shuō)，使用對(duì)不同激活FcyRs提供了差異選擇性的IgG變體可是更有利的； 例如有時(shí)可需要對(duì)FcyRIIa和FcyRIIIa ，而不是FcyRI的結(jié)合增強(qiáng)，而在 其它情況下，僅僅只有對(duì)FcYRIIa的結(jié)合增強(qiáng)可是優(yōu)選的。對(duì)某些靶和適應(yīng) 癥來(lái)說(shuō)，利用改變了 FcRn結(jié)合和增強(qiáng)了 FcyR介導(dǎo)的效應(yīng)器功能和補(bǔ)體介 導(dǎo)的效應(yīng)器功能的IgG變體可是優(yōu)選的，但在其他情況下，利用FcRn結(jié)合 增強(qiáng)或血清半衰期延長(zhǎng)，以及Fc^R介導(dǎo)的效應(yīng)器功能或補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng)器 功能增強(qiáng)的IgG變體可是有利的。對(duì)一些靶或癌癥適應(yīng)癥來(lái)說(shuō)，降低或消 除一種或多種效應(yīng)器功能，例如通過(guò)敲除對(duì)Clq、 一種或多種FcyR、 FcRn 或一種或多種其他Fc配體的結(jié)合可是有利的。對(duì)其他靶或適應(yīng)癥來(lái)說(shuō)，利 用對(duì)抑制性FcyRIIb的結(jié)合增加，但對(duì)激活FcyRs的結(jié)合為WT水平，降低 或消除的IgG變體可是優(yōu)選的。例如，當(dāng)IgG變體的目的是抑制炎癥或自 身免疫病，或在某些方面調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)時(shí)，這種IgG變體可是特別有用的。 因?yàn)樽陨砻庖呒膊⊥ǔ３掷m(xù)時(shí)間久，而且需要重復(fù)給藥進(jìn)行治療，用對(duì)FcRn 的結(jié)合增加的具有延長(zhǎng)的半衰期的Fc變體對(duì)他們進(jìn)行治療是特別優(yōu)選的。
修飾可以改善IgG穩(wěn)定性、可溶性、功能或臨床用途。在優(yōu)選實(shí)施方 案中，IgG變體可以包含減少在人體內(nèi)的免疫原性的修飾。在最優(yōu)選的實(shí)施 方案中，利用完全引入作為參考的USSN 11/004,590描述的方法降低了 IgG 變體的免疫原性。在可選擇的實(shí)施方案中，IgG變體是人源化的(Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402，完全引入作為參考)。
IgG變體可以包含降低免疫原性的修飾。降低免疫原性的修飾包括降低 來(lái)源于親代序列的經(jīng)過(guò)處理的肽對(duì)MHC蛋白的結(jié)合的修飾。例如可以設(shè) 計(jì)氨基酸修飾使沒(méi)有或有最少數(shù)量的免疫表位，其中免疫表位預(yù)計(jì)會(huì)以高 親和力結(jié)合任何普遍的MHC等位基因。鑒定蛋白序列中MHC結(jié)合表位的 幾種方法本領(lǐng)域已經(jīng)已知，而且可以用來(lái)對(duì)IgG變體中的表位進(jìn)行評(píng)分。 列如，參見(jiàn)WO 98/52976; WO 02/079232; WO 00/3317; USSN 09/903,378; USSN 10/039,170; USSN 60/222,697; USSN諮54,296; PCT WO 01/21823; 和PCT WO 02/00165; Mallios, 1999, Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001， Bioinformatics 17: 942-948; St畫(huà)iolo et al., 1999, Nature Biotech. 17:
555-561; WO 98/59244; WO 02/069232; WO 02/77187; Marshall et al.， 1995, J, Immunol. 154: 5927-5933和Hammer et al., 1994， J. Exp. Med. 180: 2353-2358,都全部引入作為參考?；谛蛄械男畔⒖捎糜诖_定給定肽-MHC 相互作用的結(jié)合得分(例如，參見(jiàn)Mallios， 1999， Bioinformatics 15: 432-439; Mallios, 2001, Bioinformatics 17: p942畫(huà)948; Stumiolo et. al., 1999, Nature Biotech. 17: 555-561，都全部引入作為參考)。 加工的lgG變體
可以通過(guò)多種方式設(shè)計(jì)本發(fā)明的變體。本文所述變體可以是插入、缺 失、替換、其他的修飾，或這些及其他改變的組合。本發(fā)明的特別新的實(shí) 施方案是設(shè)計(jì)改善或降低Fc多肽對(duì)Fc配體的結(jié)合的插入和缺失。正象這 里所公開(kāi)的那樣，可以實(shí)施增加或降低Fc多肽對(duì)FcRn的親和力的插入或 缺失?？梢酝ㄟ^(guò)合理的方法，或者通過(guò)包括用途或隨機(jī)分量的方法，例如 隨機(jī)或半隨機(jī)庫(kù)建立或篩選設(shè)計(jì)插入和缺失。在可選擇的實(shí)施方式中，公 開(kāi)了增加或降低Fc多肽對(duì)FcRn的親和力的替換。
插入和缺失
用變體氨基酸代替Fc多肽上某位點(diǎn)的親代氨基酸可以創(chuàng)造制備Fc多 肽變體。通過(guò)將Fc多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換成變體氨基酸，可以改 變那些位點(diǎn)的側(cè)鏈。大多數(shù)有用的替換通過(guò)改變Fc側(cè)鏈修飾Fc特性。替 換的側(cè)鏈可以直接或間接地與Fc結(jié)合配偶體作用，其中Fc結(jié)合配偶體與 Fc功能或特性相關(guān)。至少一個(gè)替換改變了親代Fc多肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈的 共價(jià)結(jié)構(gòu)。
或者，改變親代Fc多肽骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)可以創(chuàng)造制備出Fc多肽變體。 蛋白中的骨架原子有肽氮、a碳、羰基或肽碳和羰基氧。改變骨架的共價(jià)結(jié) 構(gòu)提供了附加的改變Fc多肽特性的方法。通過(guò)添加原子到骨架中，例如插 入一個(gè)或多個(gè)氨基酸、或從骨架中除去原子，例如刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸 可以改變Fc骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)。通過(guò)將骨架的單個(gè)原子變?yōu)槠渌右部梢?改變骨架的共 <介結(jié)構(gòu)(Deechongkit et al., J Am Chem Soc. 2004. 126(51):l6762-71 ，全部引入作為參考)。通過(guò)插入或刪除編碼Fc多肽的DNA 中的對(duì)應(yīng)核苷酸，可以實(shí)施在Fc多肽中插入或缺失氨基酸，這一點(diǎn)本領(lǐng)域 已經(jīng)已知，在這里也進(jìn)行了說(shuō)明?；蛘?，可以在合成Fc多肽期間實(shí)現(xiàn)氨基 酸的插入或缺失，這一點(diǎn)本領(lǐng)域已經(jīng)已知。
通過(guò)考慮FC多肽和它的結(jié)合配偶體的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)插入或缺
失氨基酸的設(shè)計(jì)過(guò)程，其中插入或缺失氨基酸會(huì)改變Fc多肽與一種或多種 結(jié)合配偶體(例如FcyR's、 FcRn、 Clq)的相互作用。在優(yōu)選程度較低的實(shí)施 方案中，通過(guò)考慮Fc多肽的結(jié)構(gòu)和參與與結(jié)合配偶體的結(jié)合的Fc區(qū)域的 信息可以完成設(shè)計(jì)。通過(guò)誘變實(shí)驗(yàn)、噬菌體展示實(shí)驗(yàn)、同源性比較、計(jì)算 機(jī)模型或其他方式可以獲得這些信息。
氨基酸序列中影響Fc結(jié)合相互作用，但不影響Fc多肽的整體結(jié)構(gòu)、 穩(wěn)定性、表達(dá)或用途的插入或缺失優(yōu)選位置位于參與Fc/Fc結(jié)合配偶體相互 作用的環(huán)內(nèi)。為了改變Fc多肽對(duì)FcRn的結(jié)合，位點(diǎn)244-257、 279-284、 307-317、383-390和428-435是插入或缺失的優(yōu)選環(huán)位置(編號(hào)來(lái)自EU index of Kabat et al" Bu畫(huà)ister et al" 1994, Nature, 372:379-383; Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877,全部引入作為參考)。為了改變Fc多肽對(duì)Fey受體的結(jié) 合，位點(diǎn)229-239、 266-273、 294-299和324-331是插入或缺失的優(yōu)選環(huán)位 置(編號(hào)來(lái)自EU index of Kabat et al" PDB code lE4K.pdb Sond飄ann et al. Nature. 2000406:267，全部引入作為參考)。環(huán)是不涉及a螺旋或|3片層結(jié) 構(gòu)的多肽區(qū)域。環(huán)位點(diǎn)是不在a螺旋或(3片層中的位點(diǎn)(van Holde， Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall， New Jersey 1998, Chapter 1 pp2-67，全部引入作為參考)。環(huán)位點(diǎn)是優(yōu)選的，因?yàn)榕ca螺旋和 P片層的骨架原子相比，該骨架原子通常更容易彎曲，而且參與氫鍵的可性 更小。因此，插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸導(dǎo)致環(huán)延長(zhǎng)或縮短很少會(huì)導(dǎo)致 Fc多肽發(fā)生大的破裂性變化，包括穩(wěn)定性、表達(dá)或其他問(wèn)題。
插入和缺失可以用來(lái)改變多肽的長(zhǎng)度。例如在環(huán)區(qū)域中，改變環(huán)的 長(zhǎng)度會(huì)導(dǎo)致環(huán)的屈曲性和構(gòu)象熵發(fā)生改變。環(huán)中的插入通常會(huì)增加環(huán)的構(gòu) 象熵，構(gòu)象熵被定義為乘以可構(gòu)象數(shù)目的自然對(duì)數(shù)的波耳茲曼常數(shù) (Boltzman ' s constant)(van Holde， Johnson and Ho. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998, pp78,都全部引入作為參考)。 將至少 一 個(gè)氨基酸插入到多肽中，可以使多肽可獲得的構(gòu)象的總數(shù)增加。 這些附加的構(gòu)象可對(duì)形成有利的Fc/Fc-結(jié)合配偶體相互作用有好處，因?yàn)?Fc多肽在結(jié)合Fc-結(jié)合蛋白時(shí)可以利用附加構(gòu)象中的一種。在這種情況下， 插入可以產(chǎn)生更強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果附加的構(gòu)象沒(méi)有用于 結(jié)合界面，那么插入可導(dǎo)致更弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)楦郊拥?br> 構(gòu)象將與有結(jié)合能力的構(gòu)象竟?fàn)帯Ｍ瑯?，多肽片段的缺失也可以產(chǎn)生更強(qiáng) 或更弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果降低骨架構(gòu)象可數(shù)目的片段缺失 消除了有結(jié)合能力的構(gòu)象，那么缺失可以產(chǎn)生更弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互 作用。如果缺失沒(méi)有消除有結(jié)合能力的構(gòu)象，那么缺失可以產(chǎn)生更強(qiáng)的Fc/Fc 結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)槿笔Э梢猿ヅc有結(jié)合能力的構(gòu)象竟?fàn)幍臉?gòu)象。
插入和缺失可以用來(lái)改變Fc多肽中氨基酸的的位置與方向。因?yàn)椴迦?和缺失導(dǎo)致骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，因此他們必然會(huì)引起骨架原子位點(diǎn) 的變化。圖7比較了三個(gè)不同骨架中標(biāo)記為L(zhǎng)l-L4的一些環(huán)片段上的骨架 位點(diǎn)。參考的骨架結(jié)構(gòu)包含四個(gè)環(huán)節(jié)段，缺失骨架缺乏節(jié)段L1，插入節(jié)段 在節(jié)段L1之前，即節(jié)段L1的N-末端包含附加的節(jié)段。缺失和插入會(huì)導(dǎo)致 靠近插入或缺失位點(diǎn)的骨架結(jié)構(gòu)發(fā)生最大的變化。刪除靠近環(huán)N-末端的節(jié) 段，例如節(jié)段L1，環(huán)可以縮短，剩余的節(jié)段會(huì)改變他們靠近環(huán)N末端的位 置。這會(huì)產(chǎn)生朝著L1節(jié)段在前位點(diǎn)和環(huán)N末端方向移動(dòng)L2節(jié)段的影響。 當(dāng)初始信息表明位于L2的氨基酸位于Ll時(shí)能與Fc結(jié)合配偶體產(chǎn)生有利的 相互作用時(shí)，L2節(jié)段位點(diǎn)朝著Ll節(jié)段方向的變化可以增強(qiáng)Fc/Fc結(jié)合配偶 體復(fù)合物的結(jié)合，因此也是優(yōu)選的。例如如果L2包含丙氨酸和酪氨酸， 那么以前的兩個(gè)Ll氨基酸替換成丙氨酸和酪氨酸將導(dǎo)致Fc變體結(jié)合增加， 因此缺失Ll可以產(chǎn)生對(duì)Fc結(jié)合配偶體的親和力增加的Fc變體。
同樣，在環(huán)的N-末端側(cè)將多肽節(jié)段插入Fc多肽會(huì)導(dǎo)致環(huán)節(jié)段的位點(diǎn)朝 著環(huán)C末端側(cè)的方向改變。圖7中，在節(jié)段L1之前，即節(jié)段L1的N末端 插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸會(huì)改變骨架構(gòu)象，其中骨架構(gòu)象包括L1節(jié)段朝著環(huán) C末端的方向改變。當(dāng)已知位于節(jié)段Ll的氨基酸位于L2位點(diǎn)時(shí)能產(chǎn)生有 利的相互作用時(shí)，這類(lèi)插入是優(yōu)選的，因?yàn)椴迦肟梢援a(chǎn)生更強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合 配偶體相互作用。如果想要較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，那么插入可 以用來(lái)將不利的氨基酸移動(dòng)到新位點(diǎn)。插入、刪除和參考節(jié)段(圖7中的Ll 到L4)可以是Fc多肽中多于一個(gè)氨基酸的一個(gè)或多個(gè)節(jié)段。
或者，可以以類(lèi)似于環(huán)N-末端插入或缺失的方式，在環(huán)的C末端利用 插入或缺失。環(huán)C末端的插入可以導(dǎo)致插入N-末端的位點(diǎn)朝著環(huán)N末端的 方向運(yùn)動(dòng)。環(huán)C末端的缺失可以導(dǎo)致缺失的N-末端的位點(diǎn)朝著環(huán)C末端的 方向運(yùn)動(dòng)?；谖挥诃h(huán)中的氨基酸、想要增加或降低Fc/Fc-結(jié)合配偶體親和 力的渴望和想要的位置改變，選擇利用環(huán)N-末端或C末端的插入或缺失。
插入或缺失可以用于Fc多肽的任何區(qū)域，包括環(huán)、a螺旋和P片層區(qū) 域。插入和缺失的優(yōu)選位置包括不是oc螺旋或(3片層區(qū)域的環(huán)區(qū)域。環(huán)是 優(yōu)選的，因?yàn)樗麄兺ǔ１萢螺旋或(3片層能更好地接受骨架中的改變。產(chǎn) 生更強(qiáng)蛋白/蛋白相互作用的特別優(yōu)選的插入或缺失位置是環(huán)的N-末端或C 末端邊緣。如果環(huán)的側(cè)鏈參與Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，那么邊緣的插入 或缺失很少會(huì)導(dǎo)致結(jié)合相互作用發(fā)生強(qiáng)烈的有害變化。環(huán)正中的缺失很可 會(huì)除去Fc/Fc結(jié)合配偶體界面中重要的殘基，環(huán)正中的插入很可會(huì)在Fc/Fc 結(jié)合配偶體界面產(chǎn)生不利的相互作用。通過(guò)骨架改變的容量可以確定刪除 或插入的殘基數(shù)目，插入或缺失15個(gè)或更少殘基是優(yōu)選的，插入或缺失10 個(gè)或更少殘基是更優(yōu)選的，插入或缺失5個(gè)或更少殘基是最優(yōu)選的。
一旦設(shè)計(jì)了 Fc缺失變體的位置和大小，就可以完全確定全部多肽序列， 通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法可以構(gòu)建該多肽。
但是，F(xiàn)c插入變體具有設(shè)計(jì)至少一個(gè)被插入氨基酸的序列的附加步驟。 在Fc多肽中預(yù)期將被暴露的位點(diǎn)插入極性殘基，包括Ser、 Thr、 Asn、 Gln、 Ala、 Gly、 His是優(yōu)選的。較小的氨基酸，包括Ser、 Thr和Ala是特別優(yōu)選 的，因?yàn)槌叽缧『苌贂?huì)在空間上干擾Fc/Fc結(jié)合配偶體的相互作用。Ser和 Thr也具有與Fc結(jié)合配偶體上的原子形成氫鍵的能力。
插入物也可以具有增加的屈曲性，當(dāng)希望Fc/Fc結(jié)合配偶體的結(jié)合更強(qiáng) 時(shí)，插入的多肽被設(shè)計(jì)成與Fc結(jié)合配偶體產(chǎn)生有利相互作用的形式將是合 乎需要的。通過(guò)構(gòu)建變體骨架與一般簡(jiǎn)單的待插入序列的模型可以確定骨 架插入物的長(zhǎng)度。例如可以構(gòu)建不同長(zhǎng)度的聚絲氨酸、聚甘氨酸或聚丙 氨酸插入物，并將其模型化。通過(guò)多種方法，包括基于包含插入物的同系 物的已知的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行的同源模型構(gòu)建、包括都全部引入作為參考的 MODELLER(M.A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29, 291-325, 2000)和ROSETTA(Kuhlman et al. (2003). Science 302, 1364-8)的 計(jì)算機(jī)模型構(gòu)建可以實(shí)施建模過(guò)程。通常，開(kāi)始先產(chǎn)生各種骨架構(gòu)象，然 后在確定側(cè)鏈的同一性之后再確定最后的骨架結(jié)構(gòu)。可以通過(guò)PDA⑧算法 (US 6,188,965; 6,269,312; 6,403,312; 6，801，861; 6,804,611; 6,792,356, 6，950，754和USSN 09〃82，004; 09/927,790; 10/101,499; 10/666,307; 10/666311; 10/218,102，都全部引入作為參考)設(shè)計(jì)側(cè)鏈。
可以通過(guò)本文所述方法設(shè)計(jì)除Fc多肽之外的任何多肽的插入和缺失。
例如借助于APRIL三維結(jié)構(gòu)的幫助可以在TNF超家族成員APRIL中設(shè) 計(jì)插入或缺失(DB code lXUl.pdb, Hymowitz， et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:7218，全部引入作為參考)?？梢栽O(shè)計(jì)插入或缺失以增加APRIL對(duì)它的 受體TACI的結(jié)合。作為插入或缺失位點(diǎn)的優(yōu)選的環(huán)殘基有殘基 Serll8-Va1124、 Aspl64-Phe167、 Prol92畫(huà)Ala198、 Pro221-Lys226。這些環(huán)與 APRIL/TACI復(fù)合物中的TACI相互作用并介導(dǎo)結(jié)合。 整合多肽的變體
IgG變體可以基于人IgG序列，因此人IgG序列可以用作其他序列與之 比較的"基礎(chǔ)"序列，其他序列包括但不限于來(lái)自其他生物體的序列，例如嚙 齒類(lèi)動(dòng)物和靈長(zhǎng)目動(dòng)物的序列。IgG變體也可以包含來(lái)自其他免疫球蛋白 類(lèi)，例如IgA、 IgE、 IgD、 IgM等等的序列。注意到雖然是在一個(gè)親代IgG 背景中加工設(shè)計(jì)IgG變體，但也可以在另外的第二親代IgG背景中設(shè)計(jì)變 體，或者將變體"轉(zhuǎn)移"到另外的第二親代IgG背景中。通常，以IgGs序列 之間的序列或結(jié)構(gòu)同源性為基礎(chǔ)，通過(guò)確定第一和第二 IgG之間"同等"或" 對(duì)應(yīng)"的殘基和替換可以實(shí)現(xiàn)這一 目的?？梢灾苯訉⑦@里列出的第一 IgG的 氨基酸序列與第二 IgG的序列相比較以確定同源性。在利用本領(lǐng)域已知的 一個(gè)或多個(gè)同源性比對(duì)程序(例如，利用物種之間的保守殘基)比對(duì)序列之 后，可以限定第一個(gè)IgG變體的一級(jí)序列中相當(dāng)于特殊氨基酸的殘基，其 中比對(duì)時(shí)為了維持配對(duì)考慮了必需的插入和缺失(即避免通過(guò)任意的缺失和 插入消除保守殘基)。保守殘基的比對(duì)應(yīng)該保全100%的這種殘基。但是，保 守殘基大于75%或低至50%的配對(duì)也足以限定同等殘基。通過(guò)確定第一和 第二 IgG結(jié)構(gòu)上的同源性也可以限定同等殘基，其中結(jié)構(gòu)同源性是結(jié)構(gòu)已 經(jīng)確定的IgGs的三級(jí)結(jié)構(gòu)水平的同源性。在這種情況下，同等殘基被定義 為比對(duì)后，親代或前體的特殊氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)主鏈原子的原子坐 標(biāo)(N上的N、 CA上的CA、 C上的C和O上的O)在0.13nm的區(qū)域之內(nèi)， 優(yōu)選在O.l nm的區(qū)域之內(nèi)的那些殘基。在已經(jīng)定向和定位最好的模型蛋白 使非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)出現(xiàn)最大重疊之后，可以實(shí)現(xiàn)比對(duì)。無(wú)論怎樣 確定同等或?qū)?yīng)的殘基，無(wú)論產(chǎn)生IgGs的親代IgG的同一性是多少，所要 傳達(dá)的意思是發(fā)現(xiàn)的IgG變體可以加工成與IgG變體具有顯著的序列或結(jié) 構(gòu)同源性的任何第二親IgG。因此，如果通過(guò)利用如上所述的方法或其他 確定同等殘基的方法產(chǎn)生了其中親代抗體是人IgGl的變體抗體，那么可以 在結(jié)合不同抗原的另一個(gè)IgGl親代抗體、人IgG2親代抗體、人IgA親代 抗體、小白鼠IgG2a或IgG2b親代抗體等等中加工變體抗體。如上所述， 親代IgG變體的背景不影響轉(zhuǎn)移IgG變體到其他親代IgGs的能力。
提供了加工、生產(chǎn)和篩選IgG變體的方法。所描述的方法無(wú)意限制于 任何具體應(yīng)用或操作理論。相反，提供的方法通常是用于舉例說(shuō)明可以用 實(shí)驗(yàn)方法加工、生產(chǎn)和篩選一個(gè)或多個(gè)IgG變體以獲得具有優(yōu)化的效應(yīng)器 功能的IgG變體。在都全部引入作為參考的USSN 10/754,296和USSN 10/672,280中描述了設(shè)計(jì)、生產(chǎn)和測(cè)試抗體和蛋白變體的多種方法。
多種蛋白工程方法可以用來(lái)設(shè)計(jì)具有優(yōu)化的效應(yīng)器功能的IgG變體。 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用基于結(jié)構(gòu)的加工操縱方法，在該方法中可得 到的結(jié)構(gòu)信息可用來(lái)指導(dǎo)替換、插入或缺失。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以使 用計(jì)算機(jī)操作的篩選法，其中以計(jì)算機(jī)操作計(jì)算的能量適應(yīng)性為基礎(chǔ)設(shè)計(jì) 替換。例如，參見(jiàn)USSN 10/754,296和USSN 10/672,280，以及其中引用的 參考文獻(xiàn)，所有都全部引入作為參考。
序列比對(duì)可以用來(lái)指導(dǎo)所鑒定位點(diǎn)的替換。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理 解利用序列信息可以抑制引入潛在有害于蛋白結(jié)構(gòu)的替換。序列的來(lái)源很 廣泛，包括一個(gè)或多個(gè)已知的數(shù)據(jù)庫(kù)，包括但不限于Kabat數(shù)據(jù)庫(kù) (Northwestern University) ; Johnson & Wu, 2001, iVwc/e/c Jc/tfc 29:205-206; Johnson & Wu, 2000, A^c/e/c爿c/A 28:214-218), IMGT數(shù)據(jù) 庫(kù)(IMGT, the international ImMunoGeneTics information system ;; Lefranc d <a/.， 1999, M/c/e/c ^c/A L 27:209-212; Ruiz d o/.， 2000 7VMc/e&勿A 28:219-221; Lefranc a/" 2001 ， A^c/dc Jc/A紐29:207-209; Lefranc " , 2003， A^c/e/c JcvA 31:307-310)和VBASE,所有都全部引入作為參考。 可以從種系序列或來(lái)自任何生物體，包括但不限于哺乳動(dòng)物的天然發(fā)生抗 體的序列的序列比對(duì)獲得、編輯和/或產(chǎn)生抗體序列信息。本領(lǐng)域熟練技術(shù) 人員應(yīng)理解在施用給人時(shí)，利用人序列或基本上是人的序列更進(jìn)一步地具 有免疫原性更低的優(yōu)勢(shì)。是更普遍的核酸或蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的其他數(shù)據(jù)庫(kù)，即 不為抗體所特有的其他數(shù)據(jù)庫(kù)包括但不局限于SwissProt、 GenBank Entrez 和EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)。比對(duì)的序列可以包括VH、 VL、 CH和/或CL
方法都可以用于進(jìn)行序列比對(duì)。
或者，隨機(jī)或半隨機(jī)誘變方法可以用來(lái)在想要的位點(diǎn)產(chǎn)生氨基酸修飾。 這樣的話，可以隨機(jī)選擇位點(diǎn)，或者可以利用過(guò)分簡(jiǎn)化的規(guī)則產(chǎn)生氨基酸 改變。例如，可以將全部殘基突變?yōu)楸彼?，這稱(chēng)為丙氨酸掃描。這種方 法可以與使用選擇法以篩選較高層次的序列多樣性的更復(fù)雜的加工設(shè)計(jì)方 法聯(lián)合使用。多種選擇技術(shù)可以用于這種方法，例如包括顯示技術(shù)，例如 如下所述的噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)胞表面展示等等，這一點(diǎn)本領(lǐng)域 已經(jīng)公知。
生產(chǎn)和篩選IgG變體的方法為大家所熟知。Duebel & Kontermann編輯 的 Antibody Engineering, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Maynard & Georgiou, 2000， Annu Rev BiomedEng 2:339-76中描述了抗體分子生物學(xué)、表達(dá)、純化和篩 選的一般方法。此外還參見(jiàn)都全部引入作為參考的USSN 1(V754,296; USSN 10/672,280; USSN 10/822,231和11/124,620中描述的方法。
本發(fā)明優(yōu)選的變體包括圖8中的那些?；蛘?，本發(fā)明優(yōu)選的變體包括 圖9中的那些。另外或者，本發(fā)明優(yōu)選的變體包括圖10中的那些。本發(fā)明 特別優(yōu)選的變體包括G385H和N434Y。本發(fā)明最優(yōu)選的變體包括257C、 257M、 257L、 257N、 257Y、 279Q、 279Y、 308F和308Y。
制備IgG變體
通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法可以制備IgG變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG 變體序列被用來(lái)產(chǎn)生編碼成員序列的核酸，而且如果想要的話可以將他們 克隆到宿主細(xì)胞中，進(jìn)行表達(dá)和測(cè)定。利用眾所周知的方法可以實(shí)施這些 實(shí)際操作，都全部引入作為參考的Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 200 l)和 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons)中描述了多種有 用的方法。編碼IgG變體的核酸可以整合到表達(dá)載體中以表達(dá)蛋白。表達(dá) 載體通常包括操作性地與控制或調(diào)節(jié)序列、可選擇標(biāo)記、任何融合配偶體 和/或附加元件連接，即被放入功能關(guān)系中的蛋白。通過(guò)在誘導(dǎo)或引起蛋白 表達(dá)的適當(dāng)條件下培養(yǎng)用核酸，優(yōu)選用包含編碼IgG變體的核酸的表達(dá)載 體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可以生產(chǎn)IgG變體?？梢允褂枚喾N適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，包 括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲(chóng)細(xì)胞和酵母。例如從完全引入作 為參考的美國(guó)典型培養(yǎng)菌種庫(kù)獲得的ATCC細(xì)胞系目錄中描述了多種可有
用的細(xì)胞系。將外源性核酸插入宿主細(xì)胞中的方法在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?而且該方法隨^f吏用的宿主細(xì)胞而變化。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，在表達(dá)后純化或分離IgG變體。可以用本領(lǐng)域熟 練技術(shù)人員所知的多種方式分離或純化抗體。標(biāo)準(zhǔn)提純法包括色譜技術(shù)、 電泳、免疫、沉淀、透析、過(guò)濾、濃縮和色語(yǔ)聚焦技術(shù)。本領(lǐng)域已知多種
天然蛋白與抗體結(jié)合，例如細(xì)菌蛋白A、 G和L,因此這些蛋白可用于純化。 通過(guò)具體融合配偶體常常能實(shí)現(xiàn)純化。例如如果使用了GST融合物，就 可以利用谷胱甘肽樹(shù)脂純化蛋白，如果使用了 His標(biāo)簽，就可以使用Ni+2 親和色譜法，如果使用了flag標(biāo)簽，就可以使用固定的抗flag抗體。適當(dāng) 的純化技術(shù)的總指導(dǎo)參見(jiàn)引入作為參考的Antibody Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY， 1994。 篩選IgG變體
可以利用多種方法,包括但不限于那些使用體外測(cè)定、體內(nèi)和基于細(xì)胞 的測(cè)定和選擇技術(shù)的方法篩選IgG變體。可以在篩選程序中使用自動(dòng)化高 通量篩選技術(shù)。可以通過(guò)利用融合配偶體或標(biāo)記，例如免疫標(biāo)記、同位素 標(biāo)記或小分子標(biāo)記，例如熒光或比色染料進(jìn)行篩選。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，體外測(cè)定篩選IgG變體的功能性和/或生物物理學(xué) 特性。在優(yōu)選實(shí)施方案中，篩選蛋白的功能性，例如催化反應(yīng)的能力或?qū)?它的靶的結(jié)合親和力。利用本領(lǐng)域已知的多種方法，包括但不限于基于 FRET(熒光共振能量轉(zhuǎn)移)和BRET(生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移)的測(cè)定、 AlphaScreenTM(擴(kuò)增發(fā)光光均質(zhì)鄰近測(cè)定)、閃爍鄰近分析法、ELISA(酶聯(lián)免 疫吸附測(cè)定)、SPR(表面質(zhì)子共振，又名BIACORE )、等溫滴定量熱術(shù)、 差示掃描量熱法、凝膠電泳和包括凝膠過(guò)濾的色譜法可以進(jìn)行結(jié)合測(cè)定。 這些及其他方法可以利用一些融合配偶體或標(biāo)記。測(cè)定可以使用包括但不 限于產(chǎn)色、熒光、發(fā)光或同位素標(biāo)記的多種檢測(cè)方法。利用本領(lǐng)域已知的 多種方法，可以篩選蛋白的生物物理學(xué)特性，例如穩(wěn)定性和可溶性。通過(guò) 測(cè)量折疊和展開(kāi)狀態(tài)之間的熱力學(xué)平tf可以確定蛋白的穩(wěn)定性。例如利 用化學(xué)變性劑、加熱或pH可以展開(kāi)IgG變體，利用包括但不限于圓二色語(yǔ) 學(xué)、焚光光譜學(xué)、吸光光譜學(xué)、NMR光譜學(xué)、量熱法和蛋白水解的方法可 以監(jiān)測(cè)這一轉(zhuǎn)換。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，利用這些及其他技術(shù)也可 以監(jiān)測(cè)折疊和展開(kāi)轉(zhuǎn)換的動(dòng)力參數(shù)。利用本領(lǐng)域已知的各式各樣的方法可 以定量或定性地確定IgG變體的可溶性和總的結(jié)構(gòu)完整性?？捎糜诒碚鱅gG 變體生物物理學(xué)特性的方法包括凝膠電泳、色譜法，例如分子排阻色譜和 反相高效液相色譜法、質(zhì)譜分析法、紫外光吸收光譜法、熒光光譜學(xué)、圓 二色譜學(xué)、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、分析超速離心、動(dòng)態(tài)光散 射、蛋白水解，交聯(lián)、濁度測(cè)定、過(guò)濾阻滯測(cè)定、免疫測(cè)定、熒光染料結(jié)
合測(cè)定、蛋白染色測(cè)定、顯微鏡檢查，檢測(cè)ELISA聚集物或其他結(jié)合測(cè)定。 也可以使用利用X射線結(jié)晶技術(shù)和NMR光語(yǔ)學(xué)的結(jié)構(gòu)分析。
本領(lǐng)域已知， 一類(lèi)篩選法包括選擇庫(kù)中有利成員的方法。在這里該方 法被稱(chēng)為"選擇方法"，這些方法可以用于篩選IgG變體。當(dāng)利用選4奪方法篩 選蛋白庫(kù)時(shí)，只有那些有利的庫(kù)成員，也就是滿足一些選擇標(biāo)準(zhǔn)的成員會(huì) 被繁殖，分離和/或觀察。應(yīng)理解因?yàn)橹挥凶詈线m的變體被觀察到，因此這 種方法能篩選的庫(kù)比逐一測(cè)定庫(kù)成員擬合的方法能篩選的庫(kù)大。通過(guò)任何 方法、技術(shù)、共價(jià)或非共價(jià)連接蛋白表型和它的基因型，即共價(jià)或非共價(jià) 連接蛋白功能和編碼它的核酸的融合配偶體可以進(jìn)行選擇。例如，將庫(kù)成
員融合到基因m蛋白中使大家能利用噬菌體展示作為選擇方法。因此，選
擇或分離滿足一些標(biāo)準(zhǔn)的IgG變體，例如對(duì)蛋白靶具有結(jié)合親和力的IgG 變體也是選擇或分離編碼它的核酸。 一旦分離出來(lái)，就可以擴(kuò)增編碼Fc變 體的基因。可以重復(fù)允許富集庫(kù)中有利的IgG變體的被稱(chēng)為淘洗的分離和 擴(kuò)增過(guò)程。附著核酸的核酸測(cè)序最終考慮了基因鑒定。
本領(lǐng)域已知的多種選擇方法可以用于篩選蛋白庫(kù)。這些包括但不限于 嗟菌體展示(Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay a a/., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996; Lowman a/" 1991, 30:10832-10838; Smith, 1985, Sc/e"ce 228:1315-1317)和其書(shū)亍生 方法，例如選擇性噬菌體感染(Malmborg a/., 1997, J Mol Biol 273:544-551),選擇感染性噬菌體(Krebber " "/ ， 1997, / M。/扁 268:619-630),和延遲的感染性淘洗(Benhar W a/., 2000， ■/ Mo/ 301:893-904)，纟田月包表面展示 (Witrrup， 2001, Cwr B/o^c/wo/, 12:395-399)，侈寸i口纟田菌(Georgiou a/.， 1997， A^f B/ofec/wo/ 15:29-34; Georgiou a/., 1993， 2>ew<is所o&c/z"o/ 11:6-10; Lee d "/., 2000, 腸/ec/2w0/ 18:645-648; Jun a/.， 1998,脂胸ec/mo/ 16:576-80》酵母 (Boder & Wittrup, 2000， M"Ws fe戸o/ 328:430-44; Boder & Wittrup, 1997,
歷c^ec/wo/ 15:553-557)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(Whitehorn "/.， 1995， 5z'o/tec/wo/ogy 13:1215-1219)上的展示，以及體外展示技術(shù)(Amstutz " a/., 2001， Cwr (9; /w B/ofec/z"o/ 12:400-405)，侈寸J(口多才亥4唐體展示(Mattheakis e 1994,PraciV^/^cad5W 91:9022-9026)，核糖體展示(Hanes "a/.， 1997, 尸rac A^"cadSc/94:4937-4942), mRNA展示(Roberts & Szostak， 1997, Ato/ ^cfld 何:12297-12302; Nemoto " a/.， 1997, 丄e〃
414:405-408)和核糖體失活展示系統(tǒng)(Zhou " a/.， 2002， ■/C&附5bc 124, 538-543)。這段中的所有參考文獻(xiàn)都全部引入作為參考。
其他有用的選擇方法包括，不依賴展示的方法，例如體內(nèi)方法，包括 但不限于胞質(zhì)表達(dá)和細(xì)胞計(jì)數(shù)篩選(Chen et al.， 2001, Nat Biotechnol 19:537-542,全部引入作為參考)、蛋白片段互補(bǔ)測(cè)定(Johnsson & Varshavskiy, 1994， Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA95:12141-12146，全部引入作為參考)，用于選擇方式(Visintin et al.， 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728，全部引入作為參考)的酵 母雙雜交篩選(Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246，全部引入作為參 考)。在可選擇的實(shí)施方式中，能通過(guò)結(jié)合表達(dá)載體上的特異序列的融合配 偶體進(jìn)行選擇，因此融合配偶體能共價(jià)或非共價(jià)地連接聯(lián)合的Fc變體庫(kù)成 員和編碼他們的核酸。例如都全部引入作為參考的USSN 09/642,574; USSN 10/080,376; USSN 09/792,630; USSN 10/023,208; USSN 09〃92,626; USSN 10/082,671; USSN 09/953,351; USSN 10/097,100; USSN 60/366,658; PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702和PCT WO 02/07466描述 了可以使用的這種融合配偶體和技術(shù)。在可選擇的實(shí)施方案中，如果蛋白 的表達(dá)賦予細(xì)胞一些生長(zhǎng)、繁殖或存活優(yōu)點(diǎn)，那么就可以進(jìn)行體內(nèi)選擇。
稱(chēng)為"定向進(jìn)化"方法的一類(lèi)選擇方法是那些在選擇期間包括交配或再 生有利序列，有時(shí)整合新突變的方法。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員應(yīng)理解定向進(jìn) 化方法可以促進(jìn)對(duì)庫(kù)中最有利序列的鑒定，而且可以增加篩選序列的多樣 性。多種定向進(jìn)化方法在本領(lǐng)域是已知的，他們可用于篩選IgG變體，包 括但不限于DNA重排(PCTWO00/42561 A3; PCTWO01〃0947A3),外顯 子改組 (US 6,365,377 ; Kolkman & Stemmer, 2001，淑腸&由o/ 19:423-428),家族重排(Crameri " a/.， 1998， Atowe 391:288-291; US
6,376,246)， RACHITT (Coco " a/., 2001,7Vw 19:354-359; PCT
WO 02/06469), STEP合體外重組隨機(jī)引物法(Zhao " a/., 1998, 胸ec/wo/ 16:258-261; Shao d a/" 1998, iVwc/e/d/A 26:681-683)，夕卜切 核酸酶介導(dǎo)的基因組合(US 6,352,842; US 6,361,974)， Gene Site Saturation Mutagenesis (US 6，358，709), Gene Reassembly (US 6，358，709), SCRATCHY (Lutz et al.， 2001，尸rac AW/爿cat/6W 98:11248-11253)， DNA 斷裂方法(Kikuchie/a/"G匿236:159-167),單鏈DNA重排(Kikuchi"a/" 2000, 243:133-137)和AMEsystemTM定向進(jìn)化蛋白工程技術(shù)(Applied
Molecular Evolution) (US 5,824,514; US 5,817,483; US 5,814,476; US 5,763,192; US 5,723,323)。這段中的所有參考文獻(xiàn)都全部引入作為參考。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用一種或多種基于細(xì)胞的測(cè)定或體內(nèi)測(cè)定篩選 IgG變體。進(jìn)行這種測(cè)定時(shí)，通常需要外源添加純化或未純化的蛋白，以使 細(xì)胞暴露于獨(dú)立的變體或?qū)儆趲?kù)的變體庫(kù)。這些測(cè)定通常是，但不總是以 IgG功能為基礎(chǔ)，IgG功能也就是IgG結(jié)合它的靶和介導(dǎo)一些生物化學(xué)事件 的的能力，例如效應(yīng)器功能、配體/受體結(jié)合抑制、凋亡等等。這種測(cè)定經(jīng) 常涉及監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)IgG的反應(yīng)，例如細(xì)胞存活率、細(xì)胞死亡、細(xì)胞形態(tài)學(xué) 方面的變化或翻譯激活，例如天然基因或報(bào)告基因的細(xì)胞表達(dá)。例如這 種測(cè)定可以測(cè)量IgG變體引發(fā)ADCC、 ADCP或CDC的能力。在一些測(cè)定 中，除耙細(xì)胞之外，可需要添加另外的細(xì)胞或組分，例如血清補(bǔ)體或效應(yīng) 細(xì)胞，例如外周血單核細(xì)胞(PBMCs)、 NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等等。這種另外 的細(xì)胞可以來(lái)自任何生物體，優(yōu)選來(lái)自人、小白鼠、大鼠、兔子和猴?？?體可以引起某些表達(dá)耙的細(xì)胞系凋亡，或者他們可以介導(dǎo)已經(jīng)添加到測(cè)定 中的免疫細(xì)胞攻擊靶細(xì)胞。監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡或成活力的方法在本領(lǐng)域是已知 的，包括利用染料、免疫化學(xué)試劑、細(xì)胞化學(xué)試劑和放射性試劑。例如 半胱天冬酶染色測(cè)定能測(cè)量凋亡，而且放射性底物或熒光染料，例如alamar 藍(lán)的吸收或釋放能使細(xì)胞生長(zhǎng)或激活被監(jiān)測(cè)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用了 基于細(xì)胞毒性測(cè)定的DELFIA EuTDA(Perkin Elmer, MA)。或者，通過(guò)測(cè)量 一種或多種天然胞內(nèi)蛋白，例如乳酸脫氫酶的釋力文可以監(jiān)測(cè)死亡或損害的 靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄激活也可以作為在基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)定功能的方法。在這 種情況下，通過(guò)測(cè)定可被上調(diào)的天然基因或蛋白，例如測(cè)量某些白細(xì)胞間 介素的釋放，或者由報(bào)告構(gòu)建物獲取讀數(shù)可以監(jiān)測(cè)反應(yīng)?；诩?xì)胞的測(cè)定
也可以涉及測(cè)量細(xì)胞的形態(tài)變化作為對(duì)蛋白存在的反應(yīng)。這種測(cè)定的細(xì)胞 類(lèi)型可以是原核或真核細(xì)胞，可以使用本領(lǐng)域已知的多種細(xì)胞系?；蛘撸?可利用已經(jīng)用編碼變體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞實(shí)施基于細(xì)胞的篩選。也 就是說(shuō)，沒(méi)有外源添加IgG變體到細(xì)胞中。例如在一個(gè)實(shí)施方案中，基
于細(xì)胞的篩選使用了細(xì)胞表面展示?？梢允褂媚茉诩?xì)胞表面上顯示IgG變 體的融合配偶體(Witrrup, 2001， Curr Opin Biotechnol, 12:395-399,完全引入
作為參考)。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，利用一種或多種基于細(xì)胞的測(cè)定實(shí)驗(yàn)確定IgG變 體的免疫原性。幾種方法可以用于表位的試驗(yàn)性確認(rèn)。在優(yōu)選實(shí)施方案中， 利用體外T細(xì)胞激活測(cè)定以實(shí)驗(yàn)性定量免疫原性。在該方法中，用目標(biāo)肽 或完整蛋白攻擊抗原呈遞細(xì)胞和來(lái)自匹配供體的天然T細(xì)胞一次或多次。 然后，利用許多方法，例如監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子的生產(chǎn)或測(cè)量氚化胸腺嘧啶的吸 收可以檢測(cè)T細(xì)胞激活。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，利用Elispot測(cè)定監(jiān)測(cè)干 擾素y的生產(chǎn)(Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth. 24: 17-24,全部引入作 為參考)。
可以在細(xì)胞、組織和完整生物體實(shí)^^中表征IgG變體的生物學(xué)特性。 為了測(cè)量藥物治療疾病或疾病模型的功效、或測(cè)量藥物的藥物動(dòng)力學(xué)、毒 性及其他特性，經(jīng)常在包括但不限于小白鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬和 猴的動(dòng)物中測(cè)試藥物，這一點(diǎn)本領(lǐng)域已經(jīng)已知。動(dòng)物可以被稱(chēng)為疾病模型。 經(jīng)常在包括但不限于棵鼠、SCID小白鼠、異種移植小白鼠和轉(zhuǎn)基因小白鼠 (包括敲入和敲除)的小白鼠中測(cè)試治療劑。這種實(shí)驗(yàn)可以提供有價(jià)值的數(shù)據(jù) 以確定蛋白被用作治療劑的潛力。任何生物體，優(yōu)選哺乳動(dòng)物可以被用來(lái) 進(jìn)行測(cè)試。例如，因?yàn)楹锱c人的遺傳相似性，因此猴可以作為適當(dāng)?shù)闹委?模型，用來(lái)測(cè)試IgGs的功效、毒性、藥物動(dòng)力學(xué)或其他特性。批準(zhǔn)作為藥 物最終需要在人體內(nèi)進(jìn)行測(cè)試，因此毫無(wú)疑問(wèn)已經(jīng)打算進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。因 此，可以在人體內(nèi)測(cè)試IgGs以確定他們的治療功效、毒性、免疫原性、藥 物動(dòng)力學(xué)和/或其他臨床特性。
IgG變體的〗吏用方法
IgG變體可以用于范圍廣泛的產(chǎn)物中。在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG變體是 治療試劑、診斷試劑或研究試劑，優(yōu)選是治療試劑。IgG變體可用于是單克 隆或多克隆的抗體組合物中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，IgG變體可以用來(lái)殺死負(fù)
載靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。在可選擇的實(shí)施方案中，IgG變體被用來(lái) 阻斷、對(duì)抗或干擾輩巴抗原，例如對(duì)抗細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體。在可選擇 的優(yōu)選實(shí)施方案中，IgG變體被用來(lái)阻斷、對(duì)抗或干擾靶抗原，并殺死負(fù)載 耙抗原的耙細(xì)胞。
IgG變體可以用于多種治療目的。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以給病人施用 包含IgG變體的抗體以治療與抗體相關(guān)的紊亂。適合于該目的的"病人"包括 人及其他動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。在這里"抗體相關(guān)紊亂"或"抗體 應(yīng)答紊亂"或"狀況"或"疾病"指通過(guò)施用包含IgG變體的藥物組合物能改善 的紊亂。抗體相關(guān)紊亂包括，但不限于自身免疫疾病、免疫疾病、感染性 疾病、炎性疾病、神經(jīng)學(xué)上的疾病，以及腫瘤和新生物疾病，包括癌癥。 在這里"癌癥"和"癌"指或描述的是哺乳動(dòng)物中通常以無(wú)限制的細(xì)胞生長(zhǎng)/增 殖為特征的生理狀態(tài)。癌癥的實(shí)例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、胚細(xì)胞 瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、雪旺氏瘤(schwanoma)、 腦膜瘤、腺癌、黑素瘤，以及白血病和淋巴系統(tǒng)的惡性腫瘤。
在一個(gè)實(shí)施方案中，IgG變體是施用給人的唯一治療活性劑?；蛘?，可 以與一種或多種其他治療劑，包括但不限于細(xì)胞毒活性制劑、化療劑、細(xì) 胞因子、生長(zhǎng)抑制制劑、抗激素制劑、激酶抑制劑、抗血管生成制劑、心 臟保護(hù)劑或其他治療劑結(jié)合施用IgG變體。施用IgG變體時(shí)，可以伴隨施 用一種或多種其他治療方式。例如可以將IgG變體與化療、放療、或者 放化療一起施用給病人。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以和是或不是IgG變體的 一種或多種抗體一起施用IgG變體。依照另一個(gè)實(shí)施方案，可以使用IgG 變體和一種或多種其他抗癌治療在體外治療癌細(xì)胞。預(yù)計(jì)這種體外治療可
對(duì)骨髓移植有用，對(duì)自體骨髓移植可特別有用。當(dāng)然，應(yīng)考慮到這種IgG 變體仍然可以與其他治療技術(shù)，例如手術(shù)組合使用。
多種其他治療劑可以用于和IgG變體一起施用。在一個(gè)實(shí)施方案中， 與抗血管生成劑一起施用IgG。在這里使用的"抗血管生成劑"指阻斷或一定 程度上千擾血管發(fā)生的化合物?？寡苌梢蜃涌梢允?，例如結(jié)合涉及促 進(jìn)血管發(fā)生的生長(zhǎng)因子或生長(zhǎng)因子受體的小分子或蛋白，例如抗體、Fc融 合物或細(xì)胞因子。這里優(yōu)選的抗血管生成因子是結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因 子(VEGF)的抗體。在可選擇的實(shí)施方案中，與誘導(dǎo)或增強(qiáng)適當(dāng)免疫反應(yīng)的 治療劑，例如靶向CTLA-4的抗體一起施用IgG。在可選4奪的實(shí)施方案中， 與酪氨酸激酶抑制劑一起施用IgG。這里使用的"酪氨酸激酶抑制劑"指在一 定程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在可選擇的實(shí)施方案 中，與細(xì)胞因子一起施用IgG變體。
其中配制了 IgG變體和一種或多種治療活性劑的藥物組合物也在考慮
之中。通過(guò)將具有想要純度的IgG與任意的藥學(xué)可接受載體、賦形劑或穩(wěn) 定劑混合(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.， 1980,全部引入作為參考)，可以制備凍干劑型或水溶液形式的用于儲(chǔ)藏的 IgG變體制劑。用于體內(nèi)給藥的制劑優(yōu)選是無(wú)菌的。通過(guò)過(guò)濾通過(guò)過(guò)濾除菌 膜或其他方法很容易實(shí)現(xiàn)這一目的。也可以以免疫脂質(zhì)體形式配制這里公 開(kāi)的IgG變體及其他治療活性劑，和/或?qū)⑺麄兎@在微膠嚢中。
制劑中治療活性IgG變體的濃度按重量計(jì)在大約0.1-100%之間變化。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，IgG濃度在0.003-1.0摩爾的范圍之內(nèi)。為了治療病人， 可以施用治療有效量的IgG變體。這里的"治療有效量"指施用時(shí)產(chǎn)生效果的 劑量。準(zhǔn)確劑量取決于治療目的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員利用已知技術(shù)可確 定準(zhǔn)確劑量。劑量可以在從0.01-100mg/kg體重或更大的范圍中變化，例如 為O.Ol、 0.1、 1.0、 10或50mg/kg體重，其中l(wèi)-10mg/kg是優(yōu)選的。本領(lǐng)域 已經(jīng)已知調(diào)節(jié)蛋白降解，與局部遞送相比較的系統(tǒng)遞送、新蛋白酶合成的 速度，以及年齡、體重、大體健康、性別、飲食、給藥時(shí)間、藥物相互作 用和狀況的嚴(yán)重可是必需的，本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)可確定這 —點(diǎn)。
包含IgG變體的藥物組合物，優(yōu)選無(wú)菌水溶液形式的藥物組合物的給 藥可以通過(guò)多種途徑進(jìn)行，包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、胃腸外、 耳內(nèi)(intraotically)、目艮內(nèi)、直腸、陰道、經(jīng)皮、局部(例如凝膠劑、油膏劑、 洗劑、乳膏等等。)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)(例如從Aradigm可買(mǎi)到的AERx 吸入技術(shù)或從Nektar Therapeutics可買(mǎi)到的Inhance肺遞送系統(tǒng))等等?？梢?與其他治療伴隨施用本文所述治療劑，即本文所述治療劑可以與其他治療 或治療劑，包括例如小分子、其他生物制劑、放療、手術(shù)等等一起施用。
實(shí)施例
以下實(shí)施例舉例說(shuō)明本發(fā)明。這些實(shí)施例無(wú)意將本發(fā)明限制于任何特 殊應(yīng)用或操作理論。本發(fā)明所述所有位點(diǎn)都依照Kabat中的EU指數(shù)進(jìn)行編 號(hào)(Kabat et al" 1991， Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.,
United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda， 全
部引入作為參考)?？贵w領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，這一規(guī)定由免疫球蛋 白序列具體區(qū)域的非順序編號(hào)組成，因此能參照免疫球蛋白家族中的保守 位點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。因此，EU指數(shù)所指任何給定免疫球蛋白的位點(diǎn)不一定對(duì) 應(yīng)于它的有序序列。
實(shí)施例1 : Fc變體的DNA構(gòu)建、表達(dá)和純化
利用人IgGl Fc域和曲妥單抗(Herceptin⑧，Genentech)的可變域構(gòu)建Fc 變體。Fc多肽是阿侖單抗、曲妥單抗或AC10的一部分。阿侖單抗(Campath⑧， Millenium的注冊(cè)商標(biāo))是目前批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病 的人源化單克隆抗體(Haleetal.， 1990, Tissue Antigens 35:118-127，全部引入 作為參考)。曲妥單抗(Herceptin⑧，Genentech的注冊(cè)商標(biāo))是治療轉(zhuǎn)移性乳 腺癌的抗HER2/neu抗體。AC10是抗CD30單克隆抗體。Herceptin可變區(qū) 利用回歸PCR來(lái)組裝。然后將該可變區(qū)與人IgGl —起克隆到pcDNA3.1/Zeo (+)載體(Invitrogen)中，見(jiàn)圖11。質(zhì)粒在One Shot TOP10大腸桿菌細(xì)胞 (Invitrogen)中繁殖，并利用Hi-Speed Plasmid Maxi Kit(Qiagen)純化。質(zhì)粒經(jīng) 測(cè)序證實(shí)存在克隆的插入物。
定點(diǎn)誘變利用Quikchange 方法(Stratagene)進(jìn)行。包含所需替換、插 入和缺失的質(zhì)粒在One Shot TOP 10大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen)中繁殖，并利 用Hi-Speed Plasmid Maxi Kit(Qiagen)純化。DNA測(cè)序證實(shí)序列的保真度。
(VL-Ck)的質(zhì)粒l轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染f天后，收獲培^基，利^I蛋 白A親和色鐠法(Pierce)從上清液中純化抗體。通過(guò)雙金雞寧酸(bicinchoninic acid)(BC A)測(cè)定(Pierce)確定抗體濃度。 實(shí)施例2:結(jié)合親和力測(cè)量
用表面質(zhì)子共振測(cè)量測(cè)定Fc多肽對(duì)Fc配體的結(jié)合。利用BIAcore 3000 儀器(BIAcore AB)實(shí)施表面質(zhì)子共振(SPR)測(cè)量。利用固相蛋白L (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)捕獲野生型或變體抗體，并測(cè)量對(duì)受體分析物的 結(jié)合。在CM5傳感器芯片上利用5 ul/min流速的N-羥基琥珀酰亞胺/ N-乙 基-N'-(-3-二曱氨基-丙基)碳化二亞胺(NHS/EDC),將存在于pH4.5的10mM 醋酸鈉中的濃度為1 uM的蛋白L共價(jià)連接到CM5傳感器芯片上。用 NHS/EDC模擬(mock)每個(gè)傳感器芯片的流動(dòng)細(xì)胞1作為結(jié)合的陰性對(duì)照。
所用緩沖液是0.01 MHEPESpH 7.4、 0.15MNaCl、 3mMEDTA、 0.005% v/v 表面活性劑P20(HBS-EP, Biacore, Uppsala, Sweden),芯片再生緩沖液是10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5。將125 nM野生型或變體曲妥單抗以流速1 ul/min 與HBS-EP中的蛋白LCM5芯片結(jié)合5分鐘。注入在1和250nM之間連續(xù) 稀釋的FcRn-His-GST分析物(FcRn與His標(biāo)簽和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶融合)， 在HBS-EP中結(jié)合20分鐘，解離IO分鐘，流速10 ul/min。在注射受體之 后的1200秒，獲取按共振單位(RU)計(jì)量的反映近穩(wěn)態(tài)結(jié)合的反應(yīng)。用抗體 和緩沖液進(jìn)行的循環(huán)僅提供基線反應(yīng)。產(chǎn)生RU對(duì)1/1og濃度的曲線圖，并 利用GraphPad Prism進(jìn)行非線性回歸，將其調(diào)整為S形曲線劑量反應(yīng)。
Fc多肽對(duì)Fc配體的結(jié)合也利用AlphaScreenTM(擴(kuò)增發(fā)光鄰近均質(zhì)測(cè)定， Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assa力確定。AlphaScreen 是基于珠的非放射發(fā)光鄰近測(cè)定。供體珠激發(fā)出激光，從而激發(fā)氧，當(dāng)氧 離受體珠足夠近時(shí)，產(chǎn)生一連串化學(xué)發(fā)光事件，最終導(dǎo)致在520-620 nm發(fā) 射焚光。AlphaScreen 的主要優(yōu)點(diǎn)在于它的敏感性。因?yàn)橐粋€(gè)供體珠每秒 發(fā)射多達(dá)60,000個(gè)激發(fā)態(tài)氧分子，信號(hào)放大程度非常高，其允許檢測(cè)低至 阿托摩爾(attomolar, 10"8)的水平。野生型抗體通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法生物素化，以 附著鏈親和素供體珠，標(biāo)記的Fc配體(例如FcRn)與螯合谷胱甘肽的受體珠 連接。用AlphaScreenTM作為直接結(jié)合測(cè)定，其中Fc/Fc配體的相互作用將 供體和受體珠帶到一起。另外，用AlphaScreen 作為竟?fàn)帨y(cè)定，來(lái)篩選所 設(shè)計(jì)的Fc多肽。缺乏竟?fàn)幮虵c多肽時(shí)，野生型抗體與FcRn相互作用，在 520-620 nm產(chǎn)生信號(hào)。未標(biāo)記的Fc域竟?fàn)幰吧虵c/FcRn相互作用，使熒 光大大減弱，從而能確定相對(duì)結(jié)合親和力。
實(shí)施例3 : Fc變體的FcRn結(jié)合特性
IgGl Fc對(duì)FcRn的結(jié)合親和力用變體抗體和AlphaScreen 測(cè)量。Fc 多肽是阿侖單抗、曲妥單抗的一部分。阿侖單抗(Campath , Ilex)是目前 批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單克隆抗體(Hale et aL 1990, Tissue Antigens 35:118-127，全部引入作為參考)。曲妥單抗 (Herceptin ， Genentech)是治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抗HER2/neu抗體。
收集竟?fàn)幮訟lphaScreen 數(shù)據(jù)以測(cè)量pH6.0時(shí)，F(xiàn)c變體與野生型抗體 相比的相對(duì)結(jié)合。AlphaScreen 信號(hào)相對(duì)于竟?fàn)幮涂贵w的函數(shù)的實(shí)例見(jiàn)圖 12。圖中顯示12個(gè)變體曲線，其中P257L、 P257N、 V279E、 V279Q、 V279Y、
A281S、 E283F、 V284E、 L306Y T307V、 V308F和Q311V的曲線表現(xiàn)出增 加的親和力，每一變體曲線在其框中移到野生型曲線左側(cè)。本發(fā)明Fc變體 的竟?fàn)嶢phaScreenTM數(shù)據(jù)概括在圖13和14中。變體與野生型相比的相對(duì) FcRn結(jié)合已列表。值大于1表明，與野生型相比，F(xiàn)c變體對(duì)FcRn的結(jié)合 增強(qiáng)。例如變體E283L和V284E的結(jié)合分別比野生型的強(qiáng)9.5倍和26倍。 多咯變體經(jīng)表面質(zhì)子共振測(cè)量也顯示對(duì)FcRn的結(jié)合增加，見(jiàn)圖15和16。
在位點(diǎn)257,除去亞氨基酸、脯氨酸以及將不帶骨架N的氨基酸替換成 側(cè)鏈共價(jià)鍵所得的所有變體都使骨架屈曲性更強(qiáng)，這樣可以允許Fc域更自 由以便更好地結(jié)合FcRn。特別地，位點(diǎn)257變成L和N后得到的變體在 pH 6時(shí)具有強(qiáng)烈的FcRn結(jié)合，這表明四原子側(cè)鏈和該側(cè)鏈的y分支形式可 以幫助Fc域產(chǎn)生有價(jià)值的，即強(qiáng)烈的FcRn相互作用。位點(diǎn)308與位點(diǎn)257 相互作用。這兩個(gè)位點(diǎn)依次與直接參與Fc/FcRn相互作用的H310相互作用 (表2， Burmeister et al (1994) Nature 372:379-383,全部引入作為參考)。相 對(duì)于野生型，F(xiàn)c變體V308F和V08Y的FcRn親和力增加2.9倍和4.3倍。 位點(diǎn)279和385與FcRn相互作用，因?yàn)樽凅wV279E、 V279Q和V279Y和 G385H和G385N全都具有更強(qiáng)的FcRn相互作用。這些變體都替換成了能 進(jìn)行氫鍵連接的氨基酸。
Fc變體N434Y在pH6.0時(shí)對(duì)FcRn的結(jié)合特別強(qiáng)，見(jiàn)圖13。單個(gè)變體 N434Y的結(jié)合增加16倍。該變體與其他修飾聯(lián)合導(dǎo)致更強(qiáng)的結(jié)合。例如 P257L/N434Y、 A281S/N434Y和V308F/N434Y的FcRn結(jié)合增加830倍、180 倍和350倍。
實(shí)施例4 :整合插入和缺失的變體
構(gòu)建改變Fc/FcRn相互作用強(qiáng)度的插入和缺失，并測(cè)量它們對(duì)各種Fc 配體的結(jié)合特性。設(shè)計(jì)一種Fc變體，其在殘基281和282(按Kabat等的EU 編號(hào))之間插入Ser殘基，以增加Fc域的FcRn結(jié)合特性。該變體稱(chēng)A281S, ""'表示指定位點(diǎn)后的插入。在位點(diǎn)編號(hào)后給出插入序列，其可以超過(guò)一個(gè) 殘基。利用本文所述方法，在k IgGl抗體曲妥單抗(Herceptin⑧，Genetech) 中構(gòu)建該Fc變體。在殘基281和282之間進(jìn)行插入，使殘基281C末端的 Fc環(huán)殘基移向該環(huán)C末端，并改變了該側(cè)li的位置。 一些Fc變體在位點(diǎn) 282、 283和284包含替換，它們表明該環(huán)C末端的移位是有益的(參見(jiàn)圖 14)。另構(gòu)建了一個(gè)N286缺失變體(也稱(chēng)N286弁)，以改變?cè)揊cRn結(jié)合環(huán)的位置。在pH6.0時(shí)，這兩個(gè)變體對(duì)FcRn的結(jié)合親和力都顯示出增加。
AlphaScreenTM數(shù)據(jù)顯示了 A281S變體及其他變體對(duì)FcRn的結(jié)合。收集 AlphaScreen 數(shù)據(jù)作為直接的結(jié)合測(cè)定。較高水平的化學(xué)發(fā)光信號(hào)表明更 強(qiáng)的結(jié)合。因?yàn)闇y(cè)定中變體的濃度提高了，因此產(chǎn)生了更強(qiáng)的信號(hào)。圖17a 和17b中pH 6.0時(shí)的這些數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于野生型Fc， A281S、 P257L、 P257L/A281S(替換/插入組合變體)及其他變體的親和力增加。另有一種雙重 替換T250Q/M428L，以前的報(bào)道稱(chēng)，其在猴體內(nèi)具有延長(zhǎng)的血清半衰期 (Hinton et al.， 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6216,全文引入作為參考)。 單獨(dú)的A281S插入增加了 Fc/FcRn結(jié)合。另夕卜，如~ 40nM的數(shù)據(jù)點(diǎn)所示， 當(dāng)在變體P257L產(chǎn)281S中組合兩個(gè)修飾時(shí)，A281S更進(jìn)一步地增強(qiáng)了 P257L 的結(jié)合。圖17c中的數(shù)據(jù)表明，這些變體在pH 7.0時(shí)未顯示FcRn結(jié)合增加。 pH 7.0時(shí)降低的親和力是延長(zhǎng)體內(nèi)半衰期所希望的，因?yàn)樗试SFc多肽從 FcRn釋放到細(xì)胞外間隙中，這是Fc再循環(huán)中的重要步驟。
表面質(zhì)子共振實(shí)驗(yàn)也表明，A281S對(duì)FcRn的結(jié)合被改進(jìn)。圖18顯示了 各種Fc變體與芯片表面FcRn結(jié)合時(shí)產(chǎn)生的響應(yīng)單位。在變體完全結(jié)合到 芯片上后，記錄響應(yīng)單位并將其顯示在縱坐標(biāo)上。八281S插入顯示出與本文 所述其他變體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性，即相比于野生型，對(duì)FcRn的親和力增力口(例 如參見(jiàn)圖13、 14和15)。
缺失變體N286弁包含N286的缺失，其相對(duì)于野生型，也顯示出增加的 FcRn親和力。如圖13所示，該變體的FcRn親和力增加2.0倍。其中的數(shù) 據(jù)也是pH6.0時(shí)從作為竟?fàn)帉?shí)驗(yàn)的AlphaScreen 收集的數(shù)據(jù)。用這些變體 抑制連接供體珠的野生型Fc與連接受體珠的FcRn的結(jié)合。通過(guò)Fc/FcRn 復(fù)合物抑制供體/受體珠的結(jié)合需要比游離野生型Fc少兩倍的游離N286#。 這表明N286^比野生型的結(jié)合強(qiáng)2倍。
包含插入或缺失的其他Fc變體對(duì)FcRn親和力的降低。插入變體"54N 對(duì)FcRn的結(jié)合大大降低，這可從該變體的性質(zhì)和定位預(yù)期到。該變體在 FcRn結(jié)合環(huán)的中間位置插入Asn。該插入物僅有野生型的結(jié)合親和力的 1.1% (圖13)。
本發(fā)明如上所述的具體實(shí)施例是為了進(jìn)行解釋說(shuō)明，本領(lǐng)域熟練技術(shù) 人員應(yīng)理解不脫離附加要求所描述的本發(fā)明可以對(duì)細(xì)節(jié)實(shí)施數(shù)目眾多的變 異。所有這里引用的參考文獻(xiàn)都全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.親代多肽的Fc變體，其在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)修飾，與親代多肽相比，所述變體蛋白對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出改變，且所述Fc變體包含至少一個(gè)選自由246H，246S，247D，247T，248H，248P，248Q，248R，248Y，249T，249W，251D，251E，251H，251I，251K，251M，251N，251T，251V，251Y，252F，252L，253L，253T，253V，254H，254L，254N，254T，254V，^254N，255E，255F，255H，255K，255S，255V，256E，256H，256V，257A，257C，257D，257E，257F，257G，257H，257I，257K，257L，257M，257N，257Q，257R，257S，257T，257V，257W，257Y，258R，258V，279A，279C，279D，279F，279G，279H，279I，279K，279L，279M，279N，279P，279Q，279R，279S，279T，279W，279Y，280E，280H，^281A，^281D，^281S，^281T，282D，282F，282H，282I，282T，283F，283I，283L，283Y，284H，284K，284P，284Q，284R，284S，284Y，285S，285V，286#，286L，287H，287S，287V，287Y，288H，288Q，288R，288S，305H，305T，306F，306H，306I，306N，306T，306V，306Y，307D，307V，307Y，308A，308C，308D，308E，308F，308G，308H，308I，308K，308L，308M，308N，308P，308Q，308R，308S，308T，308W，308Y，309F，309H，309I，309N，309P，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311H，311L，311S，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H，378N，380T，380Y，382H，383H，383K，383Q，384E，384G，384H，385A，385C，385D，385E，385F，385H，385I，385K，385L，385M，385N，385P，385Q，385R，385S，385T，385V，385W，385Y，386E，386H，386K，387#，387A，387H，387K，387Q，389E，389H，426E，426H，426L，426N，426R，426V，426Y，427I，429D，429F，429K，429N，429Q，429S，429T，429Y，430D，430H，430K，430L，430Q，430Y，431G，431H，431I，431P，431S，432F，432H，432N，432S，432V，433E，433N，433P，433R，433S，434H，434Q，434S，434Y，435N，436E，436F，436H，436L，436Q，436V，436W，437E，437V，438E，438H和438K組成的群組的修飾，其中參照EU指數(shù)進(jìn)行編號(hào)，^表示在指定位置后的插入，#表示指定位置的缺失。
2. 依照權(quán)利要求l的Fc變體，其中所述Fc變體包含至少一個(gè)選自由 246H， 246S， 247D, 247T, 248H, 248P， 248Q， 248R, 248Y， 249T， 249W， 251D， 251E, 251H, 2511， 251K, 251M， 251N, 251T, 251V， 251Y， 252L， 253L， 253T, 253V, 254H, 254L, 254N, 254V, A254N, 255E, 255F, 255H, 255K， 255S, 255V, 256H, 256V, 257A, 257C, 257D， 257E, 257F， 257G， 257H， 2571， 257K， 257L, 257M， 257N， 257Q, 257R， 257S, 257T， 257V, 257W, 257Y, 258R, 258V， 279A， 279C， 279D, 279F, 279G, 279H, 2791, 279K, 279M， 279N, 279P, 279Q, 279R, 279S, 279T, 279W, 279Y， 280H, A281A， A281D， A281S， A281T， 282D, 282F， 282H， 2821， 282T， 283F， 2831， 283L， 283Y, 284H, 284K, 284P， 284Q, 284R, 284S， 284Y， 285S, 285V, 286#， 286L， 287H， 287S， 287V， 287Y， 288H, 288Q, 288S， 305H， 305T， 306F, 306H， 3061， 306N, 306T, 306V, 306Y, 307D, 307V， 307Y, 308C, 308E, 308F, 308G， 308H, 3081, 308K， 308L, 308M， 308N, 308P， 308Q, 308R, 308S, 308W， 308Y， 309F， 309H， 309N， 309Q， 309V, 309Y, 310K, 310N， 310T, 311L, 311T， 311V, 311W, 312H, 313Y, 315E， 315G， 315H， 315Q， 315S, 315T, 317H, 317S, 339P, 340P, 341S, 374H, 374S, 376H, 376L, 378H, 378N, 380T, 3匿，382H， 383H, 383K， 383Q， 384E， 384G, 384H， 385A， 385C， 385F， 385H, 3851， 385K, 385L, 385M， 385N， 385P， 385Q， 385S， 385T， 385V， 385W, 385Y， 386E， 386H， 386K， 387#， 387A, 387H, 387K, 387Q, 389E， 389H, 426E, 426H, 426L， 426N, 426R, 426V, 426Y， 4271， 429D， 429F， 429K, 429N, 429Q， 429S， 429T， 429Y, 430D, 430H, 430K， 430L， 430Q, 430Y, 431G， 431H， 4311， 431P, 431S, 432F， 432H, 432N， 432S, 432V, 433E, 433N, 433P， 433S, 434H, 434Q, 434S, 435N, 436E， 436F, 436L, 436V， 436W, 437E， 437V， 438H和438K組成的群組的修飾。
3. 依照權(quán)利要求2的Fc變體，其中所述Fc變體包含至少一個(gè)選自由 246H， 246S， 247D, 247T， 248P, 248Q, 248Y, 249T, 249W， 251D, 251E， 251H, 2511， 251T， 251V, 252L， 253L， 253T， 253V, 254H， 254L， 254N， 254V, A254N， 255E， 255H, 255K, 255V, 256H, 256V， 257A, 257C, 257F, 257G, 2571, 257L, 257M, 257N, 257Q, 257S, 257T, 257V， 257W, 257Y, 258V, 279A， 279C， 279F, 2791， 279P, 279S， 279T， 279W， 279Y, A281A， A281D， A281S, A281T, 282F, 2821， 282T, 283F， 2831, 283L， 283Y， 284P, 285V， 286#， 286L, 287V, 288Q, 288S， 305T, 306F， 306H， 3061, 306N， 306T， 306V, 306Y, 307V， 308C, 308F, 308G， 308L, 308M， 308N， 308P, 308Q, 308S, 308W, 308Y， 309F， 309N, 309Q, 309V， 309Y, 310T, 311L, 311T, 311V, 311W， 313Y， 315G, 315Q, 315S， 315T， 339P, 340P, 341S， 374H， 374S, 376L， 378H, 378N， 380T, 380Y, 382H, 383Q， 384E， 384G， 384H， 385A, 385C, 385F, 3851， 385L, 385M， 385N， 385P， 385Q， 385S， 385T， 385V, 385W, 385Y, 386E， 386H， 386K， 387#， 387A, 387H, 387K， 387Q, 389H, 426L， 426N, 426V, 426Y， 4271， 429D， 429F， 429K, 429N， 429Q, 429S, 429T， 429Y, 430L, 431G， 4311， 431P, 431S, 432F, 432H, 432V， 433E, 433N， 433P, 433S， 434H, 434Q, 434S, 435N, 436F, 436L， 436V, 436W, 437E,和437V組成的群組的修飾。
4. 依照權(quán)利要求l的Fc變體，其中所述Fc變體包含至少一個(gè)選自由 257C, 257M， 257L, 257N, 257Y， 279Q, 279Y， 308F和308Y組成的群組 的替換。
5. 依照權(quán)利要求l的Fc變體，其中所述Fc變體包含G385H或N434Y。 依照權(quán)利要求3或4的Fc變體，其中所述Fc變體在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少兩個(gè)修飾。
6. 依照權(quán)利要求3或4的Fc變體，其中所述Fc變體更進(jìn)一步地包含至少 一個(gè)選自由248D， 248E， 248K, 249H, 249K， 249R， 250A, 250C， 250D, 250E， 250F， 250G， 250H, 2501， 250K, 250L, 250M， 250N， 250P， 250Q, 250R， 250S, 250V， 250W， 250Y, 251C， 251G， 251L, 251Q, 251S, 252A, 252C， 252G， 252N， 252Q， 252S, 252T, 252V, 252W, 252Y， 253A, 254A, 254S， 255C， 255G， 255N， 255Q， 255R， 255S, 255T, 255Y, 256A， 256D， 256F， 256K， 256Q, 256R， 256S, 256T, 258C, 258D, 258E, 258G, 258H, 258K， 258N, 258Q, 258S, 258T， 258Y, 277A， 277C, 277D， 277E, 277F, 277G, 277H, 2771， 277K， 277L, 277M, 277N, 277P， 277Q， 277R， 277S, 277T， 277V, 277W, 277Y， 27犯，279R， 280K， 280R, 281D, 281E, 281H， 281K， 281Q， 281R, 282E， 282K， 282R, 284C， 284D， 284E， 284G, 284N， 284T, 285A， 285C, 285D， 285G， 285H， 285N, 285Q, 285R， 285T, 285Y， 286E， 286M， 286T， 287C， 287D, 287E, 287G, 287H, 287K, 287N, 287Q, 288D， 288E, 288H， 288K， 288R, 287R, 287S, 287T, 288A， 288C， 288D， 288E, 288F， 288G, 288H, 288K, 288L， 288M, 288N， 288P, 288T, 288V， 288W, 288Y， 304C, 305A, 305C， 305D, 305E， 305G, 305K, 305N， 305Q, 305R， 305S， 305Y, 306A, 306C, 306D, 306E, 306G， 306K， 306L, 306M， 306N, 306P， 306Q 306R, 306R, 306S， 306T, 306V, 306W， 306Y, 309D， 309E， 309K， 309R， 310A， 310C， 310D, 310E, 310G, 310H， 311A, 311K， 311R， 312A, 312C， 312D, 312G, 312K, 312N, 312Q, 312R， 312S， 312T， 312Y, 313D, 313E, 313H， 313K， 313R， 314A, 314C， 314 D， 314E， 314F, 314G, 314H， 3141， 314L, 314M， 314N, 314P, 314Q，314R,314S，314T,314V, 314W， 314Y, 315D, 315K, 315R, 316H,316K,316R,317A,317C，317D， 317E，317G, 317K， 317N, 317Q,317R，317T,317Y,340D,340E,340H， 340K,340R, 343C， 343D， 343E,343G，343H,343K,3標(biāo)，343Q,343R, 343S，343T， 343Y， 344L, 345C，345D，345E，345G,345H,345K,345N, 345Q，345R, 345S, 345T, 345Y，360A，362A,376C,376D，376E,376G， 376K，376N， 376Q, 376R， 376S，376T，376Y，378S,380A，382A，383D, 383E,383R, 386P， 386T, 387P,387R，389D，389N,389P，389S,415A， 424A,424D, 424E， 424H, 424K,424R,426D,426K，428A，428C,428D, 428E，428F， 428G, 428H， 4281，428K,428L，428M,428N，428P，428Q, 428R,428S, 428T， 428V, 428W，428Y,430C,430E，430G，430N,430R， 430S,430T, 431D, 431E, 431K,431R，432C，432G,432Q,432T,432Y， 433A，433K, 434A， 434F, 434K,434L，434R,435A，436A,436D， 436R, 436T， 436Y， 438D, 438E和438R組成的群組的替換。
7. 親代多肽的Fc變體，其在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)修飾， 與所述親代多肽相比，所述變體蛋白對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出改變，且所述至 少一個(gè)修飾包括插入或缺失。
8. 依照權(quán)利要求7的Fc變體，其中所述修飾顯示對(duì)FcRn的結(jié)合增高。
9. 依照權(quán)利要求7的Fc變體，其中所述修飾是插入。
10. 依照權(quán)利要求9的Fc變體，其中所述插入位于環(huán)中。
11. 依照權(quán)利要求9的Fc變體，其中所述插入位于位點(diǎn)254或281之后。
12. 依照權(quán)利要求ll的Fc變體，其中所述插入是A281S。
13. 依照權(quán)利要求7的Fc變體，其中所述修飾是缺失，附帶條件是在同 種型IgGl的位點(diǎn)G236沒(méi)有缺失。
14. 依照權(quán)利要求13的Fc變體，其中至少一個(gè)所述的缺失發(fā)生在環(huán)內(nèi)。
15. 依照權(quán)利要求14的Fc變體，其中至少一個(gè)所述的缺失是位點(diǎn)286或 387的缺失。
16. 親代多肽的Fc變體，其在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)修飾， 與所述親代多肽相比，所述變體蛋白對(duì)FcRn和FcyR的結(jié)合顯示出改變。
17. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體在所述親代Fc多肽的Fc 區(qū)包含至少兩個(gè)氨基酸修飾。
18. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體在所述親代Fc多肽的Fc 區(qū)包含至少三個(gè)氨基酸修飾。
19. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體在所述親代Fc多肽的Fc 區(qū)包含至少四個(gè)氨基酸》務(wù)飾。
20. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fc變體 對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出增高。
21. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fc變體 對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出降低。
22. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fc變體 對(duì)FqR的結(jié)合顯示出增高。
23. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體對(duì)FcyR和FcRn的結(jié)合 顯示出增高。
24. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體對(duì)FcyR和FcRn的結(jié)合 顯示出降低。
25. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體對(duì)FcyR的結(jié)合顯示出降 低，對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出增高。
26. 依照權(quán)利要求16的Fc變體，其中所述Fc變體對(duì)FcYR的結(jié)合顯示出增 高，對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出降低。
27. 親代多肽的Fc變體，其在所述親代多肽的Fc區(qū)包含至少一個(gè)氨基 酸修飾，與所述親代多肽相比，所述Fc變體對(duì)FcRn的結(jié)合顯示出改變， 且所述Fc變體包含在特異于靶分子的多肽中，所述靶分子是從細(xì)胞因子、 可溶性蛋白因子和癌細(xì)胞上表達(dá)的蛋白組成的群組中選出的。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及優(yōu)化的IgG免疫球蛋白變體，產(chǎn)生他們的加工方法以及他們的應(yīng)用，特別是用于治療目的。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101098890SQ200580046520
公開(kāi)日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者格雷戈里·A·拉扎爾, 約斯特·維爾梅特, 約翰·R·德斯賈萊斯, 肖恩·C·約德, 謝爾·B·卡基, 阿倫·K·張伯倫 申請(qǐng)人:贊科股份有限公司