專利名稱：與FcRn結(jié)合改變的Fc變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請涉及優(yōu)化的IgG免疫球蛋白變體、用于制備它們的工程化方法、以及它們 的應(yīng)用，尤其是用于治療目的的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
抗體是與特異性抗原結(jié)合的免疫蛋白。在包括人和小鼠在內(nèi)的大多數(shù)哺乳動(dòng)物 中，抗體是由成對的多肽重鏈和輕鏈構(gòu)成的。每個(gè)鏈由各自的免疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域構(gòu) 成，因此將通用術(shù)語免疫球蛋白用于這種蛋白。每條鏈由兩個(gè)不同的區(qū)域構(gòu)成，這兩個(gè)不同 的區(qū)域稱為可變區(qū)和恒定區(qū)。輕鏈和重鏈可變區(qū)在抗體之間顯示明顯的序列多樣性，并且 負(fù)責(zé)結(jié)合靶抗原。恒定區(qū)顯示較少的序列多樣性，并且負(fù)責(zé)結(jié)合許多天然蛋白以引發(fā)重要 的生物化學(xué)事件。在人中，有5種不同種類的抗體，包括IgA(它包括IgAl和IgA2亞類)、 IgD, IgE, IgG (它包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4亞類)、以及IgM0這些抗體種類之間的區(qū) 別特征為他們的恒定區(qū)，盡管V區(qū)也可能存在細(xì)微的不同。

圖1顯示了 IgGl抗體，它在此 處作為實(shí)例來描述免疫球蛋白的一般結(jié)構(gòu)特征。IgG抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成的 四聚體蛋白。IgG重鏈由四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域從N-末端至C-末端以VH-CH1-CH2-CH3的 順序連接構(gòu)成，VH-CH1-CH2-CH3分別是指重鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈恒定結(jié)構(gòu)域1、重鏈恒定結(jié) 構(gòu)域2、和重鏈恒定結(jié)構(gòu)域3 (也稱為VH-C y I-C y 2-C γ 3，分別是指重鏈可變結(jié)構(gòu)域、、1 恒定結(jié)構(gòu)域、Y 2恒定結(jié)構(gòu)域、和Y 3恒定結(jié)構(gòu)域)。IgG輕鏈由兩個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域從 N-末端至C末端以VL-CL的順序連接構(gòu)成，VL-CL分別是指輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和輕鏈恒定結(jié) 構(gòu)域。抗體的可變區(qū)含有分子的抗原結(jié)合決定簇，因此決定著抗體對其靶抗原的特異 性?？勺儏^(qū)如此命名是因?yàn)樗c同種類的其他抗體在序列上最不相同。大部分的序列變異 存在于互補(bǔ)決定區(qū)。共有6種⑶R，重鏈和輕鏈各三種，它們命名為VH⑶R1、VH⑶R2、VH ⑶R3、VL⑶R1、VL⑶R2、和VL⑶R3。⑶R之外的可變區(qū)稱為框架(FR)區(qū)。盡管不如⑶R那么 多樣化，在不同抗體的FR區(qū)之間確實(shí)存在序列變異?？偟膩碚f，抗體的這種特征結(jié)構(gòu)提供 了穩(wěn)定的骨架(FR區(qū))，免疫系統(tǒng)可以在該骨架上開發(fā)出豐富的抗原結(jié)合多樣性(CDR)以獲 得對大量抗原的特異性。從不同的生物體中可以得到用于多種可變區(qū)片段的大量高度溶解
5結(jié)構(gòu)，一些是未結(jié)合的，一些為與抗原的復(fù)合體。已經(jīng)很好地表征了抗體可變區(qū)的序列和結(jié) 構(gòu)特征(Morea等人，1997，Biophys Chem 68 :9_16 ；Morea等人，2000，Methods20 :267_279， 全文通過引用并入)，抗體的保守特征使得能夠開發(fā)出大量的抗體工程化技術(shù)(Maynard等 Λ, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2 :339_376，其通過引用整體并入)。例如，將來自一種抗體 例如鼠抗體的CDR移植到另一種抗體例如人抗體的框架區(qū)是可能的。這個(gè)過程在本領(lǐng)域內(nèi) 稱為“人源化”，它使得能夠從非人抗體產(chǎn)生較小免疫原性的抗體治療劑。包含可變區(qū)的片 段可以在不存在抗體的其他區(qū)域時(shí)存在，它們包括，例如包含VH-C y 1和VH-CL的抗原結(jié)合 片段(Fab)、包含VH和VL的可變片段(Fv)、包含在相同的鏈上連接在一起的VH和VL的單 鏈可變片段(scFv)，以及多種其他的可變區(qū)片段(Little等人，2000，Immunol Today 21 364-370，通過引用整體并入)。 抗體的Fc區(qū)與大量Fc受體和配體相互作用，賦予它們一系列重要的功能，該功 能稱為效應(yīng)子功能。對于IgG，如圖1和2所示，F(xiàn)c區(qū)包含Ig結(jié)構(gòu)域C γ 2和C γ 3，N-末 端鉸鏈連入Cy2中。IgG種類的Fc受體的一個(gè)重要家族是Fc γ受體(FcyR)。這些受 體介導(dǎo)著抗體和免疫系統(tǒng)細(xì)胞臂之間的通訊(Raghavan等人，1996，Armu Rev Cell Dev Biol 12 181-220 ;Ravetch 等人，2001，Annu Rev Immunol 19 :275_290，它們都通過引用 整體并入)。在人中，這個(gè)蛋白家族包括Fc y RI (⑶64)，其包括同種型Fc y RIa、Fc y Rib、 和FcyRIC ；Fc γ RII (CD32)，其包括同種型Fc γ RIIa(包括同種異型Η131和R131)、 Fc γ RIIb (包括 Fc YRIIb-I 禾口 Fc γ RIIb—2)、禾口 Fc γ RIIc ；以及 Fc γ RIII (CD16)，其包括同 種型Fc ￥1 111&(包括同種異型￥158和？158)和Fc γ RIIIb (包括同種異型Fc γ RIIIb-NAl 和 Fc YRIIIb-NA2) (Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82 :57_65，其通過引用整體并 入)。這些受體通常具有介導(dǎo)與Fc結(jié)合的胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)、和可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的一些 信號傳導(dǎo)事件的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。這些受體在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、 嗜中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗氏 (Langerhans)細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、和、Y T細(xì)胞。Fc/Fc γ R復(fù)合體的形成將這些效 應(yīng)子細(xì)胞募集到結(jié)合抗原的位點(diǎn)，這通常會(huì)在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生信號傳導(dǎo)事件和隨后的重要的免 疫反應(yīng)，如炎癥介質(zhì)的釋放、B細(xì)胞活化、內(nèi)吞作用、吞噬作用、和細(xì)胞毒性侵襲。介導(dǎo)細(xì)胞 毒性和吞噬效應(yīng)子功能的能力是抗體損壞靶細(xì)胞的可能機(jī)制。其中表達(dá)Fc γ R的非特異 性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞裂解的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC) (Raghavan等人，1996，AnnuRev Cell Dev Biol 12 181-220 ；Ghetie 等人，2000，Annu Rev Immunol 18 :739_766 ；Ravetch 等人，2001，Annu Rev Immunol 19 :275_290，它們都通過引用整體并入)。其中表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞 毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上結(jié)合的抗體，并隨后引起靶細(xì)胞的吞噬作用的細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)稱為 抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用(ADCP)。已經(jīng)得出了人Fc γ R的胞外結(jié)構(gòu)域的許多結(jié)構(gòu)， 包括Fc γ RIIa (pdb登錄號1H9V，通過引用整體并入)(Sondermann等人，2001，J Mol Biol 309 :737-749，通過引用整體并入)(pdb登錄號1FCG，通過引用整體并入)(Maxwell等人， 1999，Nat Struct Biol 6 :437_442，通過引用整體并入)、Fc γ RIIb (pdb 登錄號 2FCB，通 過引用整體并入)(Sondermann等人，1999，Embo J 18 :1095_1103，通過引用整體并入)； 和 Fc γ RIIIb (pdb 登錄號 1E4J，通過引用整體并入)(Sondermann 等人，2000，Nature406 267-273，通過引用整體并入)。所有的Fc γ R結(jié)合Fc上在C γ 2結(jié)構(gòu)域上的N-末端和前面的
6鉸鏈區(qū)的相同區(qū)域，顯示在圖1中。這種相互作用已在結(jié)構(gòu)上充分鑒定(Sondermarm等人， 2001, J Mol Biol 309 :737-749，它們通過引用整體并入)，并且已經(jīng)得到了與人Fc γ RIIIb 的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人Fc的幾種結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1E4K，通過引用整體并入)(Sondermarm 等人，2000，Nature 406 :267_273，通過引用整體并入)(pdb登錄號IIIS和1IIX，通過引用 整體并入)(Radaev等人，2001，J Biol Chem 276 16469-16477，通過引用整體并入)，并且 它們具有人IgE Fc/Fc ε RI α復(fù)合體的結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1F6A，通過引用整體并入)(Garman 等人，2000，Nature 406 :259_266，通過引用整體并入)?？梢酝ㄟ^Fc區(qū)的變體來改變效應(yīng) 子功能反應(yīng)(Lazar 等人 2006 Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111) :4005_4010，通過引用整 體并入)。不同IgG亞類對Fc γ R具有不同的親和力，其中IgGl和IgG3與受體的結(jié)合通常 基本上比IgG2禾口 IgG4更好(Jefferis等人，2002，Immunol Lett82 :57_65，通過引用整體 并入)。所有的FcyR結(jié)合IgG Fc上的相同區(qū)域，但是具有不同的親和力高親和力的結(jié) 合物Fc γ RI對IgGl的Kd為ΙΟΛΓ1，而低親和力受體Fc γ RII和Fc γ RIII 一般分別以IO"6 和1(Γ5結(jié)合。Fc y RIIIa和Fc y RIIIb的胞外結(jié)構(gòu)域96%相同；然而Fc y RIIIb不具有胞 內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。此外，盡管Fc y RI.Fc y Rlla/c、和Fc Y RIIIa是觸發(fā)免疫復(fù)合體的激 活的正調(diào)節(jié)子，它們的特征是具有胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，該胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域具有基于免疫受體酪氨酸的 激活基序(ITAM)；但是Fc γ RIIb則具有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)，因此它 是抑制性的。因此，前一類被稱為激活受體，F(xiàn)c γ RIIb被稱為抑制受體。受體在不同免疫 細(xì)胞中的表達(dá)模式和水平也不同。然而另一水平的復(fù)雜性是人蛋白質(zhì)組中存在大量Fc γ R 多態(tài)現(xiàn)象。具有臨床重要性的尤其相關(guān)多態(tài)現(xiàn)象為V158/F158FCYRIIIa。人IgGl與V158 同種異型結(jié)合的親和力大于與F158同種異型結(jié)合的親和力。已經(jīng)顯示這種親和力的不同， 以及推測的其對ADCC和/或ADCP的作用的不同是抗CD20抗體利妥昔單抗(Rituxan BiogenIdec)的效力的重要決定因素。具有V158同種異型的患者對利妥昔單抗治療反應(yīng) 良好；而具有低親和力F158同種異型的患者則反應(yīng)較弱(Cartron等人，2002，Blood 99 754-758，通過引用整體并入)。約10-20%的人是V158/V158純和的，45%是V158/F158雜 合的，35-45% 的人是 F158/F158 純和的(Lehrnbecher 等人，1999，Blood 94:4220-4232; Cartron等人，2002，Blood 99 :754_758，它們都通過引用整體并入)。因此，80-90%的人是 弱反應(yīng)者，即，它們具有至少一個(gè)F158Fc YRIIIa等位基因。Fc上的重疊但是單獨(dú)的位點(diǎn)(圖1中顯示)充當(dāng)了補(bǔ)體蛋白Clq的結(jié)合點(diǎn)。與Fe/ Fc γ R的結(jié)合介導(dǎo)ADCC的方式相同，F(xiàn)c/Clq的結(jié)合介導(dǎo)補(bǔ)體依賴性的細(xì)胞毒作用(⑶C)。 Clq與絲氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復(fù)合體從而形成Cl復(fù)合體。Clq能夠結(jié)合6種抗體， 然而與兩種IgG的結(jié)合就足以激活補(bǔ)體級聯(lián)。與Fc和Fc γ R的相互作用類似，不同IgG亞 類對Clq具有不同的親和力，其中IgGl和IgG3與Fc γ R的結(jié)合通?；旧媳菼gG2和IgG4 更好(Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82 :57_65，通過引用整體并入)。在IgG中，F(xiàn)c上Cg2和Cg3結(jié)構(gòu)域之間的位點(diǎn)(圖1)介導(dǎo)與新生兒受體FcRn的 相互作用，新生兒受體FcRn的結(jié)合會(huì)從內(nèi)體中將內(nèi)吞的抗體再循環(huán)回血流中(Raghavan 等人，1996，Annu Rev Cell Dev Biol 12 181-220 ;Ghetie 等人，2000，Annu Rev Immunol 18 :739-76，它們都通過引用整體并入)。這個(gè)過程結(jié)合由于全長分子的大尺寸所引起的 腎過濾的排除致使有利抗體的血清半衰期介于1至3周。Fc與FcRn的結(jié)合還在抗體運(yùn)輸中起關(guān)鍵作用。Fc上的FcRn結(jié)合位點(diǎn)也是細(xì)菌蛋白A和G結(jié)合的位點(diǎn)。通常使用這些蛋 白的緊密結(jié)合作為純化抗體的方法，該方法在蛋白純化期間采用蛋白A或蛋白G親和色譜 進(jìn)行。因此，F(xiàn)c上這個(gè)區(qū)域的保真性對于抗體的臨床特性和它們的純化很重要。大鼠Fe/ FcRn 復(fù)合體(Burmeister 等人，1994，Nature, 372 :379_383 ；Martin 等人，2001，Mol Cell 7 =867-877,它們都通過引用整體并入)、以及Fc與蛋白A和G的復(fù)合體(Deisenhofer, 1981，Biochemistry 20 :2361_2370 ；Sauer-Eriksson 等人，1995，Structure 3 :265_278 ； Tashiro等人，1995，Curr Opin Struct Biol 5 :471_481，它們都通過引用整體并入)的可 用結(jié)構(gòu)使得能夠深入了解Fc與這些蛋白的相互作用。FcRn受體還負(fù)責(zé)將IgG轉(zhuǎn)移到新生 兒的腸和成人腸表皮腔(Ghetie 和 Ward，Annu. Rev. Immunol.，2000，18 :739_766 ；Yoshida 等人，Immunity, 2004, 20 (6) :769_783，它們都通過引用整體并入)。大鼠和人Fc結(jié)構(gòu)域的研究證明了一些Fc殘基對FcRn結(jié)合的重要性。大鼠和人 序列在Fc區(qū)(根據(jù)Kabat等人的編號為殘基237-443)具有約64%的序列同一性。關(guān)于 大鼠/人的Fc、FcRn重鏈和FcRn輕鏈(β -2-微球蛋白)的比對參見圖3、4和5。已經(jīng)從 大鼠Fc/FcRn復(fù)合體的現(xiàn)有結(jié)構(gòu)建立了人Fc/FcRn復(fù)合體的模型(Martin等人，2001，Mol Cell 7:867-877，通過引用整體并入)。大鼠和人序列共有對于FcRn結(jié)合很關(guān)鍵的一些殘 基，例如 H310 和 H435 (Medesan 等人，1997J. Immunol. 158(5) :221_7 ；Shields 等人，2001， J. Biol. Chem. 276 (9) =6591-6604,它們都通過引用整體并入)。然而，在許多位置，人和大 鼠蛋白具有不同的氨基酸，使得人序列中的殘基與大鼠序列中的殘基具有不同的環(huán)境，并 且可能具有不同的特征。這種變異性限制了將特征從一個(gè)同源物轉(zhuǎn)移到另一同源物的能 力。在鼠Fc中，在T252、T254、和T256位點(diǎn)的隨機(jī)突變和噬菌體展示選擇產(chǎn)生了三 突變體T252L/T254S/T256F，該三突變體的FcRn親和力增加了 3. 5倍，血清半衰期增加了 1. 5 倍(Ghetie 等人，1997，Nat. Biotech. 15(7) :637_640，通過引用整體并入)。通過在 位置253、310和435突變破壞Fc/FcRn的相互作用還導(dǎo)致體內(nèi)半衰期降低(Medesan等人 J. Immunol. 1997158(5) :2211_7，通過引用整體并入)。大鼠Fc/FcRn復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)鑒定出了對于FcRn結(jié)合很重要的Fc殘 基(Burmeister 等人 Nature. 372 :379_383(1994) ；Martin 等人 Molecular Cell. 7 867-877(2001)，它們都通過引用整體并入)。最初Fc/FcRn復(fù)合體結(jié)構(gòu)在1994年解析， 分辨率為6人(表2a，Burmeister等人Nature. 372 :379-383 (1994)，其通過引用整體并 入)。2001年Marin等人解析了較高分辨率的結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)顯示了更詳細(xì)的側(cè)鏈位置視圖 (Martin等人Molecular Cell. 7 :867_877 (2001)，其通過引用整體并入)。這種大鼠Fc與 大鼠FcRn結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)是使用具有一個(gè)含有突變T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/ H435E的單體和一個(gè)含有野生型Fc單體的單體的Fc 二聚體解析的，含有所述突變的單體破 壞FcRn結(jié)合。已經(jīng)在人Fc γ中對一些對于與FcRn結(jié)合很重要的殘基進(jìn)行了突變研究，并且已 經(jīng)證明它們具有增加的血清半衰期。在人Fc Yl中，Hinton等人將三個(gè)殘基分別突變?yōu)榱?外19種常見的氨基酸。Hinton等人發(fā)現(xiàn)某些點(diǎn)會(huì)突變?yōu)镕cRn結(jié)合親和力增加的雙突變體 (Hinton 等人 2004，J. Biol. Chem. 279(8) :6213_6216· Hinton 等人 Journal of Immunology 2006,176 :346-356，它們都通過引用整體并入)。在猴子中，兩種突變具有增加的半衰期。
8Shields等人將殘基幾乎都突變?yōu)锳la，并且研究了它們與FcRn和Fc γ R的結(jié)合(Shields 等人，2001，J. Biol. Chem.，276 (9) =6591-6604,通過引用整體并入)。Dair Acqua等人使用噬菌體展示選擇了與FcRn結(jié)合的親和力增加的Fc突變 (Dair Acqua 等人 2002，J. Immunol. 169 :5171_5180，通過引用整體并入)。所選擇的 DNA 序列主要為雙突變體和三突變體。該參考文獻(xiàn)表達(dá)了他們所選擇的序列中的一些所編碼的 蛋白，并且發(fā)現(xiàn)某些能比野生型Fc更緊密地結(jié)合FcRn?？贵w和Fc融合蛋白作為治療劑的施用需要指定頻率的注射，該指定頻率與所述 蛋白的清除和半衰期特征相關(guān)。較長的體內(nèi)半衰期容許更少地注射或較低的劑量，這很明 顯是有利的。盡管過去在Fc結(jié)構(gòu)域中的突變已經(jīng)得到了具有增加的FcRn結(jié)合親和力和體 內(nèi)半衰期的一些蛋白，但是這些突變還沒有鑒定最佳的突變和增強(qiáng)的體內(nèi)半衰期。Fc區(qū)的一個(gè)特征是在N297處發(fā)生的N-連接的糖基化是保守的，在圖1中顯 示。這種碳水化合物或有時(shí)稱為寡糖，在抗體中起著關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)和功能作用，并且是抗體 必須使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)制備的一個(gè)主要原因。Umafia等人，1999，Nat Biotechnol 17 :176-180 ;Davies 等人，2001，BiotechnolBioeng 74 288-294 ；Mimura ^ 人，2001， J Biol Chem 276:45539-45547. ；Radaev 等人，2001，J Biol Chem 276 16478-16483 ； Shields 等人，2001，J BiolChem 276 :6591_6604 ；Shields 等人，2002，J Biol Chem 277 26733-26740 ;Simmons 等人，2002，J Immunol Methods 263 :133_147 ;Radaev 等人，2001， JBiol Chem 276 16469-16477 ；以及 Krapp 等人，2003，J Mol Biol 325 :979_989，它們都 通過引用整體并入?？贵w已經(jīng)被開發(fā)用于治療用途。關(guān)于這種治療的代表性公開物包括Chamow等 A, 1996, Trends Biotechnol 14 52-60 ；Ashkenazi φ A,1997, CurrOpin Immunol 9 195-200 ;Cragg 等人，1999，Curr Opin Immunol 11 :541_547 ;Glennie 等人，2000，Immunol Today 21 :403_410 ;McLaughlin 等人，1998，JClin Oncol 16 :2825_2833 ；以及 Cobleigh 等人，1999，J Clin Oncol 17 :2639_2648，它們都通過引用整體并入。對于目前的抗癌治療， 死亡率方面的任何小的改進(jìn)就表明了成功。本文所公開的某些IgG變體增強(qiáng)了抗體限制靶 癌細(xì)胞的進(jìn)一步生長或至少部分破壞靶癌細(xì)胞的能力。抗體的抗腫瘤效力是通過增強(qiáng)它們介導(dǎo)細(xì)胞毒效應(yīng)子功能例如ADCC、ADCP、和 CDC 的能力而達(dá)成的。實(shí)例包括 Clynes 等人，1998，ProcNatl Acad Sci USA 95:652-656; Clynes 等人，2000，Nat Med 6 443-446 以及 Cartron 等人，2002，Blood 99 :754_758，它們 都通過引用整體并入。人IgGl是用于治療目的的最常用的抗體，并且在此方面已經(jīng)進(jìn)行了大量的工程 化研究。然而，IgG種類的不同同種型包括IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4具有獨(dú)特的物理、生 物和臨床特性。在本領(lǐng)域內(nèi)需要設(shè)計(jì)改良的IgGl、IgG2、IgG3、和IgG4變體。還需要設(shè)計(jì) 與天然IgG多肽相比改良了與FcRn的結(jié)合和/或增加了體內(nèi)半衰期的這類變體。此外，需 要將具有改良的藥代動(dòng)力學(xué)特性的變體與包括通過改變的Fc γ R結(jié)合而改善效力的修飾 的變體組合。本申請滿足了這些和其他的需求。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及親本多肽的Fc變體，該變體包括在多肽的Fc區(qū)的至少一個(gè)修飾。在 各實(shí)施方式中，所述變體多肽表現(xiàn)出與親本多肽相比改變的與FcRn的結(jié)合。在某些變化形
9式中，修飾可以選自由下列組成的組246H、246S、247D、247T、248H、248P、248Q、248R、248Y、 249T、249W、250E、250I、250Q、250V、251D、251E、251H、251I、251K、251M、251N、251T、251V、 251Y、252Q、252Y、253L、253T、253V、254H、254L、254N、254T、254V、 ~254N、255E、255F、255H、 255K、255S、255V、256E、256V、257A、257C、257D、257E、257F、257G、257H、257I、257K、257L、 257M、257N、257Q、257R、257S、257T、257V、257W、257Y、258R、258V、259I、279A、279D、279C、 279F、279G、279H、279I、279K、279M、279N、279P、279Q、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、 280H、 "281A、 "281D、 "281S、 ~281T、282D、282F、282H、282I、282T、283F、283I、283L、283Y、 284H、284K、284P、284Q、284R、284S、284Y、285S、285V、286D、286#、286L、287H、287S、287V、 287Y、288H、288Q、288S、305H、305T、306F、306H、306I、306N、306T、306V、306Y、307D、307P、 307Q、307S、307V、307Y、308C、308D、308E、308F、308G、308H、308I、308K、308L、308M、308N、 308Q、308P、308R、308S、308W、308Y、309F、309H、309N、309Q、309V、309Y、310K、310N、310T、 311A、311L、311P、311T、311V、311W、312H、313Y、315E、315G、315H、315Q、315S、315T、317H、 317S、319F、319F、319L、339P、340P、341S、374H、374S、376H、376L、378H、378N、380A、380T、 380Y、382H、383H、383K、383Q、384E、384G、384H、385A、385C、385F、385H、385I、385K、385L、 385M、385N、385P、385Q、385S、385T、385V、385W、385Y、386E、386K、387#、387A、387H、387K、 387Q、389E、389H、426E、426H、426L、426N、426R、426V、426Y、427I、428F、428L、429D、429F、 429K、429N、429Q、429S、429T、429Y、430D、430H、430K、430L、430Q、430Y、431G、431H、431I、 431P、431P、431S、432F、432H、432N、432S、432V、433E、433P、433S、434A、434F、434H、434L、 434M、434Q、434S、434Y、435N、436E、436F、436L、436V、436W、437E、437V、438H、和 438K,其中 編號是根據(jù)Kabat等人的EU索引進(jìn)行，并且“是在所指示位置后插入，#是在所指示位置 的缺失。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 250Q/252Y、250Q/256E、250Q/286D、250Q/308F、250Q/308Y、250Q/311A、250Q/311V、 250Q/380A、250Q/428L、250Q/428F、250Q/434H、250Q/434F、250Q/434Y、250Q/434A、 250Q/434M、和 250Q/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 250E/252Y、250E/256E、250E/286D、250E/308F、250E/308Y、250E/311A、250E/311V、 250E/380A,250E/428L,250E/428F,250E/434H,250E/434F,250E/434Y,250E/434A, 250E/434M、和 250E/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 252Y/250Q、252Y/250E、252Y/256E、252Y/286D、252Y/308F、252Y/308Y、252Y/311A、 252Y/311V、252Y/380A、252Y/428L、252Y/428F、252Y/434H、252Y/434F、252Y/434Y、 252Y/434A、252Y/434M、和 252Y/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 256E/250Q、256E/250E、256E/252Y、256E/286D、256E/308F、256E/308Y、256E/311A、 256E/311V、256E/380A、256E/428L、256E/428F、256E/434H、256E/434F、256E/434Y、 256E/434A、256E/434M、和 256E/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 286D/250Q、286D/250E、286D/252Y、286D/256E、286D/308F、286D/308Y、286D/311A、286D/311V、286D/380A、286D/428L、286D/428F、286D/434H、286D/434F、286D/434Y、 286D/434A、286D/434M、和 286D/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 308F/250Q、308F/250E、308F/252Y、308F/256E、308F/286D、308F/311A、308F/311V、 308F/380A、308F/428L、308F/428F、308F/434H、308F/434F、308F/434Y、308F/434A、 308F/434M、和 308F/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 308Y/250Q、308Y/250E、308Y/252Y、308Y/256E、308Y/286D、308Y/311A、308Y/311V、 308Y/380A、308Y/428L、308Y/428F、308Y/434H、308Y/434F、308Y/434Y、308Y/434A、 308Y/434M、和 308Y/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 311A/250Q、311A/250E、311A/252Y、311A/256E、311A/286D、311A/308F、311A/308Y、 311A/380A、311A/428L、311A/428F、311A/434H、311A/434F、311A/434Y、311A/434A、 311A/434M、和 311A/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 311V/250Q、311V/250E、311V/252Y、311V/256E、311V/286D、311V/308F、311V/308Y、 311V/380A、311V/428L、311V/428F、311V/434H、311V/434F、311V/434Y、311V/434A、 311V/434M、和 311V/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 380A/250Q、380A/250E、380A/252Y、380A/256E、380A/286D、380A/308F、380A/308Y、 380A/311A、380A/311V、380A/428L、380A/428F、380A/434H、380A/434F、380A/434Y、 380A/434A、380A/434M、和 380A/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 428L/250Q、428L/250E、428L/252Y、428L/256E、428L/286D、428L/308F、428L/308Y、 428L/311A、428L/311V、428L/380A、428L/434H、428L/434F、428L/434Y、428L/434A、 428L/434M、和 428L/434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 434H/250Q、434H/250E、434H/252Y、434H/256E、434H/286D、434H/308F、434H/308Y、 434H/311A、434H/311V、434H/380A、434H/428L、和 434H/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 434F/250Q、434F/250E、434F/252Y、434F/256E、434F/286D、434F/308F、434F/308Y、 434F/311A、434F/311 V、434F/380A、434F/428L、和 434F/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 434Y/250Q、434Y/250E、434Y/252Y、434Y/256E、434Y/286D、434Y/308F、434Y/308Y、 434Y/31 ΙΑ、434Y/311 V、434Y/380A、434Y/428L、和 434Y/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 434A/250Q、434A/250E、434A/252Y、434A/256E、434A/286D、434A/308F、434A/308Y、 434A/311A、434A/311V、434A/380A、434A/428L、和 434A/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾434M/250Q、434M/250E、434M/252Y、434M/256E、434M/286D、434M/308F、434M/308Y、 434M/31 ΙΑ、434M/311 V、434M/380A、434M/428L、和 434M/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾 434S/250Q、434S/250E、434S/252Y、434S/256E、434S/286D、434S/308F、434S/308Y、 434S/311A、434S/311V、434S/380A、434S/428L、和 434S/428F。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾Y319L、 T307Q、V259I、M252Y、V259I/N434S, M428L/N434S, V308F/N434S、M252Y/S254T/T256E/ N434S、M252Y/S254T/T256E/V308F、M252Y/S254T/T256E/M428L、V308F/M428L/N434S、 V259I/V308F/N434S、T307Q/V308F/N434S、T250I/V308F/N434S、V308F/Y319L/N434S、 V259I/V308F/M428L、V259I/T307Q/V308F, T250I/V259I/V308F, V259I/V308F/Y319L、 T307Q/V308F/L309Y、T307Q/V308F/Y319L、和 T250Q/V308F/M428L。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾Y319L、 T307Q、V259I、M252Y、V259I/N434S、M428L/N434S、V308F/N434S、V308F/M428L/N434S、 V259I/V308F/N434S、T307Q/V308F/N434S、T250I/V308F/N434S、V308F/Y319L/N434S、 V259I/V308F/M428L、V259I/T307Q/V308F、T250I/V259I/V308F、V259I/V308F/Y319L, T307Q/V308F/L309Y、T307Q/V308F/Y319L、和 T250Q/V308F/M428L。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾2501、 250V、252Q、252Y、254T、256V、259I、307P、307Q、307S、308F、309N、309Y、311P、319F、319L、 428L、和 434S。在另一變化形式中，F(xiàn)c變體包括選自由下列組成的組的至少一個(gè)修飾 250V/308F、250I/308F、254T/308F、256V/308F、259I/308F、307P/208F、307Q/308F、 307S/308F、308F/309Y、308F/309Y、V308F/311P、308F/319L、308F/319F、308F/428L、 252Q/308F、M252Y/S254T/T256E、259I/434S、428L/434S、308F/434S、308F/428L/434S、 259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S、308F/319L/434S、259I/308F/428L、 259I/307Q/308F、250I/259I/308F、259I/308F/319L、307Q/308F/309Y、307Q/308F/319L、和 250Q/308F/428Lo在另一變化形式中，本發(fā)明包括治療需要所述治療的患者的方法，該方法包括施 用有效量的本文所述的Fc變體。在另一變化形式中，本發(fā)明包括通過根據(jù)本文所述的修飾對Fc進(jìn)行修飾來增加 抗體或免疫粘附素的半衰期的方法。附圖簡述圖1.抗體結(jié)構(gòu)和功能。所顯示的是全長人IgGl抗體的模型，它使用來自pdb登 錄號ICEl的人源化Fab結(jié)構(gòu)(James等人，1999，J Mol Biol289 :293_301，通過引用整 體并入)和來自Pdb登錄號1DN2的人IgGl Fc結(jié)構(gòu)(DeLano等人，2000，Science 287 1279-1283，通過引用整體并入)進(jìn)行建模。未顯示連接Fab和Fc區(qū)的柔性鉸鏈。IgGl是異 源二聚體的同源二聚體，由兩條輕鏈和兩條重鏈構(gòu)成。標(biāo)記出了構(gòu)成抗體的Ig結(jié)構(gòu)域，包 括輕鏈的Vl和Cl,和重鏈的VhX伽馬I(Cyl)X伽馬2 (C γ 2)、和C伽馬3 (C γ 3) 0標(biāo)記出 了 Fc區(qū)。標(biāo)記出了相關(guān)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，包括可變區(qū)中的抗原結(jié)合位點(diǎn)和Fc區(qū)中Fc γ R、 FcRn、Clq和蛋白A和G的結(jié)合位點(diǎn)。
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圖2.本發(fā)明中所用的人IgG序列，其具有如Kabat等人的EU編號。圖3.本發(fā)明中所用的示例性人和嚙齒動(dòng)物IgG序列，其具有如Kabat的EU編號。圖4.本發(fā)明中所用的示例性人和嚙齒動(dòng)物FcRn重鏈序列。圖5.本發(fā)明中所用的示例性人和嚙齒動(dòng)物β -2-微球蛋白序列。圖6.由大鼠結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的人Fc/FcRn復(fù)合體模型(Burmeister等人，1994， Nature，372 :379-383 ;Martin 等人，2001，Mol Cell 7 :867_877，它們都通過引用整體并 入)。一些組氨酸殘基顯示為FcRn鏈(淺灰色)和Fc多肽(深灰色)上的空間填充原子。圖7.包含插入或缺失的變體的設(shè)計(jì)中所用的一些概念的圖示。圖8.本發(fā)明的變體。圖9.本發(fā)明的變體。圖10.本發(fā)明的變體。圖11.可用于Fc變體構(gòu)建體中的載體pcDNA3. 1 Zeo+的示意圖。圖12.野生型Fc和本發(fā)明的Fc變體的FcRn競爭性結(jié)合數(shù)據(jù)。在各圖中，本發(fā)明 的Fc變體顯示為左側(cè)(紅色或深灰色)曲線，野生型抗HER2抗體顯示為右側(cè)(藍(lán)色或淺 灰色)曲線。圖13. Fc變體的FcRn結(jié)合特性的概括。從左到右的縱列顯示FcRn結(jié)合修飾、所 用的免疫球蛋白、其他修飾、通過AlphaScreen 競爭測定所得的與野生型相比的相對FcRn 親和力(中值)、以及所進(jìn)行的測定的次數(shù)。相對的FcRn親和力數(shù)大于1. 0表明與野生型 相比結(jié)合增強(qiáng)。數(shù)據(jù)在PH 6.0(0. IM磷酸鈉、25mM氯化鈉)下收集。圖14. Fc變體的FcRn結(jié)合數(shù)據(jù)。Fc變體在阿侖單抗或抗HER2抗體中。所顯示的 是與野生型相比結(jié)合的增加倍數(shù)，也就是說，大于1的數(shù)表明與FcRn結(jié)合更緊密，而小于1 的數(shù)則表明與FcRn的結(jié)合減弱。圖15與FcRn結(jié)合被改善的Fc變體的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)的概況。柱形圖顯 示各變體的FcRn結(jié)合親和力與野生型Fc結(jié)構(gòu)域相比的增加倍數(shù)。圖16.野生型抗體和本發(fā)明的變體的表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)。所顯示的圖線是在 pH6. 0下Fc變體抗體與FcRn的結(jié)合和解離。圖17.本發(fā)明的Fc變體與FcRn的結(jié)合測定。所顯示的是在pH 6. 0 (a和b)和pH 7.0(c)下通過AlphaScreen 測量的直接結(jié)合測定。圖18.本發(fā)明的Fc變體與FcRn的結(jié)合測定。所顯示的是在變體Fc與表面結(jié)合 的FcRn結(jié)合后所產(chǎn)生的表面等離子體共振單位。圖19.在pH 6.0下本發(fā)明的Fc變體與人FcRn的結(jié)合親和力的表面等離子體共
振測量。圖20.本發(fā)明的Fc變體與人、獼猴和小鼠FcRn的結(jié)合親和力的表面等離子體共 振(SPR)測量概況。如通過將SPR曲線與1 1 Langmuir結(jié)合模型的擬合所測定，大于1 的數(shù)表明變體Fc與FcRn的結(jié)合增強(qiáng)。圖21. Fc變體的FcRn結(jié)合特性的概括。從左到右的縱列顯示FcRn結(jié)合修飾、所 用的免疫球蛋白、其他修飾、通過AlphaScreen 競爭測定所得的與野生型相比的相對FcRn 親和力(中值)、以及所進(jìn)行的測定的次數(shù)。相對的FcRn親和力數(shù)大于1. 0表明與野生型 相比結(jié)合增強(qiáng)了。數(shù)據(jù)在PH 6.0(0. IM磷酸鈉、125mM氯化鈉)下收集。
圖22.抗HER2抗體重鏈和輕鏈的氨基酸序列。圖23.本文所用的某些IgGl重鏈的恒定區(qū)(CHl至CH3)的氨基酸序列。圖24.本文所用的某些雜合IgGlA重鏈的恒定區(qū)(CHl至CH3)的氨基酸序列。圖25.如用AlphaScreen 競爭測定所測得的Fc變體與人Fc y RIIIA(V158同種 異型)的結(jié)合。圖26.如用AlphaScreen 競爭測定所測得的Fc變體與蛋白A的結(jié)合。圖27.野生型和人FcRn敲入小鼠的抗體變體的血清濃度。所用的抗VEGF抗體為 野生型(空正方形)、V308F (實(shí)正方形)、P257L (實(shí)三角形)和P257N (交叉線)。圖28.結(jié)合本發(fā)明的變體的FcRn的實(shí)例。列出了抗VEGF抗體與培養(yǎng)基的體積和 純化蛋白的產(chǎn)量。圖29.在PH6.0下本發(fā)明的變體與人FcRn的結(jié)合親和力。所顯示的值為所討論 的變體相對于野生型抗體的結(jié)合強(qiáng)度的增加倍數(shù)。例如，變體434S與FcRn的結(jié)合比野生 型抗體緊密4. 4倍。圖30.野生型和變體抗體與293T細(xì)胞表面上的FcRn的結(jié)合。圖31.包含多個(gè)取代的本發(fā)明的組合變體。圖32.包含標(biāo)記為Ser434的434S的變體人CH3結(jié)構(gòu)域與人FcRn的相互作用圖。發(fā)明詳述本發(fā)明公開了新的Fc結(jié)構(gòu)域變體的制備，所述Fc結(jié)構(gòu)域變體包括在抗體、Fc融 合體、和免疫粘合素中存在的那些，所述Fc結(jié)構(gòu)域變體與FcRn受體的結(jié)合增強(qiáng)。如本文所 提到的，與FcRn的結(jié)合產(chǎn)生了較長的體內(nèi)血清滯留。為了增加體內(nèi)的Fc蛋白滯留，結(jié)合親和力的增加必須在約pH 6的條件下，而在約 PH 7. 4的條件下則保持較低的親和力。盡管仍處于檢測階段，但是相信Fc區(qū)具有較長的體 內(nèi)半衰期，因?yàn)樵赑H 6時(shí)在與內(nèi)體中？^ 11的結(jié)合隔離了？(；(61^^6和13『(1，1997 Immunol Today. 18(12) :592_598，通過引用整體并入)。然后內(nèi)體隔室將Fc再循環(huán)到細(xì)胞表面。一 旦隔室向胞外空間開放，較高的PH約7. 4便誘導(dǎo)Fc釋放回血液中。在小鼠中，DairAcqua 等人顯示在PH 6和pH 7. 4的條件下FcRn結(jié)合增加的Fc突變體實(shí)際上與野生型Fc相比 具有降低的血清濃度和相同的半衰期(Dall，Acqua等人2002，J. Immunol. 169 :5171_5180， 通過引用整體并入)。認(rèn)為在PH 7. 4時(shí)Fc與FcRn的親和力增加阻止了 Fc釋放回血液。 因此，增加Fc體內(nèi)半衰期的Fc突變理想地應(yīng)在較低pH下增加FcRn結(jié)合，而在較高pH下 則仍然容許Fc釋放。氨基酸組氨酸在6.0至7.4的pH范圍內(nèi)會(huì)改變其電荷狀態(tài)。因此， 在Fc/FcRn復(fù)合體的重要位置發(fā)現(xiàn)His殘基并不出乎意料(圖6)。本發(fā)明的另一方面是增加與野生型相比的FcRn結(jié)合，尤其是在較低的pH約pH6.0 下，以促進(jìn)Fc/FcRn在內(nèi)體中的結(jié)合。由于對Fc γ R的差異結(jié)合，尤其是與Fc Y RIIIb結(jié)合 增加并且與Fc γ RIIb結(jié)合降低，已顯示導(dǎo)致效力增加，還公開了與FcRn結(jié)合改變并且與另 一類Fc受體Fc γ R(有時(shí)寫為Fc伽馬R)的結(jié)合改變的Fc變體。定義為了可以更完整地理解本申請，下面列出了一些定義。這些定義的意思涵蓋語法 上的等同物。本文所用的“ADCC”或“抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用”意指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，
14其中表達(dá)Fc Y R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上所結(jié)合的抗體，并且隨后引起靶細(xì) 胞的裂解。本文所用的“ ADCP ”或抗體依賴件細(xì)胞介導(dǎo)的吞噬作用意指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng),其中 表達(dá)Fc γ R的非特異性細(xì)胞毒性細(xì)胞識別靶細(xì)胞上所結(jié)合的抗體，并且隨后引起靶細(xì)胞的 吞噬作用。本文所謂的“M&”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失，或者與蛋白 化學(xué)連接部分的改變。例如，修飾可以是連接到蛋白上的碳水化合物或PEG結(jié)構(gòu)的改變。本 文所謂的“氨^Mit飽”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失。本文所謂的“a^MMT’或“ΜΓ意指將在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 替換為另一氨基酸。例如，取代E272Y是指變體多肽，在這種情況下為Fc變體，其中位置 272處的谷氨酸被替換為酪氨酸。本文所謂的“氨某酸插入”或“插入”意指在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 序列的添加。例如，-233E或"233E是指在位置233后和位置234前的谷氨酸插入。此 外，-233ADE或"233ADE是指位置233之后和位置234之前的AlaAspGlu插入。本文所謂的“氨某酸缺失”或“缺失”意指在親本多肽序列的特定位置的氨基酸 序列的去除。例如，E233-或E233#是指在位置233處的谷氨酸缺失。此外，EDA233-或 EDA233#是指在位置233處開始的GluAspAla序列的缺失。本文所用的“變體蛋白”或“蛋白變體”、或“變體”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾 而與親本蛋白不同的蛋白。蛋白變體可以指蛋白本身、包含蛋白的組合物、或編碼它的氨基 酸序列。優(yōu)選地，蛋白變體與親本蛋白相比具有至少一個(gè)氨基酸修飾，例如與親本相比約1 至約10個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選約1至約5個(gè)氨基酸修飾。本文的蛋白變體序列優(yōu)選具有與親 本蛋白序列至少約80%的同源性，并且最優(yōu)選至少約90%的同源性，更優(yōu)選至少約95%的 同源性。變體蛋白可以指變體蛋白本身、包含蛋白變體的組合物、或編碼它的DNA序列。因 此,本文所用的“抗體變體”或“變體抗體”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與親本抗體不同 的抗體，本文所用的“ IgG變體”或“變體ISG”意指由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與親本IgG 不同的抗體，并目.本文所用的“免疫球蛋白變體”或“變體免疫球蛋白”意指由于至少一個(gè)氨 基酸修飾而與親本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。本文所用的“Fe變體”或“變體 壓”意指包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域中的修飾的蛋白。本發(fā)明的Fc變體根據(jù)構(gòu)成它們的氨基酸修飾來 定義。因此，例如，I332E是相對于親本Fc多肽具有取代I332E的Fc變體。同樣地，S239D/ I332E/G236A定義了相對于親本Fc多肽具有取代S239D、I332E、和G236A的Fc變體。野 生型氨基酸的身份可能是非特異性的，在這種情況下，上述變體稱為239D/332E/236A。注 意其中取代的順序是任意提供的，也就是說，例如，S239D/I332E/G236A是與G236A/S239D/ I332E相同的Fc變體，等等。對于本發(fā)明所討論的所有位置，編號根據(jù)EU索引或EU編號方 案(Kabat 等人，1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest (具有免疫學(xué)重 StiWSSii^J ),M 5 IK, UnitedStates Public Health Service, National Institutes of Health，通過引用整體并入本文)進(jìn)行。EU索引或如Kabat中的EU索引或EU編號方案 是指 EU 抗體的編號(Edelman 等人，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63 :78_85，其通過引 用整體并入本文)。修飾可以是添加、缺失、或取代。取代可以包括天然存在的氨基酸和非 天然存在的氨基酸。變體可以包含非天然氨基酸。實(shí)例包括US6586207 ;W0 98/48032 ；WO03/073238 ；US2004-0214988A1 ；W005/35727A2 ；WO 05/74524A2 J. W. Chin 等人，(2002)， Journal of theAmerican Chemical Society 124 :9026_9027 ;J.W.Chin 禾口 P. G. Schultz, (2002)，ChemBioChem 11 :1135-1137 ;J. W. Chin，等人，(2002)，PICAS United Statesof America 99 :11020_11024 ；以及 L. Wang和 P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10，它們通過引用
整體并入)。如本文所用在本文意指至少兩個(gè)共價(jià)連接的氨基酸，它包括蛋白、多肽、 寡肽和肽。肽基基團(tuán)可以包含天然存在的氨基酸和肽鍵、或合成的肽模擬物結(jié)構(gòu)，即“類似 物”，如類肽(參見Simon等人，PNAS USA89 (20) :9367 (1992)，其通過引用整體并入)。氨 基酸可以是天然存在的或非天然存在的，如本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員所了解的一樣。例如高 苯丙氨酸、瓜氨酸、和正亮氨酸是本發(fā)明目的所考慮的氨基酸，并且D-和L-(R或S)構(gòu)型的 氨基酸都可以使用。本發(fā)明的變體可以包含使用非天然氨基酸的修飾，這些非天然氨基酸 使用例如Schultz和同事所開發(fā)的技術(shù)來整合，所述技術(shù)包括但不下于下列文獻(xiàn)中所描述 的方法Cropp & Shultz, 2004, TrendsGenet. 20(12) :625_30 ;Anderson 等人，2004，Proc Natl Acad Sci USAlOl (2) :7566_71 ;Zhang 等人，2003，303 (5656) :371_3 ；和 Chin 等人， 2003, Science 301(5635) :964_7，它們?nèi)客ㄟ^引用整體并入。此外，多肽可以包括一個(gè)或 多個(gè)側(cè)鏈或末端的合成衍生、糖基化、PEG化、環(huán)狀排列、環(huán)化、與其他分子的連接子、與蛋白 或蛋白結(jié)構(gòu)域的融合體、以及肽標(biāo)簽或標(biāo)記的添加。本文所用的“_”意指蛋白的位置及其相關(guān)的氨基酸身份。例如，天冬酰胺 297(還稱為Asn297，也稱為N297)是人抗體IgGl中的殘基。本文所用的“Fab，，或“Fab區(qū)”意指包含VH、CHl、VL和CL免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的多 肽。Fab可以指分離狀態(tài)的這個(gè)區(qū)域，或在全長抗體、抗體片段或Fab融合蛋白背景下的這 個(gè)區(qū)域。本文所用的“IgG亞類修飾”意指將一種IgG同種型的一個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌摹?比對的IgG同種型的對應(yīng)氨基酸的氨基酸修飾。例如，由于在EU位置296處IgGl包含酪 氨酸，IgG2具有苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y取代被認(rèn)為是IgG亞類修飾。本文所用的“非天然存在的修飾”意指非同種型的氨基酸修飾。例如，由于沒有一 種IgG在位置332包含谷氨酸，所以IgGl、IgG2、IgG3、或IgG4中的取代I332E被認(rèn)為是非 天然存在的修飾。本文所用的“氨基酸”和“氨基酸身份”意指可以在特定的、指定的位置存在的20 種天然存在的氨基酸或任何非天然類似物中的一種。本文所用的“效應(yīng)子功能”意指由于抗體Fc區(qū)與Fc受體或配體的相互作用而引 起的生物化學(xué)事件。效應(yīng)子功能包括但不限于ADCC、ADCPJP⑶C。本文所用的“效應(yīng)子細(xì)胞”意指表達(dá)一種或多種Fc受體并且介導(dǎo)一種或多種效應(yīng) 子功能的免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。效應(yīng)子細(xì)胞包括但不限于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、 樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、血小板、B細(xì)胞、大顆粒淋巴細(xì)胞、朗氏細(xì)胞、自然殺傷 (NK)細(xì)胞、和γ δΤ細(xì)胞，并且它可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。本文所用的"IrG Fc配體”意指來自任何生物體的與IgG抗體的Fc區(qū)結(jié)合形成 Fc/Fc配體復(fù)合體的分子，優(yōu)選多肽。Fc配體包括但不限于Fc y R、Fc y R、Fc y R、FcRn、Clq、
16C3、結(jié)合甘露聚糖的凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌(staphylococcal)蛋白Α、葡萄球菌蛋 白G、和病毒Fc y R0 Fc配體還包括Fc受體同源物(FcRH)，它們是與Fc γ R同源的Fc受體 家族(Davis 等人，2002，ImmunologicalReviews 190 123-136，其通過引用整體并入)。Fc 配體可以包括結(jié)合Fc的未發(fā)現(xiàn)的分子。具體的IgG Fc配體是FcRn和Fc γ受體。本文所 用的“Fe配體”意指來自仵何牛物體的與抗體的Fc區(qū)結(jié)合形成Fc/Fc配體復(fù)合體的分子， 優(yōu)選多肽。本文所用的“Fe Y警體”、“Fc Y R”或“Fe伽馬R”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且由 Fc γ R基因編碼的蛋白家族的任何成員。在人中，這個(gè)家族包括但不限于Fc γ RI (⑶64)，其 包括同種型Fc y RIa、Fc y Rib、和Fc y RIc ；Fc y RII (CD32)，其包括同種型Fc y RIIa (包括 同種異型 Η131 禾口 R131)、Fc γ RIIb (包括 Fc YRIIb-I 禾口 Fc YRIIb—2)、禾口 Fc γ RIIc ；以及 Fc y RIII (CD16)，其包括同種型Fc y RIIIa (包括同種異型V158和F158)禾口 Fc γ RIIIb (包 括同種異型 Fc YRIIIb-NAl 和 Fc γ RIIIb-NA2) (Jefferis 等人，2002，Immunol Lett 82: 57-65，通過引用整體并入)；以及任何未發(fā)現(xiàn)的人FcyR或FCYR同種型或同種異型。 Fc γ R可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和猴。小鼠Fc γ R包括但不限 于 Fc γ RI (CD64)、Fc γ RII (CD32)、Fc γ RIII (CD16)、禾口 Fc γ RII1—2 (CD16—2)、以及任何未 發(fā)現(xiàn)的小鼠Fc γ R或Fc γ R同種型或同種異型。本文所用的“_”或“新牛兒Fc警體”意指結(jié)合IgG抗體Fc區(qū)并且至少部分 由FcRn基因編碼的蛋白。FcRn可以來自任何生物體，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、和 猴。如本領(lǐng)域所已知的，功能FcRn蛋白包含兩條多肽，它們通常稱為重鏈和輕鏈。輕鏈?zhǔn)?β -2-微球蛋白，重鏈由FcRn基因編碼。除非本文中另外指明，否則FcRn或FcRn蛋白是 指FcRn重鏈與β-2-微球蛋白的復(fù)合體。具體的感興趣的FcRn序列顯示在附圖中，特別 是人的。本文所用的“親本多肽”意指隨后被修飾產(chǎn)牛變體的未被修飾的多肽。親本多肽 可以是天然存在的多肽、或天然存在的多肽的變體或工程化形式。親本多肽可以指多肽本 身、包含親本多肽的組合物、或編碼它的氨基酸序列。因此,本文所用的“親本免疫球蛋白，， 意指被修飾產(chǎn)生變體的未被修飾的免疫球蛋白多肽，本文所用的“親本抗體”意指被修飾產(chǎn) 生變體抗體的未被修飾的抗體。應(yīng)了解“親本抗體”包括如下文中所列出的已知的商業(yè)上 的重組制備的抗體。本文所用的“位置”意指蛋白序列中的定位。位置可以順序編號，或者根據(jù)已建立 的形式例如Kabat中的EU索引編號。例如，位置297是人抗體IgGl中的位置。本文所用的“靶抗原”意指被給定抗體的可變R特異件結(jié)合的分子。靶抗原可以 是蛋白、碳水化合物、脂、或其他化合物。本文所用的“靶細(xì)胞”意指表達(dá)靶抗原的細(xì)胞。本文所用的“可變區(qū)”意指包含一個(gè)或多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白區(qū)域，所述一 個(gè)或多個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域基本上由分別構(gòu)成K、λ、和重鏈免疫球蛋白基因座的V Κ、νλ、和/或 VH基因的任一種編碼。本文所謂的“野牛型或WT”意指天然存在的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位基 因變異。WT蛋白具有未被有意修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。本發(fā)明涉及與FcRn的結(jié)合受調(diào)控的抗體(調(diào)控包括結(jié)合增加以及降低)。例如，
17在某些情況下，增加的結(jié)合導(dǎo)致抗體的細(xì)胞再循環(huán)并且由此增加了半衰期，例如用于治療 抗體的情況。可選擇地，降低的FcRn結(jié)合是期望的，例如，對于含有放射性標(biāo)記的診斷抗體 或治療抗體。此外，表現(xiàn)出與FcRn結(jié)合增加并且與其他Fc受體例如Fc γ R的結(jié)合有所改 變的抗體可用于本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了抗體?？贵w本申請涉及包含調(diào)節(jié)與FcRn的結(jié)合的氨基酸修飾的抗體。特別感興趣的是最低 限度地包含F(xiàn)c區(qū)或其功能變體的抗體，所述Fc區(qū)在較低的pH下表現(xiàn)出增加的結(jié)合親和 力，而在較高的PH下不表現(xiàn)出實(shí)質(zhì)的結(jié)合改變。傳統(tǒng)的抗體結(jié)構(gòu)單位通常包含四聚體。各四聚體通常由兩對相同的多肽鏈構(gòu)成， 每對具有一條“輕”鏈(通常具有約25kDa的分子量)和一條“重”鏈(通常具有約50-70kDa 的分子量)。人輕鏈被分為K和λ輕鏈。重鏈被分為μ、δ、Υ、α、或ε，它們分別將抗 體同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgAjP IgE。IgG具有幾個(gè)亞類，包括但不限于IgGl、IgG2、 IgG3、和IgG4。IgM具有包括但不限于IgMl和IgM2的亞類。因此，本文所用的“同種型”意 指通過免疫球蛋白恒定區(qū)的化學(xué)和抗原特征所定義的任何免疫球蛋白亞類。已知的人免疫 球蛋白同種型為 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgDjP IgE。各鏈的氨基末端部分包括約100至110或更多個(gè)氨基酸的可變區(qū)，該可變區(qū)主要 負(fù)責(zé)抗原識別。在可變區(qū)中，重鏈和輕鏈的每個(gè)V結(jié)構(gòu)域集合了三個(gè)環(huán)以形成抗原結(jié)合位 點(diǎn)。每個(gè)環(huán)稱為互補(bǔ)決定區(qū)(后面稱為“CDR”)，其中氨基酸序列的變異是最顯著的。各鏈的羧基末端部分定義了恒定區(qū)，該恒定區(qū)主要負(fù)責(zé)效應(yīng)子功能。Kabat等人收 集了重鏈和輕鏈可變區(qū)的大量主要序列。根據(jù)序列的保守程度，他們將個(gè)體的主要序列分 為CDR和框架，并制作了它們的列表(參見SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST (具有 免疫學(xué)重要性的序列)，第5版，NIH publication, No. 91-3242，Ε. A. Kabat等人，其通過引 用整體并入)。在免疫球蛋白的IgG亞類中，重鏈中具有幾個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。本文所謂的“兔 疫球蛋白(Ig)結(jié)構(gòu)域”意指具有獨(dú)特的三級結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白R域。本發(fā)明中所感興趣的 是重鏈結(jié)構(gòu)域，包括重鏈恒定(CH)結(jié)構(gòu)域和鉸鏈結(jié)構(gòu)域。在IgG抗體的背景下，每個(gè)IgG 同種型具有三個(gè)CH區(qū)。因此，在IgG背景下的“CH”結(jié)構(gòu)域如下“CH1”是指根據(jù)Kabat中 的EU索引的位置118-220，“CH2”是指根據(jù)Kabat中的EU索引的位置237-340，并且“CH3，， 是指根據(jù)Kabat中的EU索引的位置341-447。另一類重鏈Ig結(jié)構(gòu)域是鉸鏈區(qū)。本文所謂的“鉸鏈”或“鉸鏈區(qū)”或“抗體鉸鏈 區(qū)”或“免疫球蛋白鉸鏈區(qū)”意指包含抗體的第一和第二恒定結(jié)構(gòu)域之間的氨基酸的柔性多 肽。在結(jié)構(gòu)上，IgG CHl結(jié)構(gòu)域在EU位置220處結(jié)束，并且IgG CH2結(jié)構(gòu)域在EU位置237 處的殘基開始。因此，對于IgG，抗體鉸鏈在本文中定義為包括位置221 (IgGl中的D221)至 236 (IgGl中的G236)，其中編號根據(jù)Kabat中的EU索引進(jìn)行。在某些實(shí)施方式中，例如在 Fc區(qū)的背景下，包含較低的鉸鏈，其中“較低的鉸鏈”通常是指位置226或230。本發(fā)明所特別感興趣的是Fc區(qū)。如本文所用的“Fe”和“Fe區(qū)”意指包含抗體的 恒定區(qū)，而不包含第一恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和在一些情況下的部分鉸鏈的多肽。因此， Fc是指IgA、IgDJP IgG的后兩個(gè)恒定區(qū)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；IgE和IgM的后三個(gè)恒定區(qū)免 疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；以及這些結(jié)構(gòu)域N末端的柔性鉸鏈。對于IgA和IgM，F(xiàn)c可以包括J鏈。對于IgG，如圖1中所示，F(xiàn)c包含免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域C伽馬2和C伽馬3 (Cg2和Cg3)以及 C伽馬I(Cgl)和C伽馬2(Cg2)之間的較低的鉸鏈區(qū)。盡管Fc區(qū)的界線可以變化，但是人 IgG重鏈Fc區(qū)通常被定義為包括殘基C226或P230至其羧基末端，其中編號是根據(jù)Kabat 中的EU索引進(jìn)行。如下文所述，F(xiàn)c可以指分離狀態(tài)的這個(gè)區(qū)域，或在Fc多肽背景下的這 個(gè)區(qū)域。如本文所用的“Fe多肽”意指構(gòu)成全部或部分的Fc區(qū)的多肽。Fc多肽包括抗體、 Fc融合體、分離的Fe、和Fc片段。在一些實(shí)施方式中，抗體為全長的。本文所謂的“全長抗體”意指構(gòu)成天然生物學(xué) 形式的抗體的結(jié)構(gòu)，包括可變區(qū)和恒定區(qū)，包括一個(gè)或多個(gè)本文所列出的修飾?？蛇x擇地，抗體可以為多種結(jié)構(gòu)，包括但不限于抗體片段、單克隆抗體、雙特異性 抗體、微型抗體(minibody)、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(有時(shí)在本文中稱為“抗體模擬物”)、嵌 合抗體、人源化抗體、抗體融合體(有時(shí)稱為“抗體軛合物”)以及它們每種各自的片段。抗體片段在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是抗體片段。特別感興趣的是包含F(xiàn)c區(qū)、Fc融合體、和 重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的抗體，還包括重鏈恒定區(qū)融合體。具體的抗體片段包括但不限于⑴包含VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域的Fab片段； ( )包含VH和CHl結(jié)構(gòu)域的Fd片段；(iii)包含單個(gè)抗體的VL和VH結(jié)構(gòu)域的Fv片段； (iv)包含單個(gè)可變區(qū)的dAb片段(Ward等人，1989，Nature 341 :544_546，其通過引用整體 并入本文)；(ν)分離的⑶R區(qū)；(vi)F(ab' ) 2片段，包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段； (vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結(jié)構(gòu)域和VL結(jié)構(gòu)域通過肽連接子連接，該肽連接子容 許兩個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合形成抗原結(jié)合位點(diǎn)(Bird等人，1988，Science 242:423-426 ；Huston等 人，1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :5879_5883，它們通過引用整體并入)；(viii)雙 特異性單鏈FV(W0 03/11161，通過引用并入本文)；以及(ix) “雙鏈抗體”或“三鏈抗體”， 通過基因融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(Tomlinson等人，2000，Methods Enzymol. 326 461-479 ；W094/13804 ；HolIiger 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 90 =6444-6448, 它們都通過引用整體并入)。抗體片段可以被修飾。例如，可以通過摻入連接VH和VL結(jié)構(gòu) 域的二硫橋來穩(wěn)定分子(Reiter等人，1996，Nature Biotech. 14 1239-1245，通過引用整 體并入)。嵌合抗體和人源化抗體在一些實(shí)施方式中，骨架組分可以為來自不同物種的混合物。同樣地，如果蛋白 為抗體，則此抗體可以為嵌合抗體和/或人源化抗體。一般來說，“嵌合抗體”和“人源化抗 體”都是指組合了來自不止一個(gè)物種的區(qū)域的抗體。例如，“嵌合抗體”在傳統(tǒng)上包含來自 小鼠(或在某些情況下為大鼠)的可變區(qū)和來自人的恒定區(qū)?！叭嗽椿贵w”一般是指具有 交換為人抗體中所存在的序列的可變結(jié)構(gòu)域框架區(qū)的非人抗體。一般而言，在人源化抗體 中，除CDR外，整個(gè)抗體是由人來源的多核苷酸編碼，或者與由人來源的多核苷酸編碼的抗 體在⑶R之外具有同一性。一些或所有的⑶R是由非人生物體來源的核酸編碼的，將它們 移植到人抗體可變區(qū)的β片層框架區(qū)以產(chǎn)生抗體，該抗體的特異性由植入的CDR決定。這 類抗體的制備描述于例如，WO 92/11018 Jones, 1986, Nature 321 :522_525 ；Verhoeyen 等人，1988，Science 239 1534-1536，它們的全文通過引用并入。通常需要將所選的受體框 架殘基“回復(fù)突變”為相應(yīng)的供體殘基以重新獲得在最初的移植構(gòu)建體中丟失的親和力(US
195530101 ；US 5585089 ；US 5693761 ；US 5693762 ；US6180370 ；US 5859205 ；US 5821337 ； US 6054297 ；US 6407213，它們都通過引用整體并入)。人源化抗體最佳地還含有至少一 部分免疫球蛋白恒定區(qū)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)，因此通常包含人Fc區(qū)。人源化 抗體還可以使用具有遺傳工程化的免疫系統(tǒng)的小鼠制備。Roque等人，2004，Biotechnol. Prog. 20 :639-654，其通過引用整體并入。用于人源化和改造非人抗體的多種技術(shù)和方法 是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的(參見 Tsurushita 禾口 Vasquez，2004，Humanization of Monoclonal Antibodies (單克隆抗體的人源化)，Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science(USA)；和本文所引用的參考文獻(xiàn)，它們都通過引用整體并入)。人源化方法包括 但不限于下列文獻(xiàn)所述的方法Jones等人，1986，Nature 321 :522_525 ；Riechmann等人， 1988 ；Nature 332 :323_329 ；Verhoeyen 等人，1988，Science, 239 1534-1536 ；Queen 等人， 1989, Proc Natl Acad Sci，USA 86 10029-33 ；He 等人，1998，J. Immunol. 160 1029-1035 ； Carter 等人，1992，Proc Natl Acad Sci USA89 :4285_9 ;Presta 等人，1997，Cancer Res. 57(20) 4593-9 ；Gorman 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor等人，1998，Protein Engll :321_8，它們都通過引用整體并入。人源化或降低非人 抗體可變區(qū)免疫原性的其他方法可以包括表面重建方法，例如Roguska等人，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :969_973中所述的方法，所述文獻(xiàn)通過引用整體并入。在一個(gè)實(shí)施 方式中，如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，親本抗體具有成熟的親和力。如USSN 11/004,590中所述， 可以采用基于結(jié)構(gòu)的方法進(jìn)行人源化和親和力成熟?？梢圆捎没谶x擇的方法使抗體可 變區(qū)人源化和/或親和力成熟，所述方法包括但不限于下列文獻(xiàn)中所述的方法Wu等人， 1999，J. Mol. Biol. 294 :151_162 ；Baca 等人，1997，J. Biol. Chem. 272(16) :10678_10684 ； Rosok 等人，1996，J.Biol· Chem. 271 (37) :22611_22618 ;Rader 等人，1998，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :8910_8915 ;Krauss 等人，2003，ProteinEngineering 16(10) :753_759， 它們都通過引用整體并入。其他人源化方法可包括僅將CDR的部分移植，包括但不限于 下列文獻(xiàn)中所述的方法:USSN09/810, 510 ；Tan 等人，2002，J. Immunol. 169 :1119_1125 ；De Pascalis等人，2002，J. Immunol. 169 :3076_3084，它們都通過引用整體并入。雙特異性抗體在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體為多特異性抗體，尤其是雙特異性抗體，有時(shí)還 稱為“雙鏈抗體”。它們是結(jié)合兩個(gè)(或更多個(gè))不同抗原的抗體。雙鏈抗體可以通過本 領(lǐng)域內(nèi)已知的多種方法制備(Holliger 和 Winter，1993，Current Opinion Biotechnol. 4 446-449，其通過引用整體并入)，例如，以化學(xué)方法制備或從雜交瘤制備。微型抗體在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體是微型抗體。微型抗體是包含連接至CH3結(jié)構(gòu)域的scFv 的最小化抗體樣蛋白。Hu等人，1996，Cancer Res. 56 :3055_3061，通過引用整體并入。在 一些情況下，scFv可以連接到Fc區(qū)，并且可以包含一些或整個(gè)的鉸鏈區(qū)。人抗體在一個(gè)實(shí)施方式中，抗體為具有至少一個(gè)本文所列出的修飾的完全的人抗體。“完 全的人抗體”或“全部的人抗體”是指具有源自人染色體的具有本文所列出的修飾的抗體基 因序列的人抗體。抗體融合體
在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的抗體是抗體融合蛋白(有時(shí)在本文中稱為“抗體軛 合物”)一種類型的抗體融合體包括Fc融合體，它連接了 Fc區(qū)與軛合配偶體。如本文所用 的“Fe融合體”意指其中一個(gè)或多個(gè)多肽可操作地連接至Fc區(qū)的蛋白。本文中的Fc融合 體意指與已有技術(shù)中所用的術(shù)語“免疫粘附素”、“Ig融合體”、“Ig嵌合體”、和“受體球蛋 白”(有時(shí)用破折號)(Chamow 等人，1996，Trends Biotechnol 14 :52_60 ；Ashkenazi 等人， 1997, Curr Opin Immunol 9 :195_200，它們通過引用整體并入)是同義的。Fc融合體組合 了免疫球蛋白Fc區(qū)與融合配偶體，該融合配偶體通?？梢詾槿魏蔚鞍谆蛐》肿?。事實(shí)上， 任何蛋白或小分子都可以連接至Fc以產(chǎn)生Fc融合體。蛋白融合配偶體可以包括但不限于 任何抗體的可變區(qū)、受體的靶結(jié)合區(qū)、粘附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、或一些其他 的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。小分子融合配偶體可以包括將Fc融合體導(dǎo)向治療靶的任何治療劑。 這種靶可以為疾病所涉及的任何分子，優(yōu)選為胞外受體。因此，可以將IgG變體連接至一個(gè) 或多個(gè)融合配偶體。在一個(gè)替代性實(shí)施方式中，IgG變體與另一種治療化合物軛合或可操 作地連接。治療化合物可以為細(xì)胞毒素劑、化療劑、毒素、放射性同位素、細(xì)胞因子或其他治 療活性劑。IgG可以連接至多種非蛋白性聚合物中的一種，例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧 化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。除了 Fc融合體之外，抗體融合體包括重鏈恒定區(qū)與一個(gè)或多個(gè)融合配偶體(還包 括任何抗體的可變區(qū))的融合體，而其他抗體融合體則基本上或全部為具有融合配偶體的 全長抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，融合配偶體的作用是介導(dǎo)靶結(jié)合，因此其在功能上類似于抗 體可變區(qū)(事實(shí)上，可以是抗體可變區(qū))。事實(shí)上，任何蛋白或小分子都可以連接至Fc以制 備Fc融合體(或抗體融合體)。蛋白融合配偶體可以包括但不限于受體的靶結(jié)合區(qū)、粘 附分子、配體、酶、細(xì)胞因子、趨化因子、或一些其他的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域。小分子融合配偶 體可以包括將Fc融合體導(dǎo)向治療靶的任何治療劑。這種靶可以為疾病所涉及的任何分子， 優(yōu)選為胞外受體。軛合配偶體可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者一般使用抗體上和軛合配偶 體上的官能團(tuán)制備。例如，連接子是本領(lǐng)域中已知的；例如同型或異型雙功能連接子 是熟知的(參見，1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section on cross-linkers (Pierce化學(xué)公司1994年的目錄，交聯(lián)劑的技術(shù)部分)，第155-200頁，通過 引用并入本文)。合適的軛合物包括但不限于如下文所述的標(biāo)記，藥物和細(xì)胞毒素劑，包括但不限 于細(xì)胞毒性藥物(例如，化療劑)或毒素或此類毒素的活性片段。適合的毒素和它們的相 應(yīng)片段包括白喉A鏈、外毒素A鏈、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒素A鏈、瀉果素、巴豆毒素、酚霉 素、依諾霉素等。細(xì)胞毒素劑還包括放射性化學(xué)物質(zhì)，它們通過將放射性同位素軛合至抗體 或?qū)⒎派湫院怂亟Y(jié)合至已經(jīng)共價(jià)連接至抗體的螯合劑來制備。其他的實(shí)施方式使用刺孢霉 素、auristatins、格爾德霉素、美登素、和倍癌霉素(duocarmycin)和類似物；對于后者，參 見U. S. 2003/0050331A1，其通過引用整體并入?？贵w的共價(jià)修飾抗體的共價(jià)修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且一般但并非總是在翻譯后進(jìn)行。例 如，通過使抗體的特定氨基酸殘基與能夠與所選擇的側(cè)鏈或N末端或C末端殘基反應(yīng)的有 機(jī)衍生劑反應(yīng)將幾種類型的抗體共價(jià)修飾引入分子中。
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半胱氨酰殘基最通常的是與諸如氯乙酸或氯乙酰胺的α -鹵代乙酸酯(和對應(yīng)的 胺)反應(yīng)以得到羧甲基或羧氨基甲基衍生物。半胱氨酰殘基還可以通過與下列物質(zhì)的反應(yīng) 來衍生溴三氟丙酮、α -溴-β -(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸、N-烷基馬來酰亞胺、3-硝 基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、對氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚、 或氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1，3- 二唑等。組氨酰殘基通過在ρΗ5. 5-7. 0下與焦碳酸二乙酯反應(yīng)來衍生，因?yàn)檫@個(gè)試劑對組 氨酰側(cè)鏈?zhǔn)窍鄬μ禺惖?。也可使用?溴苯甲酰甲基溴化物；該反應(yīng)優(yōu)選在ΡΗ6.0下在 0. IM 二甲胂酸鈉中進(jìn)行。賴氨酰基和氨基末端殘基與琥珀酸或其他羧酸酐反應(yīng)。使用這些試劑的衍生具有 逆轉(zhuǎn)賴氨酰殘基的電荷的作用。用于衍生含α氨基的殘基的合適試劑包括亞氨酸酯，如甲 基吡啶亞胺甲酯；磷酸吡哆醛；吡哆醛；氯硼氫化物；三硝基苯磺酸；0-甲基異脲；2，4_戊 二酮；和轉(zhuǎn)氨酶所催化的與乙醛酸的反應(yīng)。精氨酰殘基通過與一種或幾種常規(guī)試劑反應(yīng)來修飾，尤其是苯乙二醛、2，3-丁二 酮、1，2_環(huán)己二酮、和水合茚三酮。精氨酸殘基的衍生需要反應(yīng)在堿性條件下進(jìn)行，這是因 為胍官能團(tuán)的PKa較高。此外，這些試劑可以與賴氨酸基團(tuán)以及精氨酸ε-氨基反應(yīng)?？梢赃M(jìn)行酪氨酰殘基的特定修飾，尤其感興趣的是通過與芳族重氮化合物或四硝 基甲烷反應(yīng)而將光譜標(biāo)記引入酪氨酰殘基中。最常見的是，使用N-乙?；溥蚝退南趸?烷來分別形成0-乙?；野滨Ｎ镔|(zhì)和3-硝基衍生物。使用1251或1311將酪氨酰殘基碘 化以制備用于放射性免疫測定的標(biāo)記蛋白，上文所述的氯胺T法是合適的。羧基側(cè)基(天冬氨?；蚬劝滨?選擇性地通過與碳二亞胺(R' -N = C = N-R') 反應(yīng)來修飾，其中R和R’任選地為不同的烴基，如1-環(huán)己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳 二亞胺或1-乙基-3_(4-氮鐺-4，4-二甲基戊基)碳二亞胺。此外，天冬氨酰和谷氨酰殘 基通過與銨離子反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰殘基。用雙官能劑進(jìn)行的衍生可用于將抗體交聯(lián)至水不溶性支持體基質(zhì)或表面以供多 種方法使用，包括下面所述的方法。常用的交聯(lián)劑包括例如，1，1-雙(重氮乙酰基)-2-苯 乙烷；戊二醛；N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如與4-疊氮水楊酸的酯；同型雙官能亞氨酸酯，包 括二琥珀酰亞胺酯如3，3' -二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)、和雙官能的馬來酰亞胺， 如雙-N-馬來酰亞胺基-1，8-辛烷。諸如甲基-3-[(對疊氮苯基)二硫基]丙亞胺酯的衍生 劑會(huì)產(chǎn)生光活化的中間體，該中間體能夠在存在光的條件下形成交聯(lián)?？蛇x擇地，可以采用 反應(yīng)性的水不溶性基質(zhì)如溴化氰活化的碳水化合物和美國專利第3，969，287,3, 691，016、 4，195，128,4, 247，642,4, 229，537、和4，330，440號中所述的反應(yīng)性基質(zhì)來進(jìn)行蛋白固定， 所述專利都通過弓I用整體并入。谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰殘基經(jīng)常分別脫酰胺化為對應(yīng)的谷氨酰和天冬胺酰殘 基?？蛇x擇地，這些殘基在弱酸條件下進(jìn)行脫酰胺化。這些殘基的任一形式都屬于本發(fā) 明的范圍。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化；絲氨?；蛱K氨酰殘基的羥基的磷 酸化；賴氨酸、精氨酸、和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基的甲基化(Τ. Ε. Creighton，Proteins Structure and MolecularProperties (蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)禾口分子特性)，W. H. Freeman & Co·， San Francisco，第79-86頁[1983]，通過引用整體并入)；N-末端胺的乙酰化；和任何C-末 端羧基的酰胺化。
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糖基化另一種類型的共價(jià)修飾是糖基化。在另一個(gè)實(shí)施方式中，本文所公開的IgG變 體可以被修飾以包含一種或多種工程化糖形。如本文所用的“工程化糖形”意指共價(jià)連接 至IgG的碳水化合物組合物，其中所述碳水化合物組成在化學(xué)上與親本IgG的碳水化合物 組成不同。工程化糖形可用于多種目的，包括但不限于增強(qiáng)或降低效應(yīng)子功能。工程化 糖形可以通過許多本領(lǐng)域內(nèi)已知的方法制備(Umafia等人，1999，Nat Biotechnol 17: 176-180 ；Davies 等人，2001，Biotechnol Bioeng 74 :288_294 ;Shields 等人，2002，J Biol Chem277 :26733_26740 ；Shinkawa 等人，2003，J Biol Chem 278 :3466_3473 ；US6, 602, 684 ； USSN 10/277, 370 ；USSN 10/113, 929 ；PCT WO 00/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCT WO 02/30954A1，它們都通過引用整體并入；(Potelligent 技術(shù) [Biowa, Inc.，Princeton, NJ] ；GlycoMAb ⑧糖基化工程技術(shù)[Glycart Biotechnology AG, Zurich，Switzerland])。這些技術(shù)中的一些基于調(diào)控巖藻糖基化水平和對切共價(jià)連接至Fc 區(qū)的寡糖，例如，通過在工程化的或其他形式的各種生物體或細(xì)胞系(例如Lec-13 CHO細(xì) 胞或大鼠雜交瘤YB2/0細(xì)胞)中表達(dá)IgG ；通過調(diào)節(jié)參與糖基化通路的酶(例如FUT8[a 1， 6_巖藻糖轉(zhuǎn)移酶]和/或βΙ-4-N-乙酰葡糖氨基轉(zhuǎn)移酶III [GnTIII])；或通過在IgG表 達(dá)之后修飾碳水化合物進(jìn)行。工程化糖形通常是指不同的碳水化合物或寡糖；因此IgG變 體例如抗體或Fc融合體可以包含工程化糖形。可選擇地，工程化糖形可以指包含不同碳水 化合物或寡糖的IgG變體。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，糖基化模式可取決于蛋白序列(例如，存 在或不存在特定的糖基化氨基酸殘基，在下文中討論)或產(chǎn)生蛋白的宿主細(xì)胞或生物體。 具體的表達(dá)系統(tǒng)在下文中討論。多肽的糖基化通常為N-連接的或0-連接的。N-連接的是指碳水化合物部分 與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈的連接。其中X為除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰 胺-χ-絲氨酸和天冬酰胺-χ-蘇氨酸，是碳水化合物部分與天冬酰氨側(cè)鏈酶促連接的識別 序列。因此，多肽中這些三肽序列的任一種的存在產(chǎn)生可能的糖基化位點(diǎn)。0-連接的糖基 化是指糖N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖、或木糖中的一種與羥基氨基酸的連接，所述羥基氨 基酸最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸?？贵w中糖基化位點(diǎn)的添加是通過改變氨基酸序列使其含有上述三肽序列的一種 或多種來方便地完成(用于N-連接的糖基化位點(diǎn))。改變還可以通過將一個(gè)或多個(gè)絲氨酸 或蘇氨酸殘基添加到初始序列或用一個(gè)或多個(gè)絲氨酸或蘇氨酸殘基取代初始序列來進(jìn)行 (用于0-連接的糖基化位點(diǎn))。為了方便，抗體氨基酸序列優(yōu)選通過在DNA水平的改變來 改變，尤其是通過在預(yù)選的堿基突變編碼靶多肽的DNA使得產(chǎn)生將翻譯成所需的氨基酸的 密碼子。增加抗體上碳水化合物部分?jǐn)?shù)目的其他方法為將糖苷化學(xué)偶聯(lián)或酶促偶聯(lián)至蛋 白。這些方法的有利之處在于它們不需要在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生具有用于N-連接的和0-連接 的糖基化的糖基化能力的蛋白。依據(jù)所用的偶聯(lián)方式，糖可以連接至(a)精氨酸和組氨酸； (b)游離羧基；(c)游離巰基，如半胱氨酸的游離巰基；(d)游離羥基，如絲氨酸、蘇氨酸、或 羥脯氨酸的游離羥基；(e)芳族殘基，如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳族殘基；或(f)谷氨 酰胺的酰胺基。這些方法描述在WO 87/05330以及Aplin和Wriston，1981，CRC Crit. Rev. Biochem.，第259-306頁，它們都通過引用整體并入。
可以通過化學(xué)法或酶法完成初始抗體上所存在的碳水化合物部分的移除?；瘜W(xué)去 糖基化需要將蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或等同化合物。這種處理導(dǎo)致了除了連接糖 (N-乙?；咸前坊騈-乙?；肴樘前?之外大部分或所有的糖被裂解，而多肽則保持完 整。化學(xué)去糖基化描述在 Hakimuddin 等人，1987，Arch. Biochem. Biophys. 259 52 和 Edge 等人，1981，Anal. Biochem. 118 131中，它們通過引用整體并入。多肽上碳水化合物部分 的酶促裂解可以通過使用多種內(nèi)切和外切糖苷酶來達(dá)成，如Thotakura等人，1987，Meth. Enzymol. 138 350中所述，其全文通過引用并入。可以通過使用化合物衣霉素來防止在可 能的糖基化位點(diǎn)的糖基化，如Duskin等人，1982，J. Biol. Chem. 257 3105中所述，其全文通 過引用并入。衣霉素阻斷蛋白-N-糖苷鍵形成。另一種類型的抗體共價(jià)修飾包括將抗體連接至多種非蛋白性的聚合物上，包括但 不限于，多種多元醇，如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，這通過下列文獻(xiàn)中所述的方法進(jìn) 行例如，2005-2006 PEG Catalog fromNektar Therapeutics (2005—2006 年來自 Nektar 治療劑的PEG目錄)(可得自Nektar網(wǎng)站)美國專利4，640，835 ；4, 496，689 ；4, 301，144 ； 4，670，417 ；4, 791，192或4，179，337，它們都通過引用全文并入。此外，如本領(lǐng)域中已知的， 氨基酸取代可以在抗體中的多個(gè)位置進(jìn)行，以促進(jìn)諸如PEG的聚合物的添加。參見，例如美 國公開第2005/0114037A1號，其通過引用整體并入。標(biāo)記的抗體在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體的共價(jià)修飾包括添加一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記。在一些情 況下，考慮的是抗體融合體。術(shù)語“標(biāo)記基團(tuán)”意指任何檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，標(biāo) 記基團(tuán)經(jīng)由各種長度的間隔子臂偶聯(lián)至抗體上以降低可能的位阻。標(biāo)記蛋白的各種方法是 本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可以使用它們進(jìn)行本發(fā)明。一般來講，標(biāo)記依據(jù)檢測它們的測定分為多種類型a)同位素標(biāo)記，它可以是放 射性同位素或重同位素；b)磁性標(biāo)記(例如磁性粒子)；C)氧化還原活性部分；d)光學(xué)染 料；酶基團(tuán)(例如，辣根過氧化物酶、β _半乳糖苷酶、熒光素酶；堿性磷酸酶)；e)生物素化 基團(tuán)；和f)被二級報(bào)道物所識別的預(yù)先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈對序列、二抗的 結(jié)合位點(diǎn)、金屬結(jié)合結(jié)構(gòu)域、表位標(biāo)簽等)。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記基團(tuán)經(jīng)由各種長度的間 隔子臂偶聯(lián)至抗體上以降低可能的位阻。標(biāo)記蛋白的各種方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，可以使 用它們進(jìn)行本發(fā)明。具體的標(biāo)記包括光學(xué)染料，包括但不限于生色團(tuán)、磷光體和熒光團(tuán)，其中后一種 具體用于許多情況中。熒光團(tuán)可以為“小分子”熒光或蛋白性熒光。所謂“熒光標(biāo)記”意指可以經(jīng)由其固有的熒光特性檢測的任何分子。合適的熒 光標(biāo)記包括但不限于熒光素、羅丹明、四甲基羅丹明、伊紅、藻紅、香豆素、甲基-香豆 素、芘、孔雀石綠(Malacite green)、均二苯乙烯、熒光黃、Cascade BlueJ、德克薩斯紅、 IAEDANS、EDANS、B0DIPY FL、LC 紅 640、Cy 5,Cy 5. 5、LC 紅 705、俄勒岡綠(Oregon Green)、 Alexa-Fluor 染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、AlexaFluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow 禾口 R-藻紅蛋白(PE) (MolecularProbes, Eugene, OR)、FITC、羅丹明、和德克薩斯紅(Pierce，Rockford, IL)、Cy5、Cy5. 5、Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA)。包括熒光團(tuán)的合適的光學(xué)染料描述在Richard P. Haugland的
24Melecular Probes Handbook (分子探針手冊)中，該手冊通過引用整體并入。合適的蛋白性熒光標(biāo)記還包括但不限于綠色熒光蛋白，包括Renilla、 Ptilosarcus、或 Aequorea 種類的 GFP(Chalfie 等人，1994， Science263 :802_805)； EGFP (Clontech Laboratories, Inc.，Genbank 登錄號 U55762)；藍(lán)色熒光蛋白(BFP， Quantum Biotechnologies, Inc.1801 de MaisonneuveBlvd. West,8th Floor, Montreal, Quebec, Canada H3H 1J9 ；Stauber, 1998, Biotechniques 24 462-471 ；Heim ^A, 1996, Curr. Biol. 6 178-182)；加強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories, Inc.)； 熒光素酶(Ichiki 等人，1993，J. Immunol. 150 =5408-5417) ； β 半乳糖苷酶(Nolan 等人， 1988，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 85 :2603_2607)和 Renilla(W092/15673、W095/07463、 W098/14605、W098/26277、W099/49019、美國專利第 5292658、5418155、5683888、5741668、 5777079、5804387、5874304、5876995、5925558號)。本段中上面所引用的所有參考文獻(xiàn)特 意通過引用并入本文。IgG 變體在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供變體IgG蛋白。最低限度下，IgG變體包含含有重 鏈CH2-CH3區(qū)的抗體片段。此外，合適的IgG變體包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域(例如，包括較低的鉸鏈 區(qū))，而且包含重鏈恒定區(qū)(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的IgG變體也可用于本發(fā)明，它們都可以 與融合配偶體融合。IgG變體包括相對于親本IgG多肽的一種或多種氨基酸修飾，在一些情況下為相 對于野生型IgG的一種或多種氨基酸修飾。IgG變體可以具有一種或多種優(yōu)化的性質(zhì)。IgG 變體由于至少一個(gè)氨基酸修飾而與其親本IgG的氨基酸序列不同。因此，IgG變體與其親 本相比具有至少一個(gè)氨基酸修飾?？蛇x擇地，IgG變體與親本相比可以具有多于一個(gè)氨基 酸修飾，例如與親本相比具有約1至50個(gè)氨基酸修飾，優(yōu)選約1至10個(gè)氨基酸修飾，最優(yōu) 選約1至約5個(gè)氨基酸修飾。因此，IgG變體的序列和親本Fc多肽的序列是基本上同源的。例如，本文中的變 體IgG變體序列具有與親本IgG變體序列約80%的同源性，優(yōu)選至少約90%的同源性，并 且最優(yōu)選至少約95%的同源性。修飾可以使用分子生物學(xué)以遺傳方法進(jìn)行，或者可以酶促 或化學(xué)方法進(jìn)行。抗體的靶抗原事實(shí)上，任何抗原都可以被IgG變體靶向，包括但不限于屬于下列靶抗原中的 蛋白、亞基、結(jié)構(gòu)域、基序、和/或表位，所述靶抗原包括可溶性因子如細(xì)胞因子和膜結(jié) 合因子，所述膜結(jié)合因子包括跨膜受體17-IA、4-lBB、4Dc、6-酮-PGFla、8_異_PGF2a、 8-氧-dG、Al腺苷受體、A33、ACE、ACE-2、激活蛋白、激活蛋白A、激活蛋白AB、激活蛋白B、 激活蛋白C、激活蛋白RIA、激活蛋白RIAALK-2、激活蛋白RIB ALK-4、激活蛋白RIIA、激活 蛋白 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2, ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS, ADAMTS4、 ADAMTS5、地址素、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、α -V/ β -1 拮抗物、 ANG、Ang、APAF-I、APE、APJ, APP, APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 Id、ASPARTIC、心房利鈉 因子、av/b3 整聯(lián)蛋白、Axl、b2M、B7-1、B7-2、B7-H、B-淋巴細(xì)胞刺激因子(BlyS)、BACE、 BACE-I、Bad、BAFF, BAFF-R、Bag-U BAK, Bax, BCA-1、BCAM、Bel, BCMA, BDNF, b-ECGF、bFGF、 BID、Bik、BIM、BLC, BL-CAM、BLK, BMP、BMP_2BMP_2a、BMP-3 成骨蛋白、BMP_4BMP_2b、BMP-5、
25BMP-6Vgr-I、BMP-7(0P-1)、BMP-8(BMP_8a、0P-2)、BMPR、BMPR-IA(ALK-3)、BMPR-IB(ALK-6)、 BRK-2、RPK-U BMPR-II (BRK-3)、BMPs, b_NGF、Β0Κ、鈴蟾肽、骨源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、補(bǔ)體因子 3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA125、CAD-8、降鈣素、cAMP、癌胚抗 原(CEA)、癌相關(guān)抗原、組織蛋白酶A、組織蛋白酶B、組織蛋白酶C/DPPI、組織蛋白酶D、組織 蛋白酶E、組織蛋白酶H、組織蛋白酶L、組織蛋白酶0、組織蛋白酶S、組織蛋白酶V、組織蛋 白酶 X/Z/P、CBL、CCI、CCK2、CCL、CCLl、CCLll、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、 CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、 CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCRU CCRlO, CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、 CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CD1、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla、CDllb、 CDllc、CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、 CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、 CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、 CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉 毒桿菌(Clostridium botulinum)毒素、產(chǎn)氣莢膜芽抱桿菌(Clostridium perfringen) 毒素、CKb8-l、CLC, CMV, CMV UL、CNTF, CNTN-U COX、C-Ret、CRG-2、CT-U CTACK, CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、 CXCL9、CXCL10, CXCLlU CXCLl2, CXCLl3, CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCR、CXCRU CXCR2、 CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、細(xì)胞角蛋白腫瘤相關(guān)抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、衰變加 速因子、des (1-3) -IGF-I (腦 IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-U DNA 酶、Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、 ECAD, EDA、EDA-AU EDA-A2、EDAR、EGF, EGFR(ErbB-I)、EMA, EMMPRIN、ΕΝΑ、內(nèi)皮素受體、腦 啡肽酶、eNOS、Eot、嗜酸細(xì)胞活化趨化因子1、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EPO, ERCC、內(nèi)皮細(xì) 胞選凝素、ET-1、因子Ila、因子VII、因子VIIIc、因子IX、成纖維細(xì)胞活化蛋白(FAP)、Fas、 FcRl、FEN-I、鐵蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纖維蛋白、FL、FLIP、 Flt-3、Flt-4、促卵泡激素、分形素(Fractalkine)、FZDU FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、 FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas 6、GCP-2、GCSF、⑶2、⑶3、⑶F、⑶F_l、GDF-3 (Vgr-2)、 GDF-5 (BMP-14、CDMP-1)、GDF-6 (BMP-13、CDMP-2)、GDF-7 (BMP-12、CDMP-3)、GDF-8 (肌肉 生長抑制素(Myostatin))、GDF-9、GDF-15 (MIC-I)、GDNF、GDNF、GFAP、GFRa-I、GFR-α 1、 GFR-α 2、GFR-α 3、GITR、胰高血糖素、Glut 4、糖蛋白 IIb/IIIa(GP Ilb/IIIa)、GM-CSF、 gpl30、gp72、GR0、生長激素釋放因子、半抗原(NP-cap or ΝΙΡ-cap)、HB-EGF、HCC、HCMV gB 包膜糖蛋白、HCMV)gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生長因子(HGF)、H印B gpl20、類肝素 酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、單純孢疹病毒(HSV) gB 糖蛋 白、HSV gD糖蛋白、HGFA、高分子量黑素瘤相關(guān)抗原(HMW-MAA)、HIV gpl20、HIV IIIB gp 120 V31oop、HLA、HLA-DR、HMl. 24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌肌球蛋白、人巨細(xì)胞病毒 (HCMV)、人生長激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-U ICAM-3、ICE、I COS, IFNg、Ig、 IgA 受體、IgE、IGF、IGF 結(jié)合蛋白、IGF-1R、IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL、IL-U IL-1R、IL-2、 IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6、IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、 IL-18、IL-18R、IL-23、干擾素(INF) - α、INF- β、INF- y、抑制素、iNOS、胰島素 A-鏈、胰島 素B-鏈、胰島素樣生長因子1、整聯(lián)蛋白α2、整聯(lián)蛋白α3、整聯(lián)蛋白α4、整聯(lián)蛋白α 4/ β 、整聯(lián)蛋白α4/β7、整聯(lián)蛋白a5(aV)、整聯(lián)蛋白α5/β1、整聯(lián)蛋白α5/β3、整聯(lián)蛋
26白α 6、整聯(lián)蛋白β 1、整聯(lián)蛋白β 2、干擾素Y、IP-10、I-TAC、JE、激肽釋放酶2、激肽釋放 酶5、激肽釋放酶6、、激肽釋放酶11、激肽釋放酶12、激肽釋放酶14、激肽釋放酶15、激肽 釋放酶Li、激肽釋放酶L2、激肽釋放酶L3、激肽釋放酶L4、KC、KDR、角質(zhì)形成細(xì)胞生長因子 (KGF)、層粘連蛋白 5、LAMP、LAP、LAP (TGF-I)、潛伏性 TGF-1、潛伏性 TGF-1 bpl、LBP、LDGF, LECT2、Lefty、路易斯(Lewis)-Y 抗原、路易斯-Y 相關(guān)抗原、LFA-l、LFA_3、Lfo、LIF、LIGHT、 脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-選擇蛋白、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-I、肺表面活性物質(zhì)、黃體生 成素、淋巴毒素 β 受體、Mac-UMAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF, MDC, Mer、METALLOPROTEASES、MGDF 受體、MGMT、MHC (HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP-1- α、MK、 MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、 MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo, MSK, MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、苗勒(Mullerian)抑制 物質(zhì)、Mug、MuSK, ΝΑΙΡ、NAP、NCAD, N-鈣粘蛋白、NCA 90、NCAM、NCAM、中性溶酶、神經(jīng)營養(yǎng)蛋 白 _3、-4 或-6、Neurturin、神經(jīng)元生長因子(NGF)、NGFR、NGF_3、nN0S、N0、N0S、Npn、NRG_3、 NT、NTN、OB、OGGl、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr、甲狀旁腺激素、PARC、 PARP, PBR、PBSF, PCAD, P-鈣粘蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, ΡΕΜ、PF4、PGE、PGF、 PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盤堿性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰島素原、松弛素原、蛋白 C、PS、PSA、PSCA、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk、PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES, RANTES、松弛素A-鏈、松弛素B-鏈、腎素、呼吸道合胞病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、 類風(fēng)濕因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、 SIGIRR、SK-I、SLAM、SLPI、SMAC,SMDF,SM0H、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-II、TACE、TACI、 TAG-72(腫瘤相關(guān)糖蛋白-72)、TARC、TCA-3、T-細(xì)胞受體(例如，T-細(xì)胞受體α / β )、TdT、 TECK, ΤΕΜ1、ΤΕΜ5、ΤΕΜ7、ΤΕΜ8、TERT、睪丸 PLAP-樣堿性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、 TGF-β 泛特異性(Pan Specific) ,TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RII、TGF-β RIIb、TGF-β RIII、 TGF-β 1、TGF-β 2、TGF-β 3、TGF-β 4、TGF-β 5、凝血酶、胸腺 Ck_l、促甲狀腺激素、Tie、 TIMP、TIQ、組 只因子、TMEFF2、Tmpo、TMPRSS2、TNF、TNF-α、TNF-α β、TNF-β 2, TNFc、 TNF-RI, TNF-RII, TNFRSFIOA(TRAIL Rl Αρο_2、DR4)、TNFRSFIOB(TRAIL R2 DR5、KILLER、 TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl、LIT、TRID)、TNFRSF10D (TRAIL R4 DcR2、 TRUNDD)、TNFRSF1IA(RANKODF R、TRANCE R)、TNFRSF1IB(OPG OCIF、TRl)、TNFRSF12(TWEAKR FN14)、TNFRSF13B(TACI)、TNFRSF13C(BAFF R)、TNFRSF14(HVEMATAR,HveA, LIGHT R、TR2)、 TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、 TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSF1A(TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B (TNF RII CD 120b、p75-80)、TNFRSF26(TNFRH3)、TNFRSF3(LTbR TNFRIII,TNFC R)、TNFRSF4(0X40 ACT35、 TXGP 1R)、TNFRSF5 (CD40 p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTU CD95)、TNFRSF6B (DcR3 M68、 TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、I LA)、TNFRSF21 (DR6)、 TNFRSF22 (DcTRAIL R2 TNFRH2)、TNFRST23 (DcTRAIL Rl TNFRHl)、TNFRSF25 (DR3 Apo_3、 LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配體、TL2)、TNFSFl 1 (TRANCE/RANK 配 體 ODF、OPG 配體)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體、DR3 配體)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、 TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHT HVEM 配體、LTg)、TNFSF 15 (TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體、TL6)、TNFSFIA (TNF-a 連接素(Conectin)、 DIF、TNFSF2)、TNFSF1B (TNF-b LTa、TNFSF1)、TNFSF3 (LTb TNFC, p33)、TNFSF4 (0X40 配體gp34、TXGP1)、TNFSF5 (CD40 配體 CD154、gp39、HIGMl、IMD3、TRAP)、TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1 配體、APTl 配體)、TNFSF7 (CD27 配體 CD70)、TNFSF8 (CD30 配體 CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配體 CD137配體)、TP-l、t-PA、Tp。、TRAIL、TRAIL R、TRAIL_R1、TRAIL-R2、TRANCE、轉(zhuǎn)移受體、TRF、 Trk、TR0P-2、TSG、TSLP、腫瘤相關(guān)抗原CA 125、表達(dá)路易斯Y相關(guān)碳水化合物的腫瘤相關(guān)抗 原、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-U VECAD, VE-鈣粘蛋白、VE-鈣粘 蛋白-2、VEFGR-I (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI、VIM、病毒抗原、VLA、VLA-I、 VLA-4、VNR 整聯(lián)蛋白、馮維勒布蘭德(von ffillebrand)因子、WIF-I、WNT1、WNT2、WNT2B/13、 WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、 WNT1OA、WNT1OB、WNT11、WNT16、XCL1、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP、XPD、以及激素和生長 因子的受體。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)了解上述所列的靶不只是指具體的蛋白和生物分子，而是 指生物化學(xué)通路或包含它們的通路。例如，提到CTLA-4作為靶抗原意指構(gòu)成T細(xì)胞共刺激 通路的配體和受體也是靶，所述配體和受體包括01^-4、87-1、87-2丄028、以及任何其他未 發(fā)現(xiàn)的配體或受體。因此，如本文所用的靶不僅是指具體的生物分子，而是指與所述靶相互 作用的一組蛋白和所述靶所屬于的生物化學(xué)通路的成員。本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)了解上述 靶抗原、結(jié)合它們的配體或受體、或它們的相應(yīng)生物化學(xué)通路的其他成員中的任何一種可 以可操作地連接至本發(fā)明的Fc變體以產(chǎn)生Fc融合體。因此，例如，靶向EGFR的Fc融合體 可以通過將Fc變體可操作地連接至EGF、TGF-b、或發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的任何其 他配體來構(gòu)建。因此，本發(fā)明的Fc變體可以可操作地連接至EGFR以產(chǎn)生結(jié)合EGF、TGF-b、 或發(fā)現(xiàn)的或未發(fā)現(xiàn)的結(jié)合EGFR的任何其他配體的Fc融合體。因此，事實(shí)上，任何多肽，無 論是配體、受體還是一些其他的蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域，包括但不限于上述靶和構(gòu)成它們的相 應(yīng)生物化學(xué)通路的蛋白，都可以可操作地連接至本發(fā)明的Fc變體以得到Fc融合體。合適抗原的選擇取決于所需的應(yīng)用。對于抗癌治療，期望具有表達(dá)限制在癌細(xì)胞 內(nèi)的靶。已證明特別適于抗體治療的一些靶是具有信號傳導(dǎo)功能的那些。其他治療抗體通 過抑制受體與其軛合配體之間的結(jié)合阻斷受體的信號傳導(dǎo)來發(fā)揮其作用。治療抗體的另一 個(gè)作用機(jī)制是引起受體下調(diào)。其他抗體不通過它們的靶抗原的信號傳導(dǎo)起作用。在一些情 況下，使用針對傳染病的抗體。在一個(gè)實(shí)施方式中，將本發(fā)明的Fc變體整合到抗細(xì)胞因子的抗體中?？蛇x擇地， 將Fc變體與細(xì)胞因子融合或軛合。如本文所用的“細(xì)胞因子”意指用于由一個(gè)細(xì)胞群釋 放的作為細(xì)胞間調(diào)節(jié)物作用于另一細(xì)胞的蛋白的通用術(shù)語。例如，Penichet等人，2001， J Immunol Methods 248 :91_101中所述，其特意通過引用并入，細(xì)胞因子可以與抗體融合 以提供許多期望的特性。這些細(xì)胞因子的實(shí)例為淋巴因子、單核因子、和傳統(tǒng)的多肽激素。 細(xì)胞因子中包括生長激素，如人生長激素、N-甲硫氨?；松L激素、和牛生長激素；甲 狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素 (FSH)、促甲狀腺激素(TSH)、和黃體生成素(LH)；肝細(xì)胞生長因子；成纖維細(xì)胞生長因子； 催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-α和腫瘤壞死因子；苗勒抑制物質(zhì)；小鼠促性腺 素相關(guān)肽；抑制素；激活蛋白；血管內(nèi)皮生長因子；整聯(lián)蛋白；血小板生成素(TPO)；神經(jīng)生 長因子，如NGF-β ；血小板生長因子；轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)，如TGF-α和TGF-β ；胰島素樣 生長因子-I和胰島素樣生長因子-II ；促紅細(xì)胞生成素(EPO)；骨誘導(dǎo)因子；干擾素，如干
28擾素-α、干擾素-β和干擾素-Y ；集落刺激因子(CSFs)，如巨噬細(xì)胞-CSF(M-CSF)、粒細(xì) 胞-巨噬細(xì)胞-CSF(GM-CSF)、和粒細(xì)胞-CSF(G-CSF)；白細(xì)胞介素(IL)，如IL-U IL-I α、 IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12 ； IL-15，一種如 TNF α 或TGF- β的腫瘤壞死因子；C5a ；以及其他多肽因子，包括LIF和kit配體(KL)。如本文所 用的術(shù)語細(xì)胞因子包括來自天然來源或重組細(xì)胞培養(yǎng)物的蛋白和天然序列細(xì)胞因子的生 物活性等同物。細(xì)胞因子和可溶性靶如TNF超家族成員是用于本發(fā)明變體的優(yōu)選靶。例如，抗 VEGF、抗CTLA-4、和抗TNF抗體或它們的片段是用于增加FcRn結(jié)合的Fc變體的特別好的抗 體。針對這些靶的治療劑常涉及到自身免疫性疾病的治療，并且需要在長的時(shí)間期間內(nèi)進(jìn) 行多次注射。因此，由本發(fā)明的變體所實(shí)現(xiàn)的較長的血清半衰期和較低頻率的治療是特別 優(yōu)選的。已經(jīng)被批準(zhǔn)用于臨床試驗(yàn)或正在開發(fā)的許多抗體和Fc融合體可獲益于本發(fā) 明的Fc變體。這些抗體和Fc融合體在本文中稱為“臨床產(chǎn)品和候選物”。因此，在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc多肽可用于一系列的臨床產(chǎn)品和候選物中。例如，靶 向CD20的許多抗體可受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如，本發(fā)明的Fc多肽可用于基本 上與下列物質(zhì)類似的抗體利妥昔單抗(Rituxan ，IDEC/Genentech/Roche)(參見， 例如，US 5，736，137)，它是經(jīng)批準(zhǔn)用于治療非霍奇金(Non-Hodgkin)淋巴瘤的抗CD20 嵌合抗體；HuMax-⑶20，它是目前由Genmab開發(fā)的抗⑶20，是US 5，500, 362中描述 的 ^L CD20, AME-133(Applied Molecular Evolution), hA20(Immunomedics, Inc.), HumaLYM(Intracel)和 PR070769 (PCT/US2003/040426，標(biāo)題為 “ Immunoglobulin Variants and Uses Thereof (免疫球蛋白變體及其用途)”)。靶向許多表皮生長因子受體家族成 員包括 EGFR (ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)的許多抗體可 以受益于本發(fā)明的Fc多肽。例如，本發(fā)明的Fc多肽可用于基本上與下列物質(zhì)類似的抗 體曲妥單抗(Here印tin ，Genentech)(參見，例如US 5,677, 171)，被批準(zhǔn)用于治療乳 腺癌的人源化抗Her2/neu抗體；目前由Genentech公司開發(fā)的培妥珠單抗(rhuMab_2C4， Omnitarg ) ；US 4，753，894 中描述的抗 Her2 抗體；西妥昔單抗(Erbitux Imclone) (US 4, 943, 533 ；PCT WO 96/40210)，一種在臨床試驗(yàn)中用于多種癌癥的抗EGFR嵌合抗 體；目前由 Abgenix-Immunex-Amgen 開發(fā)的 ABX_EGF(US 6，235，883)；目前由 Genmab 開 發(fā)的 HuMax-EGFr (USSN 10/172，317) ；425、EMD55900、EMD62000、和 EMD72000 (MerckKGaA) (US 5，558，864 ；Murthy 等人 1987，Arch Biochem Biophys. 252(2) 549-60 ；Rodeck 等人， 1987，J Cell Biochem. 35(4) :315_20 ;Kettleborough 等人，1991，Protein Eng. 4(7) 773-83) ；ICR62 (Institute ofCancer Research (美國癌癥研究所))(PCT WO 95/20045 ； Modjtahedi 等人，1993，J. Cell Biophys. 1993，22 (1-3) 129-46 ；Modjtahedi 等人，1993， Br JCancer. 1993，67(2) :247_53 ；Modjtahedi 等人，1996，Br J Cancer,73(2) :228_35 ； Modjtahedi 等人，2003，Int J Cancer, 105(2) :273_80) ；TheraCIMhR3 (YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular,古巴(US 5, 891, 996 ；US 6,506,883 ； Mateo 等 人，1997, Immunotechnology,3(1) :71_81) ；mAb-806(Ludwig Institue for Cancer Research, MemorialSloan-Kettering(Ludwig 癌癥研究所，紀(jì)念斯隆-凱特琳癌 癥中心))(Jungbluth 等人 2003，Proc Natl Acad Sci USA. 100(2) :639_44) ；KSB_102(KS
29Biomedix) ；MRl-I (IVAX, National Cancer Institute (美國國家癌癥研究所))(PCT WO 0162931A2)；和 SClOO (Scancell) (PCT WO 01/88138)。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明 的Fc多肽可用于阿侖珠單抗(Campath ，Millenium)，目前被批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞慢 性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單克隆抗體。本發(fā)明的Fc多肽可用于基本上與其他臨床 產(chǎn)品和候選物類似的多種抗體或Fc融合體中，這些其他臨床產(chǎn)品和候選物包括但不限 于莫羅單抗 CD3 (Orthoclone 0KT3 )，Ortho Biotech/Johnson & Johnson 開發(fā)的抗 CD3抗體；替伊莫單抗(Zevalin )，IDEC/Schering AG所開發(fā)的抗CD20抗體；吉妥珠 單抗奧唑米星(gemtuzumab ozogamicin) (Mylotarg ), Celltech/Wyeth 所開發(fā)的抗 CD33 (p67 蛋白)抗體；阿法賽特(alefac印t) (Amevive )，Biogen 所開發(fā)的抗 LFA_3Fc 融合體)；阿昔單抗(ReoPro )，由Centocor/Lilly開發(fā)；巴利昔單抗(Simulect )，由 Novartis開發(fā)；帕利珠單抗(Synagis )，由MedImmune開發(fā)；英夫利昔單抗(Remicade )，由Centocor所開發(fā)的抗TNF α抗體；阿達(dá)木單抗(Humira )，由Abbott所開發(fā)的抗 TNFa抗體；Humicade ，由Celltech所開發(fā)的抗TNF α抗體；依那西普(Enbrel )，由 Immunex/Amgen所開發(fā)的抗TNF α Fc融合體；ABX-CBL，由Abgenix所開發(fā)的抗CD147抗 體；ABX-IL8，由Abgenix所開發(fā)的抗IL8抗體；ΑΒΧ-ΜΑ1，由Abgenix所開發(fā)的抗MUC18抗 體；Pemtumomab (R1549，90Y-muHMFGl)，由 Antisoma 所開發(fā)的抗 MUCl ；Therex (R1550)， 由 Antisoma 所開發(fā)的抗 MUCl 抗體；AngioMab (AS1405)，由 Antisoma 開發(fā)；HuBC-I，由 Antisoma 開發(fā)；Thioplatin(AS1407)，由 Antisoma 開發(fā)；Antegren (那他珠單抗)，由 Biogen所開發(fā)的抗α-4-β-1(νυ\-4)和α-4-β _7抗體；VLA-1單克隆抗體(mAb)，由 Biogen所開發(fā)的抗VLA-I整聯(lián)蛋白抗體；LTBR mAb,由Biogen所開發(fā)的抗淋巴毒素β受 體(LTBR)抗體；CAT-152，由劍橋抗體技術(shù)公司(Cambridge Antibody Technology)所開發(fā) 的抗TGF-β 2抗體；J695，由劍橋抗體技術(shù)公司和Abbott所開發(fā)的抗IL-12抗體；CAT-192， 由劍橋抗體技術(shù)公司和Genzyme所開發(fā)的抗TGFβ 1抗體；CAT-213，由劍橋抗體技術(shù)公司 所開發(fā)的抗嗜酸細(xì)胞活化趨化因子1抗體；LymphoStat-B ，由劍橋抗體技術(shù)公司和Human Genome Sciences Inc.所開發(fā)的抗Blys抗體；TRAIL-RlmAb，由劍橋抗體技術(shù)公司和Human GenomeSciences, Inc.開發(fā)的抗 TRAIL-Rl 抗體；Avastin (貝伐珠單抗，rhuMAb-VEGF)，由 Genentech所開發(fā)的抗VEGF抗體；由Genentech所開發(fā)的抗HER受體家族抗體；抗組織因 子(ATF)，由Genentech所開發(fā)的抗組織因子抗體；XolairTM(奧馬珠單抗)，由Genentech 所開發(fā)的抗IgE抗體；RaptiVaTM(依法珠單抗)，由Genentech和Xoma所開發(fā)的抗⑶Ila 抗體；MLN-02 抗體(原 LDP-02)，由 Genentech 和 Millenium Pharmaceuticals 開發(fā)； HuMax CD4，由Genmab所開發(fā)的抗CD4抗體；HuMax_IL15，由Genmab和Amgen開發(fā)的抗 IL15 抗體；HuMax-Inf lam，由 Genmab 和 Medarex 開發(fā) ；HuMax-癌癥，由 Genmab 禾口 Medarex 和Oxford GcoSciences開發(fā)的抗類肝素酶I抗體；HuMax-淋巴瘤，由Genmab和Amgen開 發(fā)；HuMax-TAC，由 Genmab 開發(fā)；IDEC-131，由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD40L 抗 體；IDEC-151 (克立昔單抗)，由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD4 抗體；IDEC-114,由 IDEC Pharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD80 抗體；IDEC-152，由 IDECPharmaceuticals 開發(fā)的抗 CD23 ；由IDEC Pharmaceuticals開發(fā)的抗巨噬細(xì)胞遷移因子(MIF)抗體；BEC2，由Imclone 所開發(fā)的抗獨(dú)特型抗體；IMC-1C11，由Imclone所開發(fā)的抗KDR抗體；DC101，由Imclone 所開發(fā)的抗flk-1抗體；由Imclone所開發(fā)的抗VE鈣粘蛋白抗體；CEA_CideTM(拉貝珠單抗)，由Immunomedics所開發(fā)的抗癌胚抗原(CEA)抗體；LymphoCideTM(依帕珠單抗)，由 Immunomedics 所開發(fā)的抗 CD22 抗體；AFP-Cide,由 Immunomedics 開發(fā)；MyelomaCide,由 Immunomedics 開發(fā)；LkoCide,由 Immunomedics 開發(fā)；ProstaCide,由 Immunomedics 開發(fā)； MDX-010,由Medarex所開發(fā)的抗CTLA4抗體；MDX-060，由Medarex所開發(fā)的抗CD30抗體； 由 Medarex 所開發(fā)的 MDX-070 ；由 Medarex 所開發(fā)的 MDX-018 ；OsidenT(IDM-I)，由 Medarex 禾口 Immuno-Designed Molecules 所開發(fā)的抗 Her2 抗體；HuMax -CD4,由 Medarex 禾口 Genmab 所開發(fā)的抗CD4抗體；HuMax-IL15，由Medarex和Genmab所開發(fā)的抗IL15抗體；CNTO 148， 由 Medarex和 Centocor/J&J所開發(fā)的抗TNF α 抗體；CNTO 1275，由 Centocor/J&J所開發(fā)的 抗細(xì)胞因子抗體；MORlOl和M0R102，由MorphoSys所開發(fā)的抗細(xì)胞間粘附分子_1 (ICAM-I) (CD54)抗體；M0R201，由MorphoSys所開發(fā)的抗成纖維細(xì)胞生長因子受體3 (FGFR-3)抗體； Nuvion (維西珠單抗)，由 ProteinDesign Labs所開發(fā)的抗CD3抗體；HuZAF ，由 Protein Design Labs所開發(fā)的抗Y干擾素抗體；由Protein Design Labs所開發(fā)的抗α 5β 1整 聯(lián)蛋白；由Protein Design Labs所開發(fā)的抗IL-12 ;ING_1，由Xoma所開發(fā)的抗Ep-CAM抗 體；和MLN01，由Xoma所開發(fā)的抗β 2整聯(lián)蛋白抗體，本段中上文所引用的所有參考文獻(xiàn)都 特意通過引用并入?？梢詫⒈景l(fā)明的Fc多肽整合到上述臨床候選物和產(chǎn)品中，或者整合到基本上與 它們類似的抗體和Fc融合體中?？梢詫⒈景l(fā)明的Fc多肽整合到人源化、親和力成熟、工程 化、或以一些其他方式修飾的形式中的上述臨床候選物和產(chǎn)品中。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明的Fc多肽用于治療自身免疫適應(yīng)癥、炎性適應(yīng)癥、或 移植適應(yīng)癥。與這些疾病相關(guān)的靶抗原和臨床產(chǎn)品和候選物包括但不限于抗α 4β 7整聯(lián) 蛋白抗體，如LDP-02 ；抗β 2整聯(lián)蛋白抗體，如LDP-Ol ；抗補(bǔ)體(C5)抗體，如5G1. 1 ；抗CD2 抗體，如 BTI-322.MEDI-507 ；抗 CD3 抗體，如 0ΚΤ3 ；SMART 抗 CD3、抗 CD4 抗體，如 IDEC-151、 MDX-CD4、0KT4A ；抗 CDlla 抗體；抗 CD14 抗體，如 IC14 ；抗 CD18 抗體；抗 CD23 抗體，如 IDEC 152 ；抗CD25抗體，如賽尼哌；抗CD40L抗體，如5c8、Antova、IDEC-131 ；抗CD64抗體，如 MDX-33 ；抗CD80抗體，如IDEC-114 ；抗CD147抗體，如ABX-CBL ；抗內(nèi)皮細(xì)胞選凝素抗體，如 CDP850 ；抗gpIIb/IIIa抗體，如ReoPro/阿昔單抗；抗ICAM-3抗體，如ICM3 ；抗ICE抗體，如 VX-740 ；抗 FcRl 抗體，如 MDX-33 ；抗 IgE 抗體，如 rhuMab_E25 ；抗 IL-4 抗體，如 SB-240683 ； 抗IL-5抗體，如SB-240563、SCH55700 ；抗IL-8抗體，如ABX-IL8 ；抗干擾素Y抗體；抗 TNF (TNF, TNFa, TNFa, TNF- α )抗體，如 CDP571、CDP870、D2E7、英夫利昔單抗、MAK-195F ；和 抗 VLA-4 抗體，如 Antegren。本發(fā)明的Fc變體，如與FcRn的結(jié)合增加的那些，可用于TNF抑制劑分子中以提 供增強(qiáng)的特性。可用的TNF抑制劑分子包括抑制哺乳動(dòng)物中TNF-α作用的任何分子。 合適的實(shí)例包括Fc融合體Enbrel (依那西普)和抗體Humira (阿達(dá)木單抗)和 Remicade (英夫利昔單抗)。使用本發(fā)明的Fc變體工程化以增加FcFn結(jié)合的單克隆抗 體(如Remicade和Humira)可以在增加的半衰期內(nèi)更高效地翻譯。在一些實(shí)施方式中，使用抗傳染病的抗體?？拐婧思?xì)胞的抗體包括靶向酵母細(xì) 胞的抗體，所述酵母細(xì)胞包括但不限于釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、多形漢 森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸 克魯維酵母(K. Iactis)、季也蒙畢赤酵母(Pichia guilliermondii)和巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、惡性皰原蟲(Plasmodium falciparum)、和耶羅成亞解脂酵母(Yarrowia lipolytica)。也可以使用抗其他真菌細(xì)胞的抗體，包括與下列菌株相關(guān)的靶抗原念珠菌屬菌 株，包括光滑念珠菌(Candida glabrata)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、克魯斯念珠 菌(C. krusei)、葡萄牙念珠菌(C. Iusitaniae)和麥芽糖念珠菌(C. maltosa)；以及曲霉 屬(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、組織胞漿菌屬(Histoplasma)、球孢子菌屬 (Coccidioides)、芽生菌屬(Blastomyces)、禾口青霉菌屬(Penicillium)等。直接針對與原生動(dòng)物相關(guān)的靶抗原的抗體包括但不限于與下列原生動(dòng)物有 關(guān)的抗體錐蟲屬(Trypmosoma)；利什曼原蟲屬(Leishmania)，包括杜氏利什曼原蟲 (Leishmania donovani)；癥原蟲屬(Plasmodium spp.)；卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii)、小球隱抱子蟲(Cryptosporidium parvum)、蘭伯賈第蟲(Giardia lamblia)、 溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytica)、和卡耶塔環(huán)孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)0也可使用抗原核抗原的抗體，包括抗合適的細(xì)菌的抗體，合適的細(xì)菌如致病的 和不致病的原核生物，包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽桿菌(Bacillus anthracis)；弧菌屬(Vibrio)，例如霍亂弧菌(V. cholerae)；埃希氏菌屬(Escherichia), 例如腸毒性的大腸桿菌(E. coli)；志賀氏菌屬(Shigella)，例如，痢疾志賀氏菌 (S. dysenteriae)；沙門氏菌屬(Salmonella)，例如，傷寒沙門氏菌(S. typhi)；分支桿菌屬 (Mycobacterium)，例如，結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)、麻風(fēng)分支桿菌(M. leprae)；梭 狀芽孢桿菌屬(Clostridium)，例如肉毒桿菌(C. botulinum)、破傷風(fēng)桿菌(C. tetani)、艱 難梭菌(C. difficile)、產(chǎn)氣莢膜桿菌(C. perfringens)；棒桿菌屬(Cornyebacterium)， 例如白喉棒狀桿菌(C. diphtheriae)；鏈球菌屬(Str印tococcus)，釀膿鏈球菌 (S. pyogenes)、月市炎鏈球菌(S. pneumoniae)；葡萄球菌屬(Staphylococcus),例如金黃色 葡萄球菌(S. aureus)；嗜血桿菌屬(Haemophilus)，例如，流感嗜血桿菌(H. influenzae)； 奈瑟氏菌屬(Neisseria)，例如，腦膜炎奈瑟氏球菌(N. meningitidis)、淋病奈瑟氏球 菌(N. gonorrhoeae)；耶爾森氏菌屬(Yersinia)，例如，Y. lamblia、鼠疫耶爾森氏菌 (Y.pestis)；假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如綠膿假單胞菌(P. aeruginosa)、惡臭假單胞 菌(P. puti da)；衣原體屬(Chlamydia)，例如，沙眼衣原體(C. trachomatis)；博德特氏菌 屬(Bordetella)，例如百日咳博德特氏菌(B. pertussis)；密螺旋體屬(Tr印onema)，例如， 梅毒密螺旋體(T. palladium)；炭疽芽孢桿菌(B. anthracis)、鼠疫耶爾森氏菌、布魯氏菌 屬(Brucella spp. )、土拉熱弗朗西絲氏菌(F. tularensis)、鼻疽假單胞菌(B. mallei)、類 鼻疽假單胞菌(B. pseudomallei)、鼻疽假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、肉毒桿菌、沙門氏菌屬 (Salmonella spp.) ,SEB V.霍亂毒素 B、大腸桿菌 0157:H7、李斯特菌屬(Listeria spp·)、 白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)，紅酵母屬(Rhodotorula species)、異常漢森 酵母(Hansenula anomala)、腸桿菌屬(Enterobacter sp·)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp·)、李其jf特菌屬(Listeria sp.)、支原菌屬(Mycoplasma sp.)等。在一些方面，抗體是針對病毒感染的，這些病毒包括但不限于包括正粘液病毒 (例如，流感病毒)、副粘液病毒(例如，呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒)、腺病 毒、鼻病毒、冠狀病毒、呼腸孤病毒、披膜病毒(例如，風(fēng)疹病毒)、細(xì)小病毒、痘病毒(例如，
32類天花病毒、痘苗病毒)、腸道病毒(例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇腸道病毒)、肝炎病毒 (包括甲型、乙型和丙型)、皰疹病毒(例如，單純孢疹病毒、水痘_帶狀皰疹病毒、巨細(xì)胞病 毒、EB病毒)、輪狀病毒、諾瓦克(Norwalk)病毒、漢坦病毒、沙粒病毒、桿狀病毒(例如，狂 犬病毒)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括HIV、HTLV-I和HTLV-II)、乳多泡病毒(例如，乳頭瘤病毒)、 多瘤病毒、和細(xì)小核糖核酸病毒等。優(yōu)化的IgG變體特性本申請還提供經(jīng)過優(yōu)化而具有多種治療相關(guān)特性的IgG變體。被工程化或預(yù)測顯 示一種或多種優(yōu)化的特性的IrG變體在本文中稱為“優(yōu)化的IgG變體”?？梢员粌?yōu)化的最 優(yōu)選特性包括但不限于增強(qiáng)或降低FcRn親和力并增加或降低體內(nèi)半衰期。合適的實(shí)施方 式包括顯出如下特性的抗體在較低的PH下，如在與內(nèi)體相關(guān)的pH如pH 6. O下與FcRn結(jié) 合親和力增加，而在較高的PH如7. 4下保持較低的親和力，從而容許進(jìn)入內(nèi)體的攝取增加， 但釋放速率則正常。類似地，這些具有被調(diào)控的FcRn結(jié)合的抗體可以任選地具有其他期望 的特性，例如，被調(diào)控的 FcyR 結(jié)合，如在 U. S. S. N. 11/174，287、11/124，640、10/822，231、 10/672，280、10/379，392、和2005年10月21日提交的申請?zhí)枮?1/256，060且題目為“具 有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG免疫球蛋白變體”的專利申請中所述的。也就是說，優(yōu)化的特 性還包括但不限于對Fc γ R的親和力增強(qiáng)或減弱。在一任選的實(shí)施方式中，IgG變體被 優(yōu)化為具有除了 FcRn結(jié)合特性之外，還具有增強(qiáng)的對人活化Fc y R，優(yōu)選Fc y RIIIa的親 和力。在又一任選的替代性實(shí)施方式中，IgG變體被優(yōu)化為具有降低的對人抑制性受體 Fc y RIIb的親和力。也就是說，具體的實(shí)施方式涵蓋了顯示增加的與FcRn的結(jié)合和增加的 與Fc YRIIIa的結(jié)合的抗體的用途。其他實(shí)施方式利用了顯示增加的與FcRn的結(jié)合和增 加的與Fc YRIIIa的結(jié)合的抗體的用途。預(yù)計(jì)這些實(shí)施方式在人中提供具有增強(qiáng)的治療特 性例如增強(qiáng)的效應(yīng)子功能和較高的抗癌效力的IgG多肽。在替代性實(shí)施方式中，IgG變體 被優(yōu)化為具有增加的或降低的對FcRn的親和力和增加的或降低的對人Fc y R的親和力，人 Fc γ R 包括但不限于 FcYRI、FcYRIIa、FcYRIIb、FcYRIIc、FcYRIIIa、fn Fc YRIIIb，包 括它們的等位基因變異。預(yù)計(jì)這些實(shí)施方式在人中提供具有增強(qiáng)的治療特性例如增強(qiáng)的血 清半衰期和降低的效應(yīng)子功能的IgG多肽。在其他實(shí)施方式中，IgG變體提供增強(qiáng)的對FcRn 的親和力和增強(qiáng)的對一種或多種Fc γ R的親和力，而降低的對一種或多種其他Fc γ R的親 和力。例如，IgG變體可以具有增強(qiáng)的與FcRn和Fc γ RIIIa的結(jié)合，而降低的與FcyRIIIb 的結(jié)合?？蛇x擇地，IgG變體可以具有降低的與FcRn和與Fc γ R結(jié)合。在另一實(shí)施方式中， IgG變體可以具有降低的對FcRn的親和力和增強(qiáng)的對Fc y RI Ib的親和力，而降低的對與一 種或多種活化Fc γ R的親和力。在另一實(shí)施方式中，IgG變體可以具有增加的血清半衰期 和降低的效應(yīng)子功能。優(yōu)選的實(shí)施方式包括與人FcRn和Fc γ R結(jié)合的優(yōu)化，然而，在替代性實(shí)施方式中， IgG變體具有增強(qiáng)的或降低的對來自非人生物體的FcRn ^P FcyR的親和力，非人生物體包 括但不限于嚙齒動(dòng)物和非人的靈長類。被優(yōu)化用于結(jié)合非人FcRn的IgG變體可用于實(shí)驗(yàn) 中。例如，可以使用用于多種疾病的小鼠模型，該小鼠模型能夠測試給定藥物候選物的特 性，如效力、毒性和藥代動(dòng)力學(xué)特性。如本領(lǐng)域中所已知的，可以將癌細(xì)胞移植或注入小鼠 以模擬人的癌癥，此過程稱為異種移植。包括被優(yōu)化用于FcRn的IgG變體的IgG變體的測 試可以提供關(guān)于蛋白的清除特征、其清除機(jī)制等的有價(jià)值信息。還可以優(yōu)化IgG變體以具
33有增強(qiáng)糖基化形式的官能度和/或溶解特性。Fc配體包括但不限于FcRn、Fc y R、Clq、和 蛋白A和G，它可以來自任何來源，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔、或猴，優(yōu)選為人。在替 代性優(yōu)選實(shí)施方式中，將IgG變體優(yōu)化為比親本IgG變體的糖基化形式更穩(wěn)定和/或更可溶。IgG變體可以包括調(diào)控與非FcRn和Fc γ R的Fc配體之間的相互作用的修飾，所述 非FcRn和Fc γ R的Fc配體包括但不限于補(bǔ)體蛋白和Fc受體同源物(FcRH)。FcRH包括但 不限于 FcRHl、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5、和 FcRH6 (Davis 等人，2002，Immunol. Reviews 190 :123-136，其通過引用整體并入)。優(yōu)選地，IgG變體的Fc配體特異性將決定它的治療效用。用于治療目的的給定IgG 變體的效用取決于靶抗原的表位或形式以及所治療的疾病或適應(yīng)癥。對于大多數(shù)的靶和適 應(yīng)癥，增強(qiáng)的FcRn結(jié)合可能是優(yōu)選的，因?yàn)樵鰪?qiáng)的FcRn結(jié)合可以導(dǎo)致血清半衰期的增加。 較長的血清半衰期容許治療劑較低頻率的給藥或較少給藥。這在治療劑是為了響應(yīng)需要重 復(fù)施用的適應(yīng)癥而提供時(shí)是尤其優(yōu)選的。對于某些靶和適應(yīng)癥，降低的FcRn親和力可能是 優(yōu)選的。這在期望變體Fc具有增強(qiáng)的清除率或降低的血清半衰期時(shí)，例如在用作成像劑或 輻射治療劑的Fc多肽中時(shí)是尤其優(yōu)選的?？梢允褂冒ㄟ@樣的IgG變體的IgG變體提供增強(qiáng)的對FcRn的親和力和對增 強(qiáng)的活化Fc γ R的親和力和/或降低的對抑制性Fc γ R的親和力。對于某些靶和適應(yīng)癥， 還有利的是使用對不同的活化Fc γ R提供不同的選擇性的IgG變體，例如，在一些情況下 可能期望增強(qiáng)與Fc y RIIa和Fc Y RIIIa而非Fc y RI的結(jié)合，而在其他情況下，僅增強(qiáng)與 Fc y RIIa的結(jié)合可能是優(yōu)選的。對于某些靶和適應(yīng)癥，可能優(yōu)選的是利用改變FcRn結(jié)合 并增強(qiáng)Fc γ R介導(dǎo)的效應(yīng)子功能和補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng)子功能二者的IgG變體，而對于其他情 況下，可能有利的是利用增強(qiáng)FcRn結(jié)合或血清半衰期以及Fc γ R介導(dǎo)的或補(bǔ)體介導(dǎo)的效應(yīng) 子功能的IgG變體。對于某些靶或癌癥適應(yīng)癥，可能有利的是降低或消除一個(gè)或多個(gè)效應(yīng) 子功能，例如通過敲除與Clq、一種或多種Fc y R、FcRn、或一種或多種其他Fc配體的結(jié)合進(jìn) 行。對于其他靶和適應(yīng)癥，可能優(yōu)選的是利用提供與抑制性Fc YRIIb結(jié)合增強(qiáng)，而與活化 FcyR結(jié)合為野生型水平、被降低或消除的IgG變體。這在例如當(dāng)IgG變體的目標(biāo)是抑制炎 性或自身免疫性疾病或以某種方式調(diào)控免疫系統(tǒng)的時(shí)候是特別可用的。由于自身免疫性疾 病通常持續(xù)很久并且治療要重復(fù)給藥，用具有增加的半衰期而不是增加的FcRn的Fc變體 進(jìn)行它們的治療是尤其優(yōu)選的?？梢赃M(jìn)行修飾來改善IgG穩(wěn)定性、溶解性、功能、或臨床用途。在優(yōu)選的實(shí)施方式 中，IgG變體可以包括在人中降低的免疫原性的修飾。在最優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用USSN 11/004, 590中所述的方法降低IgG變體的免疫原性，USSN 11/004, 590通過引用整體并入。 在替代性實(shí)施方式中，IgG變體是人源化的(Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402，通 過引用整體并入)。IgG變體可以包括降低免疫原性的修飾。降低免疫原性的修飾可以包括降低源自 親本序列的加工肽與MHC蛋白的結(jié)合的修飾。例如，可以工程化氨基酸修飾以便沒有或有 最少數(shù)目的免疫表位預(yù)計(jì)與任何主要MHC等位基因高親和力結(jié)合。本領(lǐng)域內(nèi)已知在蛋白 序列中鑒定MHC結(jié)合表位的若干方法，它們可以用于對在IgG變體中的表位評分。參見， 例如 W098/52976 ；WO 02/079232 ；WO 00/3317 ；USSN 09/903，378 ；USSN10/039, 170 ；USSN60/222, 697 ；USSN 10/754, 296 ；PCT WO 01/21823 ；和 PCT WO 02/00165 ；Mallios,1999, Bioinformatics 15 432-439 ；Mallios,2001, Bioinformatics 17 942-948 ；Sturniolo 等人，1999，Nature Biotech. 17 555-561 ；WO 98/59244 ；WO 02/069232；WO 02/77187 ； Marshall 等人，1995，J. Immunol. 154 :5927_5933 ；以及Hammer 等人，1994，J. Exp. Med. 180 2353-2358，它們都通過引用整體并入?？梢允褂没谛蛄械男畔泶_定給定肽-MHC相互 作用的結(jié)合評分(參見，例如Mallios，1999，Bioinformatics 15 :432_439 ；Mallios，2001， Bioinformatics 17 第 942-948 頁；Sturniolo 等人，1999，Nature Biotech. 17 :555_561， 它們都通過引用整體并入)。工程化IgG變體本發(fā)明的變體可以通過多種方法設(shè)計(jì)。本文所述的變體可以是插入、缺失、取代、 其他修飾、或這些的組合和其他改變。本發(fā)明的一個(gè)特別新穎的實(shí)施方式是改善或降低Fc 多肽與Fc配體的結(jié)合的插入和缺失的設(shè)計(jì)。如本文所公開的，可以進(jìn)行插入或缺失以增加 或降低Fc多肽對FcRn的親和力?？梢酝ㄟ^合理的方法或通過包括使用隨機(jī)組分例如隨機(jī) 或半隨機(jī)的文庫產(chǎn)生或篩選的方法來設(shè)計(jì)插入和缺失。在替代性實(shí)施方式中，公開了增加 或降低Fc多肽對FcRn的親和力的取代。骨架修飾插入和缺失變體Fc多肽可以通過用變體氨基酸取代Fc多肽位置的親本氨基酸產(chǎn)生。通過將 Fc多肽中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代為變體氨基酸，改變了那些位置上的側(cè)鏈。最可用的取 代通過改變Fc側(cè)鏈而更改Fc特性。取代的側(cè)鏈可以直接或間接與和Fc功能或特性相關(guān) 的Fc結(jié)合配偶體相互作用。該至少一個(gè)取代改變了親本Fc多肽的一個(gè)或多個(gè)側(cè)鏈的共價(jià) 結(jié)構(gòu)。可選擇地，可以產(chǎn)生改變親本Fc多肽的骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)的變體Fc多肽。蛋白中 的骨架原子是肽氮、α碳、羰基或肽碳和羰基氧。改變骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)提供改變Fc多肽的 特性的另外的方法。Fc骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)可以通過添加原子到骨架中來改變，例如，通過插 入一個(gè)或多個(gè)氨基酸；或從骨架中減去原子來改變，例如通過缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸。骨 架的共價(jià)結(jié)構(gòu)還可以通過將骨架的各原子改變?yōu)槠渌觼砀淖?Deechongkit等人，JAm Chem Soc. 2004. 126(51) :16762_71，通過引用整體并入)。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的和本文所 示例的，F(xiàn)c多肽中氨基酸的插入或缺失可以通過插入或缺失編碼Fc多肽的DNA中的相應(yīng) 核苷酸來進(jìn)行?？蛇x擇地，如本領(lǐng)域中所已知，氨基酸的插入或缺失可以在Fc多肽合成期 間進(jìn)行。改變Fc多肽與一個(gè)或多個(gè)結(jié)合配偶體(例如，F(xiàn)c y R、FcRn、Clq)的相互作用的氨 基酸插入或缺失的設(shè)計(jì)可以通過考慮Fc多肽及其結(jié)合配偶體的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)來進(jìn)行。在 次優(yōu)選的實(shí)施方式中，該設(shè)計(jì)可以通過考慮Fc多肽的結(jié)構(gòu)和關(guān)于參與與結(jié)合配偶體的結(jié) 合的Fc區(qū)的信息來進(jìn)行。這種信息可以通過誘變實(shí)驗(yàn)、噬菌體展示實(shí)驗(yàn)、同源性比較、計(jì)算 機(jī)建?；蚱渌椒ǐ@得。影響Fc結(jié)合相互作用但是不影響Fc多肽的整體結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性、表達(dá)或Fc用途 的插入或缺失的氨基酸序列的優(yōu)選位置為參與Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用的環(huán)。為了改 變 FcRn 與 Fc 多肽的結(jié)合，位置 244-257、279-284、307-317、383-390、和 428-435 是插入 或缺失的優(yōu)選環(huán)位置(根據(jù)Kabat等人的EU索引編號，Burmeister等人，1994，Nature,372 :379-383 ;Martin 等人，2001，Mol Cell 7 :867_877，它們都通過引用整體并入)。為 了改變Fc γ受體與Fc多肽的結(jié)合，位置229-239、266-273、294-299、和324-331是插入或 缺失的優(yōu)選環(huán)位置(根據(jù)Kabat等人的EU索引編號，PDB編號1E4K. pdb，Sondermann等 人Nature. 2000 406 :267，它們都通過引用整體并入)。環(huán)是不參與α螺旋或β片層結(jié) 構(gòu)的多肽區(qū)域。環(huán)位置是不在α螺旋或β片層結(jié)構(gòu)中的位置(van Holde, Johnson和 Ho. Principles of Physical Biochemistry (物理生化原理)· Prentice Hall,New Jersey 1998，第1章，第2-67頁，通過引用整體并入)。環(huán)位置是優(yōu)選的是因?yàn)楣羌茉优cα螺旋 和β片層的骨架原子相比通常是更柔韌的并且不太可能參與氫鍵。因此，由于一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的插入或缺失而引起的環(huán)的加長或縮短不太可能引起Fc多肽的大的破壞性改變， 包括穩(wěn)定性、表達(dá)或其他問題?？梢允褂貌迦牒腿笔砀淖兌嚯牡拈L度。例如，在環(huán)區(qū)域，改變環(huán)長度會(huì)導(dǎo)致環(huán) 的柔性和構(gòu)象熵改變。環(huán)中的插入通常增加環(huán)的構(gòu)象熵，環(huán)的構(gòu)象熵用Boltzman常數(shù)乘 以可能的構(gòu)象數(shù)的自然對數(shù)來定義(van Holde, Johnson和Ho. Principles of Physical Biochemistry (物理生化原理).PrenticeHall，New Jersey 1998，第 78 頁，通過引用整體 并入)。通過將至少一個(gè)氨基酸插入到多肽中，多肽可用的構(gòu)象總數(shù)增加了。這些額外的構(gòu) 象可能有益于形成有利的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)镕c多肽可以使用額外構(gòu)象之一 來結(jié)合Fc結(jié)合蛋白。在這種情況下，插入可能導(dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如 果額外的構(gòu)象沒有用于結(jié)合界面，則插入可能導(dǎo)致較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因 為額外的構(gòu)象會(huì)與結(jié)合活性構(gòu)象相競爭。類似地，多肽片段的缺失也可能導(dǎo)致較強(qiáng)或較弱 的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果降低可能的骨架構(gòu)象數(shù)的片段的缺失移除了結(jié)合活性 構(gòu)象，則該缺失可能導(dǎo)致較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用。如果缺失不移除結(jié)合活性構(gòu) 象，則該缺失可能導(dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，因?yàn)樵撊笔Э赡芤瞥c結(jié)合活 性構(gòu)象競爭的構(gòu)象?？梢允褂貌迦牒腿笔砀淖僃c多肽中氨基酸的位置和取向。因?yàn)椴迦牒腿笔б?起骨架的共價(jià)結(jié)構(gòu)改變，它們必然會(huì)引起骨架原子的位置改變。圖7比較了在三個(gè)不同的 骨架中標(biāo)記為Ll至L4的相同環(huán)片段的骨架位置。參考骨架結(jié)構(gòu)含有4個(gè)環(huán)片段，而缺失 骨架缺乏片段Li，插入片段在片段Ll之前即片段Ll的N-末端包含額外的片段。插入和 缺失會(huì)引起插入或缺失位點(diǎn)附近的骨架結(jié)構(gòu)的最大改變。通過缺失環(huán)的N-末端附近的片 段，例如，片段Li，環(huán)縮短了，并且剩余的片段的位置向更接近環(huán)N-末端的位置移動(dòng)。這具 有將L2片段向之前的Ll片段位置和向環(huán)N-末端移動(dòng)的效果。這種L2片段向Ll片段的 位置移動(dòng)可能增強(qiáng)Fc/Fc結(jié)合配偶體復(fù)合體的結(jié)合，并且在當(dāng)現(xiàn)有信息表明位于L2的一個(gè) 或多個(gè)氨基酸在位于Ll時(shí)能夠促進(jìn)Fc結(jié)合配偶體的相互作用時(shí)這是優(yōu)選的。例如，如果 L2含有丙氨酸和酪氨酸，并且之前將兩個(gè)Ll氨基酸取代為丙氨酸和酪氨酸導(dǎo)致Fc變體的 結(jié)合增加，則Ll缺失可能產(chǎn)生對Fc結(jié)合配偶體的親和力增加的Fc變體。類似地，在環(huán)的N末端側(cè)將多肽片段插入Fc多肽中會(huì)引起環(huán)片段的位置移向環(huán)的 C-末端側(cè)。在圖7中，在片段Ll之前即片段Ll的N-末端插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變了骨 架構(gòu)象，包括使Ll片段移至環(huán)的C-末端。這種類型的插入在已知位于片段Ll的氨基酸位 于L2位置時(shí)能夠促進(jìn)相互作用的時(shí)候是優(yōu)選的，因?yàn)樵摬迦肟赡軐?dǎo)致較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配 偶體相互作用。如果期望較弱的Fc/Fc結(jié)合配偶體相互作用，則可以使用插入來將不利的
36氨基酸移至新的位置。插入的、缺失的和參考片段(圖7中的Ll至L4)可以是Fc多肽中 的一個(gè)或多于一個(gè)的氨基酸。
可選擇地，可以在環(huán)的C-末端以類似于環(huán)的N-末端的插入或缺失的方式使用插 入或缺失。環(huán)C-末端的插入可能導(dǎo)致插入的N-末端位置向環(huán)N-末端移動(dòng)。環(huán)C-末端的 缺失可能導(dǎo)致缺失的N-末端位置向環(huán)C-末端移動(dòng)。在環(huán)的N-末端還是C-末端使用插入 或缺失的選擇基于位于環(huán)中的氨基酸、對增加或降低Fc/Fc結(jié)合配偶體親和力的期望、和 所需的位置移動(dòng)。插入或缺失可用于Fc多肽的任何區(qū)域，包括環(huán)、α螺旋和β片層區(qū)。優(yōu)選的插 入和缺失位置包括環(huán)區(qū)域，它是非α螺旋或β片層區(qū)的那些區(qū)域。環(huán)是優(yōu)選的是因?yàn)樗?們一般能比α螺旋或β片層更好地接受骨架中的改變。導(dǎo)致較強(qiáng)的蛋白/蛋白相互作用 的插入或缺失的尤其優(yōu)選的位置在環(huán)的N-末端或C-末端邊緣。如果環(huán)的側(cè)鏈參與了 Fe/ Fc結(jié)合配偶體相互作用，則在邊緣的插入或缺失會(huì)導(dǎo)致結(jié)合相互作用中強(qiáng)的有害改變的可 能性較低。環(huán)的正中心的缺失更可能移除Fc/Fc結(jié)合配偶體界面的重要?dú)埢?，環(huán)的正中心 的插入更可能產(chǎn)生Fc/Fc結(jié)合配偶體界面的不利相互作用。缺失或插入的殘基數(shù)目可以通 過所需的骨架改變的大小來決定，其中15個(gè)或更少的殘基的插入或缺失是優(yōu)選的，10個(gè)或 更少的殘基的插入或缺失是更優(yōu)選的，并且5個(gè)或更少的殘基的插入或缺失是最優(yōu)選的。一旦設(shè)計(jì)出Fc缺失變體的位置和大小，便完全確定了整個(gè)多肽序列，可以通過本 領(lǐng)域內(nèi)已知的方法構(gòu)建多肽。然而Fc插入變體則具有設(shè)計(jì)要插入的至少一個(gè)氨基酸的序列的額外步驟。包括 Ser, Thr、Asn, Gin、Ala、Gly、His的極性殘基的插入優(yōu)選在預(yù)期在Fc多肽中暴露的位置。 包括Ser、Thr、和Ala的較小氨基酸是尤其優(yōu)選的，因?yàn)樾〕叽缥蛔韪蓴_Fc/Fc結(jié)合配偶體 相互作用的可能性較小。Ser和Thr還具有與Fc結(jié)合配偶體上的原子形成氫鍵的能力。插入還具有增加的靈活性，插入的多肽可以設(shè)計(jì)成有利于與Fc結(jié)合配偶體的 相互作用，如在需要較強(qiáng)的Fc/Fc結(jié)合配偶體結(jié)合時(shí)所期望的。骨架插入的長度可以通 過對具有簡單通用的插入序列的變體骨架建模來確定。例如，可以構(gòu)建不同長度的聚絲 氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸插入，并進(jìn)行建模。建模可以通過多種方法進(jìn)行，包括基于包 含插入的同源物的已知三維結(jié)構(gòu)的同源物建模，可以通過包括如下的計(jì)算機(jī)建模進(jìn)行 MODELLER (M. A. Marti-Renom 等人· Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 29，291—325，2000) 和ROSETTA (Kuhlman等人(2003). Science 302，1364-8)，它們都通過引用整體并入。通常， 最初制備多種骨架構(gòu)象，最終的骨架結(jié)構(gòu)則在確定側(cè)鏈特征之后確定。側(cè)鏈可以通過PDA 算法設(shè)計(jì)(US 6，188，965 ；6，269，312 ；6，403，312 ；6，801，861 ；6，804，611 ；6，792，356 ； 6，950，754 禾口 USSN09/782, 004 ；09/927，790 ；10/101，499 ；10/666，307 ；10/666311 ； 10/218，102，它們都通過引用整體并入)?？梢赃M(jìn)行插入和缺失來以類似于所述用于改變FcRn結(jié)合特性的方法的方式改變 Fc多肽與Fc γ R的結(jié)合。Fc結(jié)構(gòu)域在圖1中所指示的位置結(jié)合Fc y R0 Fc/Fc y R復(fù)合體 的結(jié)構(gòu)包括 PDB 編號 1Τ89 禾口 IIIS (Radaev S 等人 J. Biol. Chem.第 276 卷，第 16469-16477 頁，通過引用整體并入)展示了兩種結(jié)構(gòu)之間的相互作用殘基和環(huán)。諸如在US11/124620 和US6737056(它們都通過引用整體并入)中所發(fā)現(xiàn)的那些誘變結(jié)果全都可用于確定適當(dāng) 的骨架定位移動(dòng)。
可以通過本文所述的方法將插入和缺失設(shè)計(jì)在Fc多肽之外的任何多肽中。例如，TNF超家族成員APRIL的插入或缺失可以借助于其三維結(jié)構(gòu)(PDB編號1XU1. pdb， Hymowitz，等人(2005) J. Biol. Chem. 280 :7218，通過引用整體并入)來設(shè)計(jì)?？梢栽O(shè)計(jì)插 入或缺失來增加APRIL與其受體TACI的結(jié)合。優(yōu)選作為插入或缺失位點(diǎn)的環(huán)殘基為殘基 Serll8-Vall24、Aspl64-Phel67、Prol92-Alal98、Pro221-Lys226。這些環(huán)與 APRIL/TACI 復(fù) 合體中的TACI相互作用并且介導(dǎo)結(jié)合。整合多肽的變體IgG變體可以基于人IgG序列，因此人IgG序列用作其他序列與之比較的“基本”序 列，其他序列包括但不限于來自其他生物體的序列，如嚙齒動(dòng)物和靈長類序列。IgG變體還 可以包含來自其他免疫球蛋白種類的序列，如IgA、IgE、IgD、IgM等。本發(fā)明包括盡管IgG 變體是在一個(gè)親本IgG的背景下工程化的，但是可以將變體工程化到或轉(zhuǎn)移到另一個(gè)第二 親本IgG的背景中。這通過確定第一和第二 IgG之間的“等同”或“對應(yīng)”殘基和取代來進(jìn) 行，通常是基于IgG序列之間的序列或結(jié)構(gòu)同源性進(jìn)行。為了確定同源性，將本文所列的第 一 IgG的氨基酸序列直接與第二 IgG的序列進(jìn)行比較。使用容許必須的插入和缺失以保持 比對(即，避免通過任意缺失和插入消除保守殘基)的本領(lǐng)域內(nèi)已知的一種或多種同源比 對程序(例如使用物種之間的保守殘基)比對序列后，定義等同于第一 IgG變體的一級序 列的具體氨基酸的殘基。保守殘基的比對優(yōu)選應(yīng)保留100%的這種殘基。然而，大于75% 或小至50%的保守殘基比對也足以定義等同殘基。等同殘基還可以通過測定第一和第二 IgG的結(jié)構(gòu)同源性來定義，結(jié)構(gòu)同源性在結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定的IgG的三級結(jié)構(gòu)水平進(jìn)行。在這 種情況下，等同殘基被定義為在比對后親本或前體的具體氨基酸殘基的兩個(gè)或多個(gè)主鏈原 子的原子坐標(biāo)(N上的N，CA上的CA、C上的C和0上的0)在0. 13nm之內(nèi)且優(yōu)選為0. Inm 的殘基。在最佳的模型被定向和定位以使蛋白的非氫蛋白原子的原子坐標(biāo)最大程度的重疊 之后，便完成了比對。無論如何確定等同或?qū)?yīng)殘基，也無論制備IgG的親本IgG的身份如 何，所傳達(dá)的意思是由此發(fā)現(xiàn)的IgG變體可以被工程化到與IgG變體具有明顯的序列或結(jié) 構(gòu)同源性的任何第二親本IgG中。因此，例如，如果通過使用上述方法或測定等同殘基的其 他方法制備了其中親本抗體為人IgGl的變體抗體，則可以將變體抗體工程化到結(jié)合不同 抗原的另一 IgGl親本抗體、人IgG2親本抗體、人IgA親本抗體、小鼠IgG2a或IgG2b親本 抗體等中。同樣，如上文所述，親本IgG變體背景不會(huì)影響IgG變體轉(zhuǎn)移至其他親本IgG的 能力。提供了工程化、制備、和篩選IgG變體的方法。所述方法不旨在限制于任何具體的 應(yīng)用或操作理論。相反，所提供的方法旨在一般性地示例出可以用實(shí)驗(yàn)方法工程化、制備 和篩選一種或多種IgG變體以獲得具有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG變體。USSN 10/754, 296 和USSN 10/672,280中描述了用于設(shè)計(jì)、制備和測試抗體和蛋白變體的多種方法，USSN 10/754，296和USSN 10/672，280都通過引用整體并入?？梢允褂枚喾N蛋白工程化方法來設(shè)計(jì)具有優(yōu)化的效應(yīng)子功能的IgG變體。在一 個(gè)實(shí)施方式中，可以使用基于結(jié)構(gòu)的工程化方法，其中使用可用的結(jié)構(gòu)信息來指導(dǎo)取代、插 入或缺失。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，可以使用計(jì)算篩選方法，其中根據(jù)它們在計(jì)算機(jī)計(jì)算中 的能量適合性(energetic fitness)來設(shè)計(jì)取代。參見，例如USSN 10/754，296和USSN 10/672，280、以及本文所引用的參考文獻(xiàn)，它們都通過引用整體并入。
可以使用序列比對來指導(dǎo)在指定位置的取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解序列信 息的使用可以控制可能不利于蛋白結(jié)構(gòu)的取代的引入。序列來源可能廣泛地變化，并且包 括一個(gè)或多個(gè)已知的數(shù)據(jù)庫，所述數(shù)據(jù)庫包括但不限于=Kabat數(shù)據(jù)庫(美國西北大學(xué))； Johnson & Wu，2001，Nucleic AcidsRes. 29 205-206 Johnson & Wu,2000，Nucleic Acids Res. 28 214-218) ；IMGT WiMf^ (IMGT，the international ImMunoGeneTics information system ； Lefranc 等人，1999，Nucleic Acids Res. 27 209-212 ；Ruiz 等人，2000 NucleicAcids Res. 28 :219_221 ；Lefranc 等人,2001，Nucleic Acids Res. 29 :207_209 ； Lefranc 等人，2003，Nucleic Acids Res. 31 :307_310)；和 VBASE，它們都通過引用整體并 入?？梢詮姆N系序列或來自包括但不限于哺乳動(dòng)物的任何生物體的天然存在的抗體序列的 序列比對獲得、匯編、和/或產(chǎn)生抗體序列信息。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解使用人或基本上 是人的序列還可以在施用給人時(shí)具有較低免疫原性的優(yōu)點(diǎn)。更一般性的核酸或蛋白數(shù)據(jù)庫 即不是針對抗體的其他數(shù)據(jù)庫包括但不限于SwissProt、GenBank EntrezJP EMBL核酸序 列數(shù)據(jù)庫。比對的序列可以包括￥!1、￥1^、01、和/或(^序列。本領(lǐng)域內(nèi)已知大量的基于序 列的比對程序和方法，并且它們都可 以用于進(jìn)行序列比對。可選擇地，可以使用隨機(jī)或半隨機(jī)誘變法在所需位置進(jìn)行氨基酸修飾。在這些情 況下，位置是隨機(jī)選擇的，或者使用簡單化的規(guī)則進(jìn)行氨基酸改變。例如，可以將所有殘基 都突變?yōu)楸彼?，這稱為丙氨酸掃描。這類方法可以與采用選擇法來篩選較高水平的序列 多樣性的更復(fù)雜的工程化方法結(jié)合。如本領(lǐng)域所已知的，多種選擇技術(shù)可以用于此類方法， 包括例如，展示技術(shù)，如噬菌體展示、核糖體展示、細(xì)胞表面展示等，如下文所描述的。制備和篩選IgG變體的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的?？贵w分子生物學(xué)、表達(dá)、純化和 篩選的一般方法描述于Antibody Engineering (抗體工程化)，Duebel & Kontermann編 輯，Springer-Verlag, Heidelberg,2001 ；禾口 Hayhurst& Georgiou,2001, Curr Opin Chem Biol 5 683-689 ；Maynard & Georgiou，2000，Annu Rev Biomed Eng 2 :339_76 巾。
USSN 10/754，296 ；USSN10/672, 280 ；和 USSN 10/822，231 ；以及 11/124，620 中所描述的方 法，它們都通過引用整體并入。本發(fā)明的優(yōu)選變體包括圖8中出現(xiàn)的那些。本發(fā)明的替代 性優(yōu)選變體包括圖9中出現(xiàn)的那些。本發(fā)明的另外的替代性優(yōu)選變體包括圖10中出現(xiàn)的 那些。如實(shí)施例中所示例的，這些變體顯示與Fc受體FcRn的結(jié)合增加。制備IgG變體IgG變體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的任何方法制備。在一個(gè)實(shí)施方式中，可以使用 IgG變體序列來制備編碼成員序列的核酸，如果需要可以然后將該核酸克隆到宿主細(xì)胞中， 表達(dá)并測定。這些實(shí)踐使用熟知的方法進(jìn)行，并且可以使用的多種方法描述在Molecular Cloning-Α Laboratory Manual (分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊)，第 3 版(Maniatis, Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,2001)；禾口Current Protocols in Molecular Biology (現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù))(John Wiley & Sons)中，它們都通過引用整體并入。 可以將編碼IgG變體的核酸整合到表達(dá)載體中以表達(dá)蛋白。表達(dá)載體通常包括與控制或調(diào) 節(jié)序列、選擇標(biāo)志物、任何融合配偶體和/或另外的元件可操作地連接即置于功能關(guān)系的 蛋白?？梢酝ㄟ^在合適的條件下培養(yǎng)用核酸，優(yōu)選含有編碼IgG變體的核酸的表達(dá)載體轉(zhuǎn) 化的宿主細(xì)胞以誘導(dǎo)或引起蛋白表達(dá)來制備IgG變體?？梢允褂枚喾N合適的宿主細(xì)胞，包 括但不限于哺乳動(dòng)物細(xì)胞、細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞和酵母。例如，可以使用的多種細(xì)胞系描述在自美國標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)獲得的ATCC細(xì)胞系目錄 中，其通過引用整體并入。將外源核酸引入宿主細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，并且可以 隨所用的宿主細(xì)胞而變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在IgG變體表達(dá)后，將其純化或分離?？贵w可以用本領(lǐng)域的 那些技術(shù)人員所已知的多種方法來分離或純化。標(biāo)準(zhǔn)的純化方法包括色譜技術(shù)、電泳、免 疫、沉淀、透析、過濾、濃縮、和色譜聚焦技術(shù)。如本領(lǐng)域內(nèi)所熟知的，多種天然蛋白結(jié)合抗 體，例如細(xì)菌蛋白A、G和L，并且這些蛋白可用于純化。通常，能夠通過特定融合配偶體來進(jìn) 行純化。例如，如果使用GST融合體，則可以使用谷胱甘肽樹脂來純化蛋白；如果使用His 標(biāo)簽，則使用Ni+2親和色譜，或如果使用flag標(biāo)簽，則使用固定的抗flag抗體。對于合適 的純化技術(shù)的一般指南，參見AntibodyPurification principles and Practice (抗體純 化原理與實(shí)踐)，第3版，Scopes, Springer-Verlag，NY，1994，其通過引用整體并入。篩選IgG變體 Fc變體可以使用多種方法來篩選，包括但不限于使用體外測定、體內(nèi)和基于細(xì) 胞的測定以及選擇技術(shù)的那些方法?？梢詫⒆詣?dòng)和高通量篩選技術(shù)用于篩選方法。篩選 可以采用融合配偶體或標(biāo)記，例如，免疫標(biāo)記、同位素標(biāo)記、或小分子標(biāo)記，如熒光或發(fā)色染 料。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在體外測定中篩選Fc變體的功能和/或生物物理特性。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，篩選蛋白的官能度，例如其催化反應(yīng)的能力或其與其靶的結(jié)合親和力。如本領(lǐng)域中所已知的，篩選方法的亞類為選擇文庫的有利成員的那些方法。該方 法在本文中稱為“選擇方法”，并且這些方法可用于在本發(fā)明中篩選Fc變體。當(dāng)使用選擇方 法篩選蛋白文庫時(shí)，僅繁殖、分離、和/或觀察那些有利的文庫成員，即符合一些選擇標(biāo)準(zhǔn) 的成員?？捎糜诒景l(fā)明中篩選蛋白文庫的許多選擇方法是本領(lǐng)域內(nèi)所已知的?？捎糜诒景l(fā) 明中的其他選擇方法包括不依賴于展示如體內(nèi)方法的方法。稱為“定向進(jìn)化”法的一組選 擇方法是包括在選擇期間配對或延伸有利序列，有時(shí)會(huì)摻入新的突變的那些方法。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用一種或多種基于細(xì)胞的測定或體內(nèi)測定來篩選Fc變 體。對于這類測定，通常外源地添加純化的或非純化的蛋白以便使細(xì)胞暴露于屬于文庫的 單個(gè)變體或變體庫。這些測定通常但不總是基于Fc多肽的功能；S卩，F(xiàn)c多肽結(jié)合其靶并介 導(dǎo)諸如效應(yīng)子功能、配體/受體結(jié)合抑制、凋亡等的一些生物化學(xué)事件的能力。這些測定通 常包括監(jiān)控細(xì)胞對IgG的反應(yīng)，例如細(xì)胞存活、細(xì)胞死亡、細(xì)胞形態(tài)改變、或轉(zhuǎn)錄激活，如天 然基因或報(bào)道基因的細(xì)胞表達(dá)。例如，這些測定可以測量Fc變體引起ADCC、ADCP、或⑶C的 能力。對于一些測定，可能需要添加另外的細(xì)胞或組分即除靶細(xì)胞之外的細(xì)胞或組分，例如 血清補(bǔ)充物、或效應(yīng)子細(xì)胞，如外周血單核細(xì)胞(PBMC)、NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。這些額外的 細(xì)胞可以來自任何生物體，優(yōu)選人、小鼠、大鼠、兔、和猴。抗體可能引起表達(dá)靶的某些細(xì)胞 系凋亡，或它們可能介導(dǎo)被添加到測定中的免疫細(xì)胞對靶細(xì)胞的攻擊。監(jiān)控細(xì)胞死亡或存 活率的方法是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，包括染料、免疫化學(xué)、細(xì)胞化學(xué)、和放射性試劑的使用。轉(zhuǎn)錄 激活還可以作為在基于細(xì)胞的測定中測定功能的方法?？蛇x擇地，基于細(xì)胞的篩選使用被 用編碼變體的核酸轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來進(jìn)行。也就是說，F(xiàn)c變體不是外源地添加到細(xì)胞中 的。IgG變體的生物特性可以在細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體實(shí)驗(yàn)中表征。如本領(lǐng)域所已知的，藥物通常在動(dòng)物中測試以測量藥物治療疾病或疾病模型的效力或測量藥物的藥代動(dòng)力 學(xué)、毒性和其他特性，所述動(dòng)物包括但不限于小鼠、大鼠、兔、狗、貓、豬和猴。這些動(dòng)物可以 被稱為疾病模型。治療劑通常在小鼠中測試，所述小鼠包括但不限于裸小鼠、SCID小鼠、異 種移植小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠(包括敲入和敲除)。此實(shí)驗(yàn)可以提供測定蛋白用作治療劑的可 能的有意義的數(shù)據(jù)?？梢允褂萌魏紊矬w，優(yōu)選哺乳動(dòng)物進(jìn)行測試。例如，由于猴與人的遺 傳相似性，它們可能是合適的治療模型，因此可以用于測試IgG的效力、毒性、藥代動(dòng)力學(xué) 或其他特性。在人中的測試最終需要被批準(zhǔn)作為藥物，因此當(dāng)然包括了這些實(shí)驗(yàn)。因此，可 以在人中測試IgG以測定它們的治療效力、毒性、免疫原性、藥代動(dòng)力學(xué)、和/或其他臨床特 性。使用IgG變體的方法 IgG變體可用于大量產(chǎn)品中。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體為治療試劑、診斷試劑、 或研究試劑，優(yōu)選為治療試劑。IgG變體可用于單克隆或多克隆的抗體組合物中。在優(yōu)選的 實(shí)施方式中，IgG變體用于殺傷具有靶抗原的靶細(xì)胞，例如癌細(xì)胞。在替代性實(shí)施方式中， IgG變體用于阻斷、拮抗或激動(dòng)靶抗原，例如拮抗細(xì)胞因子或細(xì)胞因子受體。在替代性的優(yōu) 選實(shí)施方式中，IgG變體用于阻斷、拮抗或激動(dòng)靶抗原并殺傷具有靶抗原的靶細(xì)胞。IgG變體可用于多種治療目的。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，將包含IgG變體的抗體施 用給患者以治療抗體相關(guān)病癥。為了該目的的“M”包括人和其他動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物并 且最優(yōu)選為人。本文所謂的“抗體相關(guān)病癥”或“抗體反應(yīng)件病癥”或“病況”或“為疾病” 意指可以通過施用包含IgG變體的藥物組合物而改善的病癥?？贵w相關(guān)病癥包括但不限 于自身免疫性疾病、免疫疾病、傳染病、炎性疾病、神經(jīng)疾病、以及腫瘤和瘤形成性疾病，包 括癌癥。本文所謂的“癌癥(cancer)”和“癌癥(cancerous) ”是指或描述哺乳動(dòng)物中特征 通常為細(xì)胞生長上調(diào)的生理病況。癌癥的實(shí)例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉 瘤(包括脂肉瘤)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、間皮瘤、施萬細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤、和白血病 和惡性淋巴瘤。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體是施用給患者的唯一治療活性劑?？蛇x擇地，IgG變 體與一個(gè)或多個(gè)其他治療劑組合施用，所述其他治療劑包括但不限于細(xì)胞毒素劑、化療劑、 細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素劑、激酶抑制劑、抗血管發(fā)生劑、保心劑、或其他治療劑。IgG 變體可以與一種或多種其他治療方案同時(shí)施用。例如，IgG變體可以與化療、放療、或化療 和放療兩者一起施用給患者。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG變體可以與可能是或不是IgG變體 的一種或多種抗體結(jié)合施用。根據(jù)另一實(shí)施方式，使用IgG變體和一個(gè)或多個(gè)其他抗癌治 療來治療離體的癌細(xì)胞。包括了這種離體治療可用于骨髓移植，并且尤其是自體骨髓移植。 當(dāng)然包括了可以與另外的治療技術(shù)如手術(shù)組合使用IgG變體。可以使用多種其他治療劑來與IgG變體一起施用。在一個(gè)實(shí)施方式中，IgG與抗 血管發(fā)生劑一起施用。本文所用的“抗血管發(fā)牛劑”意指在某種稈度上阻斷、或干擾血管發(fā) 育的化合物?？寡馨l(fā)生劑因子可以為例如與參與促進(jìn)血管發(fā)生的生長因子或生長因子 受體結(jié)合的小分子或蛋白，例如抗體、Fc融合體、或細(xì)胞因子。本文優(yōu)選的抗血管發(fā)生因子 為與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)結(jié)合的抗體。在替代性實(shí)施方式中，IgG與誘導(dǎo)或增強(qiáng)獲得 性免疫反應(yīng)的治療劑例如靶向CTLA-4的抗體一起施用。在替代性實(shí)施方式中，IgG與酪氨 酸激酶抑制劑一起施用。本文所用的“酪氨酸激酶抑制劑”意指在某種程度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在替代性實(shí)施方式中，IgG變體與細(xì)胞因子一起施用。包括了其中配制了 IgG變體和一種或多種治療活性劑的藥物組合物。通過混 合具有所需純度的IgG與任選的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington' s Pharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學(xué))第16版，0sol，A.編輯，1980，通過引用整體 并入)以凍干制劑或水溶液的形式制備用于儲存的IgG變體制劑。用于體內(nèi)施用的制劑優(yōu) 選為無菌的。這通過用無菌濾膜過濾或其他方法容易實(shí)現(xiàn)。本文所公開的IgG變體和其他 治療活性劑還可以配制成免疫脂質(zhì)體和/或裝入微膠囊中治療活性IgG變體在制劑中的濃度可以按重量計(jì)從約0. 1 %至100%變化。在優(yōu) 選的實(shí)施方式中，IgG的濃度在0. 003至1. 0摩爾的范圍內(nèi)。為了治療患者，可以施用治療 有效劑量的IgG變體。本f所謂的“治療有效劑量”意指產(chǎn)牛其所施用的效果的劑量。準(zhǔn) 確的劑量取決于治療目的，并且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員使用已知的技術(shù)來確定。劑量可以 在0. 01mg/kg至100mg/kg體重或更大的范圍內(nèi)，例如0. 01,0. 1,1. 0、10、或50mg/kg體重， 優(yōu)選為1至10mg/kg。如本領(lǐng)域內(nèi)所已知的，可能需要調(diào)整蛋白降解、全身性遞送或是局部 遞送、新蛋白酶合成的速率、以及年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用時(shí)間、藥物相互作 用和病況嚴(yán)重程度，并且這可以由本領(lǐng)域的那些技術(shù)人員使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。包含IgG變體的藥物組合物優(yōu)選為無菌水溶液形式的施用可以以多種方法進(jìn)行， 包括但不限于口服、皮下、靜脈內(nèi)、腸胃外、鼻內(nèi)、耳內(nèi)、眼內(nèi)、直腸、陰道、經(jīng)皮、局部(例 如，凝膠、藥膏、洗劑、乳劑等)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)(例如從Aradigm商購獲得的AERx⑧吸 入技術(shù)、或從Nektar Therapeutics商購獲得的Inhance 肺部遞送系統(tǒng)等)。本文所述的 治療劑可以與其他治療劑同時(shí)施用，即，本文所述的治療劑可以與其他治療或治療劑共同 施用，其他治療或治療劑包括例如，小分子、其他生物制劑、放射治療、手術(shù)等。實(shí)施例下面提供實(shí)施例來示例本發(fā)明。這些實(shí)施例不旨在將本發(fā)明限制于任何具體的應(yīng) 用或操作理論。對于本發(fā)明所討論的所有位置，編號根據(jù)Kabat的EU索引(Kabat等人， 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest ( ^W^^^M^t^WSS/!5 列)，第 5 版，United States Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda，其通過引用整體并入)進(jìn)行。抗體領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員應(yīng)了解該規(guī)定包括在 特定免疫球蛋白序列區(qū)的非順序編號，這使得免疫球蛋白家族的保守位置具有標(biāo)準(zhǔn)化的參 考。因此，如通過EU索引所定義的任何給定免疫球蛋白的位置不需要對應(yīng)于其順序序列。實(shí)施例1 :Fc變體的DNA構(gòu)建、表達(dá)和純化使用人IgGl Fc結(jié)構(gòu)域和曲妥單抗(Here印tin ，Genentech)的可變結(jié)構(gòu)域構(gòu) 建Fc變體。Fc多肽為阿侖單抗、抗HER2抗體或AClO的一部分。阿倫單抗(Campath⑧， Millenium的注冊商標(biāo))是目前被批準(zhǔn)用于治療B細(xì)胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單 克隆抗體(Hale等人，1990，Tissue Antigens35 :118_127，通過引用整體并入)。曲妥單抗 (Here印tin ，Genentech的注冊商標(biāo))是用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌的抗HER2/neu抗體。抗 HER2抗體的重鏈和輕鏈序列顯示在圖22中。AClO是抗⑶30單克隆抗體。Here印tin可 變區(qū)使用遞歸式PCR裝配。然后將該可變區(qū)與人IgGl —起克隆到pcDNA3. 1/Zeo (+)載體 (Invitrogen)中，顯示在圖11中。將質(zhì)粒在One ShotTOPlO大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen) 中繁殖，并使用Hi-Speed Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen)純化。對質(zhì)粒進(jìn)行測序以驗(yàn)證克隆的插入序列的存在。使用Quikchange 方法(Stratagene)進(jìn)行定點(diǎn)誘變。在One Shot T0P10大腸桿菌 細(xì)胞(Invitrogen)中繁殖含有所需的取代、插入、和缺失的質(zhì)粒，并使用Hi-Speed Plasmid Maxi試劑盒(Qiagen)將其純化。進(jìn)行DNA測序以確定序列的保真性。將含有重鏈基因(VH-C γ I-C y 2-C γ 3)(野生型或變體)的質(zhì)粒與含有輕鏈基因 (VL-Ck)的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293Τ細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后5天收獲培養(yǎng)基，并使用蛋白A親和色譜 (Pierce)從上清液中純化抗體。一些被修飾的Fc的蛋白A結(jié)合特征顯示在圖26中。通過 二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)測定(Pierce)來確定抗體濃度。
實(shí)施例2 結(jié)合親和力測量Fc多肽與Fc配體的結(jié)合使用表面等離子體共振測量來測定。表面等離子體共 振(SPR)測量使用BIAcore 3000儀器(BIAcore AB)進(jìn)行。使用固定的蛋白L(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)捕獲野生型或變體抗體，并測量它們與受體分析物的結(jié)合。 使用N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基-N’ -(-3- 二甲基氨基-丙基)碳二亞胺(NHS/EDC)以 5 μ 1/min的流速將蛋白L在CM5傳感芯片上以在IOmM乙酸鈉pH 4. 5中為1 μ M的濃度共 價(jià)偶聯(lián)到CM5傳感芯片上。每個(gè)傳感芯片的液體池1用NHS/EDC模擬以作為結(jié)合的陰性 對照。運(yùn)行緩沖液為 0. OlM HEPES ρΗ 7. 4、0. 15Μ NaCl、3mM EDTA、0. 005% ν/ν 表面活性 劑 P20(HBS-EP，Biacore, Uppsala, Sweden)，并且芯片再生緩沖液為 IOmM 甘氨酸-HCl ρΗ 1.5。將125nM野生型或變體抗HER2抗體在HBS-EP中以1μ 1/min與蛋白L CM5芯片結(jié)合 5分鐘。在HBS-EP中以10 μ 1/min注射在1和250mM之間系列稀釋的FcRn-His-GST分析 物，F(xiàn)cRn-His-GST分析物為融合至His標(biāo)簽和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的FcRn，對于結(jié)合注射20 分鐘，對于解離注射10分鐘。在受體注射后1200秒獲得以共振單位(RU)測量的反應(yīng)，它 反映了近穩(wěn)定狀態(tài)的結(jié)合?？贵w和緩沖液的循環(huán)僅提供了基線反應(yīng)。制作RU與Ι/log濃 度的曲線并用GraphPad Prism使用非線性回歸將其與S形劑量反應(yīng)進(jìn)行擬合。還使用 AlphaScreen (Amplified Luminescent Proximity HomogeneousAssay (放大的發(fā)光近似性同源測定))測定Fc多肽與Fc配體的結(jié)合。 AlphaScreen 是基于珠子的非放射性發(fā)光近似性測定。供體珠子的激光激發(fā)會(huì)激活氧， 如果氧與受體珠子足夠近則會(huì)產(chǎn)生級聯(lián)的發(fā)光事件，最終導(dǎo)致在520-620nm處的熒光發(fā) 射。AlphaScreen 的主要優(yōu)點(diǎn)為其敏感性。因?yàn)?，一個(gè)供體珠子每秒鐘發(fā)射多達(dá)60，000 個(gè)激活的氧分子，信號擴(kuò)大極高，使得能夠進(jìn)行低至渺摩爾(attomolar，10_18)級別的檢測。 通過標(biāo)準(zhǔn)方法將野生型抗體生物素化以連接至鏈酶親和素供體珠子，并且被標(biāo)記的Fc配 體，例如FcRn、Fc γ R或蛋白A與谷胱甘肽螯合物受體珠子結(jié)合。AlphaScreen 用于直接 結(jié)合測定，其中Fc/Fc配體相互作用將供體和受體珠子連在一起以產(chǎn)生測量信號。此外， AlphaScreen 用于篩選設(shè)計(jì)的Fc多肽的競爭性測定。在不存在競爭性Fc多肽的情況下， 野生型抗體和FcRn相互作用并產(chǎn)生520-620nm的信號。未帶標(biāo)簽的Fc結(jié)構(gòu)域與野生型 Fc/FcRn相互作用相競爭，從數(shù)量上降低熒光，使得能夠測定相對的結(jié)合親和力。實(shí)施例3 =Fc變體的FcRn結(jié)合特性IgGl Fc與FcRn的結(jié)合親和力使用AlphaScreen 用變體抗體測量。Fc多肽為 阿侖單抗或曲妥單抗的一部分。阿倫單抗(Campath ，Ilex)是目前被批準(zhǔn)用于治療B細(xì) 胞慢性淋巴細(xì)胞性白血病的人源化單克隆抗體(Hale等人，1990，Tissue Antigens 35:118-127，通過引用整體并入)。曲妥單抗(Here印tin ，Genentech)是用于治療轉(zhuǎn)移性乳 腺癌的抗HER2/neu抗體。收集競爭性AlphaScreen 數(shù)據(jù)以測量在0. IM磷酸鈉pH6. 0和25mM氯化鈉中Fc 變體與野生型抗體相比的相對結(jié)合。AlphaScreen 信號作為競爭劑抗體的函數(shù)的實(shí)例顯示 在圖 12 中。顯示的 12 個(gè)變體的曲線，即 P257L、P257N、V279E、V279Q、V279Y、~281S、E283F、 V284E、L306Y、T307V、V308F、和Q311V的曲線，證明親和力增加了，因?yàn)槊總€(gè)變體曲線在它 們的框中移至野生型曲線的左側(cè)。本發(fā)明的Fc變體的競爭性AphaScreen 數(shù)據(jù)總結(jié)在圖 13和14中。在0. IM磷酸鈉pH 6. 0與125mM氯化鈉中的另外的競爭性AphaScreen 數(shù)據(jù) 總結(jié)在圖21中。列出了變體與野生型相比的相對FcRn結(jié)合。大于1的值表明Fc變體與 FcRn的結(jié)合與野生型相比有所改善。例如，變體E283L和V284E分別具有比野生型強(qiáng)9. 5 倍和26倍的結(jié)合。如圖15和16所示，一些變體的表面等離子體共振測量還顯示出增加的 與FcRn的結(jié)合。
在位置257，所有移除了亞氨基酸、脯氨酸并且取代為沒有與側(cè)鏈共價(jià)鍵合的骨架 N的氨基酸的變體容許骨架更具靈活，這容許Fc結(jié)構(gòu)域更自由，從而更好地結(jié)合FcRn。具 體地，在位置257處為L和N的變體在pH 6下具有強(qiáng)的FcRn結(jié)合，這表明4個(gè)原子的側(cè) 鏈和側(cè)鏈的Y分支模式有助于Fc結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生生產(chǎn)性的即強(qiáng)的FcRn相互作用。位置308 與位置257相互作用。這兩個(gè)位置繼而都與H310相互作用，H310直接參與Fc/FcRn相互 作用(表2，Burmeister等人(1994)Nature 372 :379_383，通過引用整體并入)。Fc變體 V308F與V08Y的FcRn親和力與野生型相比具有2. 9倍和4. 3倍的增加(圖13)。位置279 和385以變體V279E、V279Q和V279Y和G385H和G385N與FcRn相互作用，它們都具有較強(qiáng) 的FcRn相互作用。這些變體都變?yōu)榱四軌蜻M(jìn)行氫鍵鍵合的氨基酸。包含本發(fā)明的各種修 飾的人IgGl Fc區(qū)序列顯示在圖23中。如圖13中所顯示，F(xiàn)c變體N434Y在pH6. 0下與FcRn的結(jié)合特別強(qiáng)。單變體N434Y 的結(jié)合增加了 16倍。這個(gè)變體與其他修飾的組合會(huì)引起甚至更強(qiáng)的結(jié)合。例如，P257L/ N434Y、"281S/N434Y 和 V308F/N434Y 顯示出增加了 830 倍、180 倍、和 350 倍的 FcRn 結(jié)合。實(shí)施例4 整合了插入和缺失的變體構(gòu)建改變Fc/FcRn相互作用強(qiáng)度的插入和缺失并測量它們與各種Fc配體的結(jié)合 特性。設(shè)計(jì)在使用Kabat等人的EU編號的殘基281和282之間插入有Ser殘基的Fc變體 以增加Fc結(jié)構(gòu)域的FcRn結(jié)合特性。這個(gè)變體稱為"281S，其中“"”意指所給定的位置之后 的插入。AlphaScreen 數(shù)據(jù)顯示"281S的結(jié)合有所改善，該數(shù)據(jù)顯示在圖12b和21a中。 可以為多于1個(gè)殘基的插入序列在位置編號之后提供。使用本文所公開的方法將這種Fc變 體構(gòu)建在κ，IgGl抗HER2抗體曲妥單抗(Here印tin ，Genetech)中。在殘基281和282 之間的位點(diǎn)的插入將殘基281的C端的Fc環(huán)殘基移向環(huán)的碳末端并且改變了側(cè)鏈的定位。 包含位置282、283和284的取代的Fc變體表明該環(huán)的C末端移動(dòng)是有利的(參見圖14)。 還構(gòu)建了另一種為缺失N286有時(shí)稱為N286#的變體以移動(dòng)該FcRn結(jié)合環(huán)的位置。該變體 顯示在ρΗ6· 0下與FcRn的結(jié)合增加(圖14b)。AlphaScreen 數(shù)據(jù)顯示了 "281S變體和其他變體與FcRn的結(jié)合。以直接結(jié)合測 定收集這種AlphaScreen 數(shù)據(jù)。較高水平的化學(xué)發(fā)光信號表明較強(qiáng)的結(jié)合。測定中變體濃 度越增加，則產(chǎn)生的信號越強(qiáng)。圖17a和17b中在pH6.0下的這些數(shù)據(jù)表明~281S、P257L、P257L/~281S (組合的取代/插入變體)和其他變體與野生型Fc相比親和力增加了。還顯示 了一種雙取代T250Q/M428L，之前已顯示該雙取代在猴中具有增加的血清半衰期(Hinton 等人，2004，J.Biol. Chem. 279(8) :6213_6216，通過引用整體并入)。單獨(dú)的插入"281S增 加了 Fc/FcRn結(jié)合。此外，如在約40nM的數(shù)據(jù)點(diǎn)所顯示的，在以變體P257廠281S形式組合 兩種修飾時(shí)，"281S還能增加P257L的結(jié)合。圖17c中的數(shù)據(jù)表明這些變體在pH7. O下不 顯示FcRn結(jié)合的增加。在pH7. O下的親和力降低是增加體內(nèi)半衰期所需的，因?yàn)樗菰S從 FcRn釋放Fc多肽到胞外間隙，這是Fc再循環(huán)的重要步驟。表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)還表明"281S與FcRn的結(jié)合有所改善。圖18顯示各種Fc 變體結(jié)合至芯片表面的FcRn時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)單位。在容許變體完全結(jié)合到芯片之后，記錄 響應(yīng)單位并顯示在縱坐標(biāo)上。插入~281S顯示與本文所顯示的其他變體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合特性， 與野生型相比具有增加的FcRn親和力(參見例如圖13、14和15)。 包含N286缺失、N286#的缺失變體還顯示比野生型增加的FcRn親和力。如圖13 所顯示，該變體具有增加了 2.0倍的FcRn親和力。本文的數(shù)據(jù)還有在PH6.0下的競爭性實(shí) 驗(yàn)所收集的AlphaScreen 數(shù)據(jù)。將用于抑制野生型Fc結(jié)合的變體連接在供體珠子上，并 將FcRn連接在受體珠子上。為抑制供體/受體珠子通過Fc/FcRn復(fù)合體的結(jié)合需要比游 離的野生型Fc少兩倍的游離的N286#。這表明N286#比野生型的結(jié)合緊密2倍。包含插入或缺失的其他Fc變體具有降低的FcRn親和力。如同從變體的性質(zhì)和定 位所預(yù)計(jì)的一樣，插入變體"254N具有顯著降低的FcRn結(jié)合。該變體將Asn插入設(shè)置在 FcRn結(jié)合環(huán)的中間。該插入僅具有野生型結(jié)合親和力的1. 的結(jié)合(圖13)。實(shí)施例5 具有改變的FcRn和Fc γ R特征的組合變體如圖13b中關(guān)于抗HER2抗體所顯示的，F(xiàn)c變體P257L相對于野生型具有增加的對 FcRn的親和力。P257L在添加有25mM NaCl的pH6. 0的磷酸鹽緩沖液中得到了中值為2. 6 倍增加的對于人FcRn的FcRn親和力。I332E或S239D/I332E向P257L變體中的添加產(chǎn)生了 雙變體和三變體，P257L/I332E和S239D/P257L/I332E，它們保持增加的對FcRn的親和力。 如圖14b中的AlphaScreen 測定所顯示，變體S239D/I332E與野生型相比具有基本上未改 變的FcRn結(jié)合。這些雙變體和三變體具有增加了 5倍和4倍的親和力。I332E和S239D/ I332E變體具有改善的與Fc γ R尤其Fc γ RIIIa的結(jié)合(參見，US11/124620，通過引用整體 并入)。本發(fā)明一些變體的Fc γ R結(jié)合特性顯示在圖25中。本發(fā)明一些變體的蛋白A結(jié)合 特性顯示在圖26中。在含F(xiàn)c的蛋白的純化期間常使用蛋白A結(jié)合。取代V308F也改善了在 pH6· 0下的FcRn結(jié)合(圖1加)。V3O8F作為抗HER2抗體曲妥單抗(Here印tin ，Genentech) 中的單取代具有增加了 3倍的親和力，并且在與諸如I332E、S239D/I332E和S298A/E333A/ K334A的增加Fc YR結(jié)合的取代組合時(shí)也具有增加的親和力(Lazar等人2006Proc. Nat. Acad. Sci USA. 103(111) :4005_4010 ;Shields 等人 2001 J. Biol. Chem. 276 :6591_6604， 它們都通過引用整體并入)。當(dāng)G385H與改善Fc γ R的取代組合時(shí)，尤其是在三取代變體 S239D/I332E/G385H中，也保持G385H的增加的FcRn結(jié)合。具有增加的與FcRn結(jié)合的變體可以與降低或敲除與Fc γ R和補(bǔ)體蛋白Clq結(jié) 合的變體組合。改善的與FcRn的結(jié)合增加保護(hù)性受體的作用，從而容許半衰期改善。還 可以將含F(xiàn)c的蛋白引入細(xì)胞中并通過它們與Fc γ R和Clq蛋白的相互作用進(jìn)行代謝。如 果FC/FcyR和Fc/Clq蛋白相互作用不是抗體效力所需要的，則可以缺失這些相互作用。這些相互作用的缺失還可以降低降解性受體的作用，從而容許半衰期改善。具體地，變體 234G、235G、236R、237K、267R、269R、325A、325L、和 328R (USl 1/396，495，通過引用整體并 入)可以與改善FcRn的變體組合以產(chǎn)生具有增加的FcRn親和力和降低的Fc γ R或Clq親 和力的變體。這些變體包括 235G/257C、325Α/385Η、325A/257L、234G/308F、234G/434Y、和 269R/308F/311V。這些變體可以在來自IgGl的Fc結(jié)構(gòu)域中制備，然而與Fc γ R或Clq的 相互作用的降低還可以通過將這些突變設(shè)置在含有來自IgG2、IgG4或IgG3的Fc結(jié)構(gòu)域的 蛋白中來實(shí)現(xiàn)。將FcRn修飾，如257N、257L、257M、308F、311V引入IgG2中容許FcyR結(jié)合 降低和FcRn相互作用增加。具有降低的與FcRn結(jié)合的變體可以與具有增加的Fc γ R或Clq結(jié)合的變體組合。 降低的FcRn結(jié)合與增加的Fc γ R結(jié)合的組合可能有利于增加可用于不正當(dāng)效應(yīng)子功能的 含F(xiàn)c的蛋白的量。降低FcRn結(jié)合可以降低被FcRn隔離的含F(xiàn)c的蛋白的量，并且會(huì)因此 影響生物可用性。諸如I253V、S254N、S254#(缺失254)、T255H、和H435N的修飾降低Fe/ FcRn結(jié)合(圖13)并且可以與具有改善的Fc γ R結(jié)合的變體如S239D、I332E、H268E、G236A 組合。所得的 Fc 結(jié)構(gòu)域，如包含 I253V/S239D/I332E、I332E/H435N、或 S254N/H268E 的那 些具有降低的FcRn結(jié)合和增加的Fc γ R結(jié)合。
具有降低的FcRn結(jié)合的變體可以與具有降低的Fc γ R結(jié)合的變體組合。這種降 低的FcRn和Fc γ R結(jié)合的組合在諸如其中用放射性或毒性示蹤物標(biāo)記含F(xiàn)c的蛋白的成像 的應(yīng)用中是有利的。理想地，包含放射性示蹤物的蛋白的半衰期與放射性核素本身的半衰 期類似。這容許示蹤物在放射性核素衰退的同時(shí)從體內(nèi)清除。降低的fcyr相互作用還容 許含F(xiàn)c的蛋白對于其靶具有最佳的可用性。例如，如果含F(xiàn)c的蛋白是抗體，則降低Fc γ R 結(jié)合容許更多的抗體可被抗原評估。影響FcRn和Fc YR的變體的組合，如235G/254N、 236R/435N、269R/I253V對于這種應(yīng)用是較佳的。實(shí)施例6 抗體0ST577中的Fc變體與人FcRn的結(jié)合0ST577是抗乙型肝炎表面抗原抗體(Ehrlich等人(1992) Hum. Antibodies Hybridomas 3 :2_7，通過引用整體并入)。重鏈和輕鏈序列取自Kabat數(shù)據(jù)庫，它們是 KADBID 000653 (重鏈)和 KADBID 007557 (輕鏈)(Martin AC, Proteins. 1996 May ；25(1) 130-3，通過引用整體并入)。編碼重鏈和輕鏈的DNA由Blue Heron Biolotechnology, Bothell, WA合成。如實(shí)施例1中的抗HER2(曲妥單抗)變體一樣表達(dá)和純化野生型和變 體0ST577抗體。Biacore 結(jié)合測定如實(shí)施例2中一樣進(jìn)行，其中將人FcRn/谷胱甘肽D 轉(zhuǎn)移酶(GST)融合蛋白連接至芯片表面。如圖19所示，本發(fā)明的Fc變體具有改變的與人 FcRn的結(jié)合。具有增加的結(jié)合的變體更容易與表面的FcRn粘附并且能引起較高的響應(yīng)單 位(RU)增加。在FcRn結(jié)合區(qū)域顯示有修飾的變體均具有比野生型蛋白增加的對FcRn的 親和力。這些變體包括 P257L、P257N、V308F、N434Y、P257L/N434Y 和 P257L/V308F。在 975 秒RU量第三高的變體T250Q/M428L顯示在獼猴中增加0ST577抗體的半衰期(Hinton等人 2004 Journal of Biological Chemistry 279(8) 6213-6216 ；Hinton ^A 2006 Jounal of Immunology 176 :346_356，它們都通過引用整體并入)。這個(gè)數(shù)據(jù)組中包括的是具有含 取代S239D/I332E的雜合IgGl/IgG2重鏈恒定區(qū)的抗體。如實(shí)施例5中所描述的，這些取 代增加了對Fc γ R的抗體親和力。如圖19中所顯示的，這些取代不改變FcRn結(jié)合特性，因 為雜合S239D/I332E的Biacore 圖線與含κ或λ CLl結(jié)構(gòu)域的野生型圖線重疊。
實(shí)施例7 =Fc變體對人、猴和小鼠FcRn的親和力 如實(shí)施例1中所述制備抗HER2抗體曲妥單抗的Fc變體。如實(shí)施例2所述收集 表面等離子體共振(SPR)圖線，不同的是將人、獼猴或小鼠的FcRn連接在芯片表面。對于 每種Fc變體收集連接在表面不同量的GST-FcRn的兩條SPR曲線。將每個(gè)曲線與1 1 Langmuir結(jié)合模型擬合，并且將所得的兩個(gè)Kd值平均以得到每個(gè)變體-受體對的代表值。 結(jié)果以與野生型曲妥單抗相比的Kd改善倍數(shù)顯示在圖20中。例如，變體V308F/Q311V與 人FcRn的結(jié)合比野生型的結(jié)合緊密3. 4倍。V308F/Q311V與猴和小鼠FcRn的結(jié)合也分別 緊密了 3. 7倍和5. 1倍。據(jù)顯示變體M428L增加抗體半衰期(Hinton等人2004 Journal of Biological Chemistry 279(8) :6213_6216，全文通過引用并入)，并且它與人、猴和小 鼠的FcRn結(jié)合分別增加了 2. 4倍、2. 0倍、和2. 1倍。其他變體，包括P257L、P257N、N434Y、 Q311V、V308F、V308F/N434Y、P257L/V308F、和 P257L/N434Y 也顯示能在 pH6. 0 下增加結(jié)合。實(shí)施例8 在各種Fc結(jié)構(gòu)域中的FcRn變體可以使用本文所述的分子生物學(xué)和純化技術(shù)，包括實(shí)施例1中的那些技術(shù)，將本 發(fā)明的變體整合到任何恒定結(jié)構(gòu)域?？梢匀鐖D2中所列使用IgGl、IgG2、IgG3、和IgGtg 定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。此外，可以使用兩種或多種不同恒定結(jié)構(gòu)域的組合。例如，圖24 列出了整合到IgG2和IgG2雜合體中的在本發(fā)明中出現(xiàn)的一些修飾。這種雜合體包含IgG2 CHl結(jié)構(gòu)域和IgGl CH2和CH3結(jié)構(gòu)域。在人中IgG3與IgGl、IgG2和IgG4相比具有較低 的半衰期(7 天相對于約 21 天，Janeway, Travers, ffalport, Shlomchik. Immunology (免疫 學(xué))，第5版Garland Publishing c2001，圖4_16，通過引用并入)，并且因此在某些應(yīng)用中 是期望的。實(shí)施例9 抗VEGF抗體中變體的制備使用本文所述包括實(shí)施例1的方法制備結(jié)合改變的抗VEGF抗體。野生型抗VEGF 重鏈包含下列氨基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTNYGMNWVRQAPGKGLEWVGWINTYTGEPTYAADFKRRFT FSLDTSKSTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAKYPHYYGSSHWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTA ALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP KSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDffLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKG FYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK野生型抗VEGF輕鏈包含下列氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKVLIYFTSSLHSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTVPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKV QWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC結(jié)合改變的單變體和組合變體包括圖28中所示的變體，圖28顯示了所制備的變 體、所用的培養(yǎng)基體積和所得的抗體變體產(chǎn)量。變體的編號根據(jù)Kabat等人的EU索引進(jìn)行。 圖28中所列的變體在IgGl或包含來自IgGl和IgG2兩者的序列的雜合VH中制備。這些 變體含有結(jié)合抗原VEGF的可變區(qū)。通過尺寸排阻色譜和SDS凝膠電泳判斷所有的蛋白純 度都大于90%。實(shí)施例10 抗體變體的體內(nèi)半衰期
在小鼠中研究了野生型和變體抗體的藥代動(dòng)力學(xué)特征。所用的小鼠為小鼠FcRn 表達(dá)缺陷的(B6-FcgrtTml吣小鼠)并且為敲入人FcRn的雜合的(hFcRn Tg-轉(zhuǎn)基因)，如 Petkova等人 International Immunology 2006Dec ；18 (12) :1759_69所述。Petkova等人顯 示變體N434A在這些敲入人FcRn的小鼠中具有增加的半衰期，這與N434A變體在猴中具有 增加的半衰期這一早期結(jié)果相一致(美國申請第11/208422號，公開號為US26067930A1)。 用2mg/kg抗體靜脈內(nèi)注射9-12周齡的雌性小鼠，每種抗體注射6只小鼠的組。在1小時(shí)、1、 4、8、11、15、18、21、25和28天從框下叢(oribitalflexus)收集血液樣品。利用夾心ELISA 測定使用抗人Fc抗體和銪檢測測量血清中每種抗體的濃度。研究結(jié)果顯示在圖27中，它是兩次獨(dú)立研究的代表數(shù)據(jù)。顯示了 4種樣品的均值 和平均標(biāo)準(zhǔn)偏差。很清楚的是，V308F變體具有較長的半衰期，可測量的濃度保持到了 25 天。野生型和P257L和P257N變體清除地較快，可測量濃度分別只持續(xù)到15、8和4天。將 血清濃度與時(shí)間的函數(shù)與使用軟件包WinNonLin(Pharsight Inc)的非房室模型進(jìn)行擬合。 V308F變體的終末半衰期為4. 9天，而野生型和P257L和P257N變體的終末半衰期分別為 3. O、1.9和0.9天。V308F變體的曲線下面積(AUC)為129天* μ g/ml，而野生型和P257L 和P257N變體的曲線下面積分別為70,38和38天g/ml。實(shí)施例11 :pH6. O下的FcRn結(jié)合實(shí)驗(yàn)如實(shí)施例2中所述并對其進(jìn)行一些修改，使用Biacore測定測試本發(fā)明的抗VEGF 變體對人FcRn的結(jié)合能力。在IOmM乙酸鈉，pH4. 5中使用N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙 基-N，-(-3- 二甲基氨基-丙基)碳二亞胺(NHS/EDC)以5 μ 1/min的流速將人FcRn共價(jià) 連接在CM5芯片上。所用的人FcRn含有GST和HIS標(biāo)記的形式以有助于純化和其他測定。 大約3300RU的FcRn連接到了芯片上。液體池1用NHS/EDC進(jìn)行模擬以作為結(jié)合的陰性對 照。運(yùn)行緩沖液為25mM磷酸鹽緩沖液pH6. 0、150mM NaCl、3mM EDTA和0.005% (ν/ν)表 面活性劑Ρ20。在ρΗ7. 4用相同的緩沖液將抗體從FcRn芯片洗脫，該過程迅速地移去了測 試的所有變體。將biacore結(jié)合和解離圖線與構(gòu)象交換模型擬合以計(jì)算表觀結(jié)合平衡常數(shù) Kd。結(jié)果表明V308F變體和一些其他的變體具有改善的與FcRn的結(jié)合。野生型抗VEGF 抗體具有 18nM 的 Kd，這與 Dair Acqua 等人(Dall，Acqua 等人 Journal of Immunology 2002,169:5171-5180)所報(bào)道的值明顯不同，這是因?yàn)闇y定設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)擬合不同。如果 FcRn芯片在制備后很快使用，則我們的測定形式能得到可再現(xiàn)的結(jié)果。然而FcRn芯片會(huì)隨 著使用而降解，這可能是由于兩條FcRn鏈的任一條與表面解離造成的。結(jié)果表明與野生型 抗VEGF相比，變體的結(jié)合改變了。圖29顯示了相對于野生型對照的結(jié)合強(qiáng)度的增加倍數(shù)。 大于1的值顯示變體抗體具有比野生型蛋白高的FcRn親和力。例如，變體V308F與FcRn的 結(jié)合比野生型抗體緊密4. 5倍。變體V308F/M428L與FcRn的結(jié)合比野生型蛋白緊密12. 3 倍，并且變體T307P/V308F與FcRn的結(jié)合比野生型蛋白緊密3. 16倍。圖29中沒有顯示與 野生型相比對FcRn親和力降低(值小于1.0)的變體。變體附345具有比野生型強(qiáng)4.4倍 的FcRn結(jié)合親和力，這與V308F相當(dāng)。實(shí)施例12 與跨膜FcRn的結(jié)合實(shí)驗(yàn)FcRna 鏈和 β-2-微球蛋白 cDNA 為從 OriGene Technologies Inc (Rockville, MD)訂購的并且將其轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中以在細(xì)胞表面表達(dá)功能FcRn。用脂質(zhì)體(Iipofectamine) (Invitrogen Inc.)轉(zhuǎn)染 20yg Fcgrt 禾口 40yg β _2_ 微球蛋白 DNA，并容 許細(xì)胞在具有10%超低IgG血清的DMEM培養(yǎng)基中生長3天。也使未用兩種FcRn鏈轉(zhuǎn)染的 對照細(xì)胞生長。在25mM磷酸鹽緩沖液pH6. 0、150mM NaCl、0. 5% BSA中使不同量的抗VEGF 抗體(野生型和變體)與細(xì)胞結(jié)合30分鐘，然后在添加有0. 003% igepal的25mM磷酸鹽 緩沖液PH6. 0、150mM NaCl,0. 5% BSA中將其洗滌6-9次。洗滌后，通過用1 % PFA的結(jié)合 處理將抗體固定在表面。然后使用抗人Fab結(jié)構(gòu)域的PE標(biāo)記的Fab’2檢測結(jié)合的抗體，使 用BD FACS Canto II測量平均熒光強(qiáng)度(MFI)。圖30中顯示每個(gè)抗體的兩個(gè)樣品的平均 值。與圖30中的數(shù)據(jù)匹配的曲線沒有提供可解釋的EC50值，因?yàn)橐恍┣€不形成使細(xì)胞 飽和的上基線。然而，可以通過報(bào)道在MFI等于3000，EC (MFI = 3000)時(shí)的log [變體]而 按照抗體的結(jié)合親和力順序?qū)⑺鼈冊u級。使用這個(gè)量度，可以如下將抗體從最強(qiáng)的FcRn親 和力至最弱的 FcRn 親和力列出V308F/M428L、V259I/V308F, T250I/V308F, T250Q/M428L, N434S、T307Q/V308F、P257L、T307S/V308F、V308F、T256V/V308F、V308F/L309Y、和 WT。實(shí)施例13 變體434S的特征包含修飾434S的抗體具有使得它們成為本發(fā)明優(yōu)選變體的特別有利的特性。在 人IgGl中，野生型殘基在位置434處為天冬酰胺Asn，因此該變體在IgGl或在位置434處 含Asn，N的其他Fc結(jié)構(gòu)域的背景下可以被稱為N434S。更一般地，該變體可以簡單地被稱 為434S。在本文中，成功地在抗HER2抗體曲妥單抗和抗VEGF抗體二者中制備了 434S變 體。位置434處的Ser具有與FcRn直接或間接即由水或溶質(zhì)分子介導(dǎo)氫鍵鍵合的能 力。如圖32所示，位置434處的Ser的、氧與FcRn分子上的Glyl31和Prol34的羰基氧 原子鄰近。圖32顯示人Fc結(jié)構(gòu)域與人FcRn形成的復(fù)合體的模型。模型中的Fc結(jié)構(gòu)域 包含了 434S取代，因此圖32中的殘基434是Ser。該模型是使用PDA 技術(shù)(Dahiyat和 Mayo Protein Sci. 1996May ；5 (5) :895_903)、大鼠Fc結(jié)構(gòu)域與大鼠FcRn結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu) (Martin 等人 Mol Cell. 2001 Apr ；7 (4) :867_77)和 Pymol (Delano Scientific)制備的。 小尺寸的Ser容易容納在兩個(gè)蛋白之間的界面內(nèi)。如biacore 測量所顯示的(圖29)，抗體變體N434S與野生型抗體相比具有增加 了 4. 4倍的FcRn結(jié)合親和力。如細(xì)胞計(jì)數(shù)測量所顯示(圖30)，該變體還顯示與結(jié)合在細(xì) 胞表面的FcRn的結(jié)合增加。根據(jù)圖29和30中所顯示的結(jié)果，包含434S和其他修飾的優(yōu)選的變體預(yù) 計(jì)包括 V308F/434S、428L/434S、252Y/434S、259I/308F/434S、250I/308F/434S、和 307Q/308F/434S。實(shí)施例14 另外的變體另外的變體是基于本文所包含的數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)(Dal 1’ Acqua等人Journalof Biological Chemistry 2006 Aug 18 ；281 (33) :23514_24 ;Petkova 等人 International Immunity 2006 Dec ； 18 (12) 1759-69 ;Dall'Acqua 等人 Journal oflmmunology 2002， 169 :5171-5180 ;Hinton 等人，Journal of BiologicalChemistry 2004 279(8) 6213-6216 ;Shields 等人 Journal of BiologicalChemistry 2001 276(9) :6591_6604 ； Hinton 等人 Journal of Immunology 2006，176 :346_356，它們都通過引用并入)。這些變 體包括圖31中所出現(xiàn)的那些變體。
49
根據(jù)圖29和30的結(jié)果以及Dall，Acqua等人的結(jié)果(Journal ofBiological Chemistry 2006 Aug 18 ；281 (33) :23514_24，通過引用并入)，優(yōu)選的變體包括Y319L、 T307Q、V259I、M252Y、V259I/N434S、M428L/N434S、V308F/N434S、M252Y/S254T/T256E/ N434S、M252Y/S254T/T256E/V308F、M252Y/S254T/T256E/M428L、V308F/M428L/N434S、 V259I/V308F/N434S、T307Q/V308F/N434S、T250I/V308F/N434S、V308F/Y319L/N434S、 V259I/V308F/M428L、V259I/T307Q/V308F、T250I/V259I/V308F、V259I/V308F/Y319L、 T307Q/V308F/L309Y、T307Q/V308F/Y319L、和 T250Q/V308F/M428L。根據(jù)圖29和30的結(jié)果，更優(yōu)選的變體包括Y319L、T307Q、V259I、M252Y、V259I/ N434S、M428L/N434S、V308F/N434S、V308F/M428L/N434S、V259I/V308F/N434S、T307Q/ V308F/N434S、T250I/V308F/N434S、V308F/Y319L/N434S、V259I/V308F/M428L、V259I/ T307Q/V308F、T250I/V259I/V308F、V259I/V308F/Y319L、T307Q/V308F/L309Y、T307Q/ V308F/Y319L、和 T250Q/V308F/M428L。盡管為了示例的目的而在上文中描述了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，但是本領(lǐng)域的那 些技術(shù)人員應(yīng)了解可以在不背離所附的權(quán)利要求所述的發(fā)明的情況下進(jìn)行大量的細(xì)節(jié)改 變。本文所引用的所有參考文獻(xiàn)都以其整體并入。序列表
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ValLeuAspSerAspGly SerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrVal
180185190
AspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMet
195200205
HisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThrGlnLysSerLeuSerLeuSer
210215220
ProGlyLys
225
<210>2
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<212>PRT
<213> 智人(Homosapiens)
<400>2
ValGluCysProProCysProAlaProProValAlaGlyProSerVal
151015
PheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThr
202530
ProGluValThrCysValValValAspValSerHisGluAspProGlu
354045
ValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLys
505560
ThrLysProArgGluGluGlnPheAsnSerThrPheArgValValSer
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ValLeuThrValValHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLys
859095
CysLysValSerAsnLysGlyLeuProAlaProlieGluLysThrlie
100105110
SerLysThrLysGlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuPro
115120125
ProSerArgGluGluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeu
130135140
ValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsn
145150155160
GlyGlnProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSer
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AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg
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TrpGlnGlnGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu
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ValPheLeuPheProProLysProLysAspThrLeuMetlieSerArg
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ThrProGluValThrCysValValValAspValSerGlnGluAspPro
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GluValGlnPheAsnTrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAla
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ValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys[1088]100105110[1089]Pro AlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro[1090]115120125[1091]Lys ProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrLeuGluValThrCys[1092]130135140[1093]Val ValValAspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp[1094]145150155160[1095]Tyr ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu[1096]165170175[1097]Glu GlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrValVal[1098]180185190[1099]His GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn[1100]195200205[1101]Lys AlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysThrLysGly[1102]210215220[1103]Gln ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu[1104]225230235240[1105]Met ThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr[1106]245250255[1107]Pro SerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn[1108]260265270[1109]Asn TyrLysThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePhe[1110]275280285[1111]Leu TyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn[1112]290295300[1113]Val PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr[1114]305310315320[1115]Gln LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys[1116]325330[1117]<210>21[1118]<211>330[1119]<212>PRT[1120]<213>人工序列[1121]<220>[1122]<223>P257N 雜合體[1123]<400>211124]AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys1125]1510151126]SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr1127]2025301128]PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer1129]3540451130]GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer1131]5055601132]LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr1133]657075801134]TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys1135]8590951136]LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys1137]1001051101138]ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro1139]1151201251140]LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrAsnGluValThrCys1141]1301351401142]ValValValAspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp1143]1451501551601144]TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu1145]1651701751146]GluGlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrValVal1147]1801851901148]HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn1149]1952002051150]LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysThrLysGly1151]2102152201152]GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu1153]2252302352401154]MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr1155]2452502551156]ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn1157]2602652701158]AsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePhe1159]2752802851160]LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn1161]2902953001162]ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr
721163]3053103153201164]Gln Lys SerLeuSerLeuSerProGlyLys1165]3253301166]<210>221167]<211>3301168]<212>PRT1169]<213>人工序列1170]<220>1171]<223>V308F 雜合體1172]<400>221173]Ala SerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys1174]1510151175]Ser ThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr1176]2025301177]Phe ProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer1178]3540451179]Gly ValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer1180]5055601181]Leu SerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr1182]657075801183]Tyr IleCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys1184]8590951185]Lys ValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys1186]1001051101187]Pro AlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro1188]1151201251189]Lys ProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys1190]1301351401191]Val ValValAspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp1192]1451501551601193]Tyr ValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu1194]1651701751195]Glu GlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrPheVal1196]1801851901197]His GlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn1198]1952002051199]Lys AlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysThrLysGly1200]2102152201201]Gln ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu
731202]2252302352401203]MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr1204]2452502551205]ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn1206]2602652701207]AsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePhe1208]2752802851209]LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn1210]2902953001211]ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr1212]3053103153201213]GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys1214]3253301215]<210>231216]<211>3301217]<212>PRT1218]<213> 智人(Homosapiens)1219]<400>231220]AlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys1221]1510151222]SerThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr1223]2025301224]PheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer1225]3540451226]GlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer1227]5055601228]LeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr1229]657075801230]TyrlieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys1231]8590951232]LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys1233]1001051101234]ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro1235]1151201251236]LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys1237]1301351401238]ValValValAspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp1239]1451501551601240]TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu
741651701751242]Glu GlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrValVal1243]1801851901244]His ValAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn1245]1952002051246]Lys AlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysThrLysGly1247]2102152201248]Gln ProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu1249]2252302352401250]Met ThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr1251]2452502551252]Pro SerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGluAsn1253]2602652701254]Asn TyrLysThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePhe1255]2752802851256]Leu TyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn1257]2902953001258]Val PheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr1259]3053103153201260]Gln LysSerLeuSerLeuSerProGlyLys1261]3253301262]<210>241263]<211>3301264]<212>PRT1265]<213>人工序列1266]<220>1267]<223>G385H 雜合體1268]<400>241269]Ala SerThrLysGlyProSerValPheProLeuAlaProSerSerLys1270]1510151271]Ser ThrSerGlyGlyThrAlaAlaLeuGlyCysLeuValLysAspTyr1272]2025301273]Phe ProGluProValThrValSerTrpAsnSerGlyAlaLeuThrSer1274]3540451275]Gly ValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSerGlyLeuTyrSer1276]5055601277]Leu SerSerValValThrValProSerSerSerLeuGlyThrGlnThr1278]657075801279]Tyr lieCysAsnValAsnHisLysProSerAsnThrLysValAspLys
75[1280]859095[1281]LysValGluProLysSerCysAspLysThrHisThrCysProProCys[1282]100105110[1283]ProAlaProGluLeuLeuGlyGlyProSerValPheLeuPheProPro[1284]115120125[1285]LysProLysAspThrLeuMetlieSerArgThrProGluValThrCys[1286]130135140[1287]ValValValAspValSerHisGluAspProGluValGlnPheAsnTrp[1288]145150155160[1289]TyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArgGlu[1290]165170175[1291]GluGlnPheAsnSerThrPheArgValValSerValLeuThrValVal[1292]180185190[1293]HisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSerAsn[1294]195200205[1295]LysAlaLeuProAlaProlieGluLysThrlieSerLysThrLysGly[1296]210215220[1297]GlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerArgGluGlu[1298]225230235240[1299]MetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPheTyr[1300]245250255[1301]ProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsnHisGlnProGluAsn[1302]260265270[1303]AsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSerAspGlySerPhePhe[1304]275280285[1305]LeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGlnGlyAsn[1306]290295300[1307]ValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyrThr[1308]305310315320[1309]GlnLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys[1310]
權(quán)利要求
一種親本Fc多肽的抗體或免疫粘附素，所述抗體或免疫粘附素包含在Fc區(qū)至少一個(gè)修飾，其中所述抗體或免疫粘附素與所述親本抗體或免疫粘附素相比表現(xiàn)出改變的與FcRn的結(jié)合，其中所述修飾選自由259I、307S、319F、319L、和434M組成的組，并且其中根據(jù)Kabat等人的EU索引進(jìn)行編號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)還包含選自由下列組成 的組的至少一個(gè)另外的修飾246H、246S、247D、247T、248H、248P、248Q、248R、248Y、249T、 249W、250E、250I、250Q、250V、251D、251E、251H、251I、251K、251M、251N、251T、251V、251Y、 252Q、252Y、253L、253T、253V、254H、254L、254N、254T、254V、 ~254N、255E、255F、255H、255K、 255S、255V、256E、256V、257A、257C、257D、257E、257F、257G、257H、257I、257K、257L、257M、 257N、257Q、257R、257S、257T、257V、257W、257Y、258R、258V、279A、279D、279C、279F、279G、 279H、279I、279K、279M、279N、279P、279Q、279Q、279R、279S、279T、279W、279Y、280H、 "281A、 "281D、 "281S、 ~281T、282D、282F、282H、282I、282T、283F、283I、283L、283Y、284H、284K、 284P、284Q、284R、284S、284Y、285S、285V、286D、286#、286L、287H、287S、287V、287Y、288H、 288Q、288S、305H、305T、306F、306H、306I、306N、306T、306V、306Y、307D、307P、307Q、307S、 307V、307Y、308C、308D、308E、308F、308G、308H、308I、308K、308L、308M、308N、308Q、308P、 308R、308S、308W、308Y、309F、309H、309N、309Q、309V、309Y、310K、310N、310T、311L、311P、 311T、311V、311W、312H、313Y、315E、315G、315H、315Q、315S、315T、317H、317S、339P、340P、 341S、374H、374S、376H、376L、378H、378N、380A、380T、380Y、382H、383H、383K、383Q、384E、 384G、384H、385A、385C、385F、385H、385I、385K、385L、385M、385N、385P、385Q、385S、385T、 385V、385W、385Y、386E、386K、387#、387A、387H、387K、387Q、389E、389H、426E、426H、426L、 426N、426R、426V、426Y、427I、428F、428L、429D、429F、429K、429N、429Q、429S、429T、429Y、 430D、430H、430K、430L、430Q、430Y、431G、431H、431I、431P、431P、431S、432F、432H、432N、 432S、432V、433E、433P、433S、434A、434F、434H、434L、434M、434Q、434S、434Y、435N、436E、 436F、436L、436V、436W、437E、437V、438H和438K，其中~是在所指示位置后的插入，#是在 所指示位置的缺失。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾250Q/252Y、250Q/256E、250Q/286D、250Q/308F、250Q/308Y、 250Q/311A、250Q/311V、250Q/380A、250Q/428L、250Q/428F、250Q/434H、250Q/434F、 250Q/434Y、250Q/434A、250Q/434M、250Q/434S、250E/252Y、250E/256E、250E/286D、 250E/308F、250E/308Y、250E/311A、250E/311V、250E/380A、250E/428L、250E/428F、 250E/434H、250E/434F、250E/434Y、250E/434A、250E/434M 和 250E/434S。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾252Y/250Q、252Y/250E、252Y/256E、252Y/286D、252Y/308F、 252Y/308Y、252Y/311A、252Y/311V、252Y/380A、252Y/428L、252Y/428F、252Y/434H、 252Y/434F、252Y/434Y、252Y/434A、252Y/434M 和 252Y/434S。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾256E/250Q、256E/250E、256E/252Y、256E/286D、256E/308F、 256E/308Y、256E/311A、256E/311V、256E/380A、256E/428L、256E/428F、256E/434H、 256E/434F、256E/434Y、256E/434A、256E/434M 和 256E/434S。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾286D/250Q、286D/250E、286D/252Y、286D/256E、286D/308F、 286D/308Y、286D/311A、286D/311V、286D/380A、286D/428L、286D/428F、286D/434H、 286D/434F、286D/434Y、286D/434A、286D/434M 和 286D/434S。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾308F/250Q、308F/250E、308F/252Y、308F/256E、308F/286D、 308F/311A、308F/311V、308F/380A、308F/428L、308F/428F、308F/434H、308F/434F、 308F/434Y、308F/434A、308F/434M、308F/434S、308Y/250Q、308Y/250E、308Y/252Y、 308Y/256E、308Y/286D、308Y/311A、308Y/311V、308Y/380A、308Y/428L、308Y/428F、 308Y/434H、308Y/434F、308Y/434Y、308Y/434A、308Y/434M 和 308Y/434S。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾311A/250Q、311A/250E、311A/252Y、311A/256E、311A/286D、 311A/308F、311A/308Y、311A/380A、311A/428L、311A/428F、311A/434H、311A/434F、 311A/434Y、311A/434A、311A/434M、311A/434S、311V/250Q、311V/250E、311V/252Y、 311V/256E、311V/286D、311V/308F、311V/308Y、311V/380A、311V/428L、311V/428F、 311V/434H,311V/434F,311V/434Y,311V/434A,311V/434M 和 311V/434S。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的至少兩個(gè)修飾380A/250Q、380A/250E、380A/252Y、380A/256E、380A/286D、 380A/308F、380A/308Y、380A/311A、380A/311V、380A/428L、380A/428F、380A/434H、 380A/434F、380A/434Y、380A/434A、380A/434M 和 380A/434S。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下 列組成的組的至少兩個(gè)修飾428L/250Q、428L/250E、428L/252Y、428L/256E、428L/286D、 428L/308F、428L/308Y、428L/311A、428L/311V、428L/380A、428L/434H、428L/434F、 428L/434Y、428L/434A、428L/434M、428L/434S、428F/250Q、428F/250E、428F/252Y、 428F/256E、428F/286D、428F/308F、428F/308Y、428F/311A、428F/311V、428F/380A、 428F/434H、428F/434F、428F/434Y、428F/434A、428F/434M 和 428F/434S。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包 含選自由下列組成的組的至少兩個(gè)修飾434H/250Q、434H/250E、434H/252Y、434H/'256E、434H,/286D、434H,/308F、434Η,/308Υ、434Η,/311Α、434Η,/311V、434Η/,380Α、434H//428L,.34H/428F434F/250Q、'434F/250Ε、434F/252Υ、434F/256Ε、434F/'286D、434F/,308F、434F,/308Y、434F,/311Α、434F,/311V、434F,/380Α、434F,/428L、434F/,428F、434Y/'250Q、434Y,/250E、434Y,/252Υ、434Υ,/256Ε、434Υ,/286D、434Υ,/308F、434Υ/,308Υ、434Y/'311A、434Y,/311V、434Υ,/380Α、434Υ,/428L、434Υ,/428F、434Α,/250Q、434Α/,250Ε、434A/'252Y、434A,/256E、434Α,/286D、434Α,/308F、434Α,/308Υ、434Α,/311Α、434Α/,311V、434A/'380A、434A,/428L、434Α,/428F、434Μ,/250Q、434Μ,/250Ε、434Μ,,252Υ、434Μ/,256Ε、434M/'286D、434M,/308F、434Μ,/308Υ、434Μ,/311Α、434Μ,/311V、434Μ,/380Α、434Μ/,428L、434M/'428F434S/250Q、434S/250Ε、434S/252Υ、434S/'256Ε、.434S/'286D、434S/'308F、434S/308Y、434S/311A、434S/311V、434S/380A、434S/428L 和 434S/428F。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列組成的組的修飾319L、307Q、259I、252Y、259I/434S、428L/434S、308F/434S、 252Y/254T/256E/434S、252Y/254IV256E/308F、252Y/254T/256E/428L、308F/428L/434S、 259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S、308F/319L/434S、259I/308F/428L、 259I/307Q/308F、250I/259I/308F、259I/308F/319L、307Q/308F/309Y、307Q/308F/319L 和 250Q/308F/428Lo
13.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的修飾250I、250V、252Q、252Y、254T、256V、259I、307P、307Q、307S、308F、309N、 309Y、311P、319F、319L、428L和 434S。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列 組成的組的修飾250V/308F、250I/308F、254T/308F、256V/308F、259I/308F、307P/208F、 307Q/308F、307S/308F、308F/309Y、308F/309Y、 V308F/311P、308F/319L、308F/319F、 308F/428L、252Q/308F、M252Y/S254T/T256E、2591/434S、428L/434S、308F/434S、 308F/428L/434S、259I/308F/434S、307Q/308F/434S、250I/308F/434S、308F/319L/434S、 259I/308F/428L,259I/307Q/308F,250I/259I/308F,259I/308F/319L,307Q/308F/309Y, 307Q/308F/319L 和 250Q/308F/428L。
15.一種治療需要所述治療的患者的方法，包括施用有效量的如權(quán)利要求1或2所述的 抗體或免疫粘附素。
16.一種增加抗體或免疫粘附素的半衰期的方法，包括修飾如權(quán)利要求1或2所述的抗 體或免疫粘附素。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含2591。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含319L。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含307S。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗體或免疫粘附素，其中所述Fc區(qū)包含選自由下列組 成的組的修飾252Y、254T、256E、259I、307Q、308F、311V、380A、428L、434A 和 434S。
全文摘要
本申請涉及優(yōu)化的IgG免疫球蛋白變體、用于制備它們的工程化方法、以及它們的應(yīng)用，尤其是用于治療目的的應(yīng)用。
文檔編號C07K16/28GK101970492SQ200880113962
公開日2011年2月9日 申請日期2008年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月31日
發(fā)明者A·張伯倫, B·達(dá)希亞特, J·R·德斯賈萊斯, S·B·卡基 申請人:Xencor公司